Post on 17-Apr-2015
Citometria de FluxoCitometria de Fluxo
Citometria: Citometria: Análise quantitativa de parâmetros celulares Análise quantitativa de parâmetros celulares
(células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc)(células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc)
Citometria de Fluxo:Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de Análise multiparamétrica de
partículas (uma a uma) em suspensão.partículas (uma a uma) em suspensão.
Princípio:Princípio: Fazer passar as partículas em suspensão, de uma Fazer passar as partículas em suspensão, de uma
forma alinhada, por um feixe de luzforma alinhada, por um feixe de luz
A interacção das partículas com o feixe gera sinais A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados que são captados por detectores apropriados
A informação produzida pode ser gerada:A informação produzida pode ser gerada:- Pela dispersão do feixe de luzPela dispersão do feixe de luz- Pela luz emitida por fluorocromos após excitação Pela luz emitida por fluorocromos após excitação
pelo feixe de luzpelo feixe de luz
O que é um Citómetro de O que é um Citómetro de Fluxo?Fluxo?
Requisitos Básicos num Requisitos Básicos num Citómetro de FluxoCitómetro de Fluxo
• Suspensão de partículasSuspensão de partículas• Fluxo laminarFluxo laminar• Fonte de iluminação Fonte de iluminação • Câmara de FluxoCâmara de Fluxo• Filtração da dispersão de luz e Filtração da dispersão de luz e
fluorescência fluorescência • Captação da dispersão de luz e Captação da dispersão de luz e
fluorescênciafluorescência• Conversão dos sinais em valores Conversão dos sinais em valores
analógico-digitaisanalógico-digitais• Aquisição, Processamento, Análise e Aquisição, Processamento, Análise e
Armazenamento no computadorArmazenamento no computador
FluídosFluídosFluídosFluídos
ÓpticaÓpticaÓpticaÓptica
ElectrónicaElectrónicaElectrónicaElectrónica
Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid)Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid), , passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm)passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm)
As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante líquido de envolvimentolíquido de envolvimento
A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são conseguidas através:conseguidas através:
- Pressão Diferencial- Pressão Diferencial - Velocidade de Fluxo- Velocidade de Fluxo
- Fluxo Contínuo- Fluxo Contínuo
FluídosFluídos
Agulha deinjecção
Dispersão laserDispersão laser
Líquido de envolvimento
Ponto de HidrofocagemPonto de Hidrofocagem
LaserLaser
Câmara de FluxoCâmara de Fluxo
ÓpticaÓptica
Fontes de iluminação: Fontes de iluminação: – Lâmpadas de MercúrioLâmpadas de Mercúrio
– LasersLasers
Emite num Emite num comprimento de onda comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), (ex: 488 nm- azul), monocromático.monocromático.
Produz um feixe de Produz um feixe de luz coerenteluz coerente
LaserLaser
Fotosensor de Dispersão Frontal Fotosensor de Dispersão Frontal (FS)(FS)
Capta a intensidade da dispersão frontalCapta a intensidade da dispersão frontal
A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das
partículaspartículas. .
Sensor de FS
Laser
Fotosensor de Dispersão Lateral Fotosensor de Dispersão Lateral (SS)(SS)
Capta a intensidade e luz dispersa a 90Capta a intensidade e luz dispersa a 90oo
A intensidade dessa dispersão é proporcional ao A intensidade dessa dispersão é proporcional ao
tamanho, granularidade e forma das partículastamanho, granularidade e forma das partículas
Laser
Sensor de FS
Sensor SS 900
Dispersão da FluorescênciaDispersão da Fluorescência A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o
comprimento de onda seleccionadocomprimento de onda seleccionado A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela
selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos.filtros e de espelhos.
Laser
Sensor de FS
Detectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)
Tipos de fluorocromosTipos de fluorocromos
Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)
Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)
FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695
Texas Red 595 615
APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667
Espectros de Excitação / Espectros de Excitação / EmissãoEmissão
488488
EthidiumEthidium
PEPE
Texas RedTexas Red
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm
457350 514 610 632
Características dos fluorocromos:
1) Emissão adequada (> 600 nm) de forma a minimizar problemas de autofluorescência
2) Emissâo de intensidade significativamente maior que a de autofluorescência
3) Espectro não sobreposto com outros fluorocromos
4) Facilmente conjugável com anticorpos
Fuorescências derivadas de Energias de Transferência
• Sobreposição de emissão de luz dos fluocromos• Tranferência dessa luz entre o 1º e o 2º fluorocromo • O segundo emite num comprimento de onda superior ao primeiro
Filtro ou Espelho Dicrónico Filtro ou Espelho Dicrónico Colocado a Colocado a 4545oo
Luz Luz ReflectiReflecti
dada
Luz TransmitidaLuz TransmitidaFonte de LuzFonte de Luz
PMT
PMT
PMT
PMT
Filtros Dicróicos
Filtros Bandpass
Laser
1
2
3
4
Câmara deFluxo
Fotosensores
Captação dos Parâmetros Captação dos Parâmetros de Análise:de Análise:
ElectrónicaElectrónica
Processamento Processamento
electrónico do sinal electrónico do sinal
gerado nos sensores gerado nos sensores
que é traduzido num que é traduzido num
histograma ou scatter histograma ou scatter
plotplot
O que pode então dizer um Citómetro de O que pode então dizer um Citómetro de fluxo de uma célula?fluxo de uma célula?
Tamanho (FSC)Tamanho (FSC)Complexidade (SSC)Complexidade (SSC)
Fluorescência relativa.Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3(FL1, FL2, FL3, ,
MetabolismosMetabolismos
ReceptoresReceptores ADNADNCitoquinasCitoquinas
EnzimasEnzimas
Antigénios celularesAntigénios celularesTamanhoTamanho
ComplexidadeComplexidade
AplicaçõesAplicações
ImunologiaImunologia HematologiaHematologia Anatomia patológicaAnatomia patológica Biologia celularBiologia celular OncologiaOncologia
Aplicações diversasAplicações diversas
• Detecção de apoptose
• Permeabilidade membranar
• Mudanças do conteúdo
•de DNA
• Estudos enzimáticos
• funcionais
• Resistência a fármacos 0 200 600 800 1000
GG00 /G/G11
SSGG22/M/M
DNA content2N2N 4N4N
Imunologia - Aplicações Imunologia - Aplicações práticaspráticas
• Separação de células sanguíneas• Diferenciação de sub populações de linfócitos T• Diferenciação linfócitos B• Diferenciação de células NK• Quantificação antigénica• Variações linfoproliferativas (idade,•, imunodeficiências, neoplasias, transplantes, •doenças autoimunes, inflamações)• Fagocitose
Granulócitos
Monocitos
Linfocitos
• Separação de células Separação de células sanguíneassanguíneas
Diferenciação da subpopulação de Diferenciação da subpopulação de linfócitoslinfócitos
Os linfócitos T, originados no Timo experimentam Os linfócitos T, originados no Timo experimentam maturação que resulta de um processo de selecção positiva e maturação que resulta de um processo de selecção positiva e negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e CD20+, até se diferenciarem terminalmente CD20+, até se diferenciarem terminalmente
em Igs.em Igs.
As células NK carecem de marcadoresAs células NK carecem de marcadores
das células T ou B, mas são constitutivamentedas células T ou B, mas são constitutivamente
citotoxicas. Na sua diferenciação citotoxicas. Na sua diferenciação
associam-se a marcadores de funçõesassociam-se a marcadores de funções
linfocitárias: CD16linfocitárias: CD16
• Quantificação antigénica/ maturação
FACSFluorescence-activated cell sorter
• Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8)
• Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente.
• O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser
488 nm laser
+Placas CarregadasPlacas Carregadas
Tubos para Recolha do Tubos para Recolha do Produto SeparadoProduto Separado
Sensor FsSensor Fs
Detectores de Detectores de FluorescênciasFluorescências
-
FACS: desenhado para a análise FACS: desenhado para a análise computarizada de células e computarizada de células e separaçaõ das mesmasseparaçaõ das mesmas
No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populações com perfis diferentes- População A e População B. No as populações com perfis diferentes- População A e População B. No computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- não reagiram c/ anti-A ou anti-B.não reagiram c/ anti-A ou anti-B.
Aplicações clínicas: são Aplicações clínicas: são múltiplas principalmente na múltiplas principalmente na detecção de antigénios “target” detecção de antigénios “target” nas células sanguíneasnas células sanguíneas Classificação de leucemiasClassificação de leucemias Detecção de HIVDetecção de HIV Marcadores tumoraisMarcadores tumorais Na previsão da evolução do curso de doençaNa previsão da evolução do curso de doença Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas
e víruse vírus Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e
antigénios viraisantigénios virais Teste de susceptibilidade a drogasTeste de susceptibilidade a drogas