Aplicações Clínicas da Citometria de Fluxo

• Diagnóstico baseado nas células

• Prognóstico baseado nas células

• Monitoramento de terapias

• Analise de lesões e morte celular

Imunologia

Hematologia

Anatomia patológica

Biologia celular

Oncologia

Avaliação de populações celulares: normais/

reativas/ em regeneração/ malignas.

Classificar as neoplasias hematopoiéticas

Monitorar a eficácia do tratamento: Estudo da

doença residual mínima

Imunofenotipagem (IMF) - Etapas

Indicação clínica e Avaliação dos dados clínicos

Marcação das amostras: Seleção e combinação de

AcMo, Morfologia

Análise e interpretação de dados:

› Caracterização fenotípica das populações celulares:

normais e alteradas

› Identificação da população neoplásica

Laudo : diagnóstico ou descritivo

Conhecimento da diferenciação imunofenotipica

das células hematopoiéticas em medula óssea

normal, timo e outros tecidos, e sua freqüência:

› Permite a seleção adequada de painéis (AcMo)

› Reconhecimento de padrões anormais de diferenciação,

de proliferações, de células em regeneração, de padrões

reativos

“software”de analises para CF : melhora a

capacidade, eficiência e velocidade de analise

dos dados pois informam simultaneamente uma

serie de parâmetros numa única células.

Selecionar o painel adequado dos marcadores antigênicos

Definir as populações a analisadas em % e qualitativamente:

› Blastos

› maturação de neutrófilos, monócitos e com menor

freqüência: eritroblastos e megacariocitos

Definir as alterações fenotípicas a serem consideradas:

› alterações numéricas , aberrações fenotípicas nos blastos.

› intensidade de fluorescência

› expressão assíncrona de marcadores associados à

maturação

Loken et al, Leuk Res, 2007

› Descrever em % as populações celulares da amostra:

normais ou alteradas.

› Nas neoplasias hematopoiéticas correlacionar com a

classificação da OMS

› Comentar as limitações de interpretação

› Emitir o laudo.

Interpretação de dados

Tipo de amostra Indicação e historia clinica Dados morfológicos Combinações dos diferentes tubos de AcMo

baseada na expressão antigênica das células durante a hematopoiese em MO.

Objetivo: detectar e diferenciar as linhagens de células hematopoiéticas e seus estádios maturativos

Linfócitos B

Linfócitos T/NK

CD79a citoplasma, CD10, CD19, CD20, CD45,

Kappa, Lambda.

CD2, CD3citoplasma ou membrana, CD4,

CD5, CD7,CD8,CD56

CélulasMielomonocíticas

MPO,CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33,

CD117, CD34, CD7, CD56

CD19, CD38, CD56, CD117Células

Plasmáticas

Wood B., Cytometry, Part B. 2007

Combinação mínima de AcMo com sensibilidade para

demonstrar a presença ou ausência de neoplasia

hematopoiética.

Linfócitos B

Linfócitos T/NK

CD9, CD11c, CD15, CD22, cCD22, CD23, CD25, CD13, CD33,

CD34, CD38, CD43, CD58, CD79b, CD103, FMC7, Bcl-2,

cKappa, cLambda, TdT, Zap-70, cIgM/membrana

CD1a, cCD3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30,

CD34, CD45RA, CD45RO, CD57, ab-TCR, gd-TCR,

cTIA-1, TdT

CélulasMielomonocíticas

CD10, CD138, CD56, CD117, CélulasPlasmáticas

CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, CD61c,

CD64, CD71, CD123, CD163, CD235a, CD105.

Combinação de AcMo que permita realizar o diagnóstico,

classificação e auxilie no prognóstico

Wood B., Cytometry, Part B. 2007

serie de etapas com múltiplas mudanças e variações na

intensidade de expressão de produtos gênicos nas células

hematopoiéticas.

Cel.Tronco

Precursor Linfoide

Precursor Mielóide

Linfócitos-TLinfócitos-BCélulas-NKCD Plasmocitoides

Células EritróidesCélulas MegacariocíticasNeutrófilosMonócitosCD MonocíticasEosinófilosBasófilosMastócitos

Celulas % ± % dp Intervalo 2dp

CD34+(CPH) 1,1 ± 0,6 0,3 – 2,6

CD34+ ou CD117+ 2,2 ± 1,4 0,6 – 6.0

Eritroides 4,7 ± 2,1 2.0 – 9.0

Neutrófilos 67 ± 6,1 57 – 80

Células monocitárias 4,3 ± 1,4 2.0 – 6.0

Eosinofilos 2,5 ± 1.3 0,8 – 5.0

Basófilos 0,4 ± 0.4 <0.1 – 2.4

Mastocitos 0,02 ± 0.02 <0.03

Plasmocitos 0,2 ± 0.2 0.01 –0.5

Linfócitos B maturos 2,9 ± 1.5 1.6 – 6.3

Linfócitos B precursores 0,9 ± 0.8 0.1 – 3.9

Linfócitos T 9,2 ± 4.5 2.6 - 18.0

Células Natural Killer 2,8 ± 1.4 0.7 – 5.0

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Linhagem % Freqüência

Eritroide 15 5 -35

Megacariocitica <1

Neutrofilica 31 12 - 39

Eosinofilica <1

Basofilica <1 <1 - 3

Monocitica 5 3 -15

Mastocitica <1

Dendritica Pl 6 1 -15

Linfoide B 23 <1 - 45

Total 81

CD34+

HPC

B

SSC

CD34-APC

% CD34+ HPC: 1.1 + 0.6 (0.3-2.6)

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Informação Fenotípica

Identificação e enumeração das CP CD34+ da MO e seu

comprometimento às diferentes linhagens :

› Imaturas e comprometidas a linhagem neutrofilica e

linfoides B

› Outras CP: monociticas, basofilicas, dendriticas (pDC),

mastocíticas e eritróides.

Caracterização fenotípica dos diferentes compartimentos das

CP CD34+ ( MO normal x MO SMD) :

› Detecção de bloqueios maturativos em MO displásica

› Investigação de padrões alterados na expressão de

antígenos individuais.

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Monócitos

CP CD34+

Granulócitos

S.Eritróide

MO Normal

MO SMD: Fenótipos Alterados

CD45

CD45 CD45CD45

SSC

SSC

SSC

SSC

• CPH CD34+ Linfóide origina:

linfócitos T e B

• Maturação T- timo

• Maturação B - MO

• Células Plasma ticas - presentes

na MO,tecido linfático e

tecido conectivo

CPH Pluripotente

Ross 5th Ed Table 10.4

CPHLinfoide

Progenitor Linfoide T

Progenitor

Linfoide B

Celulas T

Celulas B

Celulas

Plasmaticas

Timo Medula Ossea

Progenitor

Linfoide B

Perez M., Cytometry, Part B. 2010

Maturação de Linfócitos B

MO

TecidosLinfoides

MO

Mucosa

Baco

SPSP

Maturação de linfócitos T

Linfócitos T Periféricos

CD34,HLA-DR

TdT

CD2 CD7

CD3c

TdT

CD2 CD7 CD5

CD3c

(CD10) TdT

CD3c (TCR-CD3)

CD1aCD2,CD7

CD5

CD4 CD8

(TdT)

(CD3c) TCR-CD3

CD2 CD7 CD5

CD4 ou

CD8

Pró-timócito

TimócitoPrecoce

TimócitoComum

TimócitoMaduro

CD4 TCR-CD3

CD2 CD7 CD5

CD8 TCR-CD3

CD2 CD7 CD5

Linfócitos T - Timo

Linfócitos B

Sangue periférico Normal

Piatosa B., Cytometry, Part B. 2010

Células B circulantes :

› Os diferentes fenótipos estão relacionados ao processo maturacional

› Correlação com o estado imune : alterações no desenvolvimento de

células B, auto-imunidades, e linfoproliferação, tais como a linfocitose B

monoclonal

Perez M., Cytometry, Part B. 2010

WHO, 4th Ed., Fig 8.02, 2008

CD38

CD34

CD38

CD34

CD34

CD34CD45

CD45

MO normal

Blastos na LLA-B

Fenotipos B – Normal x neoplásico

WHO, 4th Ed., Fig. 8.04, 2008

Blastos de LLA-T

Origem das células Linfocito B Linfocito T Relacao

Pele < 1 > 95 95

Timo < 1 > 95 95

Linfonodo 20 70 3.5

Baco 50 40 0.8

Tonsilas 50 40 0.8

Int Delgado

Lamina P. 30 70 2.3

Placas de Peyer 40 45 1.1

Westermann J.; J of Mol. Med., 1992

Cuidado! A freqüência dos linfócitos e influenciada por muitas

variáveis: Idade, sexo, stress, Infecções ...

Distribuição da população celular (n=15), analisada por

CF . Volume LCR: 1.3 ± 0.6 mL ( 0.3 – 2.4 mL)

Quijano S. et al., JCO 2009

Diferenciação Granulocítica – MO normal

Mieloblasto MielocitoPromielocito Meta-mielocitoBastao

Neutrofilo

CD34+CD117+HLA-DR+CD13+forteCD33+forte

HLA-DR-/+CD13+CD33+forteCD15+ CD11b-/+

CD13+ fracoCD33+CD15 +CD11b+

CD13+CD33+fCD15 +CD11b+ CD16-/+

CD13+forteCD33+fracoCD15CD11b+fo CD16+fo

De

nsi

da

de

an

tig

ên

ica

Maturação Neutrofílica

Maturação neutrófilos

Analise da expressão de CD13, CD11b, CD15, MPO

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Diferenciação Granulocítica – MO normalD

en

sid

ad

e a

ntig

ên

ica

Monoblasto Promonócito Monócito

CÉLULAS MONOCÍTICAS

MO NORMAL MO SMD: Fenótipos Alterados

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

Irem-2 Irem-2

De

nsi

da

de

an

tig

ên

ica

Estágio I Estágio II Estágio III Estágio IV

Eritrócitos

CD45

CD45

SSC

SSC

CD

64

CD

64

CD36

CD36

MO Normal

MO SMD: Fenótipos Alterados

Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

A IMF por CF :

› Método ágil e preciso.

Uma boa análise e interpretação exigem:

› Um conhecimento sólido da técnica e dos padrões

normais da expressão antigênica nas diferentes

populações.

É necessário a padronização e validação da técnica

para obter informações precisas.

Novos programas de análise, novos fluorocromos e

anticorpos monoclonais, abrem novas perspectivas

para esta tecnologia.

Obrigada!

Chng W. et al, Clin and Diag Lab Imm., 2004