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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
ELLANE SABRYNA SENA RIBEIRO
ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE
SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495
NATAL/RN
2019
2
ELLANE SABRYNA SENA RIBEIRO
ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE
SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial a obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé Sousa Junior
NATAL/RN
2019
3
4
ELLANE SABRYNA SENA RIBEIRO
ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE
SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em 13 de dezembro de 2019.
Profa. Dra. Karine Cavalcanti Maurício de Sena Evangelista
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Francisco Canindé Sousa Júnior
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Orientador
Profa. Dra. Juliana Kelly da Silva Maia
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Membro Interno
Profa. Dra. Ester Ribeiro de Andrade
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
Membro Externo
5
Aos meus maiores incentivadores, Walmir e
Cristhina, José Lúcio e Dalva....
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu Deus, porque Dele, por Ele e para Ele são todas as coisas.
Aos meus amados pais, Walmir e Cristhina, por todo amor, suporte, paciência,
presença e dedicação a mim em todos os aspectos da vida.
Aos meus avós, José Lúcio e Dalva, que carinhosamente estão sempre me
incentivando, apoiando e acreditando nos meus sonhos.
A todos meus familiares queridos, os de perto e os de longe, que estão sempre
torcendo pelo meu sucesso.
A todos os meus amigos, que também se fazem presente na minha caminhada. Em
especial à minhas amigas Mariana e Ingrid e colegas de turma Ruty, Thatyane,
Josiane que dividiram muitas emoções, palavras positivas e de conforto durante
essa trajetória.
De maneira especial, agradeço a minha amiga Grazielly Louise, que acompanhou de
maneira mais próxima minha jornada e me ajudou em vários momentos com seus
sábios conselhos, reflexões e exemplo de fé.
Ao meu orientador, Prof. Francisco pela orientação brilhante, pelo respeito e
cordialidade. Por me dar autonomia para fazer minha pesquisa e desenvolver meus
conhecimentos, mas ainda assim, estar sempre presente para me ensinar e auxiliar.
A Profª. Karla Suzanne, pela disponibilidade e orientação nessa reta final.
Agradeço aos meus colegas mestrandos, Wendell, Pedro Ivo e Anderson e também
as alunas de iniciação científica, Lívia, Thereza, Wilma Fabiana, Carla e Leonan por
suas significativas contribuições no meu trabalho.
Agradeço também o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior - Brasil (CAPES) que viabilizou essa produção científica através do
auxílio financeiro (Código de Financiamento 001)
E a todos, que de alguma forma participaram e fizeram parte dessa trajetória.
7
“O Senhor é o Deus Eterno, ele criou o mundo inteiro. Ele
não se cansa, não fica fatigado; ninguém pode medir a
sua sabedoria. Aos cansados ele dá novas forças e enche
de energia os fracos. Até os jovens se cansam, e os
moços tropeçam e caem; mas os que confiam no Senhor
recebem sempre novas forças. Voam nas alturas como
águias, correm e não perdem as forças, andam e não se
cansam.” (Isaías 40: 29-31)
8
RESUMO
Probióticos são definidos como micro-organismos viáveis que exibem efeitos
benéficos para a saúde do hospedeiro quando ingeridos em quantidades
adequadas. Em virtude dos benefícios da ingestão regular de culturas probióticas e
que as fontes alimentares destes componentes funcionais ainda estarem limitadas a
produtos lácteos, é de fundamental importância que novas bebidas probióticas
sejam desenvolvidas. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo elaborar
e caracterizar uma bebida de cajá fermentada com Lactobacillus acidophilus NRRL
B-4495. Inicialmente, as condições de pH e temperatura foram otimizadas utilizando
um delineamento composto central 22. Em seguida determinou-se o tempo de
fermentação necessário para a máxima viabilidade. Durante a fermentação, os
parâmetros físico-químicos e as atividades antioxidantes foram determinados. Além
disso, a atividade antimicrobiana, e a estabilidade microbiológica em
armazenamento refrigerado e em condições gastrointestinais simuladas foi
investigada. Por fim, o suco obtido foi submetido a análise sensorial utilizando
provadores não treinados. As condições ideais para a produção de suco probiótico
foram pH inicial 6,4 e o tempo de 16 h de fermentação. A concentração de fenólicos
totais foi de 123,20 (7,36) EAG/mL em 16 h, com atividade antioxidante de 3,28
(0,02) µmol TE/mL e 3,56 (0,02) µmol TE/mL, para o sequestro dos radicais DPPH e
ABTS, respectivamente. A formulação obtida apresentou boa estabilidade
microbiológica quando armazenada por 28 dias sob refrigeração (4 oC), com
viabilidade de 8,7 Log UFC/mL. Além disso, para o suco recém fermentado não
houve alteração significativa na viabilidade probiótica após a exposição ao estresse
gástrico-intestinal simulado in vitro. Já para o suco após 28 dias de refrigeração, foi
observada uma pequena redução das células viáveis na fase entérica. A partir da
análise sensorial, foi visto que bebida probiótica de cajá não foi bem aceita, no
entanto, a análise Just about Right (JAR) permitiu identificar os atributos específicos
que necessitam ser melhorados no ponto de vista dos provadores, para que assim
seja possível aumentar a aceitação do produto. Assim, este estudo mostrou grande
potencial para elaboração de uma nova bebida probiótica a base de suco de cajá,
sendo uma excelente alternativa aos tradicionais produtos lácteos.
Palavras-chave: Probióticos, Lactobacillus acidophilus, alimentos funcionais, bebida
probiótica não láctea, Spondias mombin L., análise sensorial.
9
ABSTRACT
Probiotics are defined as viable microorganisms that exhibit beneficial effects
on host health when ingested in adequate amounts. Because of the benefits of
regular intake of probiotic beverages and that food sources of these functional
components are still limited to dairy products, it is of fundamental importance that
new probiotic beverages will are studied. In this context, the present study aimed to
elaborate and characterize a yellow mombin juice fermented with Lactobacillus
acidophilus NRRL B-4495. Initially, the pH and temperature conditions were
optimized using a central composite design 22. Then, the fermentation time required
for maximum viability was determined. During fermentation, physicochemical
parameters and antioxidant activities were determined. Also, antimicrobial activity,
microbiological stability in refrigerated storage and simulated gastrointestinal
conditions were investigated. Finally, the juice obtained was submitted to sensory
analysis using untrained tasters. The ideal conditions for probiotic juice production
were the initial pH of 6.4 at 16 h of fermentation. The total phenolic concentration
was 123.20 (7.36) GAE/mL at 16 h, with antioxidant activity of 3.28 (0.02) µmol
TE/mL and 3.56 (0.02) µmol TE/mL for the sequestration of DPPH and ABTS
radicals, respectively. The formulation obtained presented good microbiological
stability when stored for 28 days under refrigeration (4 ºC), with the viability of 8.7
Log CFU/mL. Moreover, for freshly fermented juice, there was no significant change
in probiotic viability after exposure to simulated gastric-intestinal stress in vitro. For
juice after 28 days of storage, a small reduction of viable cells in the enteric phase
was observed. From the sensory analysis, it was seen that yellow mombin probiotic
beverage was not well accepted. However, the Just about Right (JAR) analysis
allowed us to identify the specific attributes that need to be improved from the tasters'
point of view, improve product acceptance. Thus, this study showed great potential
for creating a new probiotic beverage based on yellow mombin juice, is an excellent
alternative to traditional dairy products.
Key words: Probiotics, Lactobacillus acidophilus, Functional foods, Non-dairy
probiotic drink, Spondias mombin L., Sensory analysis.
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 14
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 14
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 15
3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS PROBIÓTICOS ....................................................... 15
3.2 EFEITOS BENÉFICOS DOS PROBIÓTICOS ..................................................... 17
3.3 SUCO DE FRUTAS COMO VEÍCULO DE CULTURAS PROBIÓTICAS ............ 18
3.4 CAJÁ (Spondias mombin L.) ............................................................................... 21
4 METODOLOGIA .................................................................................................... 22
4.1 ELABORAÇÃO DO SUCO DE CAJÁ .................................................................. 22
4.2 OBTENÇÃO DO SUCO DE CAJÁ PROBIÓTICO ............................................... 22
4.2.1 MICRO-ORGANISMO ...................................................................................... 22
4.2.2 ATIVAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO............................................................. 22
4.2.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE
FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ........... 23
4.2.4. AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO .............................................. 23
4.3 AVALIAÇÃO DE VIABILIDADE, CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E
FUNCIONAIS DO SUCO PROBIÓTICO ................................................................... 24
4.3.1 VIABILIDADE ................................................................................................... 24
4.3.2 pH ..................................................................................................................... 24
4.3.3 ACIDEZ TITULÁVEL ........................................................................................ 24
4.3.4 SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS ......................................................................... 24
4.3.5 PROTEÍNAS TOTAIS ....................................................................................... 25
4.3.6 FENÓLICOS TOTAIS ....................................................................................... 25
4.3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ....................................... 25
4.3.7.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL DPPH .......... 25
4.3.7.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL ABTS ........... 26
4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ...................................... 26
4.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28
DIAS .......................................................................................................................... 27
4.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM
CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS ................................................. 27
11
4.7 AVALIAÇÃO DA ACEITAÇÃO DO PRODUTO ................................................... 28
4.7.1 ASPECTOS ÉTICOS........................................................................................ 28
4.7.2 PREPARO DAS AMOSTRAS .......................................................................... 28
4.7.4 RECRUTAMENTO ........................................................................................... 29
4.7.5 TESTES AFETIVOS ......................................................................................... 30
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 31
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 32
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE
FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ........... 32
5.2 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO .................................................. 37
5.3 DETERMINAÇÃO DE COMPONENTES FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE ........................................................................................................ 42
5.4 AVALIAÇÃO DA COR ......................................................................................... 45
5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ...................................... 47
5.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28
DIAS .......................................................................................................................... 49
5.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM
CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS ................................................. 52
5.7 ANÁLISE SENSORIAL ........................................................................................ 54
5.7.2 PERFIL DOS PROVADORES .......................................................................... 54
5.7.3 TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL ................................................................... 55
5.7.4 “JUST ABOUT RIGHT” (JAR) .......................................................................... 57
5.7.4 TESTE DE INTENÇÃO DE COMPRA .............................................................. 65
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 67
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 68
ANEXOS ................................................................................................................... 79
APÊNDICES ............................................................................................................. 82
12
1 INTRODUÇÃO
Atualmente o consumidor está mais consciente sobre o papel da alimentação
na longevidade, bem-estar e prevenção de doenças crônicas não transmissíveis1.
Nesse contexto, tem sido observado mudanças no estilo de vida e hábitos
alimentares de parcela significativa da população, elevando a procura por alimentos
mais nutritivos, saudáveis e que auxiliem na prevenção de doenças, com amplos
benefícios para a saúde, como os alimentos funcionais2.
Um tipo de alimento funcional que domina o mercado são os probióticos,
definidos como micro-organismos viáveis que exibem efeitos benéficos para a saúde
do hospedeiro quando ingeridos em quantidades adequadas3.
Em 2016, o mercado global de probióticos movimentou cerca de 40 bilhões de
euros, com iogurtes e outros produtos lácteos correspondendo a 90% do total de
vendas. Além disso, até 2021 espera-se um crescimento de 38% neste mercado4.
Os principais efeitos benéficos à saúde atribuídos ao consumo regular de
probióticos são redução da intolerância à lactose, diminuição dos níveis de
colesterol, estimulação do sistema imunológico, alívio da constipação, aumento da
absorção de minerais, efeitos antimutagênico, anticarcinogênico e anti-hipertensivo5.
Ademais, uma das funções mais importantes ligadas ao consumo de probióticos,
está na sua ação contra micro-organismos patogênicos6.
Bebidas fermentadas por maioria têm sido desenvolvidas em produtos
lácteos, no entanto, a partir do crescimento das tendências veganas, bem como dos
casos de intolerância/alergia ao leite e a preferência por dietas hipocolesterolêmicas,
têm aumentado a necessidade de inovação e desenvolvimento de novos produtos
probióticos, utilizando diferente fontes e matérias primas na obtenção de produtos
com alto valor nutricional6. Portanto, estudos com a inoculação de micro-organismos
probióticos em suco de frutas e vegetais são promissores e vêm ganhando espaço
como opção para o desenvolvimento de novos produtos probióticos7.
Suco de frutas são consumidos regularmente, o que torna uma maneira
atrativa de fornecer os probióticos. Além disso, são ricos em nutrientes e contém
concentração de açúcares adequada para estimular o crescimento destes micro-
organismos benéficos8.
O cajá (Spondias mombin L.), uma fruta pertencente à família Anacardiaceae
é comumente encontrada nas regiões Norte e Nordeste do Brasil9. Na região
amazônica, o fruto da cajazeira é conhecido como Taperebá10. O cajá é um alimento
13
que possui elevado valor nutricional e funcional, em virtude de seus baixos teores
energéticos e da presença de fibras, aliados a consideráveis valores de vitamina C e
de provitamina A, expressa em seus teores de carotenoides totais. Além disso, o
cajá apresenta polpa bastante ácida e um índice de maturação relativamente
baixo11.
Assim, considerando os benefícios da ingestão diária de culturas probióticas e
que esse tipo de alimento ainda é restrito à produtos lácteos, é imprescindível que
novas bebidas probióticas sejam desenvolvidas, com o intuito de ampliar o mercado
deste produto, além de oferecer opções aos indivíduos que não podem ou não
apreciam o consumo de produtos lácteos. Neste contexto, o presente trabalho se
propõe a elaborar e caracterizar uma bebida probiótica de suco de cajá fermentado
com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.
14
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Elaborar e caracterizar uma bebida probiótica de suco de cajá fermentado com
Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar as condições de pH, temperatura e tempo de fermentação para o
desenvolvimento e manutenção da viabilidade de L. acidophilus em suco de
cajá;
Analisar o pH, acidez titulável, sólidos solúveis totais e concentração de
proteínas totais no suco durante a fermentação;
Determinar as propriedades antioxidantes do suco de cajá fermentado e não
fermentado;
Analisar os parâmetros de cor do suco de cajá antes e após fermentação;
Investigar a atividade antimicrobiana do suco de cajá fermentado;
Avaliar a viabilidade probiótica da bebida fermentada, armazenada por 28
dias sob refrigeração;
Investigar a viabilidade do probiótico em condições gastrointestinais
simuladas;
Verificar os atributos sensoriais e a intenção de compra do suco de cajá
probiótico.
15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS PROBIÓTICOS
A ampla divulgação dos meios de comunicação acerca da alimentação e
seu impacto na saúde, tem trazido para sociedade a preocupação com a
alimentação saudável, tornando o consumidor mais exigente em relação à
qualidade nutricional dos produtos alimentícios, e, consequentemente,
impulsiona a criação e lançamento exponencial de novos produtos no
mercado12.
Os trabalhos no ramo da alimentação funcional têm merecido destaque
em consequência da mudança do estado de saúde da população. À medida que
os custos dos cuidados de saúde e a expectativa média de vida aumentam, o
público tem procurado maneiras de se tornar mais saudável e desenvolver
melhor qualidade de vida13.
Sendo assim, a procura por alimentos que promovem a saúde além da
nutrição básica, tem sido crescente, sendo esses denominados “alimentos
funcionais”, termo que abrange uma ampla gama de produtos, sendo exemplos
típicos desse ramo os produtos probióticos e os alimentos adicionados de
oligossacarídeos (prebióticos)14.
A Resolução no 18, 30 de Abril de 1999 que regula às alegações de
propriedades funcionais e/ou de saúde de alimentos e ingredientes utilizados
para consumo humano, define que para a alegação de propriedades funcionais
de um alimento, é exigido que esse alimento ou ingrediente além de possuir
funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente, deve também
necessariamente produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou efeitos
benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica15.
A popularização dos benefícios de probióticos tem feito com que haja o
crescimento no consumo, e, consequentemente na sua produção. Os micro-
organismos mais comumente utilizados na fermentação de produtos próbioticos
pertencem aos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus16. O consumo de
alimentos funcionais contendo microrganismos probióticos tem efeitos
associados na prevenção de doenças e à promoção da saúde17
Para que os probióticos exerçam seu efeito funcional necessitam ser
ingeridos diariamente, pois a composição da microbiota intestinal está
16
constantemente sendo modificada pelos substratos presentes, micro-organismos
veiculados nos alimentos, estresse e outros fatores18.
Segundo a Resolução no 241, 26 de julho de 2018 que dispõe sobre os
requisitos para comprovação da segurança e dos benefícios à saúde dos probióticos
para uso em alimentos, o termo probiótico é definido como micro-organismo viável
que, quando administrado em quantidades adequadas, confere um benefício à
saúde do indivíduo19.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estabelece a quantidade mínima
viável no momento do consumo de 106 a 107 unidades formadoras de colônia (UFC)
por mL20. Ademais, a legislação brasileira determina que bebidas lácteas
fermentadas apresentem uma contagem total de bactérias viáveis no produto final de
mínimo 106 UFC/g, durante todo o prazo de validade21.
Assim, um dos grandes desafios da indústria de alimentos na produção de
probióticos é garantir sua viabilidade e funcionalidade durante todas as etapas de
processamento e armazenamento1.
Existem diversos fatores que afetam nessa viabilidade. Como nos produtos
fermentados, durante seu processo fermentativo são formados vários metabólitos,
incluindo ácido lático, ácido acético, bacteriocinas, pode ocorrer favorecimento à
diminuição do pH do produto e consequentemente estes metabólitos podem afetar a
estabilidade das bactérias probióticas, alterando suas propriedades funcionais e
sensoriais22.
Além disso, a matriz alimentar utilizada como veículo dos micro-organismos
probióticos pode influenciar o seu crescimento, viabilidade, sobrevivência, tolerância
à ácido e sais biliares, e sua funcionalidade6.
Nesse sentido para o desenvolvimento de novos alimentos funcionais
probióticos, uma investigação cuidadosa da interação de diferentes linhagens
probióticas e componentes alimentares deve ser considerada, visando obter
sucesso no produto, uma vez que a interação micro-organismo com a matriz
alimentar deve auxiliar na resistência do probiótico durante a passagem pelo trato
gastrointestinal23.Apesar de já existir a produção de bebidas fermentadas em
matrizes não lácteas, como em chás, vale ressaltar que essas bebidas não tem
padronização pela legislação.
As cepas probióticas mais comumente utilizadas em matrizes alimentares
pertencem aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium. Espécies de Lactobacillus
17
das quais foram isoladas cepas probióticas incluem L. acidophilus. L. johnsonii, L.
casei, L. rhamnosus, L. gasseri e L. reuteri. As estirpes de Bifidobacterium incluem
B. bifidum, B. longum e B. infantis24.
Bactérias do gênero Lactobacillus sp. são produtoras de ácido láctico e
pertencem a um grupo de micro-organismos gram-positivos, que ao longo dos anos
têm sido bem utilizados na fermentação de alimentos22.
Lactobacillus são bactérias comumente encontradas no trato gastrointestinal,
bem como são encontrados na cavidade oral e vaginal de humanos 25. Esses micro-
organismos são capazes de produzir substâncias antimicrobianas, como
bacteriocinas, ácido láctico e peróxido de hidrogênio, que são fatores responsáveis
por controlar o crescimento de bactérias potencialmente patogênicas26.
L. acidophilus é classificado como uma bactéria homofermentativa que
converte hexoses exclusivamente em ácido lático27. Além de produtos lácteos, essa
espécie vem mostrando resultados positivos sendo inoculada em produtos vegetais,
como é o caso de sucos de frutas28.
3.2 EFEITOS BENÉFICOS DOS PROBIÓTICOS
Os probióticos desempenham efeitos benéficos no trato digestivo, mantendo o
equilíbrio da microbiota intestinal e impedindo que micro-organismos potencialmente
prejudiciais nelas presentes exerçam seus efeitos negativos29.
Ou seja, quando ingeridos em quantidades adequadas, são capazes de
modular a microbiota intestinal, neutralizando possíveis disfunções e
desempenhando atividade antagônica a micro-organismos patogênicos7.
Além disso, aspectos fisiológicos como o desenvolvimento da imunidade inata
e adaptativa, relativa à susceptibilidade a infecções, tolerância imunológica,
biodisponibilidade de nutrientes e função de barreira intestinal podem ser modulados
pela microbiota intestinal30. Devido a capacidade dos Lactobacillus produzirem ácido
láctico e ácido acético para diminuir o pH no trato gastrointestinal e competir por
nutrientes ou sítios de adesão epitelial com patógenos, são capazes de para inibir o
crescimento destes31.
Assim, diversos autores têm reportado os efeitos benéficos de culturas
probióticas sobre a saúde do hospedeiro, como na prevenção de colite ulcerativa,
síndrome do intestino irritável, doença de Crohn, artrite reumatoide, infecções
18
(diarréia infecciosa, Helicobacter pylori, infecções de pele e vaginais), na redução do
colesterol, síntese de vitaminas, e atividade antimutagênica29,27,32.
Probióticos também apresentam efeitos na saúde em um amplo espectro de
condições como síndrome do intestino irritável (SII), diarreia por viajantes, cárie
dentária, úlceras causadas por Helicobacter pylori, encefalopatia hepática,
enterocolite necrosante neonatal (NEC), para prevenção do câncer de cólon33,34,35.
Em pesquisa, foi observado possível benefício de um probiótico no tratamento
da Doença Inflamatória Intestinal (DII)37. Em outro estudo, realizado com gestantes,
foi visto que suplemento nutricional com probióticos administrado durante o final da
gestação e início da lactação foi bem tolerado e seguro, trazendo benefícios para a
mãe e o bebê38.
Foi observado também que a utilização de probióticos, de diferentes cepas de
Lactobacillus sp. estão associadas à diminuição do número de contagens de S.
mutans na placa dentária39. Além disso, uma pesquisa utilizando micro-organismos
probióticos na prevenção e tratamentos de saúde sugeriu que a utilização de L.
acidophilus YT1 poderia auxiliar no alívio dos sintomas da menopausa, como
aumento da sensibilidade à dor, depressão, gordura corporal e perda óssea em
mulheres na menopausa, sugerindo o desenvolvimento de um alimento funcional e
probiótico para mulheres idosas37.
É conhecida também, a relação do uso de probióticos com a redução
significativa dos níveis de colesterol total e de LDL-c em adultos
hipercolesterolêmicos, e consequentemente reduz os fatores de risco para o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares18.
3.3 SUCO DE FRUTAS COMO VEÍCULO DE CULTURAS PROBIÓTICAS
Os probióticos estão disponíveis comercialmente em diferentes tipos de
produtos como alimentos, suplementos alimentares e medicamentos. No entanto,
estes produtos alimentares que contém culturas probióticas disponíveis
comercialmente são quase exclusivamente derivados lácteos6.
Por este motivo, com o surgimento de novas tendências alimentares e o
aumento da adesão ao veganismo e outros comportamentos alimentares que optam
por não consumir leite e derivados, bem como o crescimento de pessoas
19
intolerantes à lactose e com alergia às proteínas do leite, há a necessidade de
produtos probióticos alternativos que atendam a necessidade desse público61.
Apesar da fermentação láctica estar muito mais frequentemente associada ao
leite e a subprodutos lácteos, como o soro de leite, ela também pode ser obtida a
partir de outros substratos, como as polpas de frutas, desde que possuam açúcares
fermentáveis em suas composições. O uso de frutas apresenta ainda um diferencial,
quanto a incorporação de aromas e nutrientes específicos, resultando em produtos
com características próprias e isentos de lactose, que podem ser bem aceitos pelo
consumidor40.
Sendo assim, os sucos de frutas podem constituir um meio alternativo para
veículos de bactérias probióticas devido à presença de carboidratos fermentescíveis
e consumidos de maneira regular por uma grande parcela da população, além do
aspecto nutricional de sua composição rica em minerais, vitaminas, fibras dietéticas
e vários componentes fitoquímicos41,28.
Muitas frutas e polpas têm sido utilizadas como matrizes para fermentação
lática. Em um estudo onde foi realizada a fermentação no suco de abacaxi, com
resultados adequados que mostram atividade probiótica, sugerindo assim, que o
suco da fruta é um substrato adequado para incorporação de probióticos8.
Sobre os micro-organismos, um estudo sugere atividade antimicrobiana de L.
plantarum LS5 fermentado em suco de limão doce contra Salmonella typhimurium e
Escherichia coli O157:H732.
Em pesquisa, utilizando suco de caju como substrato para fermentação láctica
por Lactobacillus casei a 30 °C; de acordo com os pesquisadores, a adição de
açúcar ao suco favoreceu a contagem de células viáveis e ao se estocar os sucos
fermentados a 4 °C foi observado que L. casei é capaz de continuar a produzir ácido
lático por 42 dias, e, consequentemente, reduzir o pH dos sucos mesmo em baixas
temperaturas42.
Outro fator observado, a polpa de Juçara (Euterpe edulis) como substrato
para o crescimento de culturas probióticas, Guergoletto et al.43 observam uma
elevação na concentração de compostos fenólicos totais e nas propriedades
antioxidantes.
Pesquisadores otimizaram a fermentação do suco de melão por L. casei
NRRL B-442, onde foi observado boa viabilidade celular (108 UFC/mL) alcançada no
20
final da fermentação. Este nível foi mantido durante 42 dias de armazenamento sob
refrigeração44.
Outro resultado positivo na contagem de células viáveis e também na
estabilidade positiva até 42 dias sob armazenamento refrigerado, com maior
viabilidade de L. casei no suco de caju adoçado. Foi observado também que a
fermentação proporcionou um bom efeito conservante na atividade antioxidante e no
teor de ácido ascórbico do suco de caju quando comparado ao suco não
fermentado, conferindo assim benefícios nutricionais, sendo assim uma bebida
funcional41.
Hashemi et al.32 utilizaram L. plantarum na inoculação do suco de limão doce
e observaram uma viabilidade de 8,52 (0,34) Log UFC/mL, enquanto após 28 dias
de armazenamento a 4 ºC, eles foram reduzidos para 7,14 (0,21) Log UFC/mL,
demonstrando uma diminuição aceitável. Deste trabalho foi possível observar
também que a fermentação no suco de limão doce poderia melhorar as propriedades
químicas como atividade antioxidante, bem como propriedades antibacterianas,
sendo assim o suco fermentado pode ser usado como alimento funcional não-lácteo.
Em pesquisa analisando as condições de fermentação em uma bebida
probiótica de cupuaçu, também foi observada a viabilidade da inoculação do micro-
organismo L. casei na bebida. Inoculou-se 7,00 Log UFC/mL e após 24 h de
fermentação microbiana, contagens superiores a 8,00 Log UFC/mL foram
observados. Podendo-se concluir que o cupuaçu é uma boa matriz para a produção
de bebidas probióticas6.
A fermentação lática no suco de melão, também se mostrou positiva e viável,
com crescimento intenso nas primeiras horas de fermentação, com fase exponencial
de crescimento de 8 h para L. casei44.
Outro estudo que testou diferentes matrizes, mostrou que polpas de manga e
de goiaba em composição ou não com o soro de leite mostraram boa potencialidade
como substratos para a fermentação láctica de uma cultura mista de L. casei, L.
bulgaricus e S. termophillus a 37 oC40.
Assim, diferentes matrizes vegetais têm apresentado resultados satisfatórios
para fermentação lática, com fornecimento eficaz para a viabilidade de diferentes
micro-organismos.
21
3.4 CAJÁ (Spondias mombin L.)
O consumo de frutas e vegetais está associado à diminuição do risco de
doenças cardíacas e câncer. Os antioxidantes presentes nos frutos atuam inativando
espécies reativas de oxigênio envolvidas na iniciação ou progressão dessas
doenças11.
O cajá é o fruto da cajazeira, árvore frutífera que faz parte da família
Anacardiaceae e com nome científico de Spondias mombin L., é extremamente
aromático e rico em carotenoides, que dão à sua polpa, além de uma intensa
coloração amarela, um apelo funcional significativo45.
Além da alta concentração de carotenóides, o cajá possui elevado teor de
componentes fenólicos e vitamina C, que dão a polpa uma notável atividade
antioxidante. Além de suas características marcantes de sabor, a fruta é uma boa
fonte de pró-vitamina A. Possui também um alto teor de taninos que afere à polpa do
cajá como um antioxidante natural46.
O cajá tem sido usado nas mais diferentes preparações, como sucos, picolés,
sorvetes, geleias e iogurtes. Seus produtos têm sido amplamente apreciados no
mercado, além da popularização de suas qualidades nutricionais, seu sabor exótico,
agridoce também é um atrativo47.
Avaliando as polpas de cajá no seu aspecto funcional, sugerem resultados
positivos para atividade antioxidante, bem como, quantidades significativas de
fenólicos totais, minerais (ênfase em cobre e potássio) e carotenoides48.
Considerando a importância dos alimentos funcionais para a saúde humana,
os benefícios da ingestão diária de culturas probióticas e que as fontes alimentares
de probióticos ainda estarem restritas a produtos lácteos, é importante que novas
bebidas probióticas sejam desenvolvidas, com o intuito de ampliar o mercado deste
produto, além de oferecer opções aos indivíduos que não podem ou não apreciam o
consumo de produtos lácteos. Diante do exposto, devido a suas excelentes
características nutricionais e bioativas, o suco de cajá poderia ser um veículo de
micro-organismos probióticos, favorecendo o seu crescimento, viabilidade,
sobrevivência e propriedades funcionais.
22
4 METODOLOGIA
4.1 ELABORAÇÃO DO SUCO DE CAJÁ
O cajá (Spondias mombin L.) foi adquirido em estabelecimentos comerciais
da cidade de Natal-RN durante o período de agosto de 2018 a outubro de 2019. As
frutas foram selecionadas, higienizadas com uma solução de hipoclorito de sódio a
1% por 15 minutos, em seguida, lavadas com água corrente, trituradas em
processador e prensadas. Após a extração, o suco foi filtrado, em seguida foi medido
o valor de sólidos solúveis totais sendo estabelecido padrão de 8,0 ºBrix pela adição
de água destilada, e posteriormente a isso, foi submetido ao processo de
pasteurização (80 ºC por 5 minutos) e armazenado a -20 °C até a fermentação. O
projeto foi cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do
Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob número AB1B7B2, em
11/10/2018.
4.2 OBTENÇÃO DO SUCO DE CAJÁ PROBIÓTICO
4.2.1 MICRO-ORGANISMO
A linhagem de Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 utilizada neste projeto
para elaboração do suco probiótico foi obtida da coleção de culturas do
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (U.S. Departament of Agriculture,
ARS Culture Collection- NRRL, Peoria, Illinois). A cepa foi armazenada a -20 °C em
microtubos contendo caldo MRS (Man, Rogosa e Sharpe) e glicerol a 50% (m/v),
segundo a metodologia de Pereira et al.6
4.2.2 ATIVAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO
Para ativação do microrganismo, 8 mL da cultura estoque em glicerol 50%, na
qual se encontra a cepa de L. acidophilus NRRL B-4495, foram transferidos
assepticamente para Erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL do caldo MRS e 10
mL de tampão fosfato 200 mM pH 6,5. Esse cultivo inicial foi realizado em estufa
estática a uma temperatura de 37 °C por 12 h, para se atingir a concentração de
células na ordem de 109 UFC/mL, equivalente a 0,600 de absorbância a 590 nm na
23
escala de McFarland baseado em Fonteles et al44. Esta suspensão foi utilizada como
inóculo do processo de fermentação.
4.2.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE
FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
A otimização das condições de pH inicial e temperatura de fermentação do
suco de cajá por L. acidophilus NRRL B-4495 foi realizada através de um
delineamento composto central rotacional (DCCR) 22 com 4 pontos axiais e
quadruplicata no ponto central, totalizando 12 ensaios. O ajuste do pH inicial dos
sucos foi realizado pela adição de bicarbonato de sódio 4 M. Em seguida, o volume
de 5 mL da linhagem ativada em caldo MRS foi transferido assepticamente para
frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do suco com diferentes
condições de pH. Os frascos foram incubados em estufa estática por 24 h em
diferentes temperaturas para avaliação da contagem de células viáveis. As
condições de pH inicial e temperatura foram definidas com base no trabalho de
Pereira et al.6. Os fatores e os níveis utilizados estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Fatores e níveis utilizados no delineamento composto central rotacional
(DCCR) 22 para otimização das condições de pH e temperatura de fermentação do
suco de cajá por L. acidophilus NRRL B-4495
Fatores Níveis
-1,41 -1 0 +1 +1,41
Temperatura (°C) 20,1 23,0 30,0 37,0 39,9
pH 3,38 4,00 5,50 7,00 7,62
4.2.4. AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO
Após determinação das condições de pH e temperatura ótimos na Seção
4.2.3, foi determinado o tempo de fermentação que favoreça a maior viabilidade
celular. Por tanto, o volume de 5 mL da linhagem L. acidophilus em caldo MRS foi
transferido assepticamente para frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL
do suco. Os frascos foram incubados na estufa estática por até 24 h, com retirada de
amostras a cada 2 h para contagem de células viáveis. O restante da amostra foi
24
submetida a centrifugação a 2500 rpm por 15 minutos. No sobrenadante foram
analisados pH, acidez titulável, sólidos solúveis totais, proteínas totais, compostos
fenólicos e atividade antioxidante.
4.3 AVALIAÇÃO DE VIABILIDADE, CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E
FUNCIONAIS DO SUCO PROBIÓTICO
4.3.1 VIABILIDADE
A viabilidade de L. acidophilus no suco de cajá fermentado foi avaliada
conforme metodologia previamente descrita por Pereira et al.6. Para cada amostra,
foram realizadas diluições decimais seriadas em água peptonada a 0,3% nas ordens
de 10-1 a 10-9. Em seguida, 100 μL das diluições 10-4 a 10-9 foram semeadas por
“spread plate” em placas contendo ágar MRS com espalhamento utilizando-se alça
de Drigalski. As placas foram incubadas a 37 °C por 72 h em estufa bacteriológica, e
em seguida, foi realizada a contagem das colônias de Lactobacillus sp., e a
viabilidade expressa em logaritmo de Unidades Formadoras de Colônias por mL
(Log UFC/mL).
4.3.2 pH
O acompanhamento do potencial Hidrogeniônico (pH) foi realizado ao longo
de todo o cultivo utilizando-se um potenciômetro de bancada49.
4.3.3 ACIDEZ TITULÁVEL
Em um Erlenmeyer, 5 mL do suco diluído 1:10 em água destilada foi titulado
com uma solução de NaOH 0,01 M utilizando fenolftaleína como indicador49. A
acidez total foi expressa em g de ácido cítrico por 100 mL de suco.
4.3.4 SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS
A medição da quantidade de açúcares de uma solução é fornecida através
dos sólidos solúveis totais - SST (°Brix). Três a quatro gotas do sobrenadante do
suco fermentado foram levadas ao refratômetro de Abbe para medição dos SST49.
25
4.3.5 PROTEÍNAS TOTAIS
Para determinação da concentração de proteínas totais presentes no suco,
100 μL de cada amostra foi misturada com 3,0 mL do reagente Bradford. Os tubos
foram agitados suavemente em agitador de tubos tipo vórtex e, em seguida,
incubados durante 5 minutos.
Logo após, foi realizada a leitura em espectrofotômetro a 595 nm, contra um
branco, no qual a amostra foi substituída por água destilada50. A curva de calibração
foi realizada através de diluições de uma solução de albumina de soro bovino (BSA),
utilizando-se uma faixa de concentração de 0,1 a 1,0 g/L.
4.3.6 FENÓLICOS TOTAIS
Os compostos fenólicos totais nos sucos foram analisados através do método
Folin-Ciocalteau de acordo com Fujita et al.51 adaptado. Em tubos de ensaio foram
adicionados sequencialmente 1 mL de Folin-Ciocalteau 50% (v/v), 400 μL de
carbonato de sódio 7,5% (p/v) e 400 μL da amostra. Após 30 minutos protegidos da
luz, as amostras tiveram suas absorbâncias medidas em espectrofotômetro a 750
nm contra um branco, no qual a amostra foi substituída por água destilada. Uma
curva padrão foi construída com ácido gálico na faixa de concentração de 10 a 200
mg/mL e a concentração dos componentes fenólicos totais expressa em
microgramas de equivalente de ácido gálico por mililitro de amostra (µg EAG/mL).
4.3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
4.3.7.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL DPPH
A capacidade de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi
avaliada conforme Nóbrega et al.52 com adaptações, utilizando microplacas com 96
poços. Em resumo, 200 µL de uma solução de DPPH 0,1 mM em solução de etanol
50% foram adicionados a 40 µL de cada amostra. A mistura foi incubada por 25
minutos em câmara escura e a leitura realizada a 517 nm em leitor de microplacas.
Uma curva padrão foi construída com concentrações de trolox (ácido 2-carboxílico-6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano) variando de 10 a 200 µM e os resultados
expressos em µmolar de trolox equivalente por mililitro de amostra (µmolar TE/mL).
26
4.3.7.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL ABTS
Para a determinação da atividade antioxidante pelo método do radical 2,2′-
azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) (ABTS), foi utilizada a metodologia
descrita por Rufino et al.53 com adaptações, utilizando microplacas com 96 poços.
Uma alíquota de 20 µL do suco diluído em etanol e água destilada foi adicionada à
microplaca. Em seguida, 280 µL do radical ABTS foram adicionados e a microplaca
permaneceu em repouso por 6 minutos em câmara escura e a leitura realizada a
734 nm. Uma curva padrão foi construída com concentrações de trolox, variando de
0 a 800 µM, e os resultados foram expressos em µmolar de trolox equivalente por
mililitro de amostra (µmolar TE/mL).
4.3.8 ANÁLISE DA COR
A análise de cor foi realizada por meio de espectrofotometria de reflectância,
utilizando-se um analisador de cor modelo ACR 1023 (Instrutherm). As amostras
foram colocadas em recipientes de vidro, dentro de uma câmara branca com
iluminação apropriada, para realização da leitura. Os parâmetros foram obtidos no
sistema RGB (vermelho, verde e azul) e convertidos para o espaço de cor CIE Lab,
utilizando o programa OpenRGB, e expressos em coordenadas de cor (L*, a* e b*).
4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A atividade antimicrobiana foi avaliada utilizando o método de microdiluição
em caldo conforme metodologia previamente padronizada pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) com adaptações54. O sobrenadante da cultura
(sem células) do suco de cajá fermentado por 16 h foi obtido por centrifugação (2500
rpm por 15 minutos). A filtração do sobrenadante foi realizada usando uma
membrana de 0,22 µm para remover as células residuais.
Foram utilizadas linhagens de Staphylococcus aureus ATCC 29213,
Enterococcus faecalis ATCC 4028, Escherichia coli ATCC 25922 e Klebsiella
pneumonie ATCC 10031. As linhagens foram semeadas em meio caldo "Brain Heart
Infusion” (BHI), e incubadas a 37 °C por 24 h. Após a incubação, obteve-se uma
turbidez equivalente a 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1 x 108
UFC/mL), que foi diluída 10 vezes, resultando em uma suspensão com
27
aproximadamente 107 UFC/mL. Aos poços da microplaca foram adicionados 100 µL
de caldo BHI, 100 µL do sobrenadante do suco (sem células) e por fim, 5 µL da
suspensão microbiana.
Poços contendo apenas caldo BHI na ausência da suspensão de micro-
organismo foram utilizados para o controle de esterilidade, e os poços com a
suspensão de micro-organismo na ausência do suco foram usados como controle
positivo de crescimento. A microplaca foi incubada por 24 h, sob agitação de 200
rpm, a 37 °C. A leitura da absorbância foi realizada no comprimento de onda 492 nm
em um leitor de microplacas. A partir da leitura espectrofotométrica foi determinada a
porcentagem de inibição do crescimento microbiano, de acordo com a equação
abaixo55:
% Inibição do crescimento microbiano = [1- (Ac/A0)] x 100
Em que: Ac representa a média das absorbâncias do suco testado já
subtraída do valor da absorbância obtida para o suco sem a adição do inóculo, e, A0
a média das absorbâncias do controle de crescimento microbiano (sem o suco).
4.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28
DIAS
O suco de cajá fermentado obtido sob condições otimizadas foi armazenado
em tubos estéreis, fechados e armazenados em refrigerador a 4 ºC. A viabilidade de
L. acidophilus, foi determinada antes do armazenamento e em intervalos de 7 dias,
durante o período de 28 dias, de acordo com metodologia previamente descrita na
Seção 4.3.1.
4.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM
CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS
A avaliação da sobrevivência de L. acidophilus NRRL B-4495 em condições
gastrointestinais simuladas foi realizada antes e após 28 dias de armazenamento do
suco sob refrigeração, conforme metodologia previamente descrita por Brinques et
al.56 e Farias et al.57, com adaptações.
28
Para isso, as células de L. acidophilus foram recolhidas do suco de cajá após
centrifugação a 3600 rpm por 15 minutos, e ressuspendidas em solução salina
(0,85% p/v) contendo 3 g/L de pepsina após ajuste de pH para 2,0, pela adição de
HCl 5 M (condições gástricas simuladas-CGS). As amostras foram incubadas a 37
ºC e 70 rpm de agitação, retirando alíquotas de 1 mL nos tempos 0, 60 e 120
minutos.
Passados os 120 minutos correspondentes à etapa gástrica, os tubos foram
centrifugados (3600 rpm por 15 minutos) e os sobrenadantes descartados. Em
seguida, o pellet foi ressuspendido em fluido intestinal simulado (Condições
intestinais simuladas -CIS), obtido pela adição de 1 g/L de pancreatina e 10 g/L de
sais biliares em solução salina (0,85% p/v) após ajuste do pH para 8,0 com solução
de NaOH 2,0 M. As amostras foram incubadas a 37 ºC e 70 rpm de agitação,
retirando-se alíquotas de 1 mL nos tempos 180 e 240 minutos. Por fim, a viabilidade
de L. acidophilus nas CGS e CIS foi avaliada conforme descrito na Seção 4.3.1.
4.7 AVALIAÇÃO DA ACEITAÇÃO DO PRODUTO
4.7.1 ASPECTOS ÉTICOS
O presente projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética do Hospital
Universitário Onofre Lopes (HUOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN) para julgamento, de acordo com a Resolução CNS/MS 466/12 (BRASIL,
2012), aprovado conforme o N° 07811118.9.0000.5292 do Certificado de
Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) (ANEXO A). O suco de cajá
fermentado com L. acidophilus foi submetido a testes afetivos, sendo esses
realizados no Laboratório de Análise Sensorial do Departamento de Nutrição da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cabines individuais e sob
condições de luminosidade específicas.
4.7.2 PREPARO DAS AMOSTRAS
O suco de cajá foi produzido de acordo com as seções 4.1 e 4.2 desta
metodologia com algumas adaptações. Após obtenção do crescimento microbiano
conforme seção 4.2.2, o conteúdo foi transferido para tubos de centrífuga estéreis e
centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos, para separação da biomassa. Em seguida,
29
o meio de cultura sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com
solução de NaCl 0,9%, e novamente centrifugadas por três ciclos. Por fim, o pellet
celular de cada tubo foi resuspenso em 50 mL de solução NaCl 0,9% e essa
suspensão foi utilizada como inóculo para fermentação do suco de cajá, preparado
utilizando água mineral e com pH ajustado para 6,4 com bicarbonato de sódio grau
alimentício. Antes do consumo dos provadores, as amostras foram submetidas a
análises microbiológicas, não sendo detectada a presença de coliformes a 45º C e
nem Salmonella sp. Sendo assim, as 3 formulações de suco estavam de acordo com
os padrões legais vigentes no Regulamento Técnico sobre o padrão microbiológico
para alimentos, estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA)97
As amostras das três formulações de suco submetidas aos testes sensoriais
apresentam diferentes características, sendo F1 a formulação padrão de suco de
cajá, F2 o suco fermentado de cajá, e F3 o suco fermentado e adoçada com 10% de
estévia em pó (Tabela 2). Desse modo, foram codificadas com algarismos de três
dígitos aleatórios, acondicionadas em copos de plásticos descartáveis. Os
provadores receberam as três amostras, com o volume de 20 mL cada, de forma
monádica (uma de cada vez) e sequencial (uma após a outra), de forma aleatória,
acompanhadas de um copo com água mineral.
Tabela 2: Composição das formulações de suco de cajá utilizadas na análise
sensorial.
Formulação Composição
F1 Suco de cajá padrão (não fermentado)
F2 Suco de cajá fermentado com L. acidophilus por 16 h
F3 Suco de cajá fermentado com L. acidophilus por 16 h e
adoçado com 10% de estévia em pó
4.7.4 RECRUTAMENTO
O recrutamento ocorreu por meio do preenchimento do questionário
(APÊNDICE A), sendo obtidas informações sobre afinidade com os produtos, dados
30
sócios demográficos e condições de saúde dos indivíduos. Assim, foram
selecionados os indivíduos que consumiam habitualmente suco de cajá, não
apresentaram informações sobre intolerância, alergias ou aversão aos ingredientes
presentes na formulação, maiores de 18 anos e que concordaram em participar da
pesquisa assinando o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE
(APÊNDICE B), onde consta o objetivo da pesquisa bem como os procedimentos
metodológicos, riscos e benefícios. Foram recrutadas 95 voluntários, dos quais
apenas 88, entre funcionários, professores e acadêmicos que frequentam o
Departamento de Nutrição e o Restaurante Universitário (DNUT) da UFRN, estavam
aptas para participarem da análise.
4.7.5 TESTES AFETIVOS
Utilizou-se o Teste de Aceitação Global para avaliar as três formulações de
suco de cajá, empregando a escala hedônica estruturada de nove pontos, variando
de “gostei muitíssimo” a “desgostei muitíssimo” 58 descritos na ficha utilizada para o
teste (APÊNDICE C).
A partir dos dados coletados, determinou-se o índice de aceitabilidade (IA)
para cada formulação. Para o cálculo do índice, dividiu-se a nota média obtida no
produto pela nota máxima dada, multiplicando essa razão por 100. Foi considerando
como 100% a maior nota alcançada por cada amostra analisada, tomando como
critério de decisão para classificação de boa aceitação o IA igual ou superior a
70%96.
Também foi utilizado o teste escala do ideal “Just About Right” (JAR), método
pelo qual é quantificado a presença de determinados atributos, e/ou intensidades.
Assim, os atributos escolhidos para avaliação foram acidez, sabor doce,
viscosidade e cor, identificando-se a preferência dos consumidores por meio de um
padrão de 5 (cinco) pontos na escala, em que os provadores decidiram para acidez
se o suco sabor doce estava “muito mais ácido do que gosto”, “muito menos ácido
do que eu gosto” ou “ideal, do jeito que eu gosto” (parâmetro ideal), e para o sabor
doce “muito mais intenso do que gosto”, “muito menos intenso do que eu gosto” ou
“ideal, do jeito que eu gosto” (parâmetro ideal), para avaliação da viscosidade a
escala variou de “muito menos viscoso do que eu gosto” a “ muito mais viscoso do
31
que eu gosto” ou “ideal, do jeito que eu gosto” e para avaliar o atributo “muito menos
claro do que eu gosto” a “muito mais escuro do que gosto” ou “ideal, do jeito que eu
gosto”, conforme descrito nas fichas utilizada para o teste (APÊNDICE C).
Ainda, avaliou-se a intenção de compra do produto pelos julgadores, por meio
de uma escala de 5 pontos, descrita no APÊNDICE C, a fim de avaliar sua aceitação
no mercado 59
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados da caracterização do suco foram expressos como média
aritmética (desvio-padrão). Para a análise estatística foi realizada a Análise de
Variância (ANOVA) com pos-teste de Tukey, considerando o grau de confiança de
95% (p<0,05) como resultado significativo, utilizando o software Statistica 8.0
(StatSoft Inc., Tulsa, EUA).
Todos os experimentos do delineamento composto central rotacional foram
realizados aleatoriamente e os dados foram tratados com o auxílio do software
Statistica. A significância estatística da equação do modelo de segunda ordem foi
determinada pelo teste F (ANOVA).
Para a estatística da análise sensorial, o teste de Shapiro-Wilk foi aplicado
para testar a normalidade dos dados. Para avaliar se houve diferença na aceitação
global entre as formulações do suco foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis com teste
Dunn para comparações Múltiplas e correção de Bonferroni. A análise de
componentes principais foi usada para criar o mapa de p preferência interno. Para
avaliar os dados JAR foi executada a análise de penalidade. Todas as análises
foram realizadas com o nível de significância de 5% (p<0,05) e utilizando o software
XLStat (Addinsoft, Paris, França). Para as outras análises (Perfil dos provadores,
teste de aceitação global e Intenção de compra) foi utilizado o Microsoft Office Excel
2016 para gerar médias, desvio- padrão e percentuais.
32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE
FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Os efeitos da temperatura e pH inicial do suco de cajá sobre a resposta da
viabilidade celular de L. acidophilus, foi avaliada após 24 h de fermentação
empregando o delineamento composto central rotacional (DCCR) 22. Conforme a
condição experimental adotada, a resposta viabilidade variou de 5,06 a 8,02 Log
UFC/mL (Tabela 3).
Tabela 3: Matriz do DCCR 22 para otimização das condições de temperatura e pH
inicial de fermentação do suco de cajá utilizando L. acidophilus.
aResultado expresso em média (DP)
bPonto central
Pode-se observar que mesmo com diferentes valores de temperatura de pH
sendo testados, a contagem de células viáveis, por maioria se manteve-se alta,
Ensaio Temperatura (ºC)
pH Viabilidadea
(Log UFC/mL)
1 23,0 (-1) 4,00 (-1) 6,01 (0,17)
2 37,0 (+1) 4,00 (-1) 6,10 (0,26)
3 23,0 (-1) 7,00 (+1) 6,65 (0,05)
4 37,0 (+1) 7,00 (+1) 6,84 (0,11)
5 20,1 (-1,41) 5,50 (0) 6,11 (0,07)
6 39,9 (+1,41) 5,50 (0) 6,19 (0,07)
7 30,0 (0) 3,38 (-1,41) 5,06 (0,02)
8 30,0 (0) 7,62 (+1,41) 7,18 (0,00)
9b 30,0 (0) 5,50 (0) 8,02 (0,03)
10b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,79 (0,00)
11b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,98 (0,03)
12b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,93 (0,05)
33
sugerindo assim a robustez desse micro-organismo No que diz respeito à resposta
viabilidade, no diagrama de Pareto (Figura 1) é possível observar que apenas a
variável pH (termo linear - L) apresentou significância estatística (p > 0,05). Os
resultados mostraram, ainda, que a viabilidade foi afetada pelo fator pH de maneira
positiva, ou seja, um incremento nesta variável (nível -1 para nível +1) conduziu a
um incremento na resposta. Assim, foi possível observar que valores de pH abaixo
de 5,0, foram aqueles que apresentaram menor viabilidade celular.
,092453
,2861543
-2,32807
-2,41124
3,159769
p=0,05
Ef eito estimado (Valor absoluto)
1Lby 2L
(1)Temp(L)
Temp(Q)
pH(Q)
(2)pH(L)
Figura 1: Diagrama de Pareto para avaliação do efeito estimado das variáveis pH e
temperatura sobre a resposta a resposta viabilidade celular de L. acidophilus em
suco de cajá.
A partir dos coeficientes de regressão ajustados, obtidos pelo software
Statistica 7.0, foi construído o modelo estatístico que correlaciona a viabilidade
celular de L. acidophilus (Log UFC/mL) com os fatores temperatura e pH inicial,
conforme observado na Equação 2:
Viabilidade (Log UFC/mL) = 7,18 + 0,10X1 - 0,90X12 + 1,09 X2- 0,93 X2
2 + 0,04 X1
X2
Em que, X1 é a temperatura e X2 o pH inicial do suco.
34
Observando o gráfico de superfície de resposta (Figura 2) podemos observar
que o ponto crítico, de maior viabilidade celular, no presente estudo foi no pH de 6,4.
Como resultado, definiu-se que o pH do suco cajá seria ajustado para 6,4 em todas
as etapas seguintes do trabalho.
Figura 2: Gráfico de superfície de resposta para viabilidade celular de L. acidophilus
(Log UFC/mL) fermentado em suco de cajá por 24 h em função das variáveis
temperatura e pH.
Os resultados encontrados neste trabalho estão de acordo com os dados
previamente descritos na literatura, que mostram o pH como uma variável
fundamental para crescimento e manutenção bactérias do gênero Lactobacillus. De
maneira geral, é descrito na literatura que as bactérias do gênero Lactobacillus com
crescimento favorecido em condições relativamente ácidas, com valores de pH
variando entre 5,5 a 6,5, devido à produção de ácido láctico como principal
metabólito60,61.
35
Similarmente aos resultados encontrados no presente trabalho, Santos Filho
et al.7 produziram um suco probiótico a partir de suco de cacau fermentado por L.
casei NRRL-442, obtendo máxima viabilidade no pH de 6,2 e na temperatura de 33
°C. Além disso, em suco de caju, também observou-se que o maior crescimento e
viabilidade de L. casei NRRL-442 ocorreu em pH 6,442. Outra pesquisa, realizada
com L. rhamnosus ATCC 7469 fermentado em suco de maracujá da caatinga
descreveu o pH inicial de 6,0 como ideal para o crescimento28.
Como a análise estatística revelou que a variável temperatura não influenciou
a resposta viabilidade de L. acidophilus em suco de cajá, para utilização na etapa
seguinte definiu-se a temperatura de 30 °C (ponto central), baseado em estudos
encontrados na literatura61. O resultado encontrado no presente trabalho, diverge do
relatado por Pereira et al.6, que ao avaliar os efeitos da temperatura e pH sobre a
viabilidade L. casei NRRL-442 em suco de cupuaçu, observam efeito significativo
apenas para variável temperatura. Tais diferenças de resultados podem ser
justificadas pelas diferenças de composição dos sucos avaliados.
Trabalhos anteriores avaliando a fermentação de L. casei em sucos de lichia
e abacaxi descreveram a temperatura de 30 °C como mais favorável para o
crescimento de probióticos62,63. Ademais, foi relatado que o crescimento e
funcionalidade de bactérias do ácido láctico é favorecido nas temperaturas de 30 a
37 °C6.
De acordo com a análise de variância – ANOVA (Tabela 4), o valor de F
calculado (6,45) para o modelo que expressa a viabilidade foi maior que o valor de
F1,10 tabelado (4,96) para 95,0% de confiança. Assim o modelo pode ser
considerado estatisticamente significativo.
A avaliação do modelo também foi realizada através da observação do gráfico
dos valores preditos versus valores observados, que é mostrado na Figura 3.
Salienta-se que o modelo foi considerado satisfatório, uma vez que os valores
observados experimentalmente aproximaram-se dos valores preditos pelo modelo.
36
Tabela 4: Análise de variância (ANOVA) para variável pH.
Fonte de
variação
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática Valor de F
Regressão 2,3851 1 2,3851 6,63
Resíduo 3,6921 10 0,3692
Total 6,0772 11
F tabelado (95%) F1,10= 4,96
4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5
Valores observados
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
Valo
res p
reditos
Figura 3: Valores observados versus valores preditos para a resposta viabilidade
celular de L. acidophilus em suco de cajá.
37
5.2 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO
Após determinação das condições de pH e temperatura ótimos para
viabilidade celular de L. acidophilus em suco de cajá, o tempo de fermentação foi
analisado através de contagem das células viáveis por 24 h (Figura 4).
Figura 4: Perfil de viabilidade celular de L. acidophilus (Log UFC/mL) e sólidos
solúveis totais (°Brix) em suco de cajá fermentado por 24 h.
De acordo com a Figura 4, pode-se observar que após a inoculação houve
uma fase de adaptação (fase lag) no suco de cajá. Após 12 h de fermentação, o
micro-organismo apresentou crescimento exponencial, atingindo maior viabilidade às
16 h, com 12,9 (0,4) Log UFC/mL, motivo pelo qual elegeu-se este tempo como ideal
para produção do suco de cajá probiótico.
É importante destacar que os resultados apresentados na Figura 4
comprovam que L. acidophilus foi capaz de fermentar o suco de cajá com viabilidade
satisfatória assim como preconiza a legislação para leites fermentados de 6 Log
UFC/mL21, utilizando os nutrientes naturalmente presentes na bebida, sem
necessidade de adição de sacarose ou qualquer outro nutriente. Estes resultados
são interessantes no ponto de vista econômico e de segurança do produto, pois isto
38
não aumentará o custo nem os pontos de controle de contaminação, uma vez que
se trata de um produto probiótico.
Outros pesquisadores relatam que o tipo de substrato exerce influência direta
sobre os parâmetros de crescimento e viabilidade de probióticos. No estudo
utilizando o suco de cupuaçu como matriz, o tempo de 8 h de fermentação foi
suficiente para a linhagem L. casei NRRL-442 atingir sua viabilidade máxima, com
valores superiores a 9,0 Log UFC/mL6.
Por outro lado, em um estudo, com a linhagem L. plantarum, fermentado no
suco de maça, observou-se que foram necessárias 24 h para atingir a viabilidade
máxima de 8,5 Log UFC/mL64. Outrossim, foram necessárias 24 h de fermentação
para atingir a maior contagem de células viáveis em um estudo utilizando uma
mistura de frutas como veículo de probióticos65. Estes resultados, divergiram do
presente estudo, sugerindo assim que a matriz utilizada foi mais eficiente, já que
apenas 16 h de fermentação, foi suficiente para obter maior viabilidade celular.
Na avaliação da fermentação láctica no suco de melão por L. casei NRRL-442
foi observado crescimento celular intenso nas primeiras horas de fermentação. A
fase exponencial de crescimento foi de 8 horas, no entanto, foi visto que o
crescimento continuou até 20 h de fermentação, e, após este período foi observado
um declínio na viabilidade das células no meio de fermentação44.
Vale destacar que o resultado desta pesquisa obteve maior contagem de
células viáveis (12,9 Log UFC/mL) contrastando com o que é visto na literatura, até
o presente momento, que apesar de obterem viabilidade máxima em menor tempo
de fermentação, não atingiram valores de viabilidade tão altos como nessa pesquisa,
evidenciando a robustez do micro-organismo, bem como, possível êxito na
adaptação na matriz.
A Figura 4 mostra também o perfil de sólidos solúveis totais - SST (°Brix) em
suco de cajá durante as 24 h de fermentação. Pode-se observar que os açúcares
naturalmente presentes no suco de cajá, foram parcialmente consumidos durante a
fermentação, já que o mesmo não foi adicionado de sacarose, caracterizando o
metabolismo das bactérias do ácido lático que utilizam açúcares para a produção de
ácido lático. Ao longo da fermentação, a concentração de sólidos solúveis caiu de
8,55 (0,05) para 7,85 (0,05) °Brix em 16 h. Observa-se que no intervalo de maior
crescimento do micro-organismo (entre 12 e 16 h de fermentação) houve uma queda
mais pronunciada dos SST. No entanto, após 18 h de fermentação, a utilização
39
desses açúcares por L. acidophilus diminui, o que pode ser justificado pelo menor
crescimento do micro-organismo nas últimas horas de fermentação.
Em um estudo realizado com iogurte de extrato hidrossolúvel de soja
fermentado, foi observado que o maior consumo de sólidos solúveis totais coincidiu
com o tempo de crescimento celular mais intenso66, se assemelhando, assim, com o
observado no presente estudo.
Nesta pesquisa, ao longo das 24 h de fermentação, não foi observado
variação expressiva nos valores de pH, que oscilou entre 6,63 e 6,95 durante o
processo, o que se diferencia de outros estudos que relatam forte diminuição do pH
ao longo da fermentação76,67. Isso pode ser explicado pela necessidade de ajuste de
pH do suco de cajá, que é naturalmente ácido (1,99), e foi alterado com a adição de
bicarbonato de sódio, até atingir o pH ideal de 6,4, definido no planejamento
experimental. Assim, pode ter sido gerado um efeito tamponante, hipótese que
explicaria essa capacidade de resistir a mudanças de pH, sendo assim, esse fator
pode ter contribuído positivamente na viabilidade, já que se observa que a redução
do pH ao longo da fermentação é fator que influencia na redução dos micro-
organismos.
Em divergência com o atual estudo, em uma pesquisa utilizando o suco de
melão fermentado por L. casei foi relatado um perfil de pH decrescente em 24 h de
processo com o pH caindo de 6,0 para 3,544. Já em outro estudo realizado com
marmelo e maçã, observaram reduções no pH, por exemplo, de 6,6 para 4,8 após
16 h de fermentação68.
Apenas um trabalho, utilizando a polpa de pitaia fermentada com
L. casei, S. thermophilus e L. bulgaricus, mostrou resultados que se assemelham
com o presente estudo, no qual o pH também não variou ao longo das 24 h de
fermentação, neste caso devido a uma dificuldade de adaptação dos micro-
organismos40. Outra exceção quanto a baixa variação de pH, que se assemelha ao
presente estudo foi observado em um estudo utilizando a carambola, no qual o pH
se manteve entre 6,0 e 6,8 ao longo das 24 h de fermentação, nesse caso os
autores desse estudo sugerem uma dificuldade adaptativa da cultura lática aos
substratos da matriz40, que não foi o caso do presente estudo, visto que a linhagem
de L. acidophilus NRRL B-4495 obteve excelente viabilidade no suco de cajá
40
A Figura 5 mostra o perfil de acidez titulável (g ácido cítrico/100 mL) em suco
de cajá fermentado por L. acidophilus. Embora o pH não tenha sofrido variação
expressiva ao longo da fermentação, foi possível observar uma variação nos valores
de acidez titulável ao longo das 24 h. Inicialmente é visto que os valores de acidez
mais baixos são observados na fase de adaptação, ou seja, nas horas iniciais, e os
valores mais elevados entre a 14 e 16 h, onde ocorreu a maior crescimento celular.
Figura 5: Perfil de proteínas totais (mg/mL) e acidez titulável (g ácido cítrico/100 mL)
em suco de cajá fermentado por L. acidophilus.
Sabe-se que a acidez pode reduzir significativamente a viabilidade das
células microbianas, portanto torna-se essencial o seu monitoramento para garantir
os efeitos desejados sobre viabilidade. É relatado que L. acidophilus tolera acidez na
faixa de 0,3% a 1,9%69.
O resultado encontrado no presente estudo difere do estudo feito com frutas
tropicais, no qual foi observado que a acidez titulável tinha um perfil crescente a
partir de 24 h refletindo o maior crescimento microbiano40. O perfil crescente dessa
pesquisa foi a partir de 10 h, atingindo maior acidez titulável em 16 h. Após essa
hora há queda brusca dos valores de acidez atingindo os menores valores de acidez
até o final da fermentação.
41
De maneira análoga ao observado no presente trabalho, um estudo realizado
com iogurte de extrato hidrossolúvel de soja, fermentado por BAL mostrou que o
maior de valor de acidez titulável foi obtido no período de maior viabilidade celular66.
Neste estudo, a concentração de proteínas totais também foi avaliada durante
as 24 h de fermentação, como ilustrado na Figura 5. O suco não inoculado
apresentou uma concentração de proteínas totais de 0,19 (0,01) mg/mL. Durante a
fermentação, esta concentração variou pouco, com valores oscilando entre 0,20
(0,01) e 0,13 (0,01) mg/mL. Quando comparados à concentração de proteínas totais
com a viabilidade celular, pode-se notar que no período de maior crescimento
microbiano (16 h), foi observado menor concentração de proteínas, o que pode
sugerir maior metabolização das proteínas por parte do micro-organismo.
É de crucial importância analisar que, apesar da baixa concentração de
proteínas totais encontrada no suco, Sameh et al.70 descrevem que as espécies do
gênero Spondias são ricas em aminoácidos livres, como glicina, cisteína, serina,
alanina e leucina. A presença destes aminoácidos livres no suco de cajá representa
uma vantagem adicional, e também, poderia justificar a boa adaptação de L.
acidophilus na matriz estudada.
42
5.3 DETERMINAÇÃO DE COMPONENTES FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
A atividade antioxidante e a concentração de componentes fenólicos totais
foram inicialmente determinadas no suco não fermentado (SNF), como mostra a
Tabela 5.
Tabela 5: Concentração de componentes fenólicos totais e atividade antioxidante no
suco não fermentado.
Parâmetro Média (DP)
Fenólicos totais (µg EAG/mL) 609,3 (8,8)
DPPH (µmol TE/mL) 3,28 (0,02)
ABTS (µmol TE/mL) 3,56 (0,25)
Em seguida, avaliou-se a concentração de fenólicos totais e a atividade
antioxidante durante as 24 h de fermentação, e os resultados estão apresentados na
Figura 6.
Ao longo da fermentação foi observado que a atividade antioxidante, avaliada
através dos testes capacidade de sequestro dos radicais DPPH e ABTS, apresentou
variações, com atividades máximas de 0,38 (0,01) µmol TE/mL e 2,87 (0,13) µmol
TE/mL, respectivamente. A maior concentração de fenólicos de 123,20 (7,36) µg
EAG/mL ocorreu em 14 h de fermentação.
43
Figura 6: Concentração de componentes fenólicos totais e atividade antioxidante
(DPPH e ABTS) durante 24 h de fermentação do suco de cajá por L. acidophilus.
Antioxidantes são compostos capazes de retardar a velocidade da oxidação
através de um ou mais mecanismos impedindo a formação de radicais livres e
complexação de metais. A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se
principalmente às suas propriedades de oxido-redução desempenhando um papel
significativo na absorção e neutralização de radicais livres, podendo atuar, ainda,
como quelante de metais ou ainda na decomposição de peróxidos71.
No suco não fermentado (SNF), a concentração de fenólicos foi de 609,3 (8,8)
µg EAG/mL (Tabela 4), ou seja, valor quase cinco vezes superior aos valores
encontrados no suco fermentado (SF). Esse fato pode ser explicado devido aos
efeitos de processamento sofridos pelo suco antes e durante a fermentação. Sabe-
se que o teor de polifenóis no produto final depende da concentração e da atividade
do teor dos seus substratos, os ácidos fenólicos, além do pH, da temperatura e da
concentração de oxigênio dissolvido no suco72.
44
Sugere-se que o ajuste do pH do suco de cajá realizado antes da
fermentação seja responsável pela modificação do metabolismo de compostos
fenólicos, bem como sua disposição para a quantificação73. Em consequência do
teor de compostos fenólicos mais elevados no SNF, a atividade antioxidante da
amostra sem ajuste de pH também foi maior. Foi observada atividade antioxidante
(SNF) pelo sequestro do radical DPPH de 3,28 (0,02) µmol TE/mL e pelo radical
ABTS de 3,56 (0,25) µmol TE/mL (Tabela 4).
De maneira análoga ao encontrado no presente estudo, Hashemi et al.32
descreveram uma redução significativa na concentração de fenólicos totais em suco
de limão doce fermentado com L. plantarum LS5, o que foi atribuído ao metabolismo
destes componentes pelo micro-organismo.
Por outro lado, alguns estudos relatam o aumento de compostos fenólicos
totais ao longo da fermentação74,75,76. Esse fato pode estar relacionado à capacidade
das bactérias ácido-láticas converterem os compostos bioativos presentes no suco
em seus metabólitos, que resultam na produção de novos compostos fenólicos.
Um estudo mostrou em análise similar, após 24 h de fermentação, a cultura
bacteriana entra na fase de morte e, portanto, o aumento de fenóis totais é
insignificante75, resultado que difere do presente estudo, no qual percebeu-se a
morte celular, bem como a diminuição dos compostos fenólicos e atividade
antioxidante após a 16a hora de fermentação.
Outro estudo também mostra o aumento do sequestro do radical DPPH ao
longo da fermentação com linhagens de Lactobacillus sp., ou seja, confirma a
capacidade de atividade antioxidante em matrizes de origem vegetal35. Como foi
visto também que o teor total de polifenóis do suco de manga aumentou durante a
fermentação com o L. plantarum76.
Em outro trabalho, analisando estabilidade, foi observado que após 30 dias a
atividade antioxidante, bem como a concentração de fenólicos diminuíram. Podendo
ser essa diminuição a consequência do armazenamento dos frutos e suas perdas
naturais de armazenamento, bem como a presença de oxigênio, resultando na
oxidação de compostos fenólicos, e também pela baixa atividade das bactérias
probióticas em temperaturas refrigeradas77.
45
Em um estudo feito com duas matrizes diferentes, com frutas vermelhas e
verdes, foi visto um efeito positivo da fermentação de bactérias do ácido lático,
também do gênero Lactobacillus sp., na atividade antioxidante. Foi observado que
os compostos polifenólicos foram preservados nas amostras fermentadas65.
Assim, pode-se observar no presente estudo que, apesar do SF apresentar
uma diminuição do teor de fenólicos totais bem como a capacidade antioxidante, o
diferencial da bebida é associar as características antioxidantes do suco à presença
do micro-organismo probiótico.
5.4 AVALIAÇÃO DA COR
A cor é uma característica que compõe a qualidade sensorial de produtos
alimentícios no mercado, sendo de grande importância na aceitação do produto.
Assim, as alterações de cor nas formulações são ilustradas na Figura 7.
Figura 7: Representação fotográfica das três formulações analisadas, F1, F2 e F3,
respectivamente.
As amostras foram avaliadas em relação às coordenadas de cor, e os
resultados são apresentados na Tabela 6.
46
Tabela 6. Coordenadas de cor obtidas para as três formulações de suco de cajá
utilizadas na análise sensorial.
Formulação Coordenadas de cor
L* a* b*
F1 21,983 (0,010)a 13,648 (0,053)a 22,645 (0,472)a
F2 13,720 (0,213)b 5,172 (0,904)b 10,662 (0,713)b
F3 11,780 (0,465)c 6,635 (0,818)b 10,470 (0,825)b
abcLetras diferentes na mesma coluna indicam que há diferença estatística entre as
médias a 95% de confiança pelo teste de Tukey (p<0,05).
Quanto ao parâmetro luminosidade (L*), percebe-se que os valores
diminuíram após a fermentação, tornando o suco mais escuro. Destaca-se que o
suco fermentado e adoçado apresentou menor valor de L*. Neste sentido, a
diferença significativa observada para L* entre os sucos fermentado pode ser
justificada pela presença do adoçante estévia a 10%, que possivelmente contribuiu
para redução da luminosidade na amostra adoçada.
Além disso, as coordenadas a* e b* diferiram significativamente entre os
sucos controle (F1) e os fermentados (F2 e F3), confirmando que a fermentação de
L. acidophilus no suco de cajá interferiu nestes parâmetros de cor.
Ao avaliar as coordenadas de cor do suco de abacaxi com juçara fermentado
por L. rhamnosus GG, Campos et al.73, não observaram interferência na
luminosidade em relação ao suco controle (não fermentado), no entanto, a adição do
probiótico foi capaz de alterar significativamente as coordenadas de cor a* e b*.
Ademais, de maneira análoga ao observado em nosso estudo, Costa et al.79
relataram que a adição de L. paracasei promoveu escurecimento em suco de
laranja, com consequente perda da cor amarela, comprometendo a aceitabilidade do
produto pelos consumidores.
47
5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
O sobrenadante suco de cajá fermentado por L. acidophilus por 16 h foi
submetido a ensaios in vitro para avaliação de seus efeitos inibitórios sobre o
crescimento de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae, bactérias oportunistas de relevância clínica por acometer
pacientes pós-cirúrgicos e imunocomprometidos. A Tabela 7 descreve o percentual
de inibição do crescimento microbiano obtido para o sobrenadante do suco de cajá
fermentado com L. acidophilus.
Tabela 7: Atividade antimicrobiana do sobrenadante do suco de cajá fermentado por
L. acidophilus durante 16 h.
Micro-organismo Inibição do crescimento (%)ª
Staphylococcus aureus 44,5 (12,4)
Enterococcus faecalis NDb
Escherichia coli 35,0 (3,3)
Klebsiella pneumoniae 16,1 (0,9)
aResultado expresso em média (DP)
bNão detectado
Estudos anteriores relatam a atividade antimicrobiana de uma variedade de
probióticos contra micro-organismos patogênicos80,81. É importante destacar, ainda,
que o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos têm motivado a pesquisa
de novas alternativas antimicrobianas, das quais os probióticos ganharam um forte
interesse. Neste sentido, o consumo de alimentos contendo Lactobacillus spp. e
Bifidobacterium spp. poderia auxiliar no combate de infecções microbianas e
melhorar a saúde humana82.
Os resultados encontrados no presente estudo, mostram que houve inibição
de crescimento dos micro-organismos Staphylococcus aureus (44,5%) e Escherichia
coli (35,0%), e menor inibição para Klebsiella pneumoniae (16,1%). Uma justificativa
para atividade encontrada é a produção compostos como bacteriocinas, ácido lático
e peróxido de hidrogênio por L. acidophilus83.
48
Abdelhamid et al.81, avaliaram a inibição do crescimento de 6 linhagens de E.
coli por diferentes probióticos, incluindo L. acidophilus, que foi capaz de inibir 56,9%
do crescimento. Nesse mesmo estudo, foram utilizados outros probióticos, como B.
longum, B. bifidum, L. helveticus e L. rhamnosus, sendo observado que a inibição do
crescimento variando de 48,62% a 57,94%.
No estudo de Hashemi et al.32 que utilizou o suco de limão para fermentação
de L. plantarum, foi observado um aumento da atividade antibacteriana durante a
fermentação, mostrando assim, que as propriedades antibacterianas foram
aceitáveis contra E. coli, e também contra S. typhimurium.
Koohestani et al.83, também demonstraram a atividade antimicrobiana de L.
acidophilus LA5 e L. casei 431 contra S. aureus. Foi avaliada pelo método da
difusão em ágar por poço, e os resultados encontrados mostram que diâmetros das
zonas de inibição de L. acidophilus foram de 50,26 mm e os de L. casei de 37,06
mm, ou seja, o L. acidophilus apresentou uma atividade antimicrobiana satisfatória
para este micro-organismo.
De maneira similar aos resultados obtidos no atual estudo, Tejero-Sariñena et
al.80 descreveram uma atividade antimicrobiana significativa de L. acidophilus
NCIMB 30184 contra E. coli e S. aureus. E, também, para E. fecalis, divergindo do
resultado encontrado no presente estudo, visto que não foi detectado atividade
antimicrobiana para este micro-organismo.
Em contrapartida, Mogna et al.84, em um estudo in vitro, avaliando a inibição
da K. pneumoniae por L. delbrueckii, observou que houve inibição do micro-
organismo, diferentemente do que foi encontrado no atual estudo, onde para K.
pneumoniae houve inibição leve. É sugerido que o maior efeito inibitório de L.
delbrueckii pode ser atribuído a uma característica específica dessa linhagem, que é
uma produção elevada de bacteriocinas.
Em outro estudo, testando a atividade antimicrobiana de diferentes linhagens
de Lactobacillus sp. e antibióticos padrão contra micro-organismos uropatogênicos,
Shim et al.85 demonstraram que os probióticos possuíam maior zona de inibição
quando comparados a alguns antibióticos, confirmando, assim, a sua eficiência
antimicrobiana.
49
Portanto, os achados desta pesquisa revelam resultados positivos quanto a
inibição do crescimento de micro-organismos patogênicos em diferentes proporções,
corroborando com que é descrito na literatura sobre a capacidade antimicrobiana de
micro-organismos probióticos.
5.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28
DIAS
Um dos grandes desafios no desenvolvimento de bebidas vegetais probióticas
é fazer com que o micro-organismo mantenha a sua viabilidade e funcionalidade
durante toda a vida de prateleira do produto. Neste estudo, a estabilidade
microbiológica do suco de cajá fermentado com L. acidophilus, armazenado sob
refrigeração (4 °C) foi avaliada por 28 dias. Os resultados são apresentados na
Figura 8.
Figura 8: Estabilidade microbiológica da bebida fermentada durante armazenamento
por 28 dias. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre as médias
a 95% de confiança (p<0,05).
50
Os resultados mostraram que a contagem de células viáveis no suco de cajá
caiu de 12,0 (0,1) Log UFC/mL no dia 0 para 9,3 (0,2) Log UFC/mL no dia 7, com o
tempo de armazenamento influenciando significativamente a viabilidade de L.
acidophilus nos primeiros 7 dias (p<0,05). Logo em seguida, a viabilidade se
manteve estável nos dias 14, 21 e 28, com uma contagem de 8,7 (0,7) Log UFC/mL
no final do período.
É importante destacar que contagem permaneceu acima de 6,0 Log UFC/mL
durante todo o período de armazenamento, o que corresponde a uma quantidade
superior a 106 UFC/mL, o valor mínimo exigido pela legislação para leites
fermentados86. Esse valor foi usado como referência para o suco produzido neste
trabalho, em virtude da inexistência de parâmetros específicos para sucos
fermentados.
A fruta escolhida para elaboração de sucos fermentados apresenta forte
influencia na viabilidade inicial e final de estoque do produto. Em pesquisa, com
metodologia similar, avaliando estabilidade por 28 dias no suco de jujuba (Ziziphus
jujuba Mill.) fermentado com L. rhamnosus GG e L. plantarum, inicialmente foi
observado um ligeiro aumento da contagem de células viáveis para 9,2 Log UFC/mL
e após 28 dias houve uma diminuição para 8,4 Log UFC/mL87.
Alguns autores sugerem que essa diminuição na contagem celular, pode estar
ligada às condições desfavoráveis de pH e alto grau de acidez durante a
estocagem87. No entanto, no presente trabalho esse efeito foi minimizado, uma vez
que o pH oscilou entre 6,63 e 6,95 durante toda a fermentação.
Por outro lado, a baixa temperatura empregada inicialmente na refrigeração,
poderia ser um fator de estresse para a célula microbiana, constituindo-se num fator
limitante da manutenção da viabilidade do micro-organismo. Entretanto, após esse
estresse inicial pode-se observar que a temperatura promoveu a manutenção da
viabilidade da bebida probiótica na temperatura de 4 ºC.
Em uma pesquisa, a estabilidade de nove linhagens do gênero Lactobacillus
em uma bebida de fruta com pH de 4,2 estocada a 4 ºC foi avaliada por até 80 dias,
com L. plantarum demonstrando a melhor viabilidade após período de
armazenamento refrigerado e L. acidophilus com a menor viabilidade ao final dos 80
dias88. Após a avaliação da estabilidade de uma bebida derivada do leite e em um
suco de cenoura, por 20 dias, foi observado que as linhagens de L. acidophilus e L.
51
plantarum não perderam viabilidade significativa durante este período em ambas as
matrizes89.
Igualmente, no suco de caju fermentado por L. casei NRRL-442, foi
observado que no início do armazenamento, houve uma alta concentração de
células viáveis de 8,63 (0,04) Log UFC/mL até ao 28º dia de armazenamento a 4 °C.
A partir do 35° dia, houve uma ligeira redução da contagem de células viáveis para
8,53 (0,05) Log UFC/mL. Apesar dessa redução na viabilidade no final do período de
armazenamento, a contagem de células viáveis de L. casei foi sempre superior a
8,00 Log UFC/mL, o que é um bom valor para produtos fermentados contendo
probióticos41.
Em um estudo utilizando o cacau como matriz para a fermentação de
bactérias do ácido lático, e avaliando sua estabilidade refrigerada a 4 oC por 42 dias,
foi observado que viabilidade do suco probiótico com adição de sacarose aumentou
de 8,76 (0,05) Log UFC/mL, no início da armazenagem para 8,99 (0,02) Log
UFC/mL, no dia 21. E então, a partir do dia 28, ocorreu redução da viabilidade para
7,52 (0,01) Log UFC/mL até 42 dias90.
52
5.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM
CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS
Outro requisito imprescindível para um alimento probiótico é que a estirpe
seja capaz de sobreviver às condições do trato grastrointestinal (TGI), tolerando pH
ácido, ação de enzimas digestivas e sais biliares73. Para avaliar a sobrevivência do
micro-organismo em condições gastrointestinais simuladas bem como sua
adequação a matriz, a viabilidade de L. acidophilus foi analisada in vitro utilizando o
suco recém-fermentado e após 28 dias de armazenamento sob refrigeração.
Figura 9: Viabilidade celular L. acidophilus NRRL B-4495 em condições
gastrointestinais simuladas no armazenados sob refrigeração no suco recém-
fermentado e no suco após 28 dias de armazenamento. Letras iguais indicam que
não há diferença estatística entre as médias a 95% de confiança (p<0,05).
A sobrevivência de L. acidophilus no suco submetido às condições
gastrointestinais simuladas é mostrada na Figura 9. O ensaio in vitro foi analisado
para as fases gástrica I (60 minutos), gástrica II (120 minutos), entérica I (180
minutos) e entérica II (240 minutos).
53
Ao avaliar o comportamento do probiótico nas diferentes fases, verificou-se
que para o suco recém-fermentado, a viabilidade da cultura probiótica antes da
exposição ao estresse gástrico não diferiu (p<0,05) da viabilidade da fases gástricas
e intestinais. No entanto, o suco refrigerado pelo período de 28 dias apresentou
contagens de células viáveis para as fases entéricas I e II, significativamente
menores (p<0,05), caindo de 11,78 Log UFC/mL (0,03) no tempo 0 para 11,58 Log
UFC/mL (0,0) e 11,55 Log UFC/mL (0,05) respectivamente (Figura 8).
Apesar da redução estatisticamente significativa do probiótico refrigerado nas
condições intestinais simulada para a bebida armazenada por 28 dias, é importante
destacar que a contagem de células viáveis ainda permaneceu acima de 6,00 Log
UFC/mL, para fornecer os efeitos benéficos, segundo preconiza a legislação para
leites fermentados e estudos da área86.
Os resultados encontrados corroboram com a afirmação de que a matriz
carreadora exerce ação sobre a estirpe probiótica durante a passagem pelo trato
gastrointestinal. Desta forma, a fermentação realizada em suco de cajá pode ter
possibilitado uma adaptação do microrganismo à matriz carreadora, o que também
pode ter favorecido a manutenção da contagem de células viáveis, mesmo em
condições adversas.
Em um estudo, onde também foi avaliado a sobrevivência de espécies de
Lactobacillus em condições gastrointestinais simuladas, foi observado um resultado
positivo. As bactérias probióticas investigadas exibiram uma viabilidade muito boa
contra ambas as tensões: 0,3% de pepsina e 0,6% de sais biliares. Apenas uma
perda de 0,01 Log UFC/mL foi detectada após o tratamento com 0,3% de pepsina
por 135 minutos77.
Outros estudos com metodologia similar, utilizando linhagens diferentes de
Lactobacillus spp. também descrevem a resistência de bactérias probióticas aos
estresses gástricos, mantendo-se viável em contagens satisfatórias em todo trânsito
gastrointestinal88,91.
Em pesquisa realizada por Ortakci et al.92, também com a espécie L.
acidophilus, foi observada diminuição da viabilidade celular após 30 minutos de
exposição do micro-organismo às condições gastrointestinais simuladas, com a
diminuição numérica de 109 para 106.
Diante disto, conclui-se que os achados no presente estudo demonstram que
a viabilidade do probiótico foi satisfatória sob condições simuladas de digestão,
54
indicando o potencial do produto em atingir o lúmen intestinal e exercer benefícios a
saúde do hospedeiro.
5.7 ANÁLISE SENSORIAL
5.7.2 PERFIL DOS PROVADORES
De acordo com a seleção de provadores, obedecendo os critérios de inclusão,
obteve-se uma amostra de 88 provadores, sendo majoritariamente do sexo feminino,
com 72 voluntários (81,81%) e apenas 16 (18,18%) do sexo masculino, com idades
entre variando de 18 a 46 anos.
Na variável escolaridade, foi observado que a maioria, possuía ensino
superior incompleto (68,18%) e ensino superior completo (19,31%). Além disso,
11,36% e possuíam ensino médio completo e 1,13% ensino fundamental completo.
Os provadores foram questionados em relação à presença de dores no
momento da análise e também sobre alergias e intolerâncias alimentares, referentes
aos ingredientes presentes nas amostras e todos negaram a presença desses
fatores.
Em relação a quanto os provadores gostam de suco de cajá, bebidas
fermentadas e suas devidas frequências de consumo, foi visto que a maioria 87,95%
marcou a opção “gosto muito”, 25% “gosto moderadamente” e 6,81% “gosto
ligeiramente” de suco de cajá. A minoria escolheu indiferença “nem gosto e nem
desgosto” (4,54%) e apenas 2,27%, 2,27% e 1,13% escolheram “desgosto
moderadamente”, “desgosto ligeiramente” e “desgosto muito”, respectivamente,
referente a intensidade de quando gostam de suco de cajá.
Os resultados sobre o quanto os provadores gostam de bebida fermentada
foram os seguintes: 29,54% elegeram a opção “gosto muito”, 23,86% “gosto
ligeiramente”, 23,86% “gosto moderadamente”, 11,36% “nem gosto nem desgosto”,
6,81% “desgosto ligeiramente”, 2,27% “desgosto moderadamente”, e 2,27%
“desgosto muito”. E ainda sobre as bebidas fermentadas, foi perguntado aos
provadores quanto a frequência de consumo desse tipo de bebida, podendo
observar que 36,36% alegaram consumo “mensal”, 18,18% “nunca”, 15,90%
55
“quinzenalmente”, 15,90% “1 vez por semana”, 11,36% “2-3 vezes por semana” e
2,27% “diariamente”.
5.7.3 TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL
A Tabela 8 apresenta o índice de aceitação das três formulações, sendo F1 a
formulação do suco de cajá (não fermentado), F2 a formulação do suco de cajá
fermentado e F3 a formulação do suco de cajá fermentado e adoçado com estévia.
Tabela 8: Média, mediana e índice de aceitação (%) de cada formulação analisada.
Parâmetro F1 F2 F3
Média de aceitação 5,78 (1,97) 2,19 (1,40) 3,74 (2,25)
Mediana 6ª 2c 3b
Índice de aceitação (%) 64,77 36,55 41,54
abcLetras diferentes na mesma linha mostram que as medianas das formulações
diferiram entre si pelo teste de Kruskal-Wallis com teste Dunn e correção de
Bonferroni (p<0,05).
Os dados de aceitação global não apresentaram distribuição normal. Assim,
foi realizado o teste de Kruskal-Wallis com teste Dunn para comparações Múltiplas e
correção de Bonferroni. Pode-se observar que as três formulações diferiram
estatisticamente entre si (p<0,0001) e que todas elas tiveram índice de aceitação
baixo (<70%)96. Em relação a isso, a formulação 1 (padrão), referente ao suco de
cajá não fermentado, teve maior índice de aceitação (64,77%).
Em contrapartida, a formulação F2, referente a amostra fermentada obteve o
pior IA de 36,55%, seguida da F3 com 41,54%. Essas aceitações mais baixas das
formulações fermentadas, podem estar ligadas ao ajuste de pH do suco para o valor
ideal da fermentação (6,4) pela adição de bicarbonato de sódio, causando
mudanças na cor (fica mais escura), viscosidade (mais viscoso) e no sabor.
Outrossim, é importante destacar que o crescimento da cultura probiótica pode gerar
metabólitos que contribuem de forma negativa para os aspectos organolépticos do
produto.
Apesar de ser uma amostra fermentada nas mesmas condições que a F2, a
F3 possuiu um IA maior. Por ser a amostra adoçada (estévia), pode-se concluir que
56
o sabor doce nessa formulação agradou mais os provadores, em comparação com a
formulação fermentada sem acréscimo de adoçante.
Assim como no presente estudo, Pereira et al.41, realizaram análise sensorial
de suco de probiótico, com uma formulação adoçada com um maior teor de
sacarose e outra formulação com um teor mais baixo do mesmo adoçante. Foi visto
que a aceitação geral foi maior da formulação mais doce. Podendo estar relacionado
à preferência e o alto consumo dos brasileiros por produtos doces93.
Para avaliar as respostas individuais de cada provador e não apenas a média
do grupo, foi realizado um teste de avaliação do componente principal, um tipo de
análise de variável multivariada, usando uma matriz com dimensões de 3 amostras x
88 consumidores para a avaliação da aceitação global. Sendo assim, os dados
foram ajustados e o resultado do teste de aceitação foi apresentado através de um
mapa de Biplot (mapas vetoriais de preferência interna), como mostrado na Figura 9.
Figura 10: Mapa de preferência interna da aceitação global de cada provador pela
avaliação do componente principal.
Os mapas apresentam os consumidores, representados pelos vetores e as
amostras são dispersas entre eles. De acordo com Reis et al. 95 para que a
avaliação do componente principal seja eficiente, é desejável que os dois primeiros
F1
F2
F3
P1
P3
P4
P6
P8
P9
P10
P11
P12
P13P14P15
P17
P19
P20
P21P22
P23
P24
P25
P27
P28
P29P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
P41
P42
P43
P44P46P47
P48
P49
P50
P51
P52
P53P54P55P56
P57
P58
P59
P60P61
P62
P63
P64
P65
P66
P67P68
P69
P70
P71 P72
P73
P74
P75
P76
P77
P78
P79
P80
P81
P82
P83
P85
P86
P87
P88
P89
P90
P91
P92P93
P95P96
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
PC
2 (
21
,96
%)
PC1 (78,04 %)
Biplot (eixos F1 e F2: 100,00 %)
57
componentes acumulem uma porcentagem de variação >70%, como observado no
mapa gerado acima, onde PC1 é 78,04%.
Pode-se perceber maior densidade de vetor direcionado ao quadrante
referente a formulação F1, confirmando assim a maior aceitação dos provadores por
essa amostra. E ainda, é observado que apenas um provador preferiu a formulação
F2, confirmando também o seu resultado de menor aceitação.
5.7.4 “JUST ABOUT RIGHT” (JAR)
O teste “Just About Right” (JAR) foi realizado para avaliar a intensidade da
influência dos atributos acidez, sabor doce, viscosidade e cor, na aceitação de cada
formulação testada (F1, F2, F3), como mostra a Figura 10.
Figura 11: Intensidade da influência dos atributos acidez, sabor doce, viscosidade e
cor na aceitação da formulação 1, 2 e 3.
É observado que entre as formulações, a F1 foi a amostra qual os provadores
elegeram como ideal a metade dos atributos avaliados, viscosidade e cor. Já em
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
F3 COR
F3 VISCOSIDADE
F3 SABOR DOCE
F3 ACIDEZ
F2 COR
F2 VISCOSIDADE
F2 SABOR DOCE
F2 ACIDEZ
F1 COR
F1 VISCOSIDADE
F1 SABOR DOCE
F1 ACIDEZ
35,22
9,09
12,5
68,18
11,36
7,95
81,81
65,9
5,68
6,81
65,9
1,13
2,27
43,18
15,9
26,13
26,13
11,36
10,22
13,63
89,77
73,86
30,68
36,36
62,5
47,72
71,59
5,68
62,5
80,68
7,95
20,45
4,54
19,31
3,4
62,5
menos que o ideal JAR mais que o ideal
58
relação aos atributos sabor doce e acidez, os resultados mostram que a maioria
escolheu os extremos da escala para classificar a intensidade desses atributos,
sendo acidez escolhida por eles como “mais que o ideal” (62,5%) e sabor doce,
“menos que o ideal” (65,9%).
Em contrapartida, na F2, podemos observar que a acidez e o sabor doce são
classificados na escala “menos que o ideal” (65,9% e 81,81%, respectivamente) e os
atributos viscosidade e cor estão na escala “mais que o ideal” (80,68 e 62,5%,
respectivamente) mostrando assim, que os avaliadores consideraram todos os
atributos dessa formulação não satisfatórios.
Na F3, é visto também que todos os atributos são considerados fora do ideal.
Sendo o atributo acidez definido como “menos que o ideal” (68,18%), assim como na
formulação anterior, o sabor doce classificado como ”mais que o ideal” (71,59%) , ou
seja, a maioria dos provadores consideraram a amostra mais doce do que
gostariam. E ainda definiram viscosidade e cor “mais que o ideal” (47,72% e 67,5%,
respectivamente). Ou seja, é observado também, uma insatisfação a todos os
atributos dessa formulação.
A fermentação foi responsável por alterar alguns aspectos sensoriais
importantes, principalmente a cor e viscosidade, que nas amostras fermentadas
ficaram bem diferentes do padrão de suco, afetando diretamente na aceitação do
provador.
Para confirmar a influência dos atributos na aceitação do provador de cada
formulação foi feito o teste de penalidade quando mais que 20% dos provadores
escolheram um extremo para avaliar aquele atributo. Sendo assim, foi gerado
resultados específicos para F1, F2 e F3.
A Tabela 9 mostra as penalidades da formulação 1 (padrão), é importante
ressaltar que os atributos cor e viscosidade para a maioria dos provadores foram
atributos definidos como ideal.
59
Tabela 9: Tabela de teste de penalidade da formulação 1.
Variável Nível % Efeitos
na média p-valor
Penalidades
p-valor
Menos ácido
1,14% 4,125
ACIDEZ JAR 36,36% 2,107 < 0,0001
Mais ácido
62,50% 2,070 < 0,0001
Menos intenso
65,91% 2,289 < 0,0001
SABOR DOCE
JAR 30,68% 2,395 < 0,0001
Mais
intenso 3,41% 4,444
Menos viscoso
6,82% 1,864
VISCOSIDADE
JAR 73,86% 0,944 0,048
Mais
viscoso 19,32% 0,619
Muito clara
5,68% 0,048
COR JAR 89,77% 0,626 0,370
Mais
escura 4,55% 1,348
Em contrapartida, atributo acidez foi avaliado como mais ácido do que o ideal
(62,50%), tendo assim, um efeito elevado na média (2,070), evidenciando assim que
a acidez elevada da formulação 1, foi um atributo que influenciou significativamente
(< 0,0001) na aceitação dessa amostra.
Também é observado um maior efeito da média (2,289) e consequentemente
maior efeito na aceitação dessa formulação, quando avaliado o atributo sabor doce
que foi classificado por 65,91% dos provadores num nível de intensidade menor do
que eles gostariam (“menos intenso”). Para os níveis “menos ácido” da acidez e
“mais intenso” do sabor doce não foi possível calcular o teste devido ao percentual
de provador inferior a 20%.
Sabendo disso, conclui-se acerca da formulação 1, que apesar de todos os
atributos terem significância estatística, apenas os atributos acidez e sabor doce
influenciaram a aceitação pelos provadores (Figura 12).
60
Sendo assim, é necessário melhorar os atributos que os provadores
consideraram importantes para a aceitação dessa formulação. Podendo ser testado
o aumento da diluição dessa amostra e ainda, adicionar adoçante, como estratégia
de tentar diminuir a acidez e evidenciar um sabor mais doce.
Figura 12: Efeitos na média (%) dos atributos penalizados na F1, sendo o eixo
horizontal o percentual de provadores e eixo vertical referente a queda média.
Os resultados adquiridos através do teste de penalidade referente a
formulação 2 estão descritos na Tabela 10. Podemos observar a significância
estatística dos atributos, e que a maioria dos provadores avaliaram a amostra nos
níveis de menor e maior intensidade e em consequência disso, longe do ideal (JAR).
Analisando o efeito da média, podemos concluir que um alto percentual de
provadores que penalizaram significativamente a formulação quando consideraram
que a amostra estava menos ácida (acidez) (p = 0,014) e mais viscosa (viscosidade)
(p = 0,046) que o ideal. Em consequência disso, pode-se concluir que esses
atributos foram os que influenciaram na aceitação da formulação 2, já que mesmo o
ACIDEZ
ACIDEZSABOR DOCE
SABOR DOCE
VISCOSIDADE
VISCOSIDADE
COR
COR
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 10 20 30 40 50 60 70
Efe
ito
s n
a m
éd
ia
%
Efeitos na média vs %
Demasiadamente pouco
61
sabor doce pouco intenso e a cor muito escura sendo atributos que sofreram
penalidades, estes não foram significativos (Figura 13).
Tabela 10: Teste de penalidade referente a formulação 2 em valores de percentual
(%), efeitos na média e penalidades (p-valor).
Variável Nível % Efeitos
na média
p-valor Penalida
des p-valor
Menos ácido 65,91% 1,236 0,014
ACIDEZ JAR 13,64% 1,127 0,009
Mais ácido 20,45% 0,778 0,277
Menos intenso 81,82% 0,319 0,531
SABOR DOCE
JAR 10,23% 0,404 0,417
Mais intenso 7,95% 1,270
Menos viscoso 6,82% -0,091 VISCOSIDA
DE JAR
12,50% 0,818 0,071
Mais viscoso 80,68% 0,895 0,046
Muito clara 4,55% 0,848
COR JAR 26,14% 0,209 0,542
Mais escura 69,32% 0,167 0,634
62
Figura 13: Efeitos na média (%) dos atributos penalizados na F2, sendo o eixo
horizontal o percentual de provadores e eixo vertical referente a queda média.
ACIDEZ
ACIDEZ
SABOR DOCE
SABOR DOCE
VISCOSIDADE
VISCOSIDADECOR
COR
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Efe
ito
s n
a m
éd
ia
%
Efeitos na média vs %
Demasiadamente pouco
63
Sobre o Teste de penalidade realizados na formulação 3, os resultados estão
descritos na Tabela 11.
Tabela 11: Teste de penalidade referente a formulação 3 em valores de percentual
(%), efeitos na média e penalidades (p-valor).
Variável Nível % Efeitos
na média
p-valor
Penalidades
p-valor
Menos ácido 68,18% 2,515
< 0,0001
ACIDEZ JAR 26,14% 2,473
< 0,0001
Mais ácido 5,68% 1,965
Menos intenso 12,50% 2,136
SABOR DOCE
JAR 15,91% 3,284
< 0,0001
Mais intenso 71,59% 3,484
< 0,0001
Menos viscoso 9,09% 1,184 VISCOSIDA
DE JAR
43,18% 1,664 0,000
Mais viscoso 47,73% 1,756 0,000
Muito clara 2,27% -0,597
COR JAR 35,23% 1,798 0,000
Mais escura 62,50% 1,885 0,000
No que se refere aos resultados encontrados dessa formulação, observa-se
uma particularidade comparado as outras formulações, que todos os atributos foram
significativos na aceitação global assim como, todos os atributos foram penalizados
significativamente (Figura 14) quando consideraram que a formulação estava menos
ácida (p< 0,0001) que o ideal, com o sabor doce mais intenso (p< 0,0001), mais
viscosa (p<0,001) e mais escura (p<0,001), por este motivo, conclui-se um alto
percentual de provadores e um alto efeito na média, consequentemente uma
influência direta de todos os atributos na aceitação dessa formulação, devendo
assim ser melhorados.
O sabor doce elevado nessa amostra é de fácil resolução, visto que é só
ajustar a proporção de adoçante utilizado (10% de estévia para cada 100mL). Os
64
outros atributos, alguns ajustes no preparo como a maior diluição do suco e ainda
alinhar-se com os conhecimentos da tecnologia dos alimentos para propor
melhorias.
Figura 14: Efeitos na média (%) dos atributos penalizados na F3, sendo o eixo
horizontal o percentual de provadores e eixo vertical referente a queda média.
Em relação a alteração de aspectos sensoriais importantes após a
fermentação, como cor, acidez e viscosidade, pode-se aplicar algumas medidas
para melhoria das formulações testadas, sendo umas delas, analisar e caracterizar
outros tempos de fermentação anteriores, para saber se com menos tempo de
fermentação há menores alterações sensoriais de cor e viscosidade, principalmente,
testar maior diluição da polpa do cajá e consequentemente, da amostra, analisar
juntamente com a tecnologia dos alimentos outras possibilidades para o ajuste do
pH que exerça menor influência na acidez do produto, e ainda, estabelecer
estratégias necessária para a melhoria das formulações no aspecto sensorial,
visando assim, melhor aceitação dos provadores sem prejudicar as características
tecnológicas e funcionais do produto que foram padronizadas e analisadas no
presente trabalho.
ACIDEZ
ACIDEZSABOR DOCE
SABOR DOCE
VISCOSIDADE
VISCOSIDADE
COR
COR
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Efe
ito
s n
a m
éd
ia
%
Efeitos na média vs %
Demasiadamente pouco
65
5.7.4 TESTE DE INTENÇÃO DE COMPRA
Os resultados obtidos para a intenção de compra durante o período sensorial
das amostras de suco de cajá fermentado estão representados na Figura 15.
Figura 15: Gráfico de intenção de compras das três formulações expressos em
percentual (%) no eixo vertical e escala hedônica variando de 1 a 5 no eixo
horizontal.
A partir dos resultados encontrados no presente estudo, percebe-se referente
a formulação F1 que os percentuais variaram de 30% a 15%, para “possivelmente
compraria” e “certamente compraria”, respectivamente. Apenas 8% dos provadores
afirmaram que “certamente não compraria” e 22% “possivelmente não compraria”. E
ainda, 8% dos provadores foram indiferentes a esta formulação (“talvez comprasse,
talvez não”). Sendo assim, pode-se perceber que a formulação 1 teve maior
interesse dos provadores para uma possível aquisição do produto.
Já em relação a intenção de compra da formulação F2, é evidenciado que
essa amostra possui o menor interesse na aquisição pelos provadores, visto que
66% decidiu que “certamente não compraria” e 23% “possivelmente não compraria”,
8% “talvez comprasse, talvez não”. E nenhum dos provadores marcou a
possibilidade de compra dessa formulação e apenas 3 escolheram a opção
8
2226
30
15
66
23
8
03
41
2419
15
1
0
10
20
30
40
50
60
70
Certamente nãocompraria
Possivelmente nãocompraria
Talvez comprasse,talvez não
Possivelmentecompraria
Certamente compraria
F1 F2 F3
66
“certamente compraria”. Concluindo-se assim, que a maioria não tem interesse de
comprar na amostra.
Os resultados referentes a F3, nos mostram baixa intenção de compra assim
como na F2. Assim, 41% dos provadores alegaram que “certamente não compraria”
esta formulação e ainda, 24% “possivelmente não compraria”. Na escala de
indiferença, 19% marcaram “talvez comprasse, talvez não”. Além disso, 15%
afirmaram que “possivelmente compraria" e apenas 1% dos provadores “certamente
compraria”.
Mesmo a formulação 1 tendo melhor interesse e maior possibilidade de
compra pelo provador quando comparado com as outras formulações, não teve um
bom percentual de pessoas que com certeza (“certamente”) comprariam o produto,
(apenas 15%). Segundo Ferreira et al.94, para um produto a ser considerado aceito
pelos consumidores como sua aprovação índice deve ser de 50% ou melhor,
levando em consideração as porcentagens obtidas para as pontuações 4
(provavelmente compraria) e 5 (certamente compraria).
Os resultados de intenção de compras refletem a aceitação das formulações.
Ou seja, a formulação que melhor foi aceita, teve maior intenção de compras pelos
provadores (F1). E as formulações com menores aceitação (F2 e F3), também
tiveram menor interesse de compra pelo consumidor. Ainda assim, esse teste de
intenção de compra, reforça a necessidade de aprimorar e melhorar as
características das amostras como já visto anteriormente, para que seja possível
aumentar o interesse dos consumidores para aquisição do novo produto probiótico
desenvolvido.
Por fim, outro aspecto de fundamental importância é quando ingredientes
funcionais, como os probióticos, sejam adicionados à alimentos, os consumidores
estejam cientes dos seus benefícios a saúde, percebendo o diferencial do produto
em relação ao convencional. Destaca-se que esse é um dos aspectos mais
importantes para a aceitação dos alimentos funcionais. Assim, a indústria de
alimentos deve comunicar os efeitos benéficos à saúde aos consumidores de forma
clara e compreensível.
67
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados nesta pesquisa, podemos afirmar que o
suco de cajá é uma matriz viável para o crescimento do Lactobacillus acidophilus em
quantidades suficientes para oferecer efeitos positivos a saúde, como é preconizado
pela legislação. Conclui-se também boa estabilidade e viabilidade ao longo de 28
dias de armazenamento sob refrigeração, bem como boa resistência do probiótico
ao estresse gastrointestinal. Podemos observar ainda boa concentração de
compostos fenólicos, sugerindo atividade antioxidante satisfatória quando
comparados a outros estudos, conferindo assim, aspecto funcional à bebida
probiótica. Em relação a análise sensorial, apesar da aceitação não ter sido
satisfatória, foi estabelecida as características que não agradaram aos provadores
nas formulações testadas, sendo assim, possível estabelecer os critérios que
necessitam de melhorias para tornar as formulações ideal ao gosto dos
consumidores, baseado em suas contribuições. Assim, este estudo mostrou grande
potencial para criação de uma nova bebida probiótica a base de suco de cajá, sendo
uma excelente alternativa aos tradicionais produtos lácteos.
68
REFERÊNCIAS
1. Panghal A, Janghu S, Virkar K, Gat Y, Kumar V, Chhikara N. Potential non-
dairy probiotic products – A healthy approach. Food Biosci [Internet].
2018;2:80–9. Available from: https://doi.org/10.1016/j.fbio.2017.12.003
2. Jaimez-Ordaz J, Martínez-Ramírez X, Cruz-Guerrero AE, Contreras-López E,
Ayala-Niño A, Castro-Rosas J, et al. Survival and proteolytic capacity of
probiotics in a fermented milk enriched with agave juice and stored in
refrigeration. Food Sci Technol. 2019;39(1):188–94.
3. Espirito-Santo AP, Carlin F, Renard CMGC. Apple, grape or orange juice:
Which one offers the best substrate for lactobacilli growth? - A screening study
on bacteria viability, superoxide dismutase activity, folates production and
hedonic characteristics. Food Res Int. 2015;78:352–60.
4. Global Probiotics and Prebiotics: Moving Beyond Digestive Health Status Quo.
2010;2016(October):7–8.
5. Raizel R, Santini E, Kopper AM, Filho AD dos R. Efeitos do consumo de
probióticos, prebióticos e simbióticos para o organismo humano. Ciência &
Saúde. 2011;4(2):66–74.
6. Pereira ALF, Feitosa WSC, Abreu VKG, Lemos T de O, Gomes WF, Narain N,
et al. Impact of fermentation conditions on the quality and sensory properties of
a probiotic cupuassu (Theobroma grandiflorum) beverage. Food Res Int.
2017;100:603–11.
7. Santos Filho AL dos, Freitas HV, Rodrigues S, Abreu VKG, Lemos T de O,
Gomes WF, et al. Production and stability of probiotic cocoa juice with
sucralose as sugar substitute during refrigerated storage. LWT - Food Sci
Technol. 2019;99:371–8.
8. Amorim JC, Piccoli RH, Duarte WF. Probiotic potential of yeasts isolated from
pineapple and their use in the elaboration of potentially functional fermented
beverages. Food Res Int. 2018;107:518–27. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.foodres.2018.02.054
9. Forzza RC, Leitman PM, Costa A, Carvalho Jr. AA de, Peixoto AL, Walter
BMT, et al. Catálogo de plantas e fungos do Brasil - Vol. 2. Vol. 2, Catálogo de
69
plantas e fungos do Brasil - Vol. 2. 2010.
10. de Carvalho JM, Maia GA, da Fonseca AV V., de Sousa PHM, Rodrigues S.
Effect of processing on physicochemical composition, bioactive compounds
and enzymatic activity of yellow mombin (Spondias mombin L.) tropical juice. J
Food Sci Technol. 2013;52(2):1182–7.
11. Caroline R, Silva DA, Cristina G, Santos V. Qualidade nutricional e parâmetros
morfológicos do fruto cajá (Spondias mombin L.). Rev Desafios.
2017;04(02):3–11.
12. Vinusha KS, Deepika K, Johnson TS, Agrawal GK, Rakwal R. Proteomic
studies on lactic acid bacteria: A review. Biochem Biophys Reports.
2018;14:140–8. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2018.04.009
13. Martirosyan DM, Singh J. A new definition of functional food by FFC: what
makes a new definition unique? Funct Foods Heal Dis. 2015;5(6):209–23.
Available from: http://www.ffhdj.com/index.php/ffhd/article/view/183/394
14. Coman MM, Cecchini C, Verdenelli MC, Silvi S, Orpianesi C, Cresci A.
Functional foods as carriers for SYNBIO®, a probiotic bacteria combination. Int
J Food Microbiol. 2012;157(3):346–52.
15. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução no 18, de 30 de
abril de 1999. D.O.U. - Diário Oficial da União 1999.
16. Mustafa SM, Chua LS, El-Enshasy HA, Abd Majid FA, Hanapi SZ, Abdul Malik
R. Effect of temperature and pH on the probiotication of Punica granatum juice
using Lactobacillus species. J Food Biochem. 2019 Apr 1;43(4).
17. Ghidurus M, Calin A, Beciu S, Ladaru R. Functional foods, probiotics and their
role on human health. J Biotechnol. 2015;208:S67. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.06.204
18. Modanesi PVG, Mercer NS, Bernardi JFB. Efeitos do uso de probióticos na
hipercolesterolemia. Rev Pesqui em Saúde. 2016;17(1):47–50.
19. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC No 241, de 26 de
Julho de 2018. D.O.U. - Diário Oficial da União 2018 p. 97.
70
20. FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotic in food. Joint FAO/WHO
Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in
Food, editor. London, Ontario, Canada; 2002. 1–11 p.
21. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Probióticos: construção da lista de
linhagens probióticas. 2017;1–14. Available from:
http://portal.anvisa.gov.br/documents/3845226/0/Análise+das+Linhagens+de+
Probióticos__23042018.pdf/6e37da13-2151-4330-85b0-0f449dbb0e95
22. Mustafa SM, Chua LS, El- Enshasy HA, Majid FAA, Malek RA. A Review on
Fruit Juice Probiotication: Pomegranate. Curr Nutr Food Sci. 2015;12(1):4–11.
23. Burns P, Lafferriere L, Vinderola G, Reinheimer J. Influence of dairy practices
on the capacity of probiotic bacteria to overcome simulated gastric digestion.
Int J Dairy Technol. 2014;67(3):448–57.
24. Villegas LM, Arango MC, Arias S. Effects of a food enriched with probiotics on
Streptococcus mutans and Lactobacillus spp. salivary counts in preschool
children: a cluster randomized trial. J Appl Oral Cience. 2018;26:1–9.
25. Saad SMI. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Rev Bras Ciências
Farm. 2006;42(1):1–16.
26. Garbaty T, Słońska A, Klimuszko D. Construction of a reporter system for
Lactobacillus sp. using the gfpuv gene. Pol J Vet Sci. 2011;14(4):655–7.
27. Widjiastuti I, Soetojo A, Cahyani F. Anti-glucan effects of propolis ethanol
extract on Lactobacillus acidophillus. Dent J (Majalah Kedokt Gigi).
2017;50(1):28.
28. Farias N, Soares M, Gouveia E. Enhancement of the viability of Lactobacillus
rhamnosus ATCC 7469 in passion fruit juice: Application of a central composite
rotatable design. LWT - Food Sci Technol. 2016;71:149–54. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2016.03.014
29. Abuajah CI, Ogbonna AC, Osuji CM. Functional components and medicinal
properties of food: a review. J Food Sci Technol. 2015;52(5):2522–9.
30. Viera VB, Piovesan N. Biotecnologia: aplicação tecnológica nas ciências
agrárias e ambientais. Ponta Grossa (PR): Atena; 2017. 323 p.
71
31. Sun B, Hu C, Fang H, Zhu L, Gao N, Zhu J. The Effects of Lactobacillus
acidophilus on the intestinal smooth muscle contraction through
PKC/MLCK/MLC signaling pathway in TBI mouse model. PLoS One.
2015;10(6):1–18.
32. Hashemi SMB, Mousavi Khaneghah A, Barba FJ, Nemati Z, Sohrabi Shokofti
S, Alizadeh F. Fermented sweet lemon juice (Citrus limetta) using Lactobacillus
plantarum LS5: Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities. J
Funct Foods. 2017;38:409–14. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.jff.2017.09.040
33. Paula I De, Theophilo P, Cintra B. Tratamento com probióticos na síndrome do
intestino irritável. Rev Bras Ciências da Saúde. 2008;19(3):271–81.
34. Wanga J, Cheng LK, Chen N. High-level production of L-threonine by
recombinant Escherichia coli with combined feeding strategies. Biotechnol
Biotechnol Equip. 2014;28(3):495–501.
35. Vivek K, Mishra S, Pradhan RC, Jayabalan R. Effect of probiotification with
Lactobacillus plantarum MCC 2974 on quality of Sohiong juice. LWT - Food Sci
Technol. 2019 Jul 1;108:55–60.
36. Santos GM, Farias VGC, Barbosa GS, Neiva RC, Andrade MCP. Probióticos
na terapia nutricional da doença de crohn. Rev UNINGÁ. 2018;33(1):111–20.
37. Lim EY, Kim JG, Jung SY, Song EJ, Lee SY, Shin HS, et al. Attenuating effects
of lactobacillus acidophilus YT1 on menopausal symptoms in ovariectomized
rats. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2018;47(12):1225–33.
38. Mantaring J, Benyacoub J, Destura R, Pecquet S, Vidal K, Volger S, et al.
Effect of maternal supplement beverage with and without probiotics during
pregnancy and lactation on maternal and infant health: A randomized
controlled trial in the Philippines. BMC Pregnancy Childbirth. 2018;18(1):1–12.
39. De Morais MB, Jacob CMA. The role of probiotics and prebiotics in pediatric
practice. J Pediatr (Rio J). 2006;82(SUPPL. 2):189–97.
40. Maldonado RR, Araújo LC, Dariva LCS, Rebac KN, Pinto IAS, Prado JPR, et
al. Fermentação láctica de frutas tropicais. In: Anais do XX Congresso
72
Brasileiro de Engenharia Química . Florianópolis/SC; 2014. p. 1–8.
41. Pereira ALF, Almeida FDL, de Jesus ALT, da Costa JMC, Rodrigues S.
Storage Stability and Acceptance of Probiotic Beverage from Cashew Apple
Juice. Food Bioprocess Technol. 2013;6(11):3155–65.
42. Pereira ALF, Maciel TC, Rodrigues S. Probiotic beverage from cashew apple
juice fermented with Lactobacillus casei. Food Res Int. 2011 Jun;44(5):1276–
83.
43. Guergoletto KB, Ishii Mauro CS, Garcia S. Juçara (Euterpe edulis) pulp as a
substrate for probiotic bacteria fermentation: Optimisation process and
antioxidant activity. Emirates J Food Agric. 2017;29(12):949–59.
44. Fonteles TV, Costa MGM, de Jesus ALT, Rodrigues S. Optimization of the
Fermentation of Cantaloupe Juice by Lactobacillus casei NRRL B-442. Food
Bioprocess Technol. 2012;5(7):2819–26.
45. Busanello MP. Desenvolvimento de bebida láctea prebiótica com cajá-manga
(Spondias dulcis). Trabalho de conclusão de curso de graduação .
Universidade Tecnológica Federal do Paraná; 2014.
46. de Carvalho JM, Maia GA, da Fonseca AV V., de Sousa PHM, Rodrigues S.
Effect of processing on physicochemical composition, bioactive compounds
and enzymatic activity of yellow mombin (Spondias mombin L.) tropical juice. J
Food Sci Technol. 2013;52(2):1182–7.
47. Janick J, Paull RE. The encyclopedia of fruit and nuts. 2008;992. Available
from: https://books.google.lt/books?id=cjHCoMQNkcgC
48. Tiburski JH, Rosenthal A, Deliza R, de Oliveira Godoy RL, Pacheco S.
Nutritional properties of yellow mombin (Spondias mombin L.) pulp. Food Res
Int. 2011;44(7):2326–31. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2011.03.037
49. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Portaria no 341, de
18/09/2014. DOU no 182, de 22/09/2014, Seção 1, 2014 p. 9.
50. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.
73
1976;72(1–2):248–54.
51. Fujita A, Borges K, Correia R, Franco BDG de M, Genovese MI. Impact of
spouted bed drying on bioactive compounds, antimicrobial and antioxidant
activities of commercial frozen pulp of camu-camu (Myrciaria dubia Mc.
Vaugh). Food Res Int. 2013;54(1):495–500. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2013.07.025
52. Nóbrega EM, Oliveira EL, Genovese MI, Correia RTP. The impact of hot air
drying on the physical-chemical characteristics, bioactive compounds and
antioxidant activity of acerola (Malphigia emarginata) residue. J Food Process
Preserv. 2015;39(2):131–41.
53. Rufino M do SM, Alves RE, de Brito ES, Pérez-Jiménez J, Saura-Calixto F,
Mancini-Filho J. Bioactive compounds and antioxidant capacities of 18 non-
traditional tropical fruits from Brazil. Food Chem. 2010;121(4):996–1002.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.01.037
54. CLSI. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that
grow aerobically. 11th ed. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards
Institute; 2018. 92 p.
55. Gudiña EJ, Rocha V, Teixeira JA, Rodrigues LR. Antimicrobial and
antiadhesive properties of a biosurfactant isolated from Lactobacillus paracasei
ssp. paracasei A20. Lett Appl Microbiol. 2010 Apr;50(4):419–24.
56. Brinques GB, Ayub MAZ. Effect of microencapsulation on survival of
Lactobacillus plantarum in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration,
and yogurt. J Food Eng. 2011;103(2):123–8. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.10.006
57. Farias TGS de, Ladislau HFL, Stamford TCM, Medeiros JAC, Soares BLM,
Stamford Arnaud TM, et al. Viabilities of Lactobacillus rhamnosus ASCC 290
and Lactobacillus casei ATCC 334 (in free form or encapsulated with calcium
alginate-chitosan) in yellow mombin ice cream. LWT- Food Sci Technol.
2019;100:391–6. Available from: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.10.084
58. ABNT. NBR ISO 11136:2016. Sensory analysis — Methodology: General
guidance for conducting hedonic tests with consumers in a controlled area.
74
Abnt. 2016; Available from: www.abnt.org.br
59. ABNT NBR ISO 4121:2018. Sensory analysis: Guidelines for the use of
quantitative response scales. Abnt. 2018;
60. Enujiugha VN, Badejo AA. Probiotic potentials of cereal-based beverages. Crit
Rev Food Sci Nutr. 2017;57(4):790–804.
61. Swain MR, Anandharaj M, Ray RC, Parveen Rani R. Fermented Fruits and
Vegetables of Asia: A Potential Source of Probiotics. Biotechnol Res Int.
2014;2014:1–19.
62. Zheng X, Yu Y, Xiao G, Xu Y, Wu J, Tang D, et al. Comparing product stability
of probiotic beverages using litchi juice treated by high hydrostatic pressure
and heat as substrates. Innov Food Sci Emerg Technol. 2014;23:61–7.
63. Alvar J, Vélez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. Leishmaniasis
worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 2012;7(5).
64. Dimitrovski D, Velickova E, Dimitrovska M, Langerholc T, Winkelhausen E.
Synbiotic functional drink from Jerusalem artichoke juice fermented by probiotic
Lactobacillus plantarum PCS26. J Food Sci Technol. 2016;53(1):766–74.
65. Di Cagno R, Minervini G, Rizzello CG, De Angelis M, Gobbetti M. Effect of
lactic acid fermentation on antioxidant, texture, color and sensory properties of
red and green smoothies. Food Microbiol. 2011;28(5):1062–71.
66. Martins GH, Kwiatkowski A, Bracht L, Srutkoske CLQ, Haminiuk CWI. Perfil
físico-químico, sensorial e reológico de iogurte elaborado com extrato
hidrossolúvel de soja e suplementado com inulina. Rev Bras Prod
Agroindustriais. 2013;15(1):93–102.
67. Valero-Cases E, Nuncio-Jáuregui N, Frutos MJ. Influence of fermentation with
different lactic acid bacteria and in vitro digestion on the biotransformation of
phenolic compounds in fermented pomegranate juices. J Agric Food Chem.
2017;65(31):6488–96.
68. Kourkoutas Y, Kanellaki M, Koutinas AA. Apple pieces as immobilization
support of various microorganisms. LWT - Food Sci Technol. 2006;39(9):980–
6.
75
69. Rita F. Influência da composição da matriz alimentar na viabilidade do
Lactobacillus acidophilus La-5 em sobremesa. Trabalho de Conclusão de
Curso, Departamento Acadêmico de Alimentos, Universidade Federal
Tecnológica do Paraná; 2014.
70. Sameh S, Al-Sayed E, Labib RM, Singab AN. Genus Spondias : A
phytochemical and pharmacological review. Evidence-Based Complement
Altern Med. 2018;2018:1–13.
71. Refosco EK, Chochuk MM, Gasparetto NR, Mazur CE. Compostos fenólicos
na alimentação e seus benefícios para a saúde : uma revisão. Ciencia Atual.
2019;13(1):2–9.
72. Zardo DM, Alberti A, Paula A, Dantas C. Efeito do processamento no teor de
compostos fenólicos e na atividade antioxidante em fermentados de maçã.
Semin Ciências agrárias. 2008;29(4):829–38.
73. Campos RCAB, Martins EMF, Pires B de A, Peluzio M do CG, Campos AN da
R, Ramos AM, et al. In vitro and in vivo resistance of Lactobacillus rhamnosus
GG carried by a mixed pineapple (Ananas comosus L. Merril) and jussara
(Euterpe edulis Martius) juice to the gastrointestinal tract. Food Res Int.
2019;116:1247–57.
74. Haida KS, Haas J, Mello SA de, Haida KS, Abrão RM, Sahd R. Phenolic
compounds and antioxidant activity of guava (Psidium guajava L.) fresh and
frozen. Rev Fitos. 2015;9(1):37–44.
75. Keppler K, Humpf HU. Metabolism of anthocyanins and their phenolic
degradation products by the intestinal microflora. Bioorganic Med Chem.
2005;13(17):5195–205.
76. Kumar A, Kumar D. Development of antioxidant rich fruit supplemented
probiotic yogurts using free and microencapsulated Lactobacillus rhamnosus
culture. J Food Sci Technol. 2016;53(1):667–75.
77. Nguyen BT, Bujna E, Fekete N, Tran ATM, Rezessy-Szabo JM, Prasad R, et
al. Probiotic Beverage From Pineapple Juice Fermented With Lactobacillus and
Bifidobacterium Strains. Front Nutr. 2019 May 9;6.
76
78. Curiel JA, Pinto D, Marzani B, Filannino P, Farris GA, Gobbetti M, et al. Lactic
acid fermentation as a tool to enhance the antioxidant properties of Myrtus
communis berries. Microb Cell Fact. 2015;14(67):1–10.
79. da Costa GM, de Carvalho Silva JV, Mingotti JD, Barão CE, Klososki SJ,
Pimentel TC. Effect of ascorbic acid or oligofructose supplementation on
L. paracasei viability, physicochemical characteristics and acceptance of
probiotic orange juice. LWT - Food Sci Technol. 2017;75:195–201.
80. Tejero-Sariñena S, Barlow J, Costabile A, Gibson GR, Rowland I. In vitro
evaluation of the antimicrobial activity of a range of probiotics against
pathogens: Evidence for the effects of organic acids. Anaerobe.
2012;18(5):530–8. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.anaerobe.2012.08.004
81. Abdelhamid AG, Esaam A, Hazaa MM. Cell free preparations of probiotics
exerted antibacterial and antibiofilm activities against multidrug resistant E. coli.
Saudi Pharm J. 2018;26(5):603–7. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.jsps.2018.03.004
82. Chai W, Burwinkel M, Wang Z, Palissa C, Esch B, Twardziok S, et al. Antiviral
effects of a probiotic Enterococcus faecium strain against transmissible
gastroenteritis coronavirus. Arch Virol. 2013;158(4):799–807.
83. Koohestani M, Moradi M, Tajik H, Badali A. Effects of cell-free supernatant of
Lactobacillus acidophilus LA5 and Lactobacillus casei 431 against planktonic
form and biofilm of Staphylococcus aureus. Vet Res Forum. 2018;9(4):301–6.
84. Mogna L, Deidda F, Nicola S, Amoruso A, Del Piano M, Mogna G. Vitro
Inhibition of Klebsiella pneumoniae by Lactobacillus delbrueckii Subsp.
delbrueckii LDD01 (DSM 22106) An Innovative Strategy to Possibly Counteract
Such Infections in Humans? J Clin Gastroenterol. 2016;50:S136–9.
85. Shim YH, Lee SJ, Lee JW. Antimicrobial activity of Lactobacillus strains against
uropathogens. Pediatr Int. 2016;58(10):1009–13.
86. Brasil. Regulamento técnico de identidade e qualidade de leites fermentados.
Diário Oficial da União. 2007. Available from:
http://http//www.cidasc.sc.gov.br/inspecao/files/2012/08/instruÇÃo-normativa-
77
no-46-de-23-de-outubro-de-2007.pdf
87. Zhao MN, Zhang F, Zhang L, Liu BJ, Meng XH. Mixed fermentation of jujube
juice (Ziziphus jujuba Mill.) with L. rhamnosus GG and L. plantarum-1: effects
on the quality and stability. Int J Food Sci Technol. 2019;
88. Champagne CP, Gardner NJ. Effect of storage in a fruit drink on subsequent
survival of probiotic lactobacilli to gastro-intestinal stresses. Food Res Int.
2008;41(5):539–43.
89. Daneshi M, Ehsani MR, Razavi SH, Labbafi M. Effect of refrigerated storage on
the probiotic survival and sensory properties of milk/carrot juice mix drink.
Electron J Biotechnol. 2013;16(5).
90. Santos Filho AL dos, Freitas HV, Rodrigues S, Abreu VKG, Lemos T de O,
Gomes WF, et al. Production and stability of probiotic cocoa juice with
sucralose as sugar substitute during refrigerated storage. LWT - Food Sci
Technol. 2019;99:371–8. Available from:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643818308259
91. Succi M, Tremonte P, Reale A, Sorrentino E, Grazia L, Pacifico S, et al. Bile
salt and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from
Parmigiano Reggiano cheese. FEMS Microbiol Lett. 2005;244(1):129–37.
92. Ortakci F, Sert S. Stability of free and encapsulated Lactobacillus acidophilus
ATCC 4356 in yogurt and in an artificial human gastric digestion system. J
Dairy Sci. 2012;95(12):6918–25.
93. Brasil. Ministério da Saúde. Guia alimentar para a população brasileira:
promovendo a alimentação saudável. Brasília: Ministério da Saúde, 2006.
210p.
94. Ferreira LO, Pimenta CJ, Pinheiro ACM, Pereira PAP, Santos G. Sensory
evaluation of “dulce de leche” with coffee and whey using different affective
data analysis methods. Ciência e Tecnol Aliment. 2011;31(4):998–1005.
95. Reis RC, Regazzi AJ, Carneiro JCS, Minim VPR. 2010. Mapa de preferencia. In:
Minim VPR, editor. Analise Sensorial: estudos com consumidores. Viçosa: Ed.
UFV. p 214– 257.
78
96. Teixeira, E.; Menert, E. M.; Barberta, P. A. Análise sensorial de alimentos.
Florianópolis: UFSC, 1987. 180 p.
97. Brasil. Resolução RDC - nº 12 de 02 de janeiro de 2001. Dispõe sobre os
princípios gerais para o estabelecimento de critérios e padrões microbiológicos
para alimentos. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA,
2001.
79
ANEXOS
ANEXO A
80
81
82
APÊNDICES
APÊNDICE A
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
Projeto de pesquisa “ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR
DE SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.”
PERFIL DOS PROVADORES
Nome:____________________________________Idade:_________Sexo:__________ 1. Escolaridade:
Fundamental completo ( )
Médio completo ( )
Superior incompleto ( )
Superior completo ( )
2. Apresenta dor de cabeça ou alguma outra dor que atrapalhe no momento da
análise?
Sim ( ) Não ( )
3. Possui alergia ao cajá, estévia ou frutose? Sim ( ) Não ( )
4. Possui intolerância a algum dos componentes acima? Sim ( ) Não ( )
5. Quanto gosta ou desgosta de suco de cajá?
( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Desgosto
muito
Desgosto
moderadamente
Desgosto
ligeiramente
Nem
gosto
nem
desgosto
Gosto
ligeiramente
Gosto
moderadamente
Gosto
muito
6. Quanto gosta ou desgosta de bebida fermentada?
( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Desgosto
muito
Desgosto
moderadamente
Desgosto
ligeiramente
Nem
gosto
nem
desgosto
Gosto
ligeiramente
Gosto
moderadamente
Gosto
muito
7. Qual a sua frequência de consumo de bebidas fermentadas?
( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Diariamente 2 a 3 x por
semana
1 x por
semana
Quinzenalmente Mensalmente Nunca
83
APÊNDICE B
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
TCLE para maiores de idade
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Esclarecimentos
Este é um convite para participar da Pesquisa “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495”, que tem como pesquisador responsável o professor Francisco Canindé de Sousa Junior.
Esta pesquisa pretende verificar a viabilidade do uso do suco de cajá como veículo de probióticos, que são micro-organismos vivos cuja ingestão regular pode trazer inúmeros benefícios à saúde. O motivo que nos leva a fazer este estudo é contribui para aumentar a disponibilidade de novos produtos probióticos e valorizar um espécie vegetal rica em nossa região.
Caso decida participar da análise sensorial dos sucos desenvolvidos com a adição de probióticos, primeiramente, voce responderá um questionário de recrutamento em que, entre outras informações sobre seus hábitos alimentares, deverá relatar se apresenta alergia ou intolerância a qualquer ingrediente contido nos produtos. Em caso positivo, voce não deverá participar da análise sensorial. No caso de participar da análise sensorial, voce receberá uma amostra de suco para avaliação dos atributos sensoriais dos produtos. Os sucos serão submetidos a análises microbiológicas objetivando garantir a segurança e minimizar os riscos de infecção alimentar, cuja elaboração será controlada por meio da adoção das boas práticas de manipulação, conforme legislação vigente.
Na presença de sintoma(s) após o consumo dos sucos, o provador deverá entrar em contato com o pesquisador responsável para que este avalie e se responsabilize pelo tratamento de saúde, se necessário. E ainda, se o provador necessitar de atendimento de urgencia/emergencia decorrente do teste sensorial com o produto proposto, o pesquisador responsável o levará ao atendimento médico mais próximo.
Durante todo o período da pesquisa voce poderá sanar suas dúvidas ligando para o professor Dr. Francisco Caninde de Sousa Junior no Departamento de Farmácia da UFRN, localizado na Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Faria, s/n, Petrópolis, Natal-RN, ou pelo telefone 3342-9821, ou e-mail: [email protected]
Sua decisão em participar da análise sensorial é voluntária. Durante a realização da pesquisa, voce pode desistir de participar da mesma a qualquer momento. O risco envolvido com a participação na pesquisa é a eventualidade de surgir(em) sintoma(s) em decorrencia da prova do suco. Os riscos relatados serão minimizados pela garantia da qualidade do produto. Só participarão da análise sensorial os usuários que não apresentarem alergia ou intolerância a qualquer componente da formulação da bebida.
Os dados que voce irá fornecer serão confidenciais e divulgados apenas em congressos ou publicações científicas, não havendo exposição de qualquer informação que possa lhe identificar. Esses dados serão guardados pelo pesquisador responsável por essa pesquisa em local seguro e por um período de 5 anos.
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Se a participação nessa pesquisa lhe gerar algum custo, este será assumido pelo pesquisador e devidamente reembolsado. Se voce sofrer qualquer dano comprovadamente decorrente deste projeto, será também indenizado.
O benefício da pesquisa para os participantes e a sociedade em geral será a possível inserção de novos produtos probióticos no mercado, que contribuirão para diversificar as opções de bebidas probióticas disponíveis.
Qualquer dúvida a respeito da ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) no endereço Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis, Natal/RN ou pelo telefone (84) 3342-5003. E-mail: [email protected]
Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra com o
pesquisador responsável, professor Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior
Consentimento Livre e Esclarecido
Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará para mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495”, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em congressos e/ou publicações científicas, desde que nenhum dado possa me identificar.
Natal, ____/____/______.
_____________________________________
Assinatura do participante da pesquisa
Declaração do pesquisador responsável
Como pesquisador responsável pelo estudo, “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495” declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente, e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo, assim como manter sigilo e confidencialidade sobre a identidade do mesmo.
Declaro ainda estar ciente que, na inobservância do compromisso ora assumido, estarei infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução do Conselho Nacional de Saúde (CNS/MS) 466 de 2012, que regulamenta as pesquisas envolvendo seres humanos.
Natal, ____/____/______
_______________________________________________
Francisco Canindé de Sousa Junior
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APÊNDICE C
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO Projeto de pesquisa “ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE SUCO DE
CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.” Data:___ /___ /___ Idade: ___________ Sexo: ________________
Você receberá 3 amostras codificadas de suco de cajá, uma de cada vez. Entre uma amostra e outra, beba um pouco de água para limpar língua, palato e bochechas.
CÓDIGO DA AMOSTRA: _______________________________
TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL – Do suco de cajá probiótico Por favor, avalie as amostras cuidadosamente e identifique, de acordo com a escala abaixo o quanto você gostou ou
desgostou. Marque a posição da escala que melhor reflete o seu julgamento:
( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
Desgostei muitíssimo
Desgostei muito
Desgostei regularmente
Desgostei ligeiramente
Indiferente Gostei ligeiramente
Gostei regularmente
Gostei muito
Gostei muitíssimo
ESCALA DO IDEAL – Avaliação de atributos do suco de cajá probiótico
Agora, por favor, marque com um X sua opinião sobre as seguintes características do suco: Acidez
( ) Muito menos ácido
do que eu gosto
( ) Menos ácido do que
eu gosto
( ) Está ideal, do jeito
que eu gosto
( ) Mais ácido do que eu
gosto
( ) Muito mais ácido do que eu gosto
Sabor doce
( ) Muito menos
intenso do que eu gosto
( ) Menos intenso do que
eu gosto
( ) Está ideal, do jeito
que eu gosto
( ) Mais intenso do que
eu gosto
( ) Muito mais intenso
do que eu gosto
Viscosidade
( ) Muito menos
viscoso do que eu gosto
( ) Menos viscoso do que
eu gosto
( ) Está ideal, do jeito
que eu gosto
( ) Mais viscoso do que
eu gosto
( ) Muito mais viscoso
do que eu gosto
Cor
( ) Muito mais clara do que eu gosto
( ) Mais clara do que eu
gosto
( ) Está ideal, do jeito
que eu gosto
( ) Mais escuro do que
eu gosto
( ) Muito mais escuro do que eu gosto
TESTE DE ATITUDE – Intenção de Compra do suco de cajá probiótico Se os produtos que você provou estivessem disponíveis no mercado, você o compraria?
( ) Certamente compraria
( ) Possivelmente compraria
( ) Talvez comprasse
talvez não
( ) Possivelmente
não compraria
( ) Certamente não
compraria
Sugestões e comentários: ______________________________________________________________________________________
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