Resumo: 19.001

AVALIAÇÃO DE MECANISMOS EPIGENÉTICOS DA GONADOTROFINA CORIÔNICA HUMANA (hCG) NA SINALIZAÇÃO DE CÉLULAS TUMORAIS MAMÁRIAS SKBR3

Autores

1NORONHA, S. A. A. C. D.

3,2, NETO, I. B.

3,2, KEDE, J.

3, WOLGIEN, M. D. C. G. M.

3, SILVA, I.

D. C. G. D. 1, NORONHA, S. M. R. D.

1, NORONHA, S. M. R. D.

1 Cirurgia - UNIFESP,

2 Medicina -

UNIRIO, 3 Ginecologia - UNIFESP

Apoio Financeiro: FAPESP

Resumo Introdução O câncer de mama é o câncer mais comum entre as mulheres. A importância da epigenética no início e na progressão do câncer de mama tem levado muitos pesquisadores a incorporar esta nova e excitante temática na investigação de possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas anti-câncer. A gonadotrofina coriônica humana (hCG) tem sido correlacionada com efeitos antitumorais, desencadeando ações anti-proliferativas, pró-apoptóticas e na ativação da diferenciação celular. Em oposição, o estradiol (E2) correlaciona-se tanto com o desenvolvimento do câncer quanto à progressão tumoral. Isto porque o E2 causa aumento na proliferação celular, na metástase, na invasão e também possui efeitos anti-apoptóticos e na desdiferenciação. Objetivos Obter um perfil da expressão de genes relacionados à remodelagem de cromatina, como HDAC5, HDC6, KAT2A e NCOA3 em linhagens de células tumorais de mama (SK-BR3) após tratamento com hCG e com estradiol. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos As células de tumor mamário SK-BR3 foram divididas em três grupos: controle (sem tratamento), hCG e E2. As células foram tratadas durante 11 dias. Após os tratamentos, o mRNA foi extraído, purificado, analisado e em seguida utilizado para quantificar a expressão dos genes HDAC5, HDC6, KAT2A e NCOA3 por meio de PCR quantitativo (qPCR). Resultados Após o tratamento com hCG e com E2, ocorreu uma hiporregulação das deacetilases histona 5 e 6 (HDAC5 e HDAC6) e do receptor nuclear coativador 3 (NCO3) em relação ao grupo controle. Entretanto este efeito hiporregulador foi mais potente por parte do hCG (-5,3, -3,3, e -3,3 vezes, respectivamente; p < 0,0001) do que por parte do E2 (-1,9, -1,2, e -2,4 vezes, respectivamente; p < 0,001). Além disto, o gene KAT2B foi mais hiper-regulado (2,0 vezes; p < 0,01) após o tratamento com hCG do que após o tratamento com E2 (1,3 vezes; p < 0,001). Conclusão Os resultados demonstram que há um importante papel desempenhado pelos hormônios hCG e E2 no controle da atividade de enzimas de modificação da cromatina, como por exemplo, HDAC5, HDC6, KAT2A e NCOA3. Enquanto o tratamento com estes hormônios hiporegula os genes que realizam deacetilação nas caudas de histona, estes mesmos hormônios hiper-regulam os genes que promovem a acetilação destes resíduos. Isto mantém determinados segmentos da

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dupla-fita acessível à transcrição. Sabe-se que as HDACs exercem um papel fundamental no controle do crescimento de células tumorais mamárias. Subjacentes à atenuação da malignidade no câncer de mama induzida por tratamento com hCG e/ou piora por tratamento com estradiol podem residir mecanismos de (des)acetilação de resíduos de amino ácidos específicos da cauda de histona, assim como de microtúbulos do citoesqueleto que alteram a mobilidade celular.

Palavras-chaves: Tumor mamário, Epigenética, hCG, Estradiol, PCR Arrays

Resumo: 19.002

EFFECTS OF GESTATIONAL EXPOSURE TO BISPHENOL-A ALONE OR ASSOCIATED WITH GENISTEIN OR INDOLE-3-CARBINOL ON UTERINE MORPHOGENESIS AND CARCINOGENESIS IN FEMALE SPRAGUE-DAWLEY OFFSPRING.

Autores 1ROMUALDO, G. R.

2, GRASSI, T. F.

1, BARBISAN, L. F.

1 Morfologia - UNESP,

2 Patologia -

UNESP

Apoio Financeiro: FAPESP

Resumo Introdução Bisphenol A (BPA), a component of epoxi resins and polycarbonate plastics, is considered a hormonally active chemical and endocrine disruptor (Endocrinology, 147:56, 2006). Previous studies have showed that BPA alters the development of rodent female reproductive tract in gestational/post-natal exposure (Biol. Reprod., 72:1344, 2005). Genistein and indole-3-carbinol (I3C), two natural compounds, have showed chemopreventive properties against spontaneous (Cancer Res., 54:1446, 1994) and chemically-induced (Cancer Res., 92:726, 2001) uterine carcinogenesis in rodents. Objetivos To evaluate the modifying effects of gestational exposure to BPA alone or associated with genistein (GEN) or indol-3-carbinol (I3C) on uterine morphogenesis and carcinogenesis in female Sprague-Dawley (SD) offspring. Código de Experimentação Animal 447-CEUA Código de Experimentação Humana Métodos Pregnant Sprague Dawley females were divided into seven experimental groups and fed with basal diet or diets containing genistein (250 mg/kg) or I3C (2000 mg/kg) during all the gestational period. Pregnant SD females were given BPA (25 µg/kg bwt. or 250 µg/kg bwt.) by gavage from gestacional day 10-21. On post-natal day 51, female offspring (n= 12 per group) was initiated with a single i.v. injection of N-methyl N-nitrosourea (MNU - 50 mg/kg) or received a single injection of 0,9% NaCl solution (1ml/kg). Female offspring were euthanized (mean body weight: 318, 62 g) at the end of 25 weeks after initiation with MNU or not. Uteri were removed for analysis of incidence of uterine proliferative and neoplastic lesions. Data

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were analyzed using Chi-Square test or Fisher’s exact probability test (p < 0.005). Resultados The treatment with BPA alone (250 µg/kg bwt.) significantly increased (p=0.002) the incidence of uterine proliferative papillary lesions when compared to control group (5/12, 41.7 % vs. 0/12, 0%). GEN and I3C treatments significantly reduced (p < 0.001 and p=0.0054, respectively) the incidence of uterine proliferative papillary lesions in BPA-exposed (250 µg/kg bwt.) in female offsprings when compared to the group treated with BPA alone (0/12, 0 % for both GEN and I3C) vs. 5/12, 41,67 %). Besides, the treatment with I3C significantly reduced (p < 0.003) the incidence of uterine adenocarcinoma in BPA-exposed (25 µg/kg B.W.) female offspring when compared to the group treated with BPA alone (0/12, 0 % vs. 5/12, 41,67 %). Conclusão The results suggest that gestational exposure to BPA increases the susceptibility to uterine carcinogenesis in female SD offspring. However, gestational exposure to genistein or indole-3-carbinol inhibits the development of uterine proliferative lesions and neoplasias in BPA-exposed female offspring.

Palavras-chaves: Bisphenol - A, Carcinogenesis, Female, Genistein, Indole-3-Carbinol

Resumo: 19.003

CHARACTERIZATION OF ESTROGEN RELATED RECEPTOR (ERR) ALPHA IN CANINE SPONTANEOUS MAMMARY GLAND TUMORS.

Autores

1,2JESUS, I. P.

3, BIONDI, L. R.

1, SOARES, D. S.

4, TOYOTA, F. T.

5, NISHIYA, A. T.

1, DAGLI,

M. L. Z. 1, GENTILE, L. B.

1 Department of Pathology, School of Veterinary Medicine and Animal

Sciences - USP, 2 Curso de Biomedicina - FMU,

3 School of Veterinary Medicine - UNIMES,

4

Veterinary Hospital - Veterinary Hospital , 5 School of Veterinary Medicine - Anhembi Morumbi

Apoio Financeiro: FAPESP and CNPq

Resumo Introdução Most neoplasms developed in animals, particularly in dogs, are similar to the neoplasms in human beings. As in humans, the tumors of mammary gland are the most common neoplasms in dogs, pointing the dog as important model for the study of this illness. Recently, new signaling pathways have been implied in the development of breast cancer, mediated by estrogen-related receptors (ERRs), called ERRα, β and γ. Some of the genes involved in breast carcinogenesis, such as pS2 and c-myc, can be regulated by ERRs, mainly in estrogen-dependent tumors. Recent studies have indicated ERRα as a possible prognostic marker in human breast cancer, playing a role as regulator of the energy metabolism in the cancer cell. The standardization of the expression pattern of these markers in the canine model will support to validate this animal model for cancer study. Objetivos Characterize the expression pattern of ERRα in benign and malignant mammary gland tumors in dogs.

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Código de Experimentação Animal Process number 2323/2011 Código de Experimentação Humana Não se aplica Métodos This study was submitted and approved by the Committee on Ethics in Animal Research (CEUA) of the Department of Pathology, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of São Paulo (USP), São Paulo, Brazil, process number 2323/2011. A total of 20 samples were analyzed. The samples were obtained from female dogs of 8 to 18 years old of different breeds. All lesions were classified in accordance with the criteria of Veterinary Pathology 48; 117, 2011. The paraffin-fixed samples were submitted to immunohistochemistry techniques for determination of ERR alpha tissue expression. The immunohistochemistry was performed using the EnVision Dual Link System-HRP kit (Dako) and the anti-ERRα clone H5844 antibody (Invitrogen). A non-parametric analysis among groups was performed using the Kruskal–Wallis test (Prism version 5, Graphpad Software). Resultados In this study 20 tissues of primary mammary gland tumors were analyzed being 2 hyperplasias, 2 complex adenomas, 6 simple carcinomas, 4 complex carcinomas, 4 mixed carcinomas, 1 anaplastic carcinoma and 1 sarcoma. Regarding the ERR alpha expression, the mean for the nuclear receptor expression was 35.7% in hyperplasia, while the mean of 54.4% of positivity was observed in complex adenomas, 31.7% for simple carcinomas, 48.9% for complex carcinomas, 39% for mixed carcinomas, 3.8% for anaplastic carcinoma and no immunolabeling was observed in the sarcoma sample. Conclusão Although it appears ERR alpha expression is increased in the histopathological tumor types where myoepithelial cells are present (i.e., complex adenoma, complex carcinoma and mixed carcinoma), a greater number of samples need to be analyzed in order to confirm this finding and the expression pattern of ERR alpha in those tumors.

Palavras-chaves: Estrogen Related Receptor alpha, Canine, Mammary gland , Tumor

Resumo: 19.004

AUMENTO NA PROLIFERAÇÃO CELULAR EM LINHAGEM MCF-7 TRATADAS COM SORO DE CAMUNDONGOS

Autores 1TEIXEIRA, V. M.

1, AMARANTE-PAFFARO, A. M.

1, IONTA, M.

1, PAFFARO-JUNIOR, V. A.

1

Departamento de Biologia Celular, Tecidual e do Desenvolvimento - UNIFAL-MG

Apoio Financeiro: FAPEMIG/UNIFAL-MG

Resumo Introdução

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Para que a gravidez se desenvolva é necessário que ocorram alterações nas concentrações de vários hormônios como o estrógeno, progesterona, corticosteroide e prolactina. Essas alterações contribuem para as mudanças imunológicas, importantes em uma gravidez. Certas alterações na resposta imunológica podem agir sobre células cancerosas. Em ambos os casos a imunidade celular é diminuída para que haja proliferação de células. Por isso, pode-se afirmar que há semelhanças nos mecanismos envolvidos na interação materno-fetal e tolerância imunológica tumoral. Embora a ocorrência do câncer de mama concomitantemente com a gravidez seja rara, dentre as mulheres grávidas diagnosticadas com câncer, o câncer de mama é o mais comum. Objetivos Avaliar a influência da suplementação de soro proveniente de camundongos prenhes e de machos sobre a proliferação de células derivadas de câncer mamário (MCF-7). Código de Experimentação Animal 461/2012 Código de Experimentação Humana Métodos Foram utilizados 10 camundongos machos e 10 fêmeas Swiss com 2 meses de idade (40g). Fêmeas e machos foram sacrificados por decapitação, sendo que as fêmeas foram sacrificadas somente no 10° dia de gestação. O sangue foi coletado e após uma hora de espera para a coagulação o mesmo foi centrifugado por 15 minutos à 1200 rpm. Células da linhagem MCF-7 foram semeadas em placas de Petri com 35mm de diâmetro a uma densidade de 5x10 4 células/placa. Após 72 horas do plaqueamento, o meio de cultura foi substituído com meio fresco suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 5% de soro coletado dos animais imediatamente após sacrifício. Foram utilizados 2 animais para a coleta do soro e os experimentos foram conduzidos em triplicatas. Os controles foram mantidos em meio suplementado com 10% de SFB. Três dias após o tratamento, as células foram contadas em câmara de Neubauer. O teste estatístico feito foi o Skott-Knott, em que os valores p < 0,05 foram considerados significativos. Resultados A densidade celular foi maior nas culturas tratadas com o soro de camundongos prenhes em relação às controles (205,7x10 4 células e 66,5x10 4 células , respectivamente). O número de células também foi maior nas culturas tratadas com soro de camundongos machos (182,7x10 4 células) em relação às controles. Embora a densidade célular em culturas tratadas com soro de camundongos machos, tenha sido menor em relação às culturas tratadas com soro de camundongos prenhes, ambos os tratamentos estimularam significativamente a proliferação de células MCF7. Alterações morfológicas não foram evidenciadas em consequência do tratamento, contudo, foi observado que as células tratadas com soro de macho apresentaram granulações não observadas nos demais grupos. Conclusão Os tratamentos com soros de camundongos fêmeas prenhes e de machos estimularam a proliferação de células MCF-7, mostrando que o soro de ambos os animais possuem fatores que contribuem para aumentar a taxa de proliferação destas células. Além disso, não houve diferença significativa na densidade celular encontrada em culturas tratadas com soros provenientes de camundongos prenhes machos, indicando que o estímulo da proliferação, neste caso, não é gravidez-dependente.

Palavras-chaves: cancer de mama, soro, gravidez

Resumo: 19.005

EFFECTS OF MELATONIN AND EXPOSURE TO DIFFERENT LIGHT/DARK CYCLES IN AN ANIMAL MODEL OF MAMMARY CARCINOGENESIS

Autores

1SASSO, E.

1, OLIVEIRA, M. A. B.

1,1,1,1, HIDALGO, M. P.

1 Programa de Pós-Graduação em

Ciências Médicas: Psiquiatria - UFRGS, 2 Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal da Faculdade

Medicina da UFRGS - UFRGS

Apoio Financeiro: FIPE, CNPq, CAPES e FAPERGS

Resumo Introdução Melatonin is the main hormone secreted by the pineal gland. Melatonin therapy has been tested as a potential treatment option in sleep disorders, ageing, jetlag, tuberous sclerosis, and Alzheimer’s disease29. In experimental studies, melatonin has been shown to play an essential role in the regulation of seasonal reproduction18, circadian rhythm-mediated activities, retinal physiology, cardiovascular physiology, immune function, and cancer. Suppression of melatonin interferes with cell cycle control, potentiates immunosuppression, and influences steroid hormones, which are directly involved in mammary carcinogenesis. Objetivos the purpose of this study was to assess the effect of melatonin on the development of mammary tumours in female rats exposed or not to desynchronization of circadian rhythms. Código de Experimentação Animal 11-0353 Código de Experimentação Humana Métodos Animals: The study sample comprised 39 female Sprague-Dawley rats (age 41–46 days, weight 147.85 ± 13.39 g). All were kept in a climate-controlled environment (room temperature 22–24ºC, relative humidity 55–65%) and given access to water and chow ad lib. The animals were randomly allocated into four groups: synchronised without melatonin, desynchronised without melatonin, synchronised with melatonin, and desynchronised with melatonin. Experiments were conducted over a period of 61 days. On day 1, animals were exposed to the carcinogen and desynchronization was begun. Light/dark cycle: Animals in the Synchronised groups were kept on a 12/12-hour light/dark cycle (light phase from 0700 to 1900), whereas those in the Desynchronised groups were subjected to an 11/11-hour light/dark cycle. Treatment: Animals in the intervention groups received 10 mg/Kg melatonin in 1 mL 1% hydroxyethyl cellulose once daily, administered by gavage within 3 hours before the onset of the dark phase. Untreated animals received only 1% hydroxyethyl cellulose once daily. Evaluating the induction: To monitor tumour development and growth mammary glands were palpated once weekly, by an experienced investigator blinded to group allocation.Tumour size calculated using the formula W / 2L / 2π. Histology: Tumours specimens were fixated in 10% formaldehyde, placed onto histological slides, stained with haematoxylin and eosin (H&E), and examined under light microscopy. Resultados Tumour development occurred as expected. Eight weeks after DMBA administration, 32 animals (82.05%) had at least one

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palpable mammary tumour, for a total of 73 tumours (mean, 1.87 ± 1.79 tumours per animal). T There were significant differences in the number of tumours developed between the Synchronised no intervention group and the two intervention groups (Synchronised with melatonin: t= 2.527, p= 0.028; Desynchronised with melatonin: t= 2.603, p= 0.019). Histological examination revealed 58 mammary intraepithelial neoplasms (MIN) (79.45%) and 15 adenocarcinomas (20.55%). Squamous metaplasia was identified in three cases (two MINs and one glandular adenocarcinoma). Of the 32 rats (82.05%) that developed tumours, 11 (28.21%) had at least one adenocarcinoma. There were significant between-group differences in the distribution of histological tumour subtypes (p=0.024). Conclusão Melatonin significantly limits the proliferation of mammary carcinoma cells in vivo. The oncostatic effects of melatonin observed in the present study reinforce the validity of clinical trials of melatonin.

Palavras-chaves: melatonina, ritmo circadiano, cronobiologia, turno, oncologia

Resumo: 19.006

2-AMINOTHIOPHENE DERIVATIVE REVERSES VINBLASTINE RESISTANCE ON SEA URCHIN EMBRYONIC CELLS

Autores

1Fernandes-Santos, T.

2, Moura, R. O.

2, Mendonça-Junior, F.J.B.

3, Lima, M.C.A.

1, Marques-Santos,

L.F. 1 Departamento de Biologia Molecular - UFPB,

2 Laboratório de Síntese e Vetorização Molecular

- UEPB, 3 Laboratório de Síntese e Planejamento de Fármacos - UFPE

Apoio Financeiro:

Resumo Introdução Mitosis is an essential cellular process for survival and homeostasis of living beings. However, its deregulation can lead to severe pathologies such as cancer. One of the major obstacles for the successful of cancer treatment has been the phenomenon of multidrug resistance, particularly the overexpression of ABC proteins. The pharmacological screening of natural and synthetic compounds has been a great tool for the discovery of new antitumor drugs as well as multidrug reversing agents. Due to a rapid and synchronic cell cycle, sea urchin embryonic development has been extensively used as a model to identify compounds with antimitotic activity. Objetivos The aim of the present study was to investigate the antimitotic activity and the reversal of vinblastine resistance by four 2-aminothiophene derivatives (ATD) - SB4, SB44, SB52 and SB200 - on E. Lucunter sea urchin embryos. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana

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Métodos Animals were collected at João Pessoa coast (Paraíba/Brazil – ICMBio authorization code: 32105-1) and gametes were obtained by KCl intracoelomic injection. Following the fertilization, embryos were treated with ATD at several concentrations (3.12 to 100 microM). The early embryonic development was monitored under optical microscopy. To investigate ATD reversing effect on vinblastine resistance, embryos were cultured in the presence or absence of each ATD (100 microM) and vinblastine (100 or 400 nM). The calcein-AM assay was used to investigate the activity of ATD on ABC protein. The calcein intracellular accumulation was determined under fluorescence microscopy and the measurement of fluorescence was quantified by the software Image J. Resultados Early embryogenesis was not inhibited by any ATD compounds. The lower vinblastine concentration (100 nM) did not inhibit the embryonic development. However, 400 nM vinblastine blocked the embryonic development at 47.55 ± 8.93% (first cleavage) and 48.52 ± 7.03% (morula stage) when compared to the control group. The association of SB4, SB44, and SB200 compound with 100 nM vinblastine did not inhibit the progression to first cleavage and morula stage. These ATD compounds did not increase the inhibitory effect of 400 nM vinblastine on embryonic development. However, there was an inhibition of 28.62 ± 9.14% on the progression to the first cleavage when SB52 was associated with vinblastine (100 nM), and 65.88 ± 6.54% inhibition on the progression to the morula stage when compared to the control group. The association of SB52 with 400 nM vinblastine also increased the antimitotic effect of the vinca alkaloid: 62.78 ± 9.70% inhibition on the progression to the first cleavage and 99.75 ± 0.16% inhibition on the progression to the morula stage. The calcein-AM fluorescence assay showed that ATD compounds are not ABC blockers since no increase in calcein fluorescence was observed when embryos where incubated in the presence of ATD compounds (100 microM). Conclusão Our data show that SB52 is a potential drug for antitumor therapy when associated with vinblastine. Additional studies must be conducted to investigate the synergistic effect between SB52 and vinblastine.

Palavras-chaves: 2-aminothiophene derivatives, antimitotic, cell division, sea urchin, vinblastine

Resumo: 19.007

Envolvimento do estresse e danos oxidativos na resistência à cisplatina in vitro

Autores 1Xavier, J.

1, Kennedy-Feitosa, E.

2, PÔRTO, L. C. M. S.

1, VALENÇA, S. D. S.

1 Instituto de Ciências

Biomédicas - UFRJ, 2 Laboratório de Histocompatibilidade e Criopreservação - UERJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq e LABIO-RedOx

Resumo Introdução As células A549 constituem uma linhagem derivada de adenocarcinoma pulmonar caracterizada como pneumócitos do tipo II. Essas células possuem resistência intrínseca à cisplatina devido à mutação do gene KRAS. A cisplatina é um dos agentes quimioterápicos mais usados no tratamento do câncer de pulmão. O mecanismo citotóxico da cisplatina é devido à ligação ao DNA impedindo a replicação e tradução e levando a apoptose. O uso da cisplatina é limitado devido ao

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desenvolvimento de resistência por vários mecanismos, dentre eles a sua detoxificação que é dependente de glutationa. Objetivos Nosso objetivo foi identificar o mecanismo de resistência da cisplatina através de diferentes doses sobre os parâmetros de estresse e dano oxidativos in vitro. Código de Experimentação Animal DFBCICB064 Código de Experimentação Humana Métodos Células A549 (1 x 105/poço - quintuplicatas) foram incubadas por 24 h com 10, 25, 50 ou 100 µg/mL de cisplatina para avaliação da viabilidade celular (XTT), quantificação das espécies reativas de oxigênio (ROS), dosagem das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX), quantificação da peroxidação lipídica (MDA), relação glutationa reduzida/glutationa oxidada (GSH/GSSG), dosagem de lactato desidrogenase e análises morfológicas. Os dados (média ± erro padrão da média) foram analisados por one-way ANOVA seguido pelo pós-teste de Tukey (alfa de 5%). Resultados A cisplatina em nenhuma dose foi citotóxica. As análises morfológicas confirmaram total viabilidade das células em comparação ao grupo controle. O ROS total foi reduzido no grupo 25 (0.98±0.08 – p < 0.01), 50 (0.85±0.05 – p < 0.001) e 100 (0.90±0.06 – p < 0.001) em comparação ao grupo controle (1.72±0.22). Não observamos diferença em nenhuma dose nas enzimas antioxidantes CAT e GPX em comparação ao grupo controle. O MDA esteve aumentando (p < 0.05) no grupo 100 (1.75±0.12) em comparação ao grupo controle (1.40±0.04). A razão GSH/GSSG esteve reduzida (p < 0.05) no grupo 100 (20.80±1.41) em comparação ao grupo controle (31.73±2.51). Finalmente, os níveis de LDH apresentaram pequena variação entre os grupos tratados com cisplatina, mas sem diferença estatística do grupo controle. Conclusão Os resultados sugerem que não há desequilíbrio redox e aumento de ROS nos grupos tratados com cisplatina. Além disso, as células permaneceram viáveis mesmo com doses altas de cisplatina. As alterações de GSH/GSSG e MDA claramente indicam um início de estresse e dano oxidativo dependentes de glutationa, mas sem sinais de apoptose. Estudos adicionais de tempo-resposta e tiol-resposta serão necessários para esclarecer os mecanismos de resistência nesse modelo.

Palavras-chaves: A549, Câncer, Pulmão, Quimioterapia, Resistência

Resumo: 19.008

MDA-MB-231 stem cell sub-population upregulates KRAB domain-containing zinc-finger gene family members to hold undifferentiated ground state

Autores 1RIBEIRO DE NORONHA, S. M.

2,1, BAPTISTA, C. F.

1, BERNARDO, W.

1, SILVA, I. D. C. G. D.

1, CORRÊA-NORONHA, S. A. A.

1 Ginecologia - UNIFESP,

2 Ginecologia - UNIRIO

Apoio Financeiro: FAPESP

Resumo Introdução Breast cancer cell lines frequently contain a sub-population of stem cells (SC). MDA-MB-231 is a model of basal-like breast cancer triple negative (TN) lineage widespread used in laboratories across the world. It contains a stem cell subpopulation, however little is known about the molecular mechanisms underlying undifferentiated ground state regulation in this type of cell. Aberrations in epigenetic processes such as histone (de)methylation may cause cancer. The largest family of zinc-finger transcription factors is composed of the Krüpell-associated box (KRAB) domain containing proteins. They do not have intrinsic enzymatic activity, instead, this transcription factor family recruits chromatin remodelers and histone-modifying enzymes to regulate gene transcription, generally acting as repressor proteins. Underlying molecular mechanisms for aggressiveness of basal-like/TN breast cancer stem cell remains to be elucidated. Objetivos To investigate the molecular basis of MDA-MB-231 sub-populations (progenitor and differentiated cells), in order to obtain and compare the genome expression profile of stem cell and of differentiated subpopulations and identify gene networks regulating distinct differentiation states. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Cells were cultured in T75 flasks, suspended in Aldefluor assay buffer and incubated for 30 minutes for staining. Heterogeneity of aldehyde dehydrogenase expression in MDA-MB-231 sub-populations was revealed by Aldefluor flow cytometry-based assay. Separated cell sub-populations were harvested, had their RNA extracted (TRIzol), purified (silica columns plus DNase), measured (Nanodrop) and analyzed (Bioanalyzer). RNA samples were submitted to Agilent whole genome (8X60K) microarray experiments (one-color), according to manufacturer’s instructions. cDNA samples from each experimental group (Aldefluor-positive cells, Aldefluor-negative cells and overall population - control) were loaded into a genome array. Experiments were performed in triplicates. The analysis of differential expression profiles were performed by GX11.5 GeneSpring software. Resultados Fluorescence activated cell sorting (FACS) assay detected 4% of the overall MDA-MB-231 cell population as Aldefluor positive and 50% as non-Aldefluor positive. Microarray results analyzed with GeneSpring software demonstrate that among 337 genes upregulated (fold change > 2.0, p Conclusão Our results show that the upregulation of the Krüpell family of zinc finger proteins might be part of the genome signature that distincts MDA-MB-231 stem cell sub-population from its progeny. It is known that HDACs have an important role in mammary tumor cell growth control. KRAB-containing zinc-finger proteins are involved in transcriptional regulation by recruiting histone modifiers and chromatin remodelers like, DNMT3a, HDAC5, JARID2 and Activation Protein 1 (AP1), in order to repress gene transcription. This being the case, zinc-finger proteins are linked to epigenetic processes and can be selectively targeted to regulate gene expression and determine cell fate.

Palavras-chaves: stem cell, breast neoplasms, zinc-finger proteins, chromatin remodelers, MDA-MB-231

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Resumo: 19.009

REGULATION OF CLASSICAL ESTROGEN RECEPTORS BY DIFFERENT LIGANDS IN PC-3 PROSTATE CANCER CELLS

Autores 1PISOLATO, R.

1, LUCAS, T. F. G.

1, LAZARI, M. D. F. M.

1, PORTO, C. S.

1 Farmacologia - EPM-

UNIFESP

Apoio Financeiro: CNPq, Fapesp

Resumo Introdução Androgen, estrogen and stromal-epithelial interactions are involved in the development of prostate cancer (Mol. Cell Endocrinol. 288:30, 2008; Steroids 73:233, 2008). Although androgen deprivation is initially effective, it may lead to an androgen-independent prostate cancer (also known as castration resistant prostate cancer), which presents a poor prognosis and no effective therapy. The estrogen, acting through its receptors, may play an important role in this progress. We have previously shown that the classical estrogen receptors ESR1 and ESR2 are present in the extranuclear region of the androgen-independent prostate cancer cell line PC-3, where they may mediate rapid signaling. As the receptor is the limiting factor that dictates the magnitude of estrogen action, determining the regulation of ERs by their endogenous ligand (17β-estradiol) and the selective agonists of ESR1 (PPT) and ESR2 (DPN) is crucial to understand the estrogen responses in the prostate cancer. Objetivos This study was performed to evaluate the regulation of the classical receptors by different ligands. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos : Research ethics committee: 1444/10. PC-3 cells were grown in RPMI 1640 medium without phenol red (GIBCO), supplemented with 10% of fetal bovine serum, HEPES (5.95 mg/ml) and gentamicin (0.02 mg/ml), at 37ºC, in a humidified atmosphere with 5% CO2, for 48 hours. After that, the medium was replaced by another without serum and the cells were grown for 24 hours. The cells were then incubated in the absence (control) and presence of 17β-estradiol (0.1 nM and 1 µM), ESR1 agonist PPT (10 nM) and ESR2 agonist DPN (10 nM) for 24 h. Immunofluorescence assay was performed as previously described (Biol. Reprod. 78:101, 2008), using rabbit polyclonal antibody anti-ESR1 (MC-20, Santa Cruz) and goat polyclonal antibody anti-ESR2 (L-20, Santa Cruz). Resultados 17β-estradiol (1 µM) downregulated, whereas the ESR2 agonist DPN, at normally used concentrations, increased the

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expression of ESR1. 17β-estradiol (0.1 nM) and PPT did not have any effects on ESR1 expression. In addition, none of the ligands affected the ESR2 expression. Conclusão The results show that expression of ESR1 in PC-3 cells is susceptible to regulation by the endogenous ligand (17β-estradiol) or the selective agonist of the ESR2 receptor, suggesting that there is a crosstalk between the classical estrogen receptors to regulate ESR1 expression. This regulation of ESR1 by ESR2 may help us understand the variable actions of the classical estrogen receptors in their target cells.

Palavras-chaves: 17beta-estradiol, DPN, ESR1, ESR2, prostate cancer

Resumo: 19.010

Estresse oxidativo sistêmico e tecidual em um modelo experimental de melanoma murino metastático

Autores 1MELO, G. P.

1, BERNARDES, S. S.

1, SOUZA-NETO, F. P.

1, LUIZ, R. C.

1, CECCHINI, R.

1,

CECCHINI, A. L. 1 Ciências Patológicas - UEL

Apoio Financeiro: Fundação Araucária

Resumo Introdução O melanoma é o mais grave das neoplasias malignas de pele, possuindo altas taxas de mortalidade devida sua característica altamente invasiva e agressiva. Tanto in vitro quanto in vivo, suas células apresentam um desequilíbrio redox e aumento da expressão de enzimas antioxidantes, o que poderia promover estresse oxidativo (EO) nos tecidos vizinhos ao mesmo tempo em que apresentam alta capacidade antioxidante, protegendo-se dos danos pelos radicais livres gerados por elas mesmas. A linhagem F10 de melanoma murino tipo B16 é extremamente agressiva e amplamente utilizada em modelos experimentais de melanoma metastático. Objetivos Avaliar a participação sistêmica e pulmonar do EO em um modelo experimental de melanoma metastático pulmonar em camundongos C57BL6 implantados com células B16F10. Código de Experimentação Animal 14636.2011 Código de Experimentação Humana Métodos As células B16F10 foram mantidas em meio de cultura DMEN suplementado com soro fetal bovino a 5% e mantidas a 37ºC

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em estufa de CO2 5%. Foram inoculadas 5x105 células viáveis em 50 &muL de DMEN sem soro em camundongos C57BL6 adultos fêmeas, pesando entre 15 – 30 g (N=10) via endovenosa pelo plexo oftálmico. Nos animais controle, foram inoculados apenas 50&muL de DMEN sem soro (N=12). Após 14 dias, os animais foram anestesiados em câmara de éter, colhido o sangue heparinizado, por punção cardíaca e mortos por deslocamento cervical. Foi coletado o pulmão e armazenado a -80ºC assim como o plasma e as hemácias. Foram quantificados glutationa total (GT), oxidada (GSSG) e reduzida (GSH), eritrocitária e pulmonar. Os níveis de EO foram avaliados pela técnica de quimiluminescência induzida por t-butil hidroperóxido (QL) no plasma e homogenato de pulmão. Analise estatistica: teste t não pareado para analise do EO, e teste t pareado para análise do peso corporal. Foi adotado p Resultados Metástases pulmonares de melanoma puderam ser observadas após 14 dias de inoculação. Os animais experimentais tiveram uma significativa perda de peso quando comparados aos controles (Controle: 21,58±1,311g x 21,96± 0,899g; Melanoma: 23,80±0,7386g x 17,25±0,7081g, p <0,05). Conclusão A metástase pulmonar de melanoma promove uma acentuada perda de peso nos animais, diminuição da defesa antioxidante promovida pelo sistema glutationa eritrocitário, e aumento da defesa pulmonar contra a lipoperoxidação. No pulmão de animais com metástase, a diminuição dos níveis de estresse oxidativo pulmonar podem ter ocorrido devido um aumento da mobilização de substâncias antioxidantes para o tecido lesionado, ou ainda, pela capacidade antioxidante exercida pela melanina, em grande producao pelos melanocitos alterados.

Palavras-chaves: Camundongo C57BL6, Melanoma, Metástase Pulmonar

Resumo: 19.011

New triazole derivatives from naphthoquinone induce apoptosis in human leukemia cell lines.

Autores

1COULIDIATI, T. H.

1, DANTAS, B. B.

1, FAHEINA-MARTINS, G. V.

1, GONÇALVES, J. C.

2,

OLIVEIRA, R. N. 2, CAMARA, C. D. A.

1, ARAUJO, D. A. M. D.

1 Programa de pós-graduação em

produtos naturais e sintéticos bioativos - UFPB, 2 Departamento de Quimica - UFRPE

Apoio Financeiro: TWAS, CNPq and CAPES

Resumo Introdução The literature highlight triazoles as an important class of heterocycles, witch display an ample spectrum of biological activities and are widely employed as pharmaceuticals. Objetivos In this study, new naphthoquinones substituted with azide or triazole groups were evaluated for their cytotoxic activity in vitro against the HL-60 and K562 leukemic cell lines. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos The effect of compounds on these cell lines were performed by cytometry using some tests, such as, cell viability, mitochondrial membrane depolarization and apoptosis, which were investigated using propidium iodide assay, tetramethylrhodamine and annexin/propidium iodide double staining measurements, respectively. Resultados The results showed that triazole compounds reduced significantly the viability of HL-60 and K562 with IC50 comprise from 2.5 to 5 µM for HL-60 cells and from 5 to 20 µM for K562 cells. The HL-60 cell line treated with compounds undergoes apoptosis through mitochondrial membrane depolarization while in the K562 cell line showed both apoptosis and necrosis overcome. Conclusão We conclude that these triazoles caused apoptosis in all cell lines tested and they are promising for clinical investigation of acute myeloid leukemia.

Palavras-chaves: Apoptosis, Cytometry, HL-60, K562, Triazole

Resumo: 19.012

p90 Ribosomal S6 Kinases (RSKs) ARE DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN GLIOBLASTOMA-DERIVED CELL LINES AND CONTROL CELLULAR PROLIFERATION

Autores 1ROFFÉ, M.

1, LUPINACCI, F. C. S.

1, HAJJ, G. N. M.

1, MARTINS, V. R.

1 Centro Internacional de

Pesquisa - ACCCC

Apoio Financeiro: Supported by FAPESP and National Institute of Translational Oncogenomics

(INCiTO) and National Institute of Translational Neurosciences

Resumo Introdução The RAS/ERK signaling pathway is essential for the control of normal cell proliferation, survival, growth and differentiation. Dysregulation of this pathway is involved in the pathology of a large number of human cancers. The Extracellular signal-Regulated Kinase-1 and 2 (ERK1/2) play a pivotal role in the RAS/ERK signaling pathway by phosphorylating, and thus regulating, several downstream targets. The 90 kDa ribosomal S6 kinases (RSKs) are a group of ERK1/2 direct substrates. A unique characteristic of this family is the presence of two distinct functional kinase domains within its molecule. The C-terminal domain is regulatory and, when activated, autophosphorylates residues necessary for the activation of the N-terminal kinase domain, that is the responsible for the phosphorylation of the RSK targets. RSKs phosphorylate numerous cytosolic and nuclear proteins, and they have been implicated in the regulation of several processes, including cell survival,

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proliferation, cell growth and motility. Four RSK isoforms (RSK1-4) are expressed in humans and they share a high degree of sequence homology. Increasing evidence links RSK1 and RSK2 to several aspects of human cancer pathology. Despite the structural and functional similarity among RSK1 and RSK2, some types of tumors are only affected by RSK1 and not by RSK2, and vice versa. It has been shown, for example, that RSK2 is overexpressed and activated in highly invasive head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines and promotes metastasis, whereas RSK1 does not. RSK2 expression also correlated with metastatic progression in patients with HNSCC. In lung adenocarcinoma patients, RSK1 expression decreases during metastasis. Accordingly, the silencing of RSK1, but not of RSK2, increases cell motility and invasiveness of A549 cells (lung adenocarcinoma epithelial cell line). Objetivos The aim of this work was to explore the relationship between RSKs and glioblastomas (GBMs), the most common and aggressive primary brain tumor in humans. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos together with results. Resultados Using immunoprecipitation followed by silver staining of SDS-PAGE we determined that the ratio of RSK1 to RSK2 is of about 3.1 in the GBM-derived cell line LN-18. We then studied by immunoblotting the expression of RSK1 and RSK2 in other GBM cells and found that in PTEN-positive cells (LN-18 and LN-229) the RSK1/RSK2 ratio is > 1 and in PTEN-negative cells (A172, U-87MG and U-118MG) is Conclusão These results point to a differential regulation of the expression of RSK1 and 2 in GBM cell lines that might result in distinct pathological phenotypes. The effect of the inhibition of RSK on proliferation of GBMs underscores the importance of the RAS/ERK signaling pathway for this type of cancer cells.

Palavras-chaves: RSK, Glioblastoma, Proliferation, PTEN, Cancer

Resumo: 19.013

EFEITO WARBURG x TRATAMENTO COM CLOTRIMAZOL: AVALIAÇÃO DO METABOLISMO ENERGÉTICO EM LINHAGENS CELULARES DE MAMA HUMANA

Autores 1VILAS BOAS, Í. T.

1, FURTADO, C.

1, ZANCAN, P.

1 FÁRMACOS - UFRJ

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ

Resumo Introdução Dentre os marcos fisiológicos que caracterizam o câncer,o metabolismo alterado de glicose é o mais frequente.Nesta patologia,o metabolismo energético é caracterizado por uma capacidade glicolítica aumentada mesmo na presença de altas concentrações de O2.Tal fato é conhecido como glicólise aeróbica ou ‘efeito Warburg’e é observado em 90% dos tumores humanos.Nosso grupo tem demonstrado que os imidazóis apresentam um potencial antineoplásico,uma vez que são capazes de diminuir a viabilidade de células tumorais através da inibição de algumas enzimas glicolíticas Objetivos Avaliar as diferenças promovidas pela hipóxia e/ou pelo tratamento com clotrimazol sobre o metabolismo energético em diferentes linhagens celulares de mama humana Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Linhagens Celulares:as linhagens utilizadas neste estudo são as de câncer de mama MCF-7 e MDA-MB-231 e a não-tumorigênica epitelial MCF-10A cultivado com Zancan et al.,2010.Indução da hipóxia:As linhagens celulares citadas foram incubadas numa câmara de hipóxia (Hypoxia Incubator Chamber,STEMCELL Technologies)durante diferentes condições de hipóxia:crônica(18h),prolongada(3-5h)e aguda(2-3h)Testes de viabilidade celular:A viabilidade das células foi avaliada pelo método de coloração(tripan-Blue)ou por avaliação da LDH extracelular(Zancan et al., 2010)Dosagem da atividade das enzimas:A atividade das enzimas foi medida pelo método acoplado,em que a oxidação/redução de NADH/NAD+ é acompanhada pela medida da absorvância em 340 nm em um leitor de placas.Dosagem do conteúdo de ATP intracelular:O conteúdo de ATP celular foi monitorado através do sistema baseado na luciferase de Photinus pyralis (PerkinElmer ATPlite)utilizando o espectrofotômetro Victor 3(PerkinElmer, EUA) e seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante e de acordo com Karovic et al. (2007).Teste de atividade mitocondrial:A atividade mitocondrial foi determinada pelo método de Mosmann(1983).A absorvância do corante foi medida no comprimento de onda de 570 nm com a subtração do background em 650nm, utilizando-se o Espectrofotômetro Victor 3.Análise estatística dos resultados: Todos os resultados serão tratados a partir de testes específicos para cada caso,escolhendo testes de Student e/ou ANOVA.A comparação de mais métodos foram feitas através de testes não paramétricos e de correlação de Pearson. Todos os testes foram realizados através do aplicativo SigmaStat 3.1(Systat Co. CA, USA) de acordo com o descrito por Zancan e Sola-Penna (2005a) Resultados Nossos ensaios indicam que quando comparamos a atividade das diferentes enzimas da via glicolíticas e da via das pentoses nas duas condições testadas não existem diferenças entre as condições nos tempos descritos para hipóxia aguda e crônica. Entretanto,quando avaliamos os efeitos após 18h de incubação em condição de hipóxia observamos que há uma redução de aproximadamente 50%na atividade hexocinásica nas linhagens MCF10A e MDA-mb-231 e de aproximadamente 85% na linhagem MCF-7.Porém,as atividades das enzimas PFK-1 e PK apresentam-se estimuladas nesta condição em todas as linhagens.O fármaco CTZ foi também capaz de promover a inibição de maneira dose e tempo dependente de todas as enzimas testadas Conclusão Podemos, então, sugerir que há diferenças entre as linhagens estudas quando comparamos as condições de hipóxia e normóxia.Estas diferenças ampliam as possibilidades de interferir no aumento da glicólise característica de tumores e ratificar o uso de CTZ como potencial quimioterápico para seu tratamento

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Palavras-chaves: hipóxia, warburg, clotrimazol, glicólise, metabolismo

Resumo: 19.014

Cancer-associated stem cells interactions in the presence of kinin-B1 receptor expression

Autores 1TURNŠEK, T. L.

1, MOTALN, H.

2, ULRICH, H.

1 Department of Genetic Toxicology and Cancer

Biology - NIB, 2 Departamento de Bioquímica - USP

Apoio Financeiro:

Resumo Introdução The application of human mesenchymal stem cells (MSC) in cell based therapies is becoming a real hope for treatment of many so far incurable diseases. This application is of particular interest and new hope for fatal cancers, such as glioblastoma multiformae (GBM), the most common and malignant form of the brain tumours. Similar as in other cancers, the migration of MSC from blood or /and bone marrow to the tumor site has been demonstrated in vivo. However, the results of GBM interactions with MSC is poorly understood so far. Objetivos We aimed first to investigate the indirect interactions of MSC obtained from bone marrow and cultivated GBM cells under in vitro conditions, which would mimic the introduction of MSC to the tumours and second the direct interactions in co-cultures of both types of cells. Código de Experimentação Animal No animals were used for these experiments Código de Experimentação Humana The experiments were done with established cells; Métodos Four different MSC clones (MSC 1-4) and three different GBM cell lines (U87, U373 and U251 lines) were used to study their mutual paracrine interactions in co-cultures compared to their monocultures, which were grown under the same experimental conditions. The effects on cell growth, proliferation and invasion in matrigel were quantified. To study the cellular cross- talk, the cytokines were measured by cytokine arrays and the gene expression in each of the interacting cell type was determined by cDNA microarrays. Further, bioinformatics tools were used to investigate whether revealed proteins and genes are significantly involved in the cellular crosstalk. Resultados We demonstrated that MSC are responsible for the impairment of GBM cell invasion and proliferation, possibly via induction of their senescence (Motaln et al. Cell Transplant 2012, 21: 7, 1529-1545). When in direct cell - cell contact, e.g.the functional synctitium (Schichor et al. 2012 Exp. Neurol. 234: 208-219) slightly decreased GBM proliferation was associated

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with increased cell invasion. The method of deconvolution was used for microarray data analyses of mixed cell samples (in vitro direct co-cultures) that allowed for identification of differences in gene expression in the direct MSC/U87-MG co-culture relative to MSC and U87-MG cells’ gene expression levels in indirect co-cultures and monocultures. Migration associated BDKRB1 (kinin-B1 receptor) candidate gene emerged as one of the most differentially expressed in direct cell contact. BDKRB1 is a part of kallikrein-kinin system where it exerts its effect after binding des-Arg9- or Lys-des-bradykinin. BDKRB1 expression increased in U87-MG cells upon direct co-culturing with MSC, whereas oppositely, in MSCs BDKRB1 expression was significantly decreased, compared to MSC grown alone or in indirect co-cultures. Conclusão We confirmed the hypothesis that the BDKRB1 participates in the regulation of migration/invasion of GBM cells, which could be also the result of increase in the secretion of proteolytic enzymes - matrix metalloproteases (MMP) and /or calpains. Taken together, significant alterations of the GBM phenotype in the presence of MSC encourages the studies on the use of naive or modified MSC for GBM treatment. Further investigations of the role of the BDKRB1 in diminishing glioma-infiltrative growth pattern could contribute to improved glioma treatment.

Palavras-chaves: Glioblastoma cells , mesenchymal stem cells, kinin-B1 receptors

Resumo: 19.015

Atividade citotóxica de composto organoselenado em linhagem de leucemia humana HL-60

Autores 1SOARES, C. L. R.

1, FAHEINA-MARTINS, G. V.

1, DANTAS, B. B.

2, SOUZA, H. D. D. S.

2,

ATHAYDE-FILHO, P. F. D. 1, ARAÚJO, D. A. M.

1 BIOTECNOLOGIA - UFPB,

2 Química - UFPB

Apoio Financeiro: CNPq

Resumo Introdução O câncer atualmente é a segunda maior causa de morte no mundo, ficando atrás apenas das doenças cardiovasculares. Em 2012 no Brasil, conforme o Instituto Nacional de Câncer (INCA), mais de 500.000 novos casos foram registrados. As leucemias, que são cânceres originados a partir de leucócitos do sangue, possuem uma incidência de cinco novos casos a cada 100 mil homens e quatro a cada 100 mil mulheres. Essa patologia é mais comum em crianças e pode ser divida em linfóide ou mielóide, dependendo da origem e ainda em aguda ou crônica. HL-60 é uma linhagem de leucemia mielóide humana aguda promielocítica, e esta linhagem vem sendo amplamente utilizada como modelo em ensaios de citotoxidade basal de compostos bioativos. A partir de testes de citotoxicidade é possível encontrar moléculas com grande potencial anticâncer, que posteriormente podem ser melhores avaliadas em outros modelos celulares e em sistemas in vivo. Compostos selenados, que podem ser orgânicos ou inorgânicos, são uma classe de moléculas que têm apresentado várias atividades biológicas, tais como, atividade antibacteriana, antiviral, antifúngica e anticâncer. Dentre estes, os compostos orgânicos selenados têm sido mais bioativos do que os compostos inorgânicos. Atualmente estas moléculas vêm sendo indicadas como inibidores de neoplasias de pulmão, cólon e mama. Objetivos Avaliar o potencial citotóxico do composto orgânico selenado, HSe-01, usando a técnica de MTT nas células HL-60. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos A avaliação da citotoxicidade de Hse-01 foi feita usando a técnica de redução do MTT que mede o metabolismo celular por meio da atividade de desidrogenases citosólicas. As células foram incubadas a 5 x 104 cél/poço em placas de 96 poços usando meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino. Em seguida foram adicionadas várias concentrações da substância (1-160 µM). Após 24 horas foi retirado o sobrenadante e adicionado a solução de MTT (5 mg/ml) que foi incubado por 4 horas, em seguida foi adicionado SDS 10% em HCL 0,01N para solubilizar o formazan. Após 16 horas a absorbância da placa foi medida a 570 nm. Resultados Foi observado que Hse-01 foi citotóxico com CI50 de 2,5 µM (1,5-4,1). Conclusão Nossos dados indicam que o composto Hse-01 foi altamente citotóxico, possuindo um forte potencial anticâncer.

Palavras-chaves: Citotoxicidade, composto organoselenado, leucemia, HL-60

Resumo: 19.016

SECOND Na+-ATPase IN OVARIAN CANCER CELLS: POSSIBLE ROLE IN PHOSPHATE UPTAKE.

Autores

1SIRTOLI, G. M.

1, SALGADO-BENVINDO, C.

1, SILVA-AGUIAR, R. P.

1, ROZADO, D. G.

2,

RANGEL, L. B. A. 1,3

, CARUSO-NEVES, C. 1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ,

2

Departamento de Farmacologia - UFES, 3 INCT-INBEB/CNPq - MCT

Apoio Financeiro: FAPERJ, CAPES and CNPq

Resumo Introdução Epithelial ovarian cancer (EOC) is the gynecologic malignancy with the higher mortality rate among women because the inefficiency of early diagnosis, prognosis evaluation, and currently therapeutic strategies. Among the possible EOC biomarkers, there is the sodium-dependent phosphate co-transporter Type IIb (NaPi-IIb), codified by the gene SLC34A2, which has been already associated to cancer development and/or progression. As a secondary active transporter, NaPi-IIb promotes the influx of sodium and phosphate ions coupled to the electrochemical gradient generated and maintained by (Na++K+)ATPase. Recently, it was cloned a second sodium pump insensitive to ouabain and K+ able to create a sodium gradient.

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Objetivos In this study we aimed to determine the presence of this second Na+-pump in EOC cells and show its role in phosphate uptake. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Here were used three EOC cell lines, A2780, ACRP and ES-2, which differ in their profile of responsiveness to chemotherapy. Phosphate uptake was measured in the presence or absence of 0.1mM Na2HPO4/NaH2PO4.H2O, both in the presence of 1mCi/mM 32γPi, expressed as nmol Pi x min-1 x mg-1 protein. ATPase activity measurement followed the method described by Grubmeyer & Penefsky, and ATP hydrolysis was assayed in the presence or absence of furosemide, expressed as nmol Pi x min-1 x mg-1 protein. Cell viability was measured by LDH activity assay. Resultados The hydrolysis of ATP was significantly inhibited by furosemide in a dose dependent manner in all of three cell lines used, with a maximum inhibition of 35% with 2 mM furosemide. Treatment with increasing concentrations of furosemide for 2 hours also inhibited the Na+-dependent Pi uptake in a dose dependent manner in all cells tested with maximal effect observed at 2 mM concentration (48% of inhibition related to control in A2780, 40% in ACRP and 46% in ES-2 cells). The Na+-independent Pi uptake was equally inhibited by 0.1-2 mM furosemide in A2780 and ACRP cells, but it was not changed in ES-2 cells. Next we performed time-course experiments, showing that 2 mM furosemide already inhibited Pi uptake after 30 minutes in A2780 and ACRP cells (18% and 22%, respectively). However, in ES-2 cells we only observed inhibition on Pi uptake after 1 hour incubation (34% of inhibition related to control). Disruption of the Na+ gradient by incubation with monensin, led to a decrease on Na+-dependent Pi uptake already at low concentration in all cell lines used (approximately 50% of inhibition with 5 uM monensin). Na+-independent Pi uptake decreased only in A2780 and ACRP cells treated with monensin, while it was not changed in ES-2 cells even at high concentrations. The reduction in Pi uptake observed was not due to an increase in cell death, since LDH activity remains low throughout treatments. Conclusão This is the first evidence showing the presence of Na+-ATPase in EOC cells and its role in the regulation of phosphate uptake. Our results introduce a new perspective about the mechanisms involved in the progression of EOC.

Palavras-chaves: Na+-ATPase, ovarian cancer, phosphate uptake

Resumo: 19.017

AÇÃO FOTODINÂMICA DO ÁCIDO GRAXO ÔMEGA-3 α-LINOLÊNICO EM UMA LINHAGEM CELULAR DE MELANOMA EXPOSTA AO UVB

Autores 1GONZALEZ, J. R.

1, VASCONCELOS, R. O.

1, VOTTO, A. P. D. S.

1, TRINDADE, G. S.

1 Instituto

de Ciências Biológicas - FURG

Apoio Financeiro: FAPERGS

Resumo Introdução A família de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 (PUFAs n-3) tem sido demonstrada por promover diversas atividades biológicas importantes, em especial, como agente antitumoral. Sabe-se que há três principais PUFAs n-3, o ácido alfa-linolênico (ALA), e os ácidos eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA). PUFAs n-3 também têm atraído muito interesse como possíveis agentes protetores contra a carcinogênese da pele induzida pela radiação ultravioleta (UV), uma vez que tem se tornado claro que a exposição a este estressor é contínua. Por outro lado, a atividade resultante da interação entre PUFAs n-3 e radiação ultravioleta em células de câncer da pele ainda não foi relatada. Objetivos Visto a necessidade de um melhor entendimento do efeito resultante entre PUFAs n-3 e radiação UV em células tumorais, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito resultante da associação entre o PUFA n-3 alfa-linolênico (ALA) e a radiação UVB na linhagem celular de melanoma (B16F10). Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos A linhagem B16F10 foi mantida em meio DMEM, suplementado com bicarbonato de sódio (0,2 g/L), L-glutamina (0,3 g/L) e Hepes (3 g/L), com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico e antimicótico, em garrafas de cultura a 37ºC. Para os experimentos, as células (2x105 célula/mL) foram incubadas por 24h para aderência em placas de cultura a 37ºC. Primeiramente, foram testadas diferentes concentrações do PUFA n-3 ALA (7,5, 15, 30 e 60 µM) na linhagem B16F10. As células controle receberam o mesmo volume do veículo utilizado (etanol - 0,05%). Posteriormente, foram testados diferentes tempos de exposição à radiação UVB (30 s, 1 min., 5 min., 10 min. e 20 min.), correspondentes às doses de 0,005 J/cm2, 0,01 J/cm2, 0,05 J/cm2, 0,10 J/cm2, 0,20 J/cm2, respectivamente. A fim de verificar uma possível ação fotodinâmica entre estes agentes, foi testada a interação entre 30 µM do ALA e 0,005 J/cm2 de radiação UVB. A linhagem foi incubada a 37ºC e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio MTT imediatamente, 24, 48 e 72h após a exposição. Os dados foram apresentados como médias ± erro padrão, analisados utilizando ANOVA com pós-teste de Tukey. Os valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Resultados No experimento com o ALA, a linhagem apresentou inibição de proliferação com 60 µM já em 24 h (0,325 ± 0,014), em 48 h para as concentrações de 15 µM (0,734 ± 0,100), 30 µM (0,8 ± 0,047) e 60 µM (0,553 ± 0,037) e em 72 h para todas as concentrações testadas. No experimento de exposição ao UVB, a linhagem B16F10 apresentou morte celular na dose de 0,20 J/cm2 em 24 h (0,12 ± 0,011), em 48 h e 72 h foi observado o efeito de inibição de proliferação celular na dose de 0,01 J/cm2 (0,5 ± 0,044; 0,482 ± 0,034) e morte celular para as demais doses. Na interação entre o ALA e a radiação UVB, a linhagem apresentou inibição de proliferação celular em 24, 48 e 72 horas (0,471 ± 0,037; 0,572 ± 0,045; 0,64 ± 0,035), em relação às células controle. Conclusão Assim, este estudo sugere um efeito antitumoral do ácido graxo ômega-3 ALA, que pode ser potencializado quando associado com a radiação UVB.

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Palavras-chaves: Inibição de proliferação, Linhagem B16F10, Morte celular, Radiação ultravioleta