CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA

S Pk1

k -1

E + S ES E + Pk1

k -1

k2

Las reacciones enzimáticas se ajustan a dos tipos de cinéticas, que son:

Hipérbolas rectangulares:Hipérbolas rectangulares: Enzimas que siguen la cinética de

Michaelis-Menten

Sigmoidales:Sigmoidales: Enzimas alostéricas que muestran

fenómenos de cooperatividad

Propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas

CINÉTICA ENZIMÁTICACINÉTICA ENZIMÁTICA

E + S ES E + P

[E]<<[S]

Velocidad inicial (Vo)

ECUACION DE ECUACION DE MICHAELIS-MENTENMICHAELIS-MENTEN

VVMAXMAX = = Velocidad máxima de la reacción.

KKmm = = constante de michaelis

Valor Teórico Máximo

•Vmax es una constante

•Vmax es la rapidez teórica máxima de la reacción pero NUNCA es obtenida realmente

•Para obtener Vmax se requiere que todas las moléculas de enzima se encuentren unidas con el sustrato.

VmaxVmax

• Concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es ½ de Vmax.

• Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato.

• Tiene unidades de concentración.

• Km es una constante derivada de las constantes de velocidad

Km (cte. de Michaelis)

1.-

ECUACION DE MICHAELIS-MENTENECUACION DE MICHAELIS-MENTEN

Km>>[S] Km<<[S]

* (-1)

Método Gráfico

Doble recíproco o Ec. de Lineweaver-Burk

1/V

1/[S]

Dado el siguiente gráfico, calcular Km y Vmax de la enzima X.

-4 -2 2 4

4

3

2

1

[s] (mM) Vo (µM/s)0,2 5,00,4 7,50,8 10,01,0 10,72,0 12,54,0 13,6

1.- A partir de los siguientes resultados determine:•Cuál es el valor de Km:•Cuál es el valor de Vmax:

2.- A partir de los siguientes resultados determine:•Cuál es el valor de Km:•Cuál es el valor de Vmax:

[S] mM V (mmol/ml/min)0,1 3,330,2 5,00,5 7,140,8 8,01,0 8,332,0 9,09

[S] (M) Velocidad (µmol/min)

1,25 1,72

1,67 2,04

2,5 2,63

5,0 3,33

10,0 4,17

7.- La penicilina se inactiva por la enzima penicilinasa, que también se conoce como B-lactamasa). Se determinó la cantidad de penicilina hidrolizada por minuto, en una solución que contiene 10-9 g de penicilinasa, y los valores se expresaron en función a la concentración de penicilina:

•Determine por regresión lineal los valores de Km y Vmax de la enzima:•Con los valores obtenidos por regresión lineal para Km y Vmax y la ecuación de Michaelis Mentel, determine la velocidad de la reacción si la concentración de sustrato es 0,18 M.

K cat = Vmax / [ET]

CONSTANTE CATALITICACONSTANTE CATALITICA

“kcat”: permite describir la velocidad límite para cualquier reacción catalizada por una enzima a saturación.

K cat = Vmax / [ET]

NUMERO DE RECAMBIONUMERO DE RECAMBIO

• Número de moléculas de sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una molécula

de enzima cuando la enzima está saturada de sustrato.

PARÁMETROS ENZIMÁTICOSPARÁMETROS ENZIMÁTICOS

INHIBICION ENZIMATICAINHIBICION ENZIMATICA

• Una inhibición competitiva se puede superar aumentando la concentración de sustrato.

Mecanismos de regulación enzimática

Mecanismos de regulación de enzimas

P + ADP+ ATP

Quinasa

FosfatasaInactiva Activa

Regulación por modificación covalente

Regulación por retroalimentación

Mecanismos de regulación de enzimas

Mecanismos de regulación de enzimas

Zimógeno

Enzima activa

Rompimiento Proteolítico

Regulación alostérica:

UNION REVERSIBLE Y NO COVALENTE DE UN MODULADOR ALOSTERICO.

PUEDE SER UN METABOLITO O UN COFACTOR.

Mecanismos de regulación de enzimas

1.- Uno de los parámetros cinéticos importantes es el valor de Km. Mientras mayor sea el valor de Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato. ¿Es correcta esta aseveración? Explique brevemente y fundamente su respuesta. 2.- Se mide la velocidad de una reacción catalizada por una enzima en función de la concentración del sustrato. Esta reacción se realiza en presencia y ausencia de un inhibidor específico (I). Los datos obtenidos se indican en la siguiente tabla:

Velocidad (µmol/min) [S] (M) Sin inhibidor Con inhibidor

0.3 x 10-5 10.4 4.1 0.5 x 10-5 14.5 6.4 1.0 x 10-5 22.5 11.3 3.0 x 10-5 33.8 22.6 9.0 x 10-5 40.5 33.8

a) ¿Cuáles son los valores de Vmax y KM en ausencia y presencia del inhibidor? b) ¿Qué tipo de inhibidor es I?

3.- Defina y explique qué es el número de recambio de una enzima 4.- Explique el mecanismo de acción general de una enzima (su funcionamiento), respecto a la reacción química que cataliza, en términos de la Energía Libre de la reacción. 5.- Defina sitio activo y sitio de unión al sustrato de una enzima. 6.- Defina los siguientes conceptos:

a) Holoenzima b) Apoenzima c) Cofactor d) Coenzima e) Enzima alostérica

Preguntas propuestas:

7.- Con relación a la representación gráfica de Michaelis-Menten responda:

a) A qué variable corresponde cada eje de la gráficab) Cómo es la ecuación que describe este gráficac) Qué es la velocidad máximad) Qué es el Km y cuál es su utilidade) Qué significa que una enzima está saturada

8.- Con relación a la Representación de Lineweaber-Burk: a) Qué variables se representan en cada eje b) Cuál es la utilidad de esta gráfica c) Cómo se transforma una curva de Michaelis-Menten en una línea de Lineweaber-Burk

Preguntas propuestas:

9.- Defina y explique el mecanismo de acción de las siguientes clases de inhibidores: competitivos, no competitivos y acompetitivos.

10.- Qué es un zimógeno? Escriba ejemplos.

11.- Qué es Alosterismo, cooperatividad positiva y cooperatividad negativa de una enzima?

Preguntas propuestas:

12.- Con los datos del siguiente gráfico, que representa la actividad de una enzima X, determine el valor e Km y de Vmax de dicha enzima.

[S] (M) Velocidad (µmol/min)

1,25 1,72

1,67 2,04

2,5 2,63

5,0 3,33

10,0 4,17

13.- La penicilina se inactiva por la enzima penicilinasa, que también se conoce como B-lactamasa). Se determinó la cantidad de penicilina hidrolizada por minuto, en una solución que contiene 10-9 g de penicilinasa, y los valores se expresaron en función a la concentración de penicilina:

•Determine por regresión lineal los valores de Km y Vmax de la enzima:•Con los valores obtenidos por regresión lineal para Km y Vmax y la ecuación de Michaelis Mentel, determine la velocidad de la reacción si la concentración de sustrato es 0,18 M.

[S](mM)

Velocidad (mmol/ml/min)Sin inhibidor Con

inhibidor3 10,4 2,15 14,5 2,9

10 22,5 4,530 33,8 6,890 40,5 8,1

14.- Si la cinética del ejercicio anterior se determina en presencia de un inhibidor diferente se tienen los siguientes datos:•Cuál es el valor de Km y Vmax en ausencia de inhibidor:•Cuál es el valor de Km y Vmax en presencia de inhibidor:•Que tipo de inhibidor es I:•Cual es la velocidad de la reacción en presencia y ausencia de inhibidor se la [S]= 0,13mM:•Explique el efecto que tienen el inhibidor sobre la velocidad de la reacción: