Biofábricas de proteínas:

operários microscópicos!

Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br

28 de maio de 2013

Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?

Estudos bioquímicos

Determinação da estrutura 3D

Aplicações biotecnológicas

- Terapia

- Vacinas

- Diagnóstico...

Alternativa para as seguintes limitações:

Quantidade

Dificuldade de purificação a partir do tecido original

Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)

Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas

Processo completamente controlado

Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Mycoplasma hyopneumoniae

Pneumonia Micoplásmica Suína

Toxina botulínica

Clostridium botulinum C e D

Botulismo

Como prevenir?

Toxóide

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas

***Algas, animais e plantas

2. Expression vectors

3. Hosts

Relação volume meio/capacidade do frasco 0,2 (20%)

Inóculo – 5 a 10%

Bactérias e leveduras

Microalgas

Produção industrial

Cultivo:

- 28 a 37 C

- Aerobiose

- pH neutro

- Fonte de C e N, microelementos (sais)

Escherichia coli Bacillus subtilis

BACTÉRIAS

Vantagens Desvantagens

Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais

Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural

Fácil controle da expressão gênica Alto conteúdo de endotoxinas (LPS)

Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção

Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Expressão heteróloga em E. coli

*** Alternativas

Vantagens Desvantagens

Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares

Codon usage adequado Plasmídeos instáveis

Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli

Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Secreção instável

Alta produção de proteínas heterólogas

Expressão heteróloga em B. subtilis

*** Alternativas

LEVEDURAS

Eucariotos unicelulares – “organelas”

Multiplicação rápida

Manipulação simplificada

Altas densidades celulares

Não Patogênicas (GRAS)

Fisiologia e genética bem conhecidas

Realizam modificações pós-traducionais

PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS

Saccharomyces cerevisiae

Pichia pastoris

Pichia methanolica

Hansenula polymorpha (Pichia augusta)

Kluyveromyces lactis

Schizosaccharomyces pombe

Schwanniomyces occidentalis

Yarrowia lipolytica

DESVANTAGENS

Saccharomyces cerevisiae

Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose

Alteração da antigenicidade da proteína

Alteração da estrutura 3D

Produção de etanol – tóxico

Falha na secreção de proteínas

Alternativa: outras espécies de leveduras

Pichia pastoris

Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono

Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos

Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades

celulares

28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0

Fonte de C (glicerol, metanol...)

Fonte de N (sulfato de amônio)

Pichia pastoris

Desvantagens

Proteólise de proteínas secretadas

Poucos vetores disponíveis (Invitrogen)

Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade

celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de

oxigênio!

PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA

MICROALGAS

Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese

Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado

“Best of both worlds”

Micro-organismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo

Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais

Rápida produção e scale up

Meio de cultivo muito barato: sais, CO2 e luz solar

Não Patogênicas (GRAS)

Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes

Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella

Baixa expressão de proteínas heterólogas

Chlamydomonas reinhardtii

Cultivo:

- No geral 18 a 22 C

- Agitação

- Luz natural ou fluorescente

- pH 8,2 – 8,7

- Microelementos (P, Zn, B...)

- Salinidade 20 a 24 g.L-1

Algumas empresas que comercializam insumos para a

expressão de proteínas heterólogas

http://www.promega.com

http://www.neb.com

http://www.stratagene.com

http://www.invitrogen.com

OBRIGADO!