Fundação Universidade Federal do Rio GrandeInstituto de Oceanografia

Disciplina de Poluição Marinha

Ítalo Braga de Castro

CROMATOGRAFIA(aula 1)

Definição:

É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura por interação entre uma fase estacionária e uma fase móvel.

Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado com sólido) que permanece dentro da coluna de separação.

Fase Móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através da coluna, carregando os solutos.

Histórico:M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]

(grego)

Princípio:

1-De acordo com o sistema cromatográfico

•Em Coluna

Cromatografia LíquidaCromatografia GasosaCromatografia Supercrítica

•Planar

Cromatografia em Camada Delgada (CDC)Cromatografia em Papel (CP)

Classificação:

2-De acordo com a Fase Móvel•Utilização de Gás

Cromatografia Gasosa (CG)Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

•Utilização de Líquido Cromatografia Líquida Clássica (CLC)Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

•Utilização de Gás Pressurizado Cromatografia Supercrítica (CSC)

Classificação:

3-De acordo com a Fase Estacionária•Líquida•Sólida•Quimicamente Ligadas

4-De acordo com o Modo de Separação•Por adsorção•Por partição•Por troca iônica

Classificação:

Mecanismos de separação:

Processos físicos -> Sorção“atrações polares”

S

CROMATOGRAFIA

Em colunaPlanar

L

L F L

CP CCD

CCD

Gás

L

S

F L

CGL

CGS

CGFL

Fluído supercrítico

F LL

CSS CSFL

Líquido

L

S

CLL

CLS CE

F L

CLFL CTI CB

Tipos de Cromatografia

Fase Móvel

Técnica

Fase Estacionária

Classificação:

- Cromatografia Planar Líquido-líquido

- Princípio: partição – relaciona a diferença de solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase móvel e fase estacionária;

- Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular

- Análise qualitativa: Rf (fator de retenção);

Rf = distância percorrida pela substância distância percorrida pela fase móvel

Cromatografia em Papel:

Método rápido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromogênicos Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Método simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (sílica, alumina, celite, amido) Métodos de detecção: físico-químicos Princípio: Adsorção (polaridade)

Cromatografia em camada delgada:

Pode ser também chamada de cromatografia líquida clássica.

FE – sílica e alumina;

FM – eluente;

PRINCÍPIO: adsorção

Cromatografia em coluna:

FASE MÓVEL

injeção separação eluição

Fase estacionária

DETECTOR

Cromatografia Gasosa:

Em CG a FEpode ser:

Sólida

Líquida

CromatografiaGás-Sólido (CGS)

CromatografiaGás-Líquido (CGL)

FE sólida com uma grande área superficial e a separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias neste sólido.

FE líquida pouco volátil recobrindo um suporte sólido ou as paredes da coluna capilar. A separação baseia-se em mecanismo de partição das substâncias entre a fase líquida e gasosa.

Cromatografia Gasosa:

Rapidez Alto poder de separação Separação de várias

classes de compostos em uma análise

Sensibilidade (ppm - ppb) Facilidade de registrar

dados Variedade de detetores

(especificidade)

Amostras voláteis

Compostos termicamente

estáveis

Técnicas auxiliares p/ identificação

Cromatografia Gasosa:

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEIS (“evaporáveis”)

(para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente

- nesse gás)

DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.

Cromatografia Gasosa (Aplicações):

Ambiental◦ Pesticidas, organoclorados e PCB’s◦ Hidrocarbonetos◦ Aminas e fenóis

Alimentos◦ Análise de ácidos graxos e triglicerídeos ◦ Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico

de alimentos◦ Análise de açúcares e aminoácidos

Farmacêutica Química Forense/Toxicologia

◦ Doping◦ Metabólitos de drogas

Química Industrial Petroquímica

Cromatografia Gasosa (Aplicações):

Cromatógrafo de Fase Gasosa:

1

2

3

4

6

5

Cromatografia Gasosa:

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento de Sinal.6 - Registro

Gás de Arraste:Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE

Requisitos:INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FE

incompatíveis com DCEH2O, O2

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

Requisitos:

CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

CU

ST

O

PUREZA

AB

CA = 99,995 % (4.5)

B = 99,999 % (5.0)

C = 99,9999 % (6.0)

Gás de Arraste:

Componentes necessários à linha de gás:

controladores de vazão / pressão de gás

dispositivos para purificação de gás (“traps”)

1

2

34

5

6

1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário5 - Regulador de Vazão 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Gás de Arraste:

1

2

3

41 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica

Injetor:

Injeção:

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua decomposição.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

COLUNAAmostrasGasosas

AmostrasLíquidas

empacotada = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L

capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

Injeção:

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microseringa de 10 L:

Microseringa:

EMPACOTADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m

Recheada com sólido pul-verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-ção de m) de FE líquida

ou sólida

Colunas:

Colunas (parâmetros):Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer

a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = f

Estrutura químicado analito

Temperatura da coluna

Temperaturada

coluna

Pressãode

vapor

Velocidadede

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)

TE

MP

ER

AT

UR

A D

A C

OL

UN

A

CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

Colunas (parâmetros):

Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.

Detectores:

UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída.

SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.

ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

Detectores:

~ 60 detectores já usados em CG

~ 15 equipam cromatógrafos comerciais

4 respondem pela maior parte das aplicações

DCT TCDDetector por

CondutividadeTérmica

DIC FIDDetector porIonização em

Chama

DCE ECDDetector porCaptura de

Eletrons

EM MSDetector Es-

pectrométrico de Massas

Detectores:DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)•É um Detector de 2 canais•mede a diferença, em Condutividade Térmica , entre o Gás de Arraste (Referência) e o do Gás de Arraste + Amostra (analítico)•possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando uma ponte.• As vazões dos 2 canais devem ser praticamente iguais •A presença de um componente, dissolvido no Gás de arraste, ao atingir o canal analítico muda a resistência deste filamento , provocando um desequilíbrio na ponte que gera um sinal proporcional a quantidade deste• A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento , concentração dos componentes e da diferença da Condutividade Térmica entre o Gás de arraste e o componente .

TCD:

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID) .

Detectores:

•baseia-se no princípio de que a concentração de um composto é diretamente proporcional a concentração das partículas ionizadas presentes no mesmo•O Gás de arraste e os componentes que eluem da Coluna atingem a chama . Esta ioniza (queima) as moléculas orgânicas presentes na corrente gasosa .•As partículas ionizadas, entre os eletrodos, gera uma corrente que é medida através de uma resistência

Hydrogen in

Air in

CollectorFlame jet

Column connection

FID:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD)

Detectores:

•É um Detector seletivo, específico para análises de Compostos Eletrofílicos (como os Halogênios nos Clorados) .• A cela do ECD é revestida internamente por uma lâmina do isótopo radioativo de “Ni-63”.•As “Partículas Beta” emitidas pelo isótopo ionizam o Carrier e os Íons e Elétrons resultantes migram para o anodo coletor por influencia de uma voltagem polarizada pulsante , aplicada entre a fonte e o coletor •A freqüência de pulsação é controlada para manter a corrente constante e é a geradora do sinal analítico .•É um Detector não destrutivo e altamente sensível, ideal para análise de pesticidas e agrotóxicos clorados

Collector

63Nickel foil

Make-up gas in

Column connection

ECD:

Detectores:DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

•A GC/MS é uma técnica analítica , também bastante conhecida, que visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de uma mistura .

• Os componentes da amostra, previam. separados no GC, são transferidas p/ o MS, através De uma linha de transferência.

• No MS ocorre a fragmentação da molécula e a detecção, possibilitando ao usuário o detalhamento da estrutura e o peso molecular do composto.

• Utilizando uma biblioteca específica podemos identificar positivamente o composto, baseado na abundância dos seus fragmentos (ions) .

Espectro de Massa (TBT):

• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA (CLC)

• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (CLAE)

Cromatografia Líquida:

Esquema para CLC:

Preparo da coluna

Aplica-se a amostra

Eluente

Detecção e quantificação (espectroscopia ou gravimetria)

Cromatografia Líquida:

Esquema para CLAE:

Coluna fechada

Injeção de amostra

Detector

Cromatogramas

Cromatografia Líquida:

Características da Fase Móvel usada em CLAE:

• Alto grau de pureza ou de fácil purificação;

• Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes;

• Não decompor ou dissolver a FE;

• Ter baixa viscosidade;

• Ser compatível ao detector utilizado;

• Ter polaridade adequada para permitir uma separação dos componentes da amostra.

Cromatografia Líquida de Alta Resolução:

Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE:

• aminoácidos;

• explosivos;

• lipídeos polares;

• metabólicos de animais e plantas;

• pigmentos de plantas;

• produtos farmacêuticos;

• proteínas;

• tintas.

Cromatografia Líquida de Alta Resolução:

FATOR CG CLAE

Requisitos para amostra

Amostra volátil ou derivatizável, termicamente estável na temperatura de operação do sistema cromatográfico.

Amostra solúvel na fase móvel.

Tipos de amostras Gases, líquidos ou sólidos MM: 2 a 1200

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. MM: 32 a 4.000.000

Quantidades mínimas detectáveis

10-12g 10-9

Tempo de análise Minutos até poucas horas

Minutos até poucas horas

Capacidade analítica Excelente, separação de amostras com até 200 componentes.

Excelente, separação de amostras com até 50 componentes.

Tempo de treinamento para um operador

Cerca de 3 meses. Pelo menos 6 meses.

Comparação entre CG e CLAE:

A migração de um analito pela coluna

provoca inevitavelmente o

alargamento da sua banda:

TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:Separação deficiente de analitos com retenções

próximas.

Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

Eficiência dos sistemas cromatográficos:

Fontes de Informações Qualitativas

RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação

DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas

Identificação individual das espécies contidas na amostra

Determinação da identidade da amostra propriamente dita

Aplicações Qualitativas

de CG

Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados

provenientes de pelo menos duas fontes

Análise Qualitativa:

t’R = fInterações analito / FE

Pressão de vapor do analitoCondições operacionais

Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante

AMOSTRA

PADRÃO

Comparação de cromatogramas da amostra e de

uma solução padrão do analito

suspeito

Análise Qualitativa: (tempos de retenção)

Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos eluídos:

Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)

Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)

Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção

Análise Qualitativa: (métodos de detecção)

Padrões cromatográficos:

Padrões

• Externos (Identificação)

•Internos (Quantificação)

•Surogates (Recuperação)

Controle de Qualidade dos dados:

• Programas de Intercalibração

•Materiais de referência

RT: 6.00 - 15.00

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tempo (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Abu

ndân

cia

rela

tiva

10.43

12.91

10.15

11.78

11.34

12.51

10.678.01 9.51 13.698.82 14.757.08 14.39

Cromatogramas:

Cromatogramas: