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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

JOSELITO DE OLIVEIRA NETO

ALTERAÇÕES MECÂNICAS E HISTOLÓGICAS DE PULMÕES EM

MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO AGUDA INDUZIDA PELO

VENENO DA SERPENTE Crotalus durissus cascavella

FORTALEZA

2015

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JOSELITO DE OLIVEIRA NETO

ALTERAÇÕES MECÂNICAS E HISTOLÓGICAS DE PULMÕES EM

MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO AGUDA INDUZIDA PELO

VENENO DA SERPENTE Crotalus durissus cascavella

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de

Carnívoros, Onívoros e Aves.

Orientadora: Dra. Janaina Serra Azul Monteiro

Evangelista

FORTALEZA

2015

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4

5

AGRADECIMENTOS

A Deus que me possibilitou a realização desse sonho tão aguardado em minha vida.

Aos meus pais José Airton de Oliveira e Maria de Fátima Bezerra Oliveira que me

apoiaram e incentivaram para a realização do curso.

À minha irmã Mayra Bezerra Oliveira, que sempre me ajudou quando precisei.

À minha esposa Raquel Horn Vasconcelos de Oliveira que esteve ao meu lado em

todos os momentos e minhas filhas Nínive e Nina que representamminha razão em conquistar

e vencer todos os desafios.

À Universidade Estadual do Ceará, que propiciou minha formação acadêmica e me

proporcionou experiências engrandecedoras e momentos memoráveis ao lado de pessoas

incríveis.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa de mestrado concedida.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias por terem

compartilhado seus conhecimentos dentro e fora das salas de aula, contribuindo para o meu

crescimento profissional.

Aos demais funcionários do PPGCV, em especial à querida Adriana, pela paciência e

orientação quanto ao funcionamento do programa.

Aos membros da banca examinadora, por aceitarem ao convite em participar e pelas

considerações feitas durante a defesa, que contribuíram para a melhora da dissertação.

À professora Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, por ter me acompanhado

e orientado no decorrer do curso e por ter aberto as portas de seu laboratório para que eu

pudesse crescer pessoal e profissionalmente, minha imensa gratidão.

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Ao professor Dr.Francisco Sales Ávila Cavalcante pela parceria e utilização de

equipamentos no laboratório em que o mesmo é responsável.

Ao professor Ms. Daniel de Araujo Viana pela leitura de lâminas histológicas e pelo

laudo patológico.

A todos os alunos que fazem parte do Laboratório de Biofísica da Respiração – LBR,

da Universidade Estadual do Ceará, em especial ao aluno de doutorado Daniel Silveira Serra,

por ter me acompanhado nos experimentos de mecânica pulmonar.

A todos os alunos do Laboratório de Histologia dos efeitos causados pelos venenos de

serpentes e plantas – HISTOVESP / Universidade Estadual do Ceará (UECE).

Ao aluno de mestrado em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, João

Alison de Moraes Silveira, por estar sempre presente durante todas as etapas de

desenvolvimento dos experimentos.

À professora Dra. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos da Universidade Estadual do

Ceará - (UECE), por ter participado do processo de qualificação do meu projeto.

À professora Dra. Helena Serra Azul Monteiro da Universidade Federal do Ceará –

UFC, por ter cedido seu laboratório e ter firmado sua parceria.

À professora Dra. Célia Maria de Souza Sampaio por ter-me co-orientado, estando

sempre disponível todas as vezes que a procurei e por ter participado como membro da banca

em minha defesa de mestrado.

À professora Dra. Diva Maria Borges Nojosa e à médica veterinária Roberta Rocha do

Núcleo Regional de Ofiologia (NUROF) do departamento de Biologia da Universidade

Federal do Ceará – UFC, por terem cedido gentilmente o veneno total.

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RESUMO

Crotalus durissus cascavella (C.d.cascavella) é uma serpente encontrada na Caatinga do

Nordeste Brasileiro. Seu veneno é caracterizado em promover alterações sistêmicas e causar

óbitos em suas vítimas logo após o acidente ofídico. Esse estudo teve por objetivo investigar

as alterações em mecânica pulmonar (propriedades elásticas, resistivas e viscoelásticas) e

histopatologia em pulmões após inoculação intraperitoneal (3,0 µg/Kg) do veneno dessa

serpente (C.d.cascavella) em camundongos. Os valores médios de resistência Newtoniana

(RN), resistência tecidual(G) e elastância tecidual(H) foram significativos em todos os grupos

experimentais (1h, 3h, 6h, 12h e 24h), sendo maiores nos dois últimos grupos. A

histeresividade (η) foi significativa em 6h, 12h e 24h. Os valores médios de complacência

estática (Cst) foram significativos nos grupos de 6h, 12h e 24h sendo nesse último grupo

valores menores. A capacidade inspiratória (CI) mostrou-se significativa em 3h, 6h, 12h e

24h. Após desafio com Metacolina, RN apresentou valores médios significativos nos grupos

6h, 12h e 24h. O veneno da serpente (C.d.cascavella) induziu no tecido pulmonar, atelectasia,

enfisema, hemorragia, infiltrado inflamatório com polimorfonucleares, congestão em todos

os grupos experimentais e edema apenas no grupo de 24h. O veneno da serpente

C.d.cascavella provocou alterações mecânicas e histopatológicas no tecido pulmonar.

PALAVRAS-CHAVE: Crotalus durissus cascavella. Veneno. Mecânica Pulmonar.

Histopatologia.

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ABSTRACT

Crotalus durissus cascavella (C. d. cascavella) is a snake found in the Brazilian Northeast

Caatinga. Its venom is featured on promoting systemic changes and cause death in his victims

after the snakebite. This study aimed to investigate the changes in lung mechanics (elastic

properties, resistive and viscoelastic) and histopathology in lungs after intraperitoneal

injection (3,0 µg/Kg) of this snake venom (C. d. cascavella) in mice. The average values of

Newtonian resistance (RN), tissue resistance (G) and tissue elastance (H) were significant in

all groups (1h, 3h, 6h, 12h and 24h) and higher in the last two groups. The histeresividade (η)

was significant in 6h, 12h and 24h. The static compliance of average values (Cst) were

significant in groups of 6h, 12h and 24h and the latter group lower values. The inspiratory

capacity (CI) was significant at 3h, 6h, 12h and 24h. After challenge with Methacholine, RN

known significant average values in groups 6h, 12h and 24h. The venom of the snake C. d.

cascavella also induced in pulmonar tissue atelectasis, emphysema, hemorrhage,

inflammatory infiltrate with polymorphonuclear cels, congestion in all experimental groups,

and edema only in the 24h group. The venom of the snake C. d. cascavellaca used mechanical

and histopathological changes in lung tissue.

Keywords: Crotalus durissus cascavella.Venom.Pulmonary Mechanics. Histopathology.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Famílias e gêneros de serpentes da fauna brasileira com importância médica... 16

Figura 2 - Características morfológicas de espécies de serpentes Viperidae....................... 17

Figura 3 - Fotomicrografia da parede alveolar ao final da inspiração, Aumento 400X e

coloração H.E ......................................................................................................................

28

Figura 4 - Exemplos de modelos utilizados para descrever o sistema respiratório: (A)

Modelo viscoelástico; (B) Modelo de fase constante...........................................................

39

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

PH – Potencial de Hidrogênio

O2 – Gás Oxigênio

CO2 – Gás Carbônico

SINAN – Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SINITOX/FIOCRUZ/MS - Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas da

Fundação Oswaldo Cruz

SIM/SUS - Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde

PLA2 – Fosfolipase A2

LAO - L-amino-oxidase

FAD - Flavina adenina dinucleotídeo

MEC - Matriz Extracelular

MCh – Metacolina

Cp – complacência pulmonar

CI – Capacidade inspiratória

Cst – complacência estática

f – frequência

G – resistência tecidual

H – elastância tecidual

I – inertância

η – histeresividade

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Patm – pressão atmosférica

Palv – pressão alveolar

Pel – pressão elástica dos pulmões

Pao – pressão na abertura das vias aéreas

PEEP – pressão positiva expiratória final

Ppl – pressão intrapleural

Raw – resistência das vias aéreas

RN – resistência Newtoniana

T – tensão superficial

V’ – fluxo

Zrs – impedância de entrada do sistema respiratório

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................. 15

2.1 CLASSIFICAÇÃO DAS SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA................. 15

2.2 ASPECTOS BIOLÓGICOS DO GÊNERO Crotalus.......................................... 18

2.2.1 Classificação e Distribuição Geográfica ........................................................... 18

2.2.2 Habitat................................................................................................................ 19

2.2.3 Hábitos Alimentares.......................................................................................... 19

2.3ASPECTOS GERAIS E EPIDEMIOLÓGICOS DO GÊNERO CROTALUS...... 19

2.4 CONSTITUINTES DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS........................ 22

2.4.1 Crotoxina e suas subunidades............................................................................ 22

2.4.2 Crotamina.......................................................................................................... 24

2.4.3 Convulxina......................................................................................................... 24

2.4.4 Giroxina............................................................................................................. 25

2.4.5 Peptídio natriurético........................................................................................... 26

2.5 SISTEMA RESPIRATÓRIO............................................................................... 26

2.5.1 Caracterização Morfofuncional......................................................................... 26 2.5.2 Troca Gasosa..................................................................................................... 27

2.5.3 Rede de fibras do parênquima pulmonar........................................................... 29

2.5.4 Fibras de colágeno e elastina............................................................................. 30

2.5.5 Glicoproteínas.................................................................................................... 30

2.5.6 Proteoglicanos.................................................................................................... 31

2.6 MECÂNICA PULMONAR.................................................................................. 31

2.6.1 Propriedades elásticas do pulmão...................................................................... 31

2.6.2 Propriedades elásticas da parede torácica.......................................................... 32

2.6.3 Propriedades resistivas do sistema respiratório................................................. 33

2.6.4 Resistência pulmonar......................................................................................... 33

2.6.5 Resistência da parede torácica........................................................................... 34

2.6.6 Viscoelasticidade............................................................................................... 34

2.6.7 Dissipação de energia durante o ciclo respiratório............................................ 34

2.7 MODELAGEM EM MECÂNICA PULMONAR................................................ 35

2.7.1 O modelo de fase constante............................................................................... 40

2.8 PESQUISA POR HIPERRESPONSIVIDADE DE VIAS AÉREAS

MEDIANTE DESAFIO COM METACOLINA(MCH)............................................

41

3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 42

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.................................................................................... 43

5 OBJETIVOS.......................................................................................................... 44

5.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................. 44

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................... 44

6 CAPÍTULO 1......................................................................................................... 45

7 CONCLUSÕES...................................................................................................... 73

8 PERSPECTIVAS................................................................................................... 74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 75

13

1 INTRODUÇÃO

Os venenos de serpentes são compostos de uma complexidade de substâncias

ativas, a maioria delas com estruturaproteica, que exercem um papel importante no processo

de sobrevivência desses animais. Devido às necessidades de defesa e captura de presas, as

serpentes desenvolveram evolutivamente uma grande variedade de toxinas. Essas moléculas

possuem diversos alvos biológicos, apresentando, portanto, vários efeitos importantes. A

caracterização dos efeitos específicos das frações de venenos ofídicos é de profunda

importância para o entendimento das alterações patológicas decorrentes do envenenamento

(GARCIA; LEWIS, 2003).

A composição química e as atividades biológicas dos venenos podem variar muito

entre as famílias e gêneros das serpentes (DOS-SANTOS, 2005). Segundo Barraviera e

Pereira (1999), a maior gravidade encontra-se nos acidentes causados por serpentes do gênero

Crotalus, e essas têm ganhado relevante espaço no campo científico, visto que em algumas

décadas seu veneno vem sendo alvo de pesquisadores devido a sua constituição e o efeito que

essas substâncias podem causar (PINHO; PEREIRA, 2001).

A subespécie Crotalus durissus cascavella (C. d. cascavella), encontrada na

Caatinga do Nordeste Brasileiro (BARRAVIERA,1989; PINHO; PEREIRA, 2001), produz

um veneno que conduz a alteração sistêmica, sendo responsável pela causa preliminar de

óbito após o acidente ofídico (EVANGELISTA et al., 2008).

A peçonha de Crotalus apresenta-se como um complexo tóxico-enzimático, na

qual são encontradas as enzimas fosfodiesterase, l amino oxidase, 5-nucleotidase e toxinas

como a crotoxina, convulxina, crotamina e giroxina (RANGEL-SANTOS et al., 2004).

Os animais acometidos por envenenamento crotálico manifestam as principais

complicações: insuficiência renal aguda (NISHIOKA, 2000), choque circulatório (PINHO et

al.,2000; PINHO et al., 2005), reações edematogênicas, agregação de plaquetas (MARTINS et

al., 2004) e hipotensão arterial (EVANGELISTA et al., 2008). Segundo Vital Brazil (1972)

apud Damico et al. (2005), há insuficiência respiratória aguda relacionada à paralisia

neuromuscular.

Os pulmões são os órgãos essenciais do sistema respiratório, mas não são apenas

órgãos respiratórios. Eles participam do equilíbrio térmico, pois, com o aumento da ventilação

14

pulmonar há maior perda de calor e água. Auxiliam na manutenção do pH plasmático dentro

da faixa fisiológica, regulando a eliminação de ácido carbônico (sob a forma de CO2). O

aparelho respiratório também é utilizado para outros fins como a defesa contra agentes

agressores (FRASER, 2005; ZIN; ROCCO; FAFFE, 2008). Sua função básica é de

disponibilizar oxigênio (O2) para o organismo enquanto retira gás carbônico (CO2) produzido

pelo metabolismo celular (AIRES, 1999).

Estudos realizados por Nonaka et al. (2008) e Silveira et al. (2004) analisaram,

respectivamente, a exposição ao veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e Bothrops

jararaca ao processo de injúria pulmonar.

Nos últimos 30 (trinta) anos, houve um grande avanço na área de pesquisa com

toxinas e enzimas ofídicas, em virtude do advento das análises da estrutura bioquímica, em

especial dos venenos elapídicos, em virtude de sua maior letalidade. Contudo, novas

descobertas como das toxinas das cascavéis americanas e hipotensivas dos venenos botrópicos

geraram grande interesse para os estudos com a família Viperidae (EVANGELISTA, 2008).

O comprometimento pulmonar após envenenamento crotálico causa um quadro de

hipotensão e consequente hipoventilação, se instalando um processo de angústia respiratória,

cuja consequência será a perda do status de bem estar do animal.

Em vista disso, torna-se relevante estudar as alterações no sistema respiratório

após exposição do veneno da subespécie C. d. cascavella, buscando a um entendimento de

seus efeitos biológicos e seu comportamento agindo sob esse sistema.

15

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. CLASSIFICAÇÃO DAS SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA

As serpentes estão classificadas no reino Animalia, filo Chordata, classe Reptilia,

subclasse Lepdosaura, ordem Squamata, subordem Serpentes. Esses animais estão presentes

praticamente em todo o mundo, constituindo o maior número de répteis viventes

(HICKMAM; ROBERTS; LARSON, 2004). Já foram descritas aproximadamente 2.300

espécies de serpentes (MELGAREJO-GIMÉNEZ, 2002). São animais vertebrados,

carnívoros, ectotérmicos e pertencem ao grupo dos répteis. (INSTITUTO BUTANTAN,

2014).

No Brasil estão presentes 75 gêneros agrupados em 10 famílias somando 371

espécies. Dessas, apenas duas famílias, Viperidae e Elapidae, são consideradas peçonhentas,

ou seja, espécies que possuem glândula produtora de veneno e aparelho inoculador, causando

intoxicações em humanos e animais (CARDOSO, 2003; BÉRNILS, 2010), constituindo um

grande risco em muitas regiões do mundo (NADUR-ANDRADE et al., 2012). O veneno

possui misturas complexas de toxinas e enzimas que mostram diferentes atividades nos

diversos sistemas biológicos, tais como citotóxica, hemorrágica, liberação debradicinina,

trombina-like, hemólise, efeitos cardiovasculares e hipotensores, necrose do tecido e efeitos

neurotóxicos (PATIÑO et al., 2013).

Nas Américas, a Família Elapidae é representada pelas serpentes corais. As 61

espécies reconhecidas estão divididas em três gêneros Micrurus com 57 espécies,

Leptomicrurus com três espécies e Micruroides com uma espécie. O gênero Micrurus ocorre

desde a Argentina até o sul dos Estados Unidos (Melgarejo, 2003). Na fauna brasileira há 22

espécies da Família Elapidae, a maioria pertencente ao gênero Micrurus (SBH, 2006).

A família Viperidae é composta pelos gêneros Bothrops, Bothropoides,

Bothriopsis, Bothrocophias, Rhinocerophis, Crotalus e Lachesis. Esses gêneros estão

distribuídos por todo o mundo e são responsáveis pelos principais acidentes ofídicos no

Brasil, tanto pela quantidade quanto pela severidade dos casos (AZEVEDO-MARQUES;

CUPO; HERING, 2003; QUEIROZ et al.,2008). O veneno contém um grande número de

16

proteínas farmacológica e bioquimicamente ativas, além de serem mais complexos que os

pertencentes à de outras famílias (DAL PAI; SANTO NETO, 1994).

O Brasil possui quatro gêneros de importância médica: Bothrops e Bothropoides,

ambos conhecidos genericamente como jararacas; Crotalus, que constituem as cascavéis; e

Lachesis, chamada popularmente de surucucus (BRASIL, 2012). A Figura 1 ilustra exemplos

de serpentes de importância clínica no Brasil.

Família Elapidae

Gênero Micrurus sp.

Família Viperidae

Gênero Bothropssp. Gênero Bothropoides sp.

Gênero Lachesis sp. Gênero Crotalus sp.

Figura 1. Famílias e gêneros de serpentes da fauna brasileira com importância médica. Fonte:

Adaptado de http://www.fiocruz.br

São utilizadas algumas características morfológicas para diferenciar serpentes

peçonhentas e não peçonhentas. O conhecimento dessas diferenças é de grande importância,

17

pois auxiliam a notificação correta dos casos, além de permitir à população identificar

possíveis riscos nas regiões onde habitam. (BRASIL, 2001).

De maneira geral, três características são analisadas para facilitar o

reconhecimento das serpentes da família Viperidae: cabeça triangular; presença de fosseta

loreal, um orifício localizado entre o olho e a narina do animal, com função termossensorial,

permitindo o movimento e a caça noturna (Figura 2a); presença de presas inoculadoras de

veneno bem desenvolvidas e móveis na região anterior do maxilar (Figura 2b); e estrutura da

cauda: Gêneros Bothrops e Bothropoides apresentam cauda lisa; Gênero Lachesis, cauda com

escamas eriçadas; e o gênero Crotalus, cauda com chocalho (Figura 2c) (BRASIL,2001).

a) b)

c)

Figura 2. Características morfológicas de reconhecimento de espécies de serpente da

Viperidae. Fonte: Adaptado de Brasil, 2001.

Legenda: a) Fosseta loreal; b) Presas inoculadoras de veneno; c) Caudas características dos gêneros Bothrops,

Bothropoides, Crotalus e Lachesis.

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2.2. ASPECTOS BIOLÓGICOS DO GÊNERO CROTALUS

2.2.1 CLASSIFICAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

As subespécies da cascavel sul-americana, Crotalus durissus, são classificadas de

acordo com suas características morfológicas externas e distribuição geográfica, sendo

responsáveis pela alta morbidade e mortalidade representando um importante problema de

saúde pública (SANTORO et al., 1999; MARTINS et al., 2004).

No Brasil elas são representadas por apenas uma espécie, a Crotalus durissus, e

classificadas nas subespécies Crotalus durissus terrificus (encontrada nas regiões sul oriental

e meridional), Crotalus durissus collilineatus (distribuídas nas regiões secas do Centro-Oeste,

em Minas Gerais e no norte de São Paulo), Crotalus durissus cascavella (encontrada nas

áreas de caatinga da região Nordeste), Crotalus durissus ruruima (observada na região Norte),

Crotalus durissus marajoensis (observada na Ilha de Marajó). Alguns autores reconhecem

uma sexta subespécie no território brasileiro, a Crotalus durissus trigonicus, encontrada em

algumas regiões de Roraima e na savana de Rupununi na Guiana (PINHO; PEREIRA, 2001;

RATELSLANGEN, 2010; MELGAREJO, 2003; CAMILLO, 1998; AUTO, 1999).

Serpentes do gênero Crotalus são consideradas um bom modelo para estudos

relacionados à ecologia e variação geográfica, devido a sua ampla distribuição que abrange

diversos tipos de habitats, incluindo desertos, até ambientes alagados e florestais (NORMAN,

1994; BEAUPRE et al., 1998; PLACE; ABRAMSON, 2004).

O gênero é originário da América do Norte, mas se distribuindo também na

América Central e do Sul (ECHEVERRIGARAY et al, 2001). São conhecidas atualmente 30

espécies, sendo que a maior diversidade ocorre no México e nos Estados Unidos (ERNST,

1992; CAMPBELL; LAMAR, 1989).

A intensificação do processo de fragmentação de áreas florestais pode ter

facilitado àampliação na distribuição e o aumento na densidade populacional das serpentes

Crotalus durissus cascavella - cascavéis (BASTOS et al.,2005).

19

2.2.2. HABITAT

Serpentes do Gênero Crotalus são encontradas em áreas secas e pedregosas, de

baixa vegetação, sendo raramente encontradas em florestas (CAMPBELL; LAMAR, 1989;

SOERENSEN, 1990).

Apesar do número de estudos ter aumentado recentemente, ainda são escassos os

trabalhos de cunho ecológico baseados na observação de indivíduos em seu habitat natural.

Esse fato se deve em parte à dificuldade em encontrar serpentes na natureza, pois elas

apresentam densidades populacionais relativamente baixas e podem passar por longos

períodos de inatividade (SAZIMA, 1988; SECOR, 1994; BECK, 1995; OLIVEIR;

MARTINS, 2001). Apesar de estar associada preferencialmente às fitofisionomias abertas, há

registros de cascavéis em áreas com presença de mata (BASTOS et al., 2005).

2.2.3 HÁBITOS ALIMENTARES

A alimentação das serpentes Crotalus durissus compreende principalmente os

roedores, devido à grande disponibilidade ao longo do ano (SALOMÃO et al., 1995),

mamíferos não identificados, marsupiais e répteis, entretanto aves (VANZOLINI et al., 1980;

SALOMÃO et al., 1995) e lagartos teiídeos (Ameiva) podem também fazer parte da dieta

(ALMEIDA-SANTOS; GERMANO, 1996).

Aatividade de caça promovida pelas serpentes Crotalus durissus cascavella é

caracteristicamente noturna, período que coincide com o pico da atividade de suas presas,

apresentando uma estratégia de forrageamento caracterizada por permanecerem paradas

próximas a locais onde há indícios de suas presas (BURGHARDT, 1967; BROWN;

MACLEAN, 1983; REINERT et al., 1984; CHISZAR et al., 1990), aguardando por sua

passagem. O aumento da atividade de forrageio na estação seca pode estar associado a uma

maior necessidade de ingestão calórica nesse período (SALOMÃO; ALMEIDA-SANTOS,

2002).

2.3 ASPECTOS GERAIS E EPIDEMIOLÓGICOS DO GÊNERO CROTALUS

As serpentes possuem grande importância tanto na cadeia ecológica, como na área

biomédica. Pesquisas realizadas com os venenos por elas produzidos têm se intensificado,

20

uma vez que suas frações enzimático-proteicas vêm sendo usadas na fabricação de

medicamentos (SANTOS, 1995).

Destacando a anatomofisiologia da família Viperidae, estas serpentes apresentam

grande especialização no crânio, o que justifica a extrema mobilidade da maxila e outros

ossos da cabeça, conformação que favorece a efetividade nos ataques desses animais e

possibilita a inoculação do veneno durante seus botes. O veneno dessas serpentes é produzido

por duas glândulas especiais localizadas na cabeça, atrás e abaixo dos olhos, que são

glândulas salivares modificadas, onde a saliva é a própria toxina. Elas possuem reservas para

vários botes seguidos, sendo que, uma vez totalmente extraído o veneno ou secreção, as

glândulas só voltarão a estar totalmente cheias após duas semanas (SANTOS, 1995).

O veneno crotálico apresenta-se como um complexo tóxico-enzimático de várias

substâncias, dentre as enzimas podemos destacar fosfodiesterase, L-amino oxidase, 5-

nucleotidase e o fracionamento destas revela as seguintes toxinas: crotoxina, crotamina,

giroxina, convulxina e proteinases séricas, como crotalocitina, trombocitina e enzimas

trombina-like (identificadas como proteases séricas sendo capazes de degradar cadeias de

fibrinogênio, induzindo a agregação plaquetária) (RANGEL-SANTOS et al., 2004;

FONSECA, et al., 2006; SPINOSA, 2008).

Envenenamentos causados por animais peçonhentos constituem um grave

problema de saúde pública, devido a sua elevada incidência e morbimortalidade associada

(MORENO et al.,2005; PINHO;VIDAL;BURDMANN,2000; PINHO ;PEREIRA, 2001;

PINHO; OLIVEIRA; FALEIROS, 2004; PINHO;ZANETTA; BURDMANN, 2005)

principalmente na América Latina, África e Ásia (ANTUNES et al., 2010). Na Europa,

Estados Unidos e Canadá, os casos de envenenamento são raros. Na África, paralelamente, a

ocorrência desses acidentes é subnotificada, sendo desconhecida a incidência real. No

continente asiático, Paquistão, Índia e Birmânia são os países com maior frequência de casos

(CHIPPAUX,1998).

Estudos realizados sobre levantamentos epidemiológicos de acidentes ofídicos

notificados entre 1901 e 2000, observaram que o perfil de acidentes não se alterou durante

todo o século, acontecendo principalmente trabalhadores rurais do sexo masculino entre 15 e

49 anos, no início e final de cada ano (BOCHNER; STRUCHINER,2003).

21

A incidência mundial de acidentes ofídicos e sua gravidade são desconhecidas.

Estudos no ano de 2011 estimaram-se a ocorrência de 3 a 5,4 milhões de eventos por ano,

resultando em cerca de 125 a 150 mil mortes por ano (BARONE et al.,2011).

Sabe-se que os acidentes mais graves acontecem nos países pobres de regiões

tropicais e subtropicais. Entretanto, nesses países a notificação desses casos também é

subestimada, sendo por muitas vezes tratados com métodos ultrapassados e procedimentos

não efetivos (ALBUQUERQUE et al., 2004).

A sazonalidade dos acidentes ofídicos é muito variada nas diferentes regiões do

Brasil. Entretanto, há uma hipótese aceita de que o aumento dos casos esteja relacionado ao

período chuvoso e de altas temperaturas, em que as espécies residentes próximas às margens

de rios se desloquem a procura de terra firme, facilitando seu contato com o homem

(OLIVEIRA et al., 2010).

Dentre os países latinos, o Brasil ocupa a 1ª colocação em números de casos

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009), justificada pela sua grande extensão territorial. Foram

registrados 103.422 acidentes ofídicos, com 464 óbitos entre os anos de 2010 a 2013(SINAN

– Sistema de Informação de Agravos de Notificação, 2013),sendo segundo o Sinan, no ano de

2012, 19.946 casos de acidentes ofídicos em humanos no Brasil, sendo a família Viperidae

envolvida em 82,7% dos casos, e a família Elapidae, em 0,9% (BRASIL, 2012). Seguido pelo

Peru (4.500), Venezuela (2500 a 3 mil) e Colômbia (2675) (WARREL,2004).

No Brasil, os dados sobre os casos de envenenamento são coletados por meio de

alguns sistemas de notificação, alémdo Sistema de Informação de Agravos de Notificação

(SINAN/MS) há mais dois, o Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas da

Fundação Oswaldo Cruz (SINITOX/FIOCRUZ/MS) e o Sistema de Informações Hospitalares

do Sistema Único de Saúde (SIM/SUS). Apesar da existência desses programas, sabe-se que a

quantidade de casos é muito superior à quantidade registrada, devido, entre outros fatores, às

dificuldades de acesso aos serviços de saúde, principalmente no campo (LEMOS et al.,2009).

No Ceará, entre 2010 a 2013, foram notificados 2.328 ataques (SINAN, 2013).

Sendo em 2012, notificados 445 casos envolvendo picadas de serpentes peçonhentas, tendo

sido 68,1% atribuídos aos gêneros Bothrops sp. e Bothropoides sp., 8,3% ao gênero Crotalus

sp., 1,6% ao gênero Micrurus sp. e 0,9% ao gênero Lachesis sp. (BRASIL,2012).

22

2.4 CONSTITUINTES DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS

2.4.1 CROTOXINA E SUAS SUBUNIDADES

A Crotoxina é o principal polipeptídeo presente no veneno crotálico e foi isolada

por Silva (1982) na subespécie Crotalus durissus terrificus, este autor destacou que este

componente correspondia a 68% do peso total do veneno. De Acordo com Hendon (1971) a

crotoxina (24 kDa) é um β-neurotoxina que tem duas subunidades, uma ácida, a crotapotina

(crotoxina A) e outra básica, a fosfolipase A2 (PLA2) (crotoxina B).

A crotapotina tem sua acidez justificada pela composição de aminoácidos: 12

resíduos de aspartato/asparagina e 14 de glutamato/glutamina versus 2 resíduos de lisina e 2

de arginina. A fosfolipase A2 crotálica contém 11 resíduos de aspartato/asparagina e 10 de

glutamato/glutamina versus 11 resíduos de lisina e 12 de arginina, caracterizando seu caráter

básico. A crotapotina e a fosfolipase A2 são ricas em cistina, contendo 7 e 8 pontes

dissulfídicas respectivamente. As duas subunidades formam a crotoxina, um complexo molar

de proporção 1:1 (BREITHAUPT et al., 1974; SPINOSA, 2008).

Variações interespecíficas e intraespecíficas foram descritas para o complexo

crotoxina. Variações intraespecíficas diferem na presença de diferentes isoformas das

subunidades A e B, as quais possuem potência e atividade biológica diferente (PEREAÑEZ et

al., 2009).

A crotapotina (crotoxina A) não possui a toxicidade e a atividade enzimática da

crotoxina, mas potencializa a sua toxicidade. Essa potencialização é explicada pelo fato de

que, quando associado ao componente B (PLA2), o componente A (crotamina) previne a

ligação da PLA2 a sítios de baixas especificidades e afinidade, direcionando a PLA2 a se ligar

a sítios de receptores de membrana (pós-sináptica) de alta especificidade e alta afinidade, o

que potencializa a toxicidade da crotoxina. Esses sítios de alta especificidade podem ser

receptores colinérgicos ou componentes da membrana fortemente associados a estes (BON et

al., 1997). Esses receptores foram denominados como tipo N (neuronal) e M (muscular). Os

receptores do tipo N foram os primeiros a serem identificados e estão presentes em grande

quantidade nas membranas de cérebro de ratos. Tais receptores ligam-se com alta afinidade às

23

PLA2s neurotóxicas. Os receptores do tipo M foram identificados em músculo esquelético de

coelhos (MATSUBARA, 2009).

A crotapotina demonstrou potencializar o edema inflamatório (induzido por

carragenina), possuir efeito antimicrobiano contra, principalmente, bactérias Gram-negativas

e aumento da pressão de perfusão renal e da resistência vascular renal em rins perfundidos

(sem, entretanto, alterar o fluxo urinário e a filtração glomerular, ao contrário da crotoxina)

(OLIVEIRA et al., 2003).

O veneno da C.d.cascavella contém pelo menos 4 isoformas de crotoxinas

formadas por diferentes combinações de crotapotinas com uma única isoforma de fosfolipase

A2 (PLA2). Ao contrário do veneno de Crotalus durissus terrificus, que contém 3 ou 4

isoformas de PLA2 (BEGHINI et al., 2000).

Os dados supracitados podem servir como indicio para sugerir as diferenças na

intensidade de atuação do veneno das diferentes subespécies.

A crotoxina é uma β-neurotoxina que possui um efeito tóxico bloqueador pós-

sináptico, diminuindo a ação da acetilcolina e impedindo a despolarização da membrana, e

pré-sináptico da liberação de acetilcolina, ou seja, ela bloqueia a transmissão neuromuscular,

impedindo a contração muscular estriada esquelética. Ela pode causar uma paralisia dos

músculos respiratórios, culminando na morte do envenenado. A crotoxina também aumenta a

permeabilidade de íons Na+ (BON et al., 1997; GOPALAKRISHNAKONE et al., 1984;

RANGEL-SANTOS et al., 2004; SPINOSA, 2008; MATSUBARA, 2009). O veneno da

Crotalus durrissus terrificus e a crotoxina B induzem a expressão protéica de cicloxigenase-2

pelas células endoteliais (MATSUBARA, 2009).

A superfamília de PLA2 consiste um amplo espectro de enzimas definidas pela

sua habilidade de catalisar a hidrólise da ligação do centro estérico (posição sn-2) de

fosfolipídios (SIX; DENNIS, 2000). Elas conferem à crotoxina uma ação miotóxica por

atuarem clivando fosfolipídios em sítios específicos de membranas de fibras musculares

estriadas esqueléticas sensíveis à PLA2, causando mionecrose, com perda de estriação das

fibras e degeneração hialina (4 a 6 horas após a injeção da crotoxina)

(GOPALAKRISHNAKONE et al., 1984).

As PLA2s induzem a um extravasamento de plasma, sendo capazes de aumentar a

permeabilidade microvascular da pele na região dorsal de ratos. Os mecanismos de formação

24

de edema induzido pelas PLA2s envolvem a ativação de fibras sensoriais C, as quais liberam

neuropeptídeos, como a substância P, que medeiam efeitos neurogênicos inflamatórios locais

(respostas vasoativas) em tecidos inervados e de mastócitos locais (pela substância P), os

quais liberam histamina e serotonina (CÂMARA et al., 2003).

Fonseca e colaboradores (2006) afirmaram então que a crotoxina apresenta duas

diferentes atividades enzimáticas (PLA2 e da protease de serina) e dois tipos diferentes de

ações biológicas (neurotóxica e coagulante).

2.4.2 CROTAMINA

A crotamina é um polipeptídeo básico, pertencente à família das miotoxinas

polipetitídicas básicas, as quais possuem a capacidade de penetração intracelular, através de

mecanismos independentes de gasto energético, por interação com proteoglicanos

(MATSUBARA, 2009).

O efeito miotóxico é causado pela crotamina, que apresenta atividade sinérgica à

da crotoxina, atua principalmente causando contrações musculares, dependentes da

despolarização da membrana das células musculares estriadas esqueléticas, através do

aumento da permeabilidade desta ao sódio. Esta ação provavelmente é exercida sobre os

canais de sódio, pela indução do influxo de cálcio (LOMONTE et al., 2003). Também foi

observado que a crotamina interage ativamente com as membranas lipídicas das células,

formando vacúolos e demonstrando uma atividade mionecrótica. Sua atividade é similar à da

alfa-toxina dos escorpiões (NICASTRO et al., 2003).

2.4.3 CONVULXINA

A convulxina é uma toxina de alto peso molecular, pertencente à família das

lectinas do tipo C, isolada de Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavella e

Crotalus durissus collilineatus, consiste em um potente ativador plaquetário. De acordo com

Lima e colaboradores (2005) além de induzir a agregação plaquetária ao ligar-se ao receptor

GPV1 das plaquetas, ela causa convulsões, alterações respiratórias e circulatórias. É formada

por duas cadeias polipeptídicas (Cvxα e Cvxβ) covalentemente associadas em uma estrutura

trimérica (αβ)3. A indução plaquetária provocada por esta toxina consiste em uma reação

dependente de Ca+, iniciada pela ligação da convulxina à glicoproteína Ib (GPIb) (POLGAR

25

et al., 1997; JANDROT-PERRUS, 1997, KANAJI et al., 2003). Matsubara (2009) também

descreveu que esta toxina é capaz de agregar e lisar plaquetas, ligando-se com alta afinidade a

um pequeno número de sítios plaquetários, por mecanismo dependente de cálcio, fibrinogênio

e adenosina difosfato.

Leduc e Bon (1998) clonaram e sequenciaram as duas cadeias da convulxina de

Crotalus durissus terrificus. Neste estudo, observou-se uma alta similaridade entre as cadeias

α e β, com uma média de porcentagem de identidade de 74%. O sequenciamento das

subunidades resultou em cadeias compreendendo 158 e 148 resíduos de aminoácidos para

Cvxα e Cvxβ, respectivamente e um peptídeo sinal de 23 resíduos de aminoácidos idênticos

para as duas subunidades. Toyama e colaboradores (2001) isolaram e caracterizaram uma

proteína semelhante à convulxina da peçonha de Crotalus durissus collilineatus com alta

similaridade em relação à convulxina da Crotalus durissus terrificus.

2.4.4 GIROXINA

A giroxina pertence ao grupo do gênero trombina e foi isolado a partir do veneno

da serpente Crotalus durissus terrificus por Raw em 1986, por meio de três passos

cromatográficos de purificação (precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em

Sephadex G-75 e Sepharose-1, 4-butanodiol diglycyl-p-aminobenzamidina). Após análise

eletroforética descobriu-se que a giroxina possuía um peso molecular de 34 kDa e 23 um pH

8,0, ótimo para a coagulação do sangue humano (RAW et al., 1986).

A giroxina converte o fibrinogênio em fibrina e assim aumenta o tempo de

coagulação do sangue (SANO-MARTINS et al., 2001). Além de atuar na coagulação, a

giroxina apresenta uma excelente atividade neurotóxica (BARROS et al., 2011). Fonseca e

colaboradores (2006) descreveram a giroxina apresentando duas frações principais: atividade

de trombina-like e L-amino-oxidase (LAO). A LAO é a única oxidase dependente de FAD

(Flavina adenina dinucleotídeo) encontrada em veneno de serpentes e sua toxicidade,

possivelmente, envolve a geração de peróxido de hidrogênio, produto final da oxidação de L-

aminoácidos. A LAO também induz a agregação plaquetária, envolvendo a ativação da PLA2

(TOYAMA et al., 2006).

Em estudos mais recentes verificaram que a giroxina demonstrou um elevado

nível de atividade coagulante, com uma dose mínima entre 0,015 a 0,037μg/μL (BARROS et

al.,2011).

26

Outras atividades da giroxina são a amidásica e a esterásica (MARTINS et al.,

2002). Prado-Franceschi (1990) sugere que esta toxina produz uma síndrome convulsiva

peculiar em camundongos, caracterizada por movimentos rápidos de rotação do corpo em

torno de seu eixo longitudinal.

Estudos posteriores confirmaram sua ação no sistema nervoso central, causando a

síndrome labiríntica em camundongos, corroborando os achados anteriores (MATSUBARA,

2009). O estudo desta enzima poderá servir como um modelo molecular interessante para o

desenvolvimento de novos fármacos ou agentes terapêuticos (MORAES et al., 2004;

FERRARO et al.,2005), principalmente devido a sua resistência aos inibidores de proteinases

fisiológicas (MATSUI et al., 2000;SERRANO et al., 2005).

2.4.5 PEPTÍDIO NATRIURÉTICO

Outro componente presente no veneno é o peptídio natriurético que ao ser isolado

da Crotalus durissus cascavella foi capaz de aumentar a pressão de perfusão e a resistência

vascular renal em rins perfundidos de ratos. Este componente demonstrou ser capaz de

aumentar o fluxo urinário e a filtração tubular renal e diminuir o transporte tubular de sódio e

a pressão arterial sistêmica. EVANGELISTA et al. (2008) observaram que este componente

do veneno crotálico apresentou efeitos renais e vasculares, com consequente efeito diurético e

hipotensor.

2.5 SISTEMA RESPIRATÓRIO

2.5.1 CARACTERIZAÇÃO MORFOFUNCIONAL

A traqueia divide-se em brônquios principais direito e esquerdo, os quais se

seguem dividindo em brônquios lobares e segmentares, bronquíolos terminais e respiratórios,

ductos alveolares, sacos alveolares e alvéolos. A região compreendida entre a boca ou nariz

até os bronquíolos terminais, é denominada de zona de condução, sua função é condicionar o

ar, removendo material particulado, ajustando a umidade e a temperatura, e o conduzir até os

pulmões. O epitélio de superfície dessa zona é composto por células ciliadas e secretoras, que

27

repousam sobre o tecido subepitelial, que consiste basicamente de tecido conjuntivo e

glândulas, como estas vias aéreas não contêm alvéolos e não participam das trocas gasosas,

elas constituem o espaço morto anatômico, com volume de cerca de 150 mL, em humanos. Já

a região compreendida pelos bronquíolos respiratórios, ductos alveolares e alvéolos, é

denominada de zona respiratória, por ser a região que participa das trocas gasosas (WEST,

2010; FRASER, 2005).

A traqueia, os brônquios e os bronquíolos terminais e respiratórios que não

contêm alvéolos em suas paredes, juntamente com artérias, veias, vasos linfáticos, nervos,

septo interlobular e pleura que os acompanham, formam a porção não parenquimatosa do

pulmão. Os alvéolos da zona de transição juntamente com os sacos alveolares mais distais

constituem o parênquima pulmonar propriamente dito. Há uma estimativa de que 87% do

volume pulmonar total é composto por alvéolos, o que em números equivale a cerca de 500

milhões, com área de superfície de trocas gasosas em torno de 85 m2, em humanos (WEST,

2010; FRASER, 2005).

2.5.2 TROCA GASOSA

Enquanto as células dos animais vivos liberam continuamente dióxido de carbono

e outros produtos residuais, requerem um suprimento contínuo de oxigênio e nutrientes

(BATES, 2009).

A difusão através dos tecidos é mais bem descrita pela lei de Fick, a qual afirma

que a velocidade de transferência de um gás através de uma lâmina de tecido é proporcional a

área do tecido e a diferença de pressão parcial entre os dois lados e inversamente proporcional

à espessura do tecido. A área da troca, a espessura da mesma, a solubilidade dos gases nos

tecidos, o peso molecular dos gases e a diferença de pressão entre os dois lados da membrana

de troca, são fatores que determinam a velocidade da difusão (ZIN; ROCCO, 2008).

O principal sítio de trocas gasosas a nível pulmonar é o alvéolo. Os alvéolos são

delimitados por estruturas que, vistas em corte, se assemelham a hexágonos, como observado

na Figura 3. Essa estrutura é composta por uma camada contínua de células epiteliais ao redor

de um fino interstício. Em três dimensões há alguns sólidos geométricos que se aproximam da

forma alveolar, como o dodecaedro regular.

28

Figura 3 – Fotomicrografia da parede alveolar ao final da inspiração, Aumento 400X e

coloração H.E.(Adaptado de Pavone et al., 2007).

FONTE: PAVONE, L.; ALBERT, S.; DIROCCO, J.; GATTO, L.; NIEMAN, G. Alveolar instability caused by

mechanical ventilation initially damages the nondependent normal lung. Critical Care. v. 11, p. 1-10, 2007.

A superfície alveolar é constituída principalmente por dois tipos de células:

pneumócitos tipo I e II; macrófagos alveolares também estão presentes na superfície epitelial.

O interstício contém os capilares envolvidos na troca gasosa, tecido conjuntivo e uma grande

variedade de células responsáveis por manter a forma do alvéolo e as defesas a nível alveolar

(FRASER, 2005).

O pneumócito tipo I ou célula alveolar escamosa recobre 95 % da superfície

alveolar, e apresenta pouca organela citoplasmática. As células tipo I são unidas por ligações

firmes que produzem uma barreira contra a difusão de fluidos e substâncias solúveis em água

para o interior do alvéolo (FRASER, 2005; ZIN; ROCCO; FAFFE, 2008).

O pneumócito tipo II ou célula alveolar granular tende a se localizar próximo às

junções dos alvéolos, contém muitas organelas celulares, como o retículo endoplasmático

rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e numerosos grânulos eosinofílicos (corpúsculos

lamelares) que armazenam e secretam surfactante. O surfactante, que recobre a superfície

alveolar reduzindo a tensão superficial, é composto principalmente por fosfolipídios, tais

como, fosfatidilcolina saturada e insaturada, fosfatidilglicerol, fosfolípides:

fostatidiletanolamina, fosfatidilinisitol e ácido fosfatídico liso-bis, lípides neutros:

diacilglicerol e esfingomielina, colesterol. (POSSMAYER et al,1984;) e por proteínas tais

como: proteína A (SP-A), proteína B (SP-B), proteína C (SP-C) e proteína D (SP-D). Um

pequeno número de células tipo II é mitoticamente ativado e capaz de se diferenciar em

células tipo I (ZIN; ROCCO; FAFFE, 2008).

29

As membranas basais endoteliais e epiteliais são separadas por um espaço

intersticial de extensão variável que contém tecidos conectivos, como as fibras elásticas e

colágenas e uma variedade de células como os miofibroblastos e células intersticiais

contráteis. As zonas de transporte e de transição juntamente com artérias, veias, vasos

linfáticos, nervos, septo interlobular e pleura, constituem a porção não parenquimal do

pulmão. Os alvéolos das vias aéreas de transição associados com os sacos alveolares mais

distais constituem o parênquima pulmonar (FRASER, 2005).

A membrana alvéolo-capilar funciona como uma barreira entre os espaços aéreos

e o sangue. Ela é composta pelo líquido que banha os alvéolos, epitélio alveolar, membrana

basal do epitélio, estroma alveolar, membrana basal do endotélio e endotélio capilar, além

disso, o oxigênio precisa chegar à molécula de hemoglobina no interior da hemácia, logo

podemos acrescentar a barreira alvéolo capilar (o plasma, a membrana da hemácia e seu

estroma). Em alguns locais esse espaço atinge uma espessura de 0,4 μm a 0,5 μm e essa é a

principal região onde ocorrem as trocas gasosas. Nas demais regiões, a espessura varia devido

à presença de tecido conectivo (incluindo fibras de elastina e colágeno) e de uma variedade de

células, predominantemente os miofibroblastos (ZIN; ROCCO, 2008; FRASER, 2005).

2.5.3 REDE DE FIBRAS DO PARÊNQUIMA PULMONAR

Em um pulmão normal, as proteínas da matriz extracelular (MEC) são usualmente

secretadas pelo fibroblasto, e organizadas em uma rede nos espaços ao redor das células. A

MEC ocupa um volume significativo no tecido e possui informações que orientam a

migração, ligação, diferenciação e organização das células, modulando, assim, uma série de

processos (RAGHOW, 1994, JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008). Três grupos de

macromoléculas associam-se fisicamente para formar a matriz extracelular: as proteínas

estruturais fibrosas, como as fibras de colágeno e elastina; glicoproteínas e proteoglicanos.

Essas moléculas organizam-se em duas porções do tecido, a matriz intersticial e a membrana

basal (COTRAN et al., 1999).

30

2.5.4 FIBRAS DE COLÁGENO E ELASTINA

As fibras de colágeno são os principais constituintes da MEC. Existem vários

tipos de colágeno, sendo que os pulmões contem principalmente o colágeno tipo I e III,

envolvidos na estruturação das paredes alveolares. Sua organização se dá formando uma rede

de fibras central, que se estende desde as vias aéreas centrais aos ductos alveolares, uma

periférica partindo da pleura visceral, e um parênquima intersticial conectando as duas (SUKI

et al., 1994).

O colágeno tipo I é a principal proteína estrutural do interstício pulmonar e é

produzido principalmente durante o desenvolvimento do pulmão e nas reações fibróticas

(GOLDSTEIN, 1991), sendo adaptado para resistir às tensões e apresenta ligações covalentes

fortes entre suas fibrilas (FUNG, 1993). As fibras colágenas são mais rígidas e fortes que

qualquer outro constituinte da MEC, consequentemente, a quantidade e organização do

colágeno dentro da parede alveolar têm papel fundamental na determinação da função

pulmonar (YUAN et al, 2000).

As fibras elásticas são compostas de elastina e microfibrilas, e são sintetizadas

pelos fibroblastos e miofibroblastos e células musculares lisas do pulmão (FUNG, 1993). Elas

apresentam uma heterogeneidade estrutural e estão mecanicamente ligadas ao colágeno

através das microfibrilas e/ou proteoglicanos. O papel das microfibrilas na elasticidade do

pulmão, entretanto, ainda não foi estudado. A elastina é uma proteína hidrofóbica que se

agrega a filamentos e lâminas por ligações cruzadas, e é comumente apontada como

responsável pela elasticidade pulmonar durante a respiração em volume corrente (SUKI et al.,

1994). Entretanto, um estudo realizado comparando os efeitos da digestão de fibras de

colágeno e elastina em equações constitutivas em tiras de parênquima mostrou que o colágeno

pode ser tão importante quanto à elastina mesmo em baixos volumes (YUAN et al., 2000).

2.5.5 GLICOPROTEÍNAS

As glicoproteínas são proteínas cuja principal função é a capacidade de se ligar a

outros componentes da MEC e a proteínas específicas integrantes da membrana celular. As

principais proteínas de adesão são a fibronectina e a laminina. A fibronectina é produzida por

31

fibroblastos, monócitos, células endoteliais e outras células e sua principal função é a de

promover a ligação entre os diversos componentes da MEC, incluindo colágeno, fibrina,

proteoglicanos e às células. A laminina é a glicoproteína mais abundante nas membranas

basais e atravessa a lâmina basal, ligando-se a receptores específicos sobre a superfície das

células e componentes da MEC (SNYDER et al, 2000).

2.5.6 PROTEOGLICANOS

As moléculas de proteoglicanos formam, no tecido conjuntivo, uma substância

gelatinosa e hidratada onde se encontram as proteínas fibrosas. Os proteoglicanos fornecem

suporte mecânico ao tecido, permitindo a difusão de moléculas hidrossolúveis e migração

celular. Influenciam a formação da fibra de colágeno e interagem com várias citocinas e

fatores de crescimento (MISEROCCHI et al., 2001). Ao nível dos tecidos, encontram-se

frequentemente ligados às fibras colágenas, fibras elásticas e fibronectina, participando da

organização da MEC (ALBERTS et al., 1994). Um novo papel importante para os

proteoglicanos é o de estabilizador da rede de fibras de colágenas e elásticas, contribuindo

para a elasticidade tecidual pulmonar e estabilização em pequenos e médios volumes

(CAVALCANTE et al., 2005).

2.6 MECÂNICA PULMONAR

A difusão do ar segue a um gradiente pressórico, determinando um fluxo de ar do

local de maior pressão para o local de menor pressão. Para que isso ocorra durante a

inspiração, a pressão alveolar (Palv) tem que ser inferior à pressão atmosférica (Patm), esta

diferença de pressão é gerada pela contração dos músculos inspiratórios (ex. diafragma), os

quais aumentam a negatividade da pressão intrapleural (Ppl) distendendo as vias aéreas e os

alvéolos. Os músculos respiratórios agem de forma rítmica na parede torácica e sua ação

destina-se a vencer as impedâncias mecânicas impostas pelo sistema respiratório. Esta

impedância se refere aos componentes elásticos dos pulmões e da parede torácica, e

resistência das vias aéreas e ao atrito dos tecidos. A mecânica do sistema respiratório é

subdividida em dois sistemas elásticos: os pulmões e a parede torácica. (BATES,2009; ZIN;

ROCCO, 2009; WEST, 2010).

2.6.1 PROPRIEDADES ELÁSTICAS DO PULMÃO

A Elastância (E) é a medida do quão difícil é distender o tecido pulmonar, a fim

de se aumentar o volume que lhe rodeia, e seu valor está relacionado com a composição do

32

tecido pulmonar, a tensão superficial (T), as propriedades da parede torácica e a organização

estrutural dos constituintes do tecido. Desta maneira, podemos considerar que a pressão

associada à retração elástica (Pel, P) cresce linearmente com o volume pulmonar, de modo que

E seja a constante de proporcionalidade. (BATES, 2009; ZIN; ROCCO, 2009). É importante

ressaltar que na prática clínica é mais usual o emprego da complacência pulmonar, dada pelo

recíproco de E. Complacência pulmonar (CP) é a mudança de volume por unidade de

alteração de pressão (WEST, 2010).

Segundo a Lei de Laplace aplicada a uma superfície esférica, a pressão relaciona-

se com o raio e com a tensão superficial (T) de acordo com a equação: P = 4T/r, onde o

número quatro está associado a duas interfaces ar-líquido (interna e externa). Entretanto,

quando relacionamos esta Lei a um alvéolo esférico revestido por líquido na sua face interna,

apenas uma interface está envolvida e o numerador na Lei de Laplace tem o número 2 no

lugar de 4 (BATES, 2009;MACHADO; ZIN, 2009). De acordo com essa Lei, era de se

esperar que a tensão superficial fosse crescente à medida que os alvéolos fossem tornando-se

menores, acarretando colapsos e hiperdistensões dos espaços aéreos, entretanto, os

pneumócitos tipo II secretam o surfactante, um líquido de composição proteica e

principalmente fosfolipídios, que diminui a tensão superficial no alvéolo na medida em que

sua área diminui, evitando assim o colapso alveolar durante a expiração (ZIN; ROCCO,

2009).

2.6.2 PROPRIEDADES ELÁSTICAS DA PAREDE TORÁCICA

Da mesma forma que o pulmão possui suas propriedades elásticas intrínsecas,

assim também é a parede torácica, sendo composta pelo arcabouço torácico, o diafragma, a

parede abdominal e o mediastino. A parede torácica tende a expansão até que se consiga

atingir seu equilíbrio elástico (cerca de 75% da capacidade vital), a partir desse ponto tenderá

a retração, agindo de forma contrária a ventilação pulmonar em volumes acima desse

equilíbrio (MACHADO; ZIN, 2009).

Em indivíduos hígidos, pulmão e parede torácica movimentam-se em conjunto e

estas estruturas são separadas pelo espaço pleural. A pressão intrapleural (PPL), é a pressão no

interior do espaço pleural, e é determinada pela interação mecânica entre os pulmões e a

parede torácica. Ao final da expiração, as pressões de recolhimento elástico dos pulmões e da

parede torácica são iguais, e as forças associadas a essas pressões produzem efeitos

33

concorrentes: expansão da caixa torácica e redução do volume pulmonar, o que faz com que a

Ppl seja negativa, em torno de 3 cmH2O abaixo da pressão atmosférica. No momento da

inspiração, essa pressão torna-se mais negativa, retornando ao seu valor inicial no final da

expiração. A pressão alveolar (PAL), por sua vez, é negativa na inspiração e positiva na

expiração em relação à pressão na abertura das vias aéreas (Pao) (BERNE et al, 2004;

MACHADO; ZIN, 2009).

2.6.3 PROPRIEDADES RESISTIVAS DO SISTEMA RESPIRATÓRIO

A resistência pulmonar pode ser subdividida em dois componentes: a resistência

das vias aéreas (Raw), que influencia o fluxo de ar no interior dos pulmões, e a resistência

tecidual (Rtis), que é determinada pelas perdas energéticas geradas pela viscosidade (atrito)

pertinente à movimentação do pulmão (BATES, 2009; MACHADO; ZIN, 2009).

2.6.4 RESISTÊNCIA PULMONAR

A resistência pulmonar (RL) é obtida pela soma da resistência tecidual (Rtis) e a

resistência das vias aéreas (Raw) (WEST, 2010).

Quando o tecido pulmonar é deformado, como ocorre durante as mudanças de

volume, as fibras, células e fluidos que compõem o tecido pulmonar movem-se uns em

relação aos outros sob a ação de forças de atrito, gerando perdas energéticas, determinando a

resistência tecidual. Esse componente da resistência corresponde a cerca de 20% da

resistência pulmonar (BATES, 2009; ZIN; ROCCO; FAFFE, 2008).

Em uma abordagem simplificada e com a finalidade de descrever o escoamento de

ar ao longo das vias aéreas, estas podem ser consideradas uma série de tubos ramificados, os

quais se tornam mais estreitos, curtos e numerosos, à medida que penetram mais

profundamente nos pulmões. A resistência das vias aéreas pode ser quantificada pela

diferença de pressão entre os alvéolos e a boca, dividida pelo fluxo. Esta pode ser influenciada

pela geometria da árvore traqueobrônquica, pelo volume pulmonar, pela complacência das

vias aéreas, pela densidade e viscosidade do gás inspirado e pela musculatura lisa dos

brônquios. Baseando-se na equação de Poiseuille, seria natural pensar que a resistência das

vias aéreas tenderia a crescer dos bronquíolos (pequeno calibre) em direção aos grandes

brônquios, contudo devido ao aumento da secção transversal à medida que as vias aéreas vão

34

se tornando menores, esta resistência é maior nos brônquios de tamanho médio e muito

pequena nos bronquíolos (WEST, 2010; MACHADO; ZIN, 2009).

2.6.5 RESISTÊNCIA DA PAREDE TORÁCICA

A resistência da parede torácica é determinada pelo atrito que ocorre entre os

constituintes (caixa torácica óssea, os músculos da caixa torácica, o diafragma e o abdome) do

tecido, entre as duas pleuras e nas articulações (MACHADO; ZIN, 2009).

2.6.6 VISCOELASTICIDADE

Além dos componentes elásticos e resistivos, o sistema respiratório apresenta

propriedades viscoelásticas, que atuam no tecido pulmonar e na parede torácica (BATES et

al., 1989).

A viscoelasticidade pode ser demonstrada com materiais (ex. fios de seda) que

obedecem à lei da proporcionalidade entre a força aplicada e o alongamento resultante (Lei de

Hooke), porém, apenas por um curto período de tempo após a aplicação da força. Quando esta

força for aplicada por um período prolongado, o alongamento passa a aumentar

continuamente. Substâncias viscoelásticas quando mantidas sob deformação constante,

apresentam o chamado relaxamento de tensão (“stress relaxation”) que é uma queda de

tensão, quando o corpo é estirado. Em contrapartida, sob uma tensão constante, o corpo tende

a se deformar continuamente com o decorrer do tempo, comportamento conhecido como

“creep”. Do ponto de vista morfofuncional, a viscoelasticidade ocorre no tecido pulmonar e

na parede torácica e permite a troca de energia (pressão) entre o componente elástico e

resistivo (KOCHI, 1988).

2.6.7 DISSIPAÇÃO DE ENERGIA DURANTE O CICLO RESPIRATÓRIO

A elasticidade é uma propriedade da matéria que permite ao corporetornar à sua

forma original após sofrer deformação por uma força aplicada sobre ele. Os tecidos dos

pulmões e do tórax possuem propriedades elásticas e obedecem, dentro de certas condições, à

lei de Hooke. De acordo com essa lei, um corpo é perfeitamente elástico quando, ao sofrer

uma força distensora se deforma proporcionalmente, ou seja, a variação de comprimento (ou

35

volume) é diretamente proporcional à força (ou pressão) aplicada até que se atinja seu limite

elástico. Desta forma, quanto maior for a pressão gerada pelos músculos inspiratórios, maior

será o volume inspirado e a energia acumulada no sistema. Parte da energia gasta na

inspiração é dissipada como calor, mas parte dela é armazenada como energia potencial

elástica pelas estruturas que sofrem o estiramento, essa energia armazenada é então gasta para

realizar a expiração em volume corrente (MACHADO; ZIN, 2009; WEST, 2010; BATES,

2009).

A curva pressão-volume (PV) no sistema respiratório é obtida através de um ciclo

respiratório, sendo que o ramo da curva inspiratória não coincide com o da curva expiratória,

estes juntos formarão um loop, efeito conhecido como histerese pulmonar. Na curva PV

obtida em regime quase estático, condição em que se pode considerar desprezível as perdas

energéticas devido à viscosidade do ar, é possível quantificar a dissipação de energia sem a

contribuição da resistência das vias aéreas (APPADU; HANNING, 2003). Nessa curvaPV o

trabalho realizado durante a inspiração (trabalho positivo) é dado pela área entre o ramo

inspiratório e o eixo dos volumes, e o trabalho realizado durante a expiração é dado pela área

correspondente no ramo expiratório (trabalho negativo) e o eixo dos volumes.

Considerando o estado final do sistema, definido pelos valores de pressão e

volume ao final da expiração, como sendo igual ao estado inicial, à soma do trabalho

inspiratório e expiratório é igual à diferença entre as duas áreas acima mencionadas, ou seja, é

igual à área circunscrita pelo loop PV. Um fator importante que reduz a dissipação de energia

durante o ciclo respiratório é a camada de surfactante presente no alvéolo. Então, em

patologias onde há alteração nas propriedades ou na quantidade de surfactante, espera-se

encontrar correspondente alteração na área do loop PV (APPADU; HANNING, 2003).

2.7 MODELAGEM EM MECÂNICA PULMONAR

Esse assunto é referenciado quase que totalmente por Bates (2009).

Do ponto de vista mecânico a grande maioria dos eventos queinfluenciam a

função pulmonar ocorre no seu interior, impossibilitando a sua observação direta, deixando-

nos a intuir o que está acontecendo em seu interior a partir das relações dinâmicas observadas

entre as variáveis que podemos mensurar experimentalmente. Para isso são utilizados

modelos matemáticos. Estes nada maissão que um conjunto de equações que servem como

uma indicação precisa de nossas suposições sobre o funcionamento da mecânica pulmonar e

como um meio de se explorar as consequências dessas suposições.

36

Os testes de função pulmonar são uma ferramenta indispensável parafornecer uma

relação entre as mudanças funcionais e estruturais que ocorrem no pulmão. A resistência e a

elastância pulmonar têm sido por muito tempo as variáveis tradicionais, nos modelos animais,

para avaliar a função pulmonar, apesar de haver uma compreensão limitada da relação entre

esses parâmetros e as características estruturais do órgão.

Um exemplo de modelagem bastante simples é o chamado modelo linearde

compartimento único, constituído por um balão elástico selado ao final de um tubo, o balão

(com elastância E) representando o tecido pulmonar e o tubo (com resistência R) representa as

vias aéreas pulmonares. A equação do movimento que descreve este modelo é:

P (t) = RV’ (t) + EV (t) + P0 (1)

Onde P (t) é a pressão na entrada do modelo, V’ (t) é o fluxo de gás pelo tubo do

modelo, V (t) é o volume de gás no compartimento elástico, P0é a pressão restante aplicada e t

é o tempo.

A representação do sistema respiratório por um compartimentoúnico

uniformemente ventilado é considerada adequada desde que o fluxo fornecido ao sistema

esteja limitado a uma única frequência. Por mais que este modelo incorpore o fundamental

para o entendimento do processo da ventilação, o pulmão é muito mais complicado do que

este simples modelo nos oferece. Se o fluxo fornecido ao sistema apresentar diversas

frequências, o sistema respiratório passa a responder como sendo composto por diversos

componentes distintos, cujas contribuições relativas para o comportamento do sistema

respiratório variam com a frequência.

Com isso, podemos inferir que o ar não irá se distribuir da mesma forma, nem

aomesmo tempo para todas as unidades constituintes do pulmão. A modelagem da mecânica

do sistema respiratório que utilizaremos neste trabalho é conhecida como modelagem inversa.

Nessa abordagem considera-se que a imposição de um fluxo de ar V’ (t) na entrada das vias

aéreas corresponde à existência de uma pressão na entrada dessas vias, Pao(t). No contexto da

teoria de Sistemas Lineares, diz-se que o sistema recebeu uma entrada, dada por V’ (t), e em

resposta a ela produziu uma saída, Pao(t).

Do ponto de vista mecânico, a relação entre essa entrada e a saídadepende dos

processos físicos que ocorrem no sistema. A descrição desses processos envolve o

conhecimento das propriedades mecânicas dos constituintes internos do sistema, bem como

das interações entre esses constituintes. No sistema respiratório podem ser citados alguns

37

constituintes, como por exemplo, a rede de fibras elásticas e de colágeno, a interface ar-

líquido recobrindo alvéolos, dentre outros. As interações entre esses constituintes podem ser

exemplificadas pela transmissão das forças geradas pela tensão superficial às estruturas

sólidas do pulmão através das redes de fibras.

As propriedades mecânicas dos constituintes dificilmente são conhecidascom

precisão absoluta, e com ainda menor precisão são conhecidas às inúmeras e complexas

interações entre eles. Para contornar essas dificuldades, uma abordagem possível consiste em

identificar os constituintes com papel predominante e determinar suas propriedades e

principais interações, e buscar uma relação entre entrada (V’) e saída (Pao). Essa relação

muitas vezes é expressa por meio de equações diferenciais em que as derivadas são em

relação ao tempo. Nessas situações diz-se que essas relações matemáticas são as equações de

movimento do sistema, geralmente obtidas das leis de Newton.

Conforme foi descrito previamente, o sistema respiratório tem propriedades

elásticas e resistivas interdependentes e bastante complexas. Em mecânica Newtoniana é

muito comum abordar essa malha de interações, que são distribuídas espacialmente ao longo

de todo o sistema respiratório, por meio de descrições que agrupam as características elásticas

em um ou poucos componentes fictícios, nomeadas neste contexto como molas. O mesmo é

comumente feito para os componentes resistivos do sistema, utilizando um único componente

hipotético que tem a propriedade de dissipar energia mecânica, e cujas características

representem as propriedades combinadas dos inúmeros constituintes teciduais.

Esse constituinte dissipativo será aqui chamado de amortecedor.Para exemplificar,

a figura 4 (A) mostra um dos modelos comumente utilizados para descrever o sistema

respiratório, conhecido como modelo viscoelástico. Nessa abordagem as vias respiratórias são

representadas por um único duto cilíndrico de paredes rígidas com resistência R, que

representa o efeito combinado das resistências de todas as vias aéreas. Nessa figura o sentido

do fluxo é indicado pela seta tracejada, o que significa uma inspiração. Ao longo da via aérea

são representados os níveis de pressão alta por preenchimentos densos e baixos por pontos

rarefeitos. As regiões de trocas gasosas são representadas por uma câmara cilíndrica de

paredes rígidas e com base móvel, possibilitando variações no volume.

Note que esse modelo supõe uma distribuição perfeitamente homogênea dos gases

no pulmão. A base da câmara é conectada a uma mola, cuja ação se opõe a aumento de

volume, gerando uma pressão de recuo proporcional ao volume, medido a partir da

capacidade residual funcional. Essa constante de proporcionalidade é ET, que representa o

efeito combinado de todos os elementos elásticos do sistema respiratório. Atuando

38

mecanicamente em paralelo à mola há um amortecedor, que atuando na base do cilindro

produz uma pressão proporcional à variação do volume da câmara, supostamente igual ao

fluxo V ’. Na realidade essas quantidades (V ’ e variação do volume da câmara) são

consideradas iguais porque desprezamos a compressibilidade do ar dentro do pulmão, dentre

outros fatores. A constante de proporcionalidade entre a pressão gerada pelo amortecedor e o

fluxo é a resistência tecidual, RT, que representa o efeito combinado dos elementos resistivos

de todos os constituintes teciduais do sistema.

Uma vez estabelecido o modelo de trabalho, procede-se à estimativa dos

parâmetros do dado modelo. Com o animal conectado a um ventilador mecânico, impõe-se a

aplicação de um fluxo V’experimental ( t ) à abertura das vias aéreas e mede-se a pressão

correspondente, Pexperimental (t). Em seguida faz-se o ajuste das constantes ET e RT, de

modo que os valores de V ’(t) e PAO (t) calculados a partir das equações de movimento sejam

mais próximos possíveis doscorrespondentes valores experimentais.

Os modelos usualmente ligam as estruturas do sistema respiratório àssuas

respectivas funções. Os valores dos parâmetros do modelo devem refletir as alterações nas

estruturas do sistema associadas a patologias ou intervenções com drogas ou manobras

respiratórias. Verifica-se, por exemplo, aumento de R com o aparecimento de

broncoconstricções.

Para uma dada frequência de respiração e em pulmões sadios ou comleve grau de

injúria, esse modelo viscoelástico consegue descrever razoavelmente bem algumas

propriedades do sistema respiratório. Entretanto, há nuances presentes no sistema respiratório

que não conseguem ser descritas por esse modelo, como por exemplo, a diminuição da

resistência do sistema respiratório com o aumento da frequência respiratória.

Há muitos modelos propostos que, em melhor grau, respondem a um ou outro

aspecto da mecânica respiratória. Dentre eles, o modelo de fase constante é o mais difundido,

particularmente por descrever bem a dependência das propriedades elásticas com a frequência

e por separar, com apenas quatro parâmetros, as contribuições dos tecidos e das vias aéreas na

resistência do sistema respiratório.

Este modelo difere do modelo viscoelástico apenas pela substituição

doselementos representativos dos tecidos, ou seja, a mola e o amortecedor, conforme a Figura

4. Outra diferença é que as variáveis pressão e fluxo são tratadas no espaço das frequências.

Isso é feito a partir da transformada de Fourrier das funções V ’(t) e PAO (t), conforme as

equações abaixo:

39

No espaço das frequências, as transformadas de Fourrier da pressão e do fluxo são

relacionadas por uma simples relação de proporcionalidade, onde o fator de proporcionalidade

é uma função chamada de impedância,

Z (f): P (f) = Z (f) V’ (f) (4)

Z(f) nesse caso é chamada de impedância de entrada porque relaciona duas

quantidades medidas na entrada do pulmão.

Figura 4 - Exemplos de modelos utilizados para descrever o sistema respiratório: (A)

Modeloviscoelástico; (B) Modelo de fase constante.

40

2.7.1 O MODELO DE FASE CONSTANTE

O modelo de fase constante é um modelo avançado de mecânicapulmonar que

oferece uma distinção entre a mecânica respiratória central e periférica. Tem sido o modelo de

escolha para descrever a impedância de entrada do sistema respiratório (Zrs), que expressa

separadamente os efeitos de resistência de vias aéreas, resistência e elastância tecidual e

inertância dos gases respirados.

Para extração desses parâmetros faz-se o uso de ventilação mecânica a

frequênciaspré-definidas. O modelo de fase constante descreve a impedância utilizando a

seguinte equação:

onde RN é a resistência Newtoniana, que representa a resistência ao fluxo de ar nas vias aéreas

condutoras, e I representa a inertância do gás nas vias aéreas centrais. No modelo acima, G

reflete as propriedades dissipativas do tecido pulmonar (resistência tecidual), sendo chamado

comumente de amortecimento tecidual; H reflete o caráter elástico do tecido (elastância); f

representa a frequência, i é a raiz quadrada de -1 e α é dado por:

𝛼 =2

𝜋𝑡𝑎𝑛−1 (

𝐻

𝐺)

Outra característica importante do modelo de fase constante, além dapossibilidade

de separar as contribuições das vias aéreas e dos tecidos, diz respeito à razãoη = G/H,

conhecida como histeresividade. Duas nuances desse parâmetro merecem destaque.

A primeira é que, considerando pulmões de um mesmo grupo experimental,

verifica-se que esse parâmetro se mantém aproximadamente constante dentro do grupo. Isso

indica que os parâmetros G e H não são independentes, ou seja, um aumento da resistência

tecidual está geralmente associado a um aumento na mesma proporção do parâmetro H,

associado às características elásticas do tecido.

A segunda característica, igualmente importante, mas com maioresrepercussões

do ponto de vista fisiológico, diz respeito ao aumento de η durante broncoconstrição

(KACZKA et al., 1997). A partir de experimentos com cápsulas alveolares verificou-se que

há aumento das desigualdades regionais (heterogeneidades) nas propriedades mecânicas do

pulmão com o aumento na severidade de broncoconstricções (FREDBERG et al., 1985). Isso

41

tem levado à aceitação de que η sempre cresce à medida que o pulmão se torna

mecanicamente heterogêneo. Assim, a histeresividade pode ser usada como um indicativo

dessas heterogeneidades (BATES, 2009).

2.8PESQUISA POR HIPERRESPONSIVIDADE DE VIAS AÉREAS MEDIANTE

DESAFIO COM METACOLINA(MCH)

Estudos demonstraram que a fração do volume tecidual que éatribuído à

maquinaria contrátil é comparável nas vias aéreas, dutos alveolares e vasos sanguíneos no

parênquima pulmonar, determinando que o parênquima pulmonar, assim como as vias aéreas,

pode ser considerado um tecido (FREDBERG, 2004).

A hiperresponsividade das vias aéreas é definida como um estreitamentoexcessivo

das vias aéreas em resposta a uma variedade de estímulos químicos e físicos que têm pouco

ou nenhum efeito em indivíduos saudáveis (BRUSASCO etal., 2003). A medida da

responsividade das vias aéreas, alterada em algumas patologias, pode ser realizada através da

utilização de agonistas que provocam a broncoconstrição, com um procedimento chamado de

desafio com agonista. Este é realizado através da administração, seja por via inalatória ou

intravenosa, de um agonista da musculatura lisa das vias aéreas. Os agonistas mais

comumente utilizados são a metacolina (MCh), a acetilcolina (ACh) e o carbacol.

O termo hiperresponsividade das vias aéreas é usado para descrever afacilidade de

estreitamento das vias aéreas em resposta ao desafio com agonistas contráteis inespecíficos

(FREDBERG, 2004), é uma anormalidade funcional que pode ser desencadeada por

alérgenos, e por alguns estímulos inespecíficos, tais como poluição atmosférica, estimulantes

farmacológicos, infecções respiratórias, exercício físico e fatores emocionais (BLEASE,

2000). Alguns mecanismos quepodem estar relacionados com a hiperresponsividade

brônquica são: contratura excessiva da musculatura lisa das vias aéreas, espessura e

integridade da camada epitelial, alterações mecânicas dos brônquios, modificações no

conteúdo e no equilíbrio das proteínas da MEC e ainda regulação autonômica exacerbada.

Entretanto o percentual de participação de cada um destes fatores ainda não

étotalmente compreendido. O processo inflamatório, no qual acompanha uma vasta liberação

de mediadores inflamatórios e citocinas, tem um papel chave na hiperresponsividade

(HIZUME, 2010).

42

3 JUSTIFICATIVA

Diante da prevalência de acidentes ofídicos associados a escassos estudos com

envenenamento relacionados ao sistema respiratório, faz-se necessário um estudo mais

aprofundado e uma maior investigação dessas alterações morfofuncionais, tendo em vista o

maior esclarecimento dos mecanismos fisiopatológicos.

Essa Dissertação se enquadra na linha de pesquisa em sanidade animal visando a

um estudo morfológico com ênfase nas alterações sistêmicas que acometem a arquitetura

histológica pulmonar e vias aéreas superiores, promovidas pelo veneno desta serpente em

estudo, a fim de determinar as suas alterações histológicas e propiciar o menor sofrimento ao

animal vitimado após o acidente ofídico.

O comportamento das propriedades mecânicas do sistema respiratório, a

caracterização das estruturas pulmonares e a quantificação do processo inflamatório gerado

pela ação do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella (C.d.cascavella)são pouco

conhecidos. Desta forma, faz-se necessário conhecer os efeitos desta possível lesão para que,

em eventual acometimento, a intervenção terapêutica seja a mais precoce e eficiente possível.

43

4 HIPÓTESE

Existe uma relação direta entre as alterações mecânicas e as alterações morfológicas

no sistema respiratório após envenenamento crotálico.

44

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Analisar as propriedades mecânicas e a morfologia pulmonar em modelo

experimental de lesão pulmonar aguda induzida pelo veneno da serpente Crotalus durissus

cascavella (C. d. cascavella).

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudar os efeitos biológicos do veneno bruto da serpente Crotalus durissus cascavella

(C. d. cascavella) em modelo animal.

Descrever as alterações histológicas pulmonares e das vias aéreas superiores

promovidas pela ação tóxica do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella (C. d.

cascavella).

Observar o comportamento das propriedades mecânicas elásticas, viscosas e

viscoelásticas do sistema respiratório em resposta à lesão pulmonar aguda induzida pelo

veneno da serpente Crotalus durissus cascavella (C. d. cascavella).

Correlacionar os dados obtidos na mecânica pulmonar com a histopatologia.

45

6 CAPÍTULO 1

Mecânica Pulmonar e Histopatologia induzida pelo Veneno da

serpente Crotalus durissus cascavella

Pulmonary mechanical and Histopathology induced by Crotalus

durissus cascavella snake venom

Periódico: Acta Médica Portuguesa (Submetido em 14 de janeiro de 20015).

46

Mecânica Pulmonar e Histopatologia induzida pelo Veneno da

serpente Crotalus durissus cascavella

Pulmonary mechanical and Histopathology induced by Crotalus

durissus cascavella snake venom

Joselito de Oliveira NETO1, João Alison de Moraes SILVEIRA

2, Daniel Silveira

SERRA3, Daniel de Araújo VIANA

1, Diva Maria BORGES-NOJOSA

4, Paula Priscila

Correia COSTA2, Célia Maria de Souza SAMPAIO

5, Helena Serra Azul MONTEIRO

2,

Francisco Sales Ávila CAVALCANTE3, Janaina Serra Azul Monteiro EVANGELISTA

1

1 Laboratório deHistologia dos efeitos causados pelos venenos de serpentes e plantas –

HISTOVESP. Faculdade de Veterinária. Universidade Estadual do Ceará. Fortaleza. Brasil.

2 Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Ceará. Fortaleza. Brasil.

3 Laboratório de Biofísica da Respiração. Centro de Ciências e Tecnologia. Universidade

Estadual do Ceará. Fortaleza. Brasil.

4 NUROF-Núcleo Regional de Ofiologia. Centro de Ciências, Departamento de Biologia

Universidade Federal do Ceará. Fortaleza. Brasil.

5 Coordenação de Ciências Biológicas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Estadual

do Ceará. Fortaleza. Brasil.

Correspondência: Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:

60714-903. Telefone: (85) 3101 9889. E-mail: janainaserrazul@gmail.com

47

RESUMO

Crotalus durissus cascavella (C.d.cascavella) é uma serpente encontrada na Caatinga

do Nordeste Brasileiro. Este trabalho teve por objetivo investigar as alterações em mecânica

pulmonar (propriedades elásticas, resistivas e viscoelásticas) e histopatologia em pulmões

após inoculação intraperitoneal (3,0 µg/Kg) do veneno desta serpente (C.d.cascavella) em

camundongos. Os valores médios de resistência Newtoniana (RN), resistência tecidual(G) e

elastância tecidual(H) foram significativos em todos os grupos experimentais (1h, 3h, 6h, 12h

e 24h), sendo maiores nos dois últimos grupos. A histeresividade (η) foi significativa em 6h,

12h e 24h. Os valores médios de complacência estática (Cst) foram significativos nos grupos

de 6h, 12h e 24h sendo nesse último grupo valores menores. A capacidade inspiratória (CI)

mostrou-se significativa em 3h, 6h, 12h e 24h. Após desafio com Metacolina, RN apresentou

valores médios significativos nos grupos 6h, 12h e 24h. O veneno da serpente C. d. cascavella

induziu no tecido pulmonar, atelectasia, enfisema, hemorragia, infiltrado inflamatório com

polimorfonucleares, congestão em todos os grupos experimentais e edema apenas no grupo de

24h. O veneno da C. d. cascavella provocou alterações mecânicas e histopatológicas no tecido

pulmonar, porém o mecanismo de ação continuará a ser estudado para possíveis descobertas

morfofuncionais.

PALAVRAS-CHAVE: Crotalus durissus cascavella, Mecânica Pulmonar, Histopatologia.

ABSTRACT

Crotalus durissus cascavella (C. d. cascavella) is a snake found in the Brazilian Northeast

Caatinga. This study aimed to investigate the changes in lung mechanics (elastic properties,

resistive and viscoelastic) and histopathology in lungs after intraperitoneal injection (3,0

µg/Kg) of this snake venom (C. d. cascavella) in mice. The average values of Newtonian

resistance (RN), tissue resistance (G) and tissue elastance (H) were significant in all groups

48

(1h, 3h, 6h, 12h and 24h) and higher in the last two groups. The histeresividade (η) was

significant in 6h, 12h and 24h. The static compliance of average values (Cst) were significant

in groups of 6h, 12h and 24h and the latter group lower values. The inspiratory capacity (CI)

was significant at 3h, 6h, 12h and 24h. After challenge with Methacholine, RN known

significant average values in groups 6h, 12h and 24h. The venom of the snake C. d.

cascavellaalso induced in pulmonar tissue atelectasis, emphysema, hemorrhage, inflammatory

infiltrate with polymorphonuclear cels, congestion in all experimental groups, and edema only

in the 24h group. The venom of the snake C. d. cascavellacaused mechanical and

histopathological changes in lung tissue, however the mechanism of action will continue to be

studied for possible morphological and functional findings.

Keywords: Crotalus durissus cascavella,Pulmonary Mechanics, Histopathology.

INTRODUÇÃO

A composição química e as atividades biológicas dos venenos podem variar muito

entre as famílias e gêneros das serpentes. 1A maior gravidade encontra-se nos acidentes

causados por serpentes do gênero Crotalus, e essas têm relevante espaço no campo científico,2

visto que em algumas décadas seu veneno vem sendo alvo de pesquisadores devido a sua

constituição e o efeito que essas substâncias podem causar.3

A subespécie Crotalus durissus cascavella (C.d.cascavella), encontrada na Caatinga

do Nordeste Brasileiro4,3

, produz um veneno que conduz à alteração sistêmica, sendo

responsável pela causa preliminar de óbito após o acidente ofídico.5

A peçonha de Crotalus apresenta-se como um complexo tóxico-enzimático, na qual

são encontradas as enzimas fosfodiesterase, l amino oxidase, 5-nucleotidase e toxinas como a

crotoxina, convulxina, crotamina e giroxina.6

Os animais acometidos por envenenamento crotálico manifestam como principais

complicações: insuficiência renal aguda 7, choque circulatório

8,9, reações edematogênicas,

agregação de plaquetas10

e hipotensão arterial5. Há insuficiência respiratória aguda

relacionada à paralisia neuromuscular. 11

49

O comprometimento pulmonar após envenenamento crotálico apresenta um quadro de

hipotensão e consequente hipoventilação, se instalando um processo de angústia respiratória,

cuja consequência será a perda do status de bem estar do animal acometido pelo acidente

ofídico.

Em vista disso, tornou-se relevante estudar as alterações morfofuncionais no sistema

respiratório após exposição do veneno da subespécie C. d. cascavella, buscando a um

entendimento de seus efeitos biológicos e suas ações nesse sistema.

A observação das propriedades mecânicas do sistema respiratório, a caracterização das

estruturas pulmonares e a quantificação do processo inflamatório gerado pela ação do veneno

da subespécie C. d. cascavella são pouco conhecidos. Portanto, fez-se necessário estudar os

efeitos desta possível alteração na arquitetura pulmonar para que, em eventual acometimento,

a intervenção terapêutica seja a mais precoce e eficiente possível.

Esse trabalho teve por objetivo, analisar a função pulmonar em modelo experimental

de lesão pulmonar aguda induzida pelo veneno. Para este fim, as propriedades elásticas,

resistivas e viscoelásticas foram determinadas em 1, 3, 6, 12 e 24 h após inoculação

intraperitoneal do veneno em camundongos, e os resultados foram correlacionados com dados

colhidos a partir da histopatologia pulmonar.

MATEIAL E MÉTODOS

Veneno

O veneno total foi obtido e gentilmente cedido pela professora doutora Diva Maria

Borges Nojosa e pela médica veterinária Roberta da Rocha Braga do Núcleo Regional de

Ofiologia (NUROF) do departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará – UFC,

Fortaleza, Brasil. O veneno foi liofilizado e diluído em solução salina (0,9%, w/v solução de

NaCl) no momento de sua utilização.

Animais

Camundongos machos Balb/C (20-30g), foram mantidos em alojamento com

temperatura controlada, umidade relativa do ar 65,3 % e 12 h claro/escuro, receberam água e

comida ad libitum. Os animais e os protocolos de pesquisa utilizados neste estudo estão de

50

acordo com as diretrizes da Comissão de Ética para uso de animais da Universidade Estadual

do Ceará – UECE, número de protocolo 12773584-4.

Protocolo Experimental

Os animais foram ventilados em padrões basais a uma frequência de 150

respirações/min, um volume corrente de 10 mL/kg, com limite pressórico de 30 cmH2O, e

uma pressão positiva expiratória final (PEEP) de 3 cmH2O.

Para a análise da função pulmonar os animais foram sedados com Diazepan

(1mg)(Novafarma Indústria) e anestesiados com Pentobarbital sódico (Hypnol 3%, Syntect)

(50 mg/mL),todos intraperitonealmente, posteriormente realizou-se procedimento cirúrgico de

traqueostomia.

Para que as variáveis da função pulmonar fossem coletadas de forma fidedigna, se faz

necessário que o animal esteja suficientemente sedado e paralisado para não haver

interferência da atividade de seus músculos respiratórios. Para tanto, após o início da

ventilação, estes foram paralisados com brometo de pancurônio (0,5 mL/kg, Pancuron®,

Cristália, Brasil), intraperitonealmente.

Antes do protocolo de análise, realizou-se duas inflações profundas (IP) com limite

pressórico de 30 cmH2O e 6s de duração, seguido por um período de 5 minutos de ventilação

nos padrões basais, para que se realizasse a padronização do histórico pulmonar. Logo após,

foi iniciado o protocolo de análise de dados, onde a impedância do sistema respiratório (Zsr)

foi medida através da técnica de oscilações forçadas de forma sequencial, em intervalos de

10s durante 2 minutos. Seguidos da realização de duas curvas pressão-volume para a coleta da

complacência estática (Cst), estimativa da capacidade inspiratória(CI) e área da curva.

A Zsr foi determinada através da medição do volume de deslocamento e pressão do

pistão no cilindro do ventilador enquanto perturbações de 3s de volume oscilatório foram

entregues para as vias aéreas. Estas perturbações eram realizadas através de 13 ondas

sinusoidais sobrepostas com variações de amplitude e frequência (1-20,5 Hz). As frequências

foram fixadas em valores mutuamente condicionadas para reduzir a distorção harmônica que

pode ocorrer em sistemas não lineares. 12

Antes do início do protocolo obtiveram-se os sinais

de calibração dinâmica necessárias para corrigir as características físicas do ventilador

mecânico em medições subsequentes de Zsr. A Zsr foi determinada através da transformada de

51

Fourier dos sinais de fluxo e a pressão do cilindro, tal como descrito anteriormente 13

. A Zsr

foi interpretada de acordo com o modelo

onde,

onde RN é a resistência Newtoniana, i é a √−1, f é a frequência (Hz), I é a inertância das vias

aéreas, e G e H caracterizam respectivamente as propriedades dissipativas e elásticas do

tecido pulmonar 12

. Outra característica importante do modelo de fase constante, diz respeito à

razão G/H, conhecida como histeresividade (η).

Hiperresponsividade do músculo liso das vias aéreas

Logo após a coleta de dados iniciais, realizaram-se novamente duas IPs seguidas por 5

minutos de ventilação com padrões basais. A hiperresponsividade do musculo liso das vias

aéreas foi avaliada através da inalação de MCh (Sigma-Aldrich®) realizada através de

aerossol produzido por um nebulizador ultrassônico (Inalasonic®, NS) acoplado na linha

inspiratória do ventilador mecânico. Para o procedimento, foram adicionados sequencialmente

4 mL de solução de MCh (0, 3, 6, 12,5, 25 e 50 mg/mL) no recipiente do nebulizador. A

nebulização foi realizada durante 30s de ventilação mecânica em padrões basais 14

e a

quantidade média de solução nebulizada foi 0,4 mL. Imediatamente após a nebulização,

realizou-se novamente a técnica de oscilações foçadas de forma sequencial em intervalos de

10s durante 2 minutos. Entre a coleta de dados das concentrações de MCh realizou-se duas

IPs seguidas por 5 minutos de ventilação com padrões basais.

Análise Morfológica

Foram obtidos fragmentos de pulmões de aproximadamente 1,5cm2 e

acondicionados em frascos contendo solução de formaldeído a 10% por um período de 48

horas. Em seguida esses fragmentos foram lavados em água corrente por 1 hora para

eliminação de resíduos de formol. Posteriormente os fragmentos foram transferidos para o

etanol a 70% permanecendo imersos nesta substância por um período de 24 horas, sendo

52

iniciado o processo de desidratação em sucessivas diluições crescentes de etanol para

posterior diafanização e em seguida cortados no micrótomo na espessura de 4 μm. Utilizou-se

Hematoxilina-Eosina (HE) para coloração e visualização em microscopia de luz (Microscópio

Nikon trinocular; ®View Software versão 7.3.1.7).

Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão da média, onde n

representa o número de experimentos. Foi considerada diferença estatística significativa os

resultados que apresentaram probabilidade de ocorrência da hipótese nula menor que 5% (p <

0,05). Para tanto, foi utilizado o teste t de Student, para análise de significância da diferença

entre as médias.

RESULTADOS

Efeito da exposição ao veneno C. d. cascavella na Mecânica Pulmonar

Após a inoculação do veneno, os valores médios de resistência Newtoniana (RN)

(Figura 1A), resistência tecidual(G) (Figura 1B) e elastância tecidual(H) (Figura 1C)

foramaumentados e significativos nos grupos de 1h, 3h, 6h, 12h e 24h, sendo maiores nesses

dois últimos grupos. A histeresividade (η) (Figura 1D) apresentou valores médios aumentados

e significativos nos grupos 6h,12h e 24h.

A Figura 2A mostra os valores médios de complacência estática (Cst) sendo reduzidos

e significativos nos grupos de 6h, 12h e 24h sendo nesse último grupo valores menores. A

capacidade inspiratória (CI) (Figura 2B) mostrou valores médios significativos e reduzidos

nos grupos de 3h, 6h, 12h e 24h.

Efeito da exposição ao veneno C. d. cascavella na Mecânica Pulmonar após

utilização de Metacolina

A Figura 3 apresenta a resistência Newtoniana (RN) aumentada após desafio com

Metacolina onde seus valores médios foram significativos nos grupos 6h, 12h e 24h.

53

Efeito da exposição ao veneno C. d. cascavella nos achados histopatológicos

A arquitetura histológica dos pulmões (árvore brônquica, bronquiolar e alveolar)

apresentou alteração da organização arquitetural causada por atelectasia e enfisema. A

atelectasia presente em todos os grupos apresentou intensidade moderada nos grupos 6h, 12h

e 24h (Figura 4A). O enfisema esteve presente em todos os grupos experimentais

deintensidade leve (Figura 4B). O edema foi observado apenas no grupo de 24h de

intensidade leve (Figura 4C). Em todos os grupos experimentais havia infiltração

inflamatória, embora discreta, de linfócitos e plasmócitos. Observou-se uma maior

concentração de infiltrado nos animais dos grupos de 3h e 6h (Figura 4D). Houve presença do

tecido linfoide associado ao brônquio (BALT) aumentado nos grupos 6h e 12h (Figura 4E).

A congestão foi observada em todos os grupos com intensidade leve (Figura 5).

Houve hemorragia em todos os grupos experimentais, de intensidade variável desde

leve a intensa e com maior concentração de intensidade moderada no grupo de 3h (Figura 6).

DISCUSSÃO

Os efeitos dos venenos crotálicos já são bem discutidos e elucidados na literatura, no

que se refere ao bloqueio pré-sináptico da junção neuromuscular, assim como as alterações

em rins, fígado e até mesmo sua ação local. 15,16,17,18,19

As ações deste veneno no sistema respiratório de seres humanos e animais são pouco

conhecidas, apresentadas apenas por estudos de casos e suas representações como melhores

exemplos para se estabelecer possíveis intervenções clínicas. Não foram encontradas

referências científicas a respeito da função pulmonar após inoculação desse veneno em

modelo animal.

Em estudos realizados sobre repercussões pulmonares após aplicação do veneno de

Bothrops jararaca por via intravenosa, as primeiras 48 horas seguidas do acidente são

decisivas para o estabelecimento das lesões pulmonares. 20

Em outro estudo investigando a análise das propriedades mecânicas e histopatológicas

do tecido pulmonar, encontrou-se alteração nos grupos experimentais de 3h (aumento

significativo na elastância tecidual), 6h (aumento significativo na resistência tecidual) e 12h

(aumento das propriedades viscoelásticas) após inoculação por via intramuscular do veneno

da serpente Crotalus durissus terrificus na dose de 0,6 µg/g e que após 24 horas houve

54

retorno aos valores basais. 21

Enquanto que encontramos em nosso estudo, alterações

significativas (aumento na resistência Newtoniana (RN), resistência tecidual(G) e elastância

tecidual(H)) em todos os grupos experimentais (1h, 3h, 6h, 12h e 24h), sendo maiores nos

dois últimos grupos, e nos grupos de 6h,12h e 24h, aumento na histeresividade (η), indicando

aumento na heterogeneidade do pulmão no tocante às propriedades mecânicas o que se reflete

em distribuição heterogênea das áreas ventiladas.

De modo geral, a complicação respiratória consequente ao acidente crotálico se instala

nas primeiras 24 horas, podendo surgir nos casos graves, dentro de 3 a 4 horas após a picada.

22

O infiltrado inflamatório com linfócitos e plasmócitos, presente em todos os grupos

experimentais sendo evidenciado no grupo de 6 horas é sugestivo de uma agressão tecidual

aguda do veneno C. d. cascavella. Isso provavelmente resultou em quimiotaxia, proveniente

da atividade de mediadores químicos inflamatórios liberados, como prostaglandinas,

histamina, bradicinina, ou o óxido nítrico e consequente diapedese de células inflamatórias

para o local da lesão. 24

Houve presença do tecido linfoide associado ao brônquio (BALT)

aumentado nos grupos 6h e 12h, estando relacionado com uma maior ativação do sistema

imunológico desses animais.

Estudo em que houve instilação de lipopolissacarídeo de E. coli, percebeu-se que a

lesão provocada de forma direta nos pulmões, apresentou um processo inflamatório mais

acentuado, acompanhado por aumento nos níveis de citocinas (IL-6, IL-8 e IL-10) e do

infiltrado neutrofílico.25

Em estudos com envenenamento botrópico em modelos animais, ratos e

camundongos, observou-se aparecimento de neutrófilos polimorfonucleares nas primeiras

horas. Após alcançar um pico entre 6 e 72 horas, houve substituição e aparecimento de células

mononucleares, monócitos e linfócitos.26

Outros estudos realizados com o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus,

observou-se um aumento de células linfomononucleares no grupo de 6 horas em vias aéreas.

21 Outros estudos consideraram que em resposta à lesão aguda pulmonar ocorreu a presença

de células mononucleares. 27

A presença de hemorragia em todos os grupos experimentais, de intensidade variável

desde leve a intensa, é justificada pela existência da crotamina associada a uma alta atividade

55

de PLA2, fazendo a esse veneno ser caracterizado pela miotoxidade, podendo ser assim

responsável pelo processo hemorrágico encontrado, sendo relatado na literatura seu potencial

neurotóxico. 18,21,23

A hemorragia intensa indica extravasamento de sangue em virtude de

ruptura vascular.

A PLA2 de ação sistêmica, após a distribuição pelo corpo, se liga a receptores de alta

afinidade da membrana das células musculares em outras regiões anatômicas, induzindo a

miotoxicidade sistêmica. 28

A atividade catalítica das PLA2 irá potencializar as atividades

inflamatórias e neurotóxicas. 29

O aparecimento de edema pulmonar em um animal do grupo experimental de 24h de

exposição ao veneno retrata bem na literatura a não ocorrência frequente dessa alteração

histopatológica, podendo ser relacionado ao fator indireto da lesão gerada pelo veneno da

serpente C. d. cascavellae atribuída à ação das PLA2 sistêmico. Houve relato de uma resposta

edematogênica induzida pelo veneno da serpente Crotalus durissus terrificus onde não foi

dose-dependente e de curso rápido e transitório. 18

Há na literatura vários estudos relatando

que a PLA2 induz edema, um efeito que em alguns casos, são dependentes da habilidade das

PLA2 em se ligarem a proteínas específicas de membrana. 29

O aparecimento de edema

acentuado é encontrado em venenos de serpentes do gênero botrópico. 26

A congestão observada em todos os órgãos teve intensidade leve em todos os grupos.

Tal alteração geralmente deve estar relacionada com o processo de eutanásia dos animais. A

congestão de leitos capilares e venosos está intimamente relacionada ao desenvolvimento de

edema. A estase de sangue pouco oxigenado causa hipóxia que pode acarretar em

degeneração ou morte das células parenquimatosas, às vezes, com cicatrizes microscópicas. A

ruptura de vasos nestes locais de congestão também pode causar pequenos focos de

hemorragia. 30

A atelectasia presente em todos os grupos apresentou intensidade moderada nos

grupos 6h, 12h e 24h. Essa alteração quando ocorre em uma região segmentar do pulmão

pode distorcer o parênquima e o subsegmento adjacente e assim afetar a mecânica tecidual

local. 31

Isso é associado ao aumento da histeresividade (n).

O enfisema esteve presente em todos os grupos experimentais de intensidade leve.

Estudo em que se utilizaram animais tratados com veneno C. d. cascavella, esses

apresentaram evidente congestão vascular hepática intensa. 32

A isquemia transitória hepática

56

causa significativas alterações histológicas no fígado de rato, o que sugere o dano decorrente

da isquemia-reperfusão hepática. 33

A deficiência de alfa-1 antitripsina é um distúrbio genético

de recente descoberta e que ocorre com frequência comparável à da fibrose cística. Resulta de

diferentes mutações no gene SERPINA1 e tem diversas implicações clínicas. A alfa-1

antitripsina é produzida principalmente no fígado e atua como uma antiprotease, tendo como

principal função inativar a elastase neutrofílica, impedindo a ocorrência de dano tecidual. A

mutação mais frequentemente relacionada à doença clínica é o alelo Z, que determina

polimerização e acúmulo dentro dos hepatócitos. O acúmulo e a consequente redução dos

níveis séricos de alfa-1 antitripsina determinam, respectivamente, doença hepática e

pulmonar, sendo que esta se manifesta principalmente sob a forma de enfisema de

aparecimento precoce, habitualmente com predomínio basal. 34

Portanto, há uma hipótese de

que o veneno C. d. cascavella pode ter ocasionado lesão hepática e assim, resultar na

diminuição e/ou na deficiência da produção da alfa-1 antitripsina.

A resistência Newtoniana (RN) tem sido usada como uma boa estimativada resistência

total das vias aéreas. 35

Encontraram-se valores de significância estatística em todos os grupos

experimentais, sendo maiores nos grupos de 12h e 24h, logo estes resultados podem

representar um maior estreitamento ou um aumento na rigidez do músculo liso das vias aéreas

nestes grupos experimentais em relação ao grupo controle. A alteração no diâmetro das vias

aéreas apresenta uma dependência de alguns fatores que nãopodem ser isolados, sua

constrição depende da geração de força a partir da contração do músculo liso, 36

das

flutuações da pressão no interior das vias aéreas 37

e da natureza viscoelástica do músculo liso

e dos tecidos do parênquima ao redor. Ao reduzir o recolhimento elástico do pulmão,

rompendo fibras e destruindo anexos alveolares, ocorre uma limitação do fluxo aéreo, levando

a um aumento da resistência das vias aéreas. O aprisionamento de ar e a nova morfologia

pulmonar atuam reduzindo a superfície disponível para a troca gasosa. 38,39

A resistência de vias aéreas representa valores mais importantes quando se compara à

resistência tecidual. 40

Há correlação da variação das pressões resistivas do pulmão com a

resistência de vias aéreas. 41

A resistência tecidual (G) e elastância tecidual (H) estão relacionadas às propriedades

intrínsecas do tecido, e a análise desses parâmetros não é tão simples quanto à resistência

Newtoniana (RN). Existem várias hipóteses para explicar suas mudanças, uma delas é devido à

alteração das propriedades reológicas do tecido. 35

Outra maneira seria através da influência

que o estreitamento dasvias aéreas tem sobre estes parâmetros, estreitamento que poderia

57

resultar em uma distorção do parênquima pulmonar com fechamento de pequenas vias aéreas,

constituindo um pulmão efetivamente menor com uma elastância tecidual (H)

proporcionalmente maior.42

A resistência tecidual (G) reflete a dissipação de energia viscosa

no tecido pulmonar, parâmetro que também é alterado devido à distorção do parênquima

pulmonar que ocorre quando as vias aéreas se contraem, 42

o que pode explicar os aumentos

significantes dos valores G e H em todos os grupos experimentais, em especial nos grupos

12h e 24h, já que houve aumento no parâmetro relacionado à resistência das vias aéreas (RN).

Outra possibilidade para esse aumento é a presença de hemorragia em todos os grupos

testados, sendo de intensidade moderada no grupo de 12h e de intensidade grave no grupo de

24h, em vias aéreas de pequeno calibre, assim como a ocorrência de edema apenas no grupo

de 24h, favorecendo a oclusões dessas vias e a produção de áreas com atelectasia, presente em

todos os grupos experimentais, sendo de intensidade moderada para os grupos de 6h, 12h e

24h e no grupo controle, visto que esse processo é encontrado na prática clínica em animais

submetidos à ventilação mecânica.

Com relação ao parâmetro histeresividade (η), observou-se significância estatística nos

grupos de 6h, 12h e 24h em relação ao grupo controle. Seu valor cresce à medida que o

pulmão se torna mecanicamente heterogêneo, com isso a histeresividade pode ser usada como

um indicativo dessas heterogeneidades ventilatórias. Podemos então supor que o aumento dos

valores de η seja devido à presença de heterogeneidades ventilatórias decorrentes do aumento

da RN. A essas heterogeneidades ventilatórias podemos associar à presença de hemorragia de

intensidade moderada no grupo 12h e grave no grupo 24h, atelectasias de intensidade

moderada nos grupos 6h, 12h e 24h, enfisema de intensidade leve presente em todos os

grupos testados e edema presente no grupo 24h. A presença de secreções nas vias aéreas

periféricas pode afetar a distribuição da ventilação e assim, aumentar a inomogeneidade

mecânica. As mudanças no tônus contrátil da musculatura lisa do parênquima pulmonar não

devem ser descartadas. 31

Os parâmetros da CST e da estimativa da capacidade inspiratória (CI),obtidos através

da realização da curva PV, foram calculados a partir da equação de Salazar e Knowles, esta

equação é utilizada apenas para ajuste na metade superior do ramo expiratório da curva PV.43

A diminuição do parâmetro CSTcom significância estatística nos grupos de 6h, 12h e 24h é

reflexo do aumento da elastância tecidual (H). A diminuição da capacidade inspiratória (CI)

com significância nos grupos 3h, 6h, 12h e 24h, especialmente nesses dois últimos, estão

coerentes com o efetivo enrijecimento do tecido pulmonar indicado pelo aumento de H. Os

58

resultados desses dois parâmetros são justificados pelos mesmos achados histopatológicos

encontrados para se explicar os resultados da elastância tecidual (H).

Broncoconstrictores têm sido amplamente utilizados em pesquisas de animais com

inflamação pulmonar devido à noção de que o problema primário na asma é o encurtamento

excessivo do músculo liso das vias aéreas, quer seja por uma melhor capacidade de resposta

do músculo liso em si 44

ou por um aumento da rigidez e da espessura da parede das vias

aéreas. 45,42

Existem várias maneiras em que o pulmão pode se tornar hiperresponsivo a uma

broncoprovocação, estes incluem mecanismos pelos quais o efeito do encurtamento do

músculo liso das vias aéreas é amplificado através de efeitos geométricos 46

e os mecanismos

que envolvem o aumento do encurtamento muscular.47

Após realização de administração da Metacolina em aerossol, observou-se o aumento

com significância da resistência Newtoniana (RN) para os grupos experimentais 6h, 12h e 24h

sendo visualizado o aparecimento de tecido linfoide associado ao brônquio (BALT)

aumentado nos grupos de 6h e 12h, podendo esta hiperresponsividade estar relacionado às

condições imunológicas desses animais. A broncoconstrição causada pela Metacolina faz com

que pequenas vias aéreas se fechem por completo, 48

estas não podemmais abrir apenas com o

relaxamento da sua musculatura lisa. A capacidade residual funcional (CRF) em ratos

reportado na literatura apresentou um aumento dose dependente com a administração da

Metacolina, indicativo de aprisionamento de ar nos pulmões, sugerindo que as estruturas que

estão se fechando são vias aéreas e não alvéolos.49

Os mecanismos da Hiperresponsividade Brônquica são múltiplos, sendo associados

com inflamação aguda, crônica e com o remodelamento das vias aéreas, especialmente com o

aumento da massa de músculo liso das vias aéreas. 50,36

A maior tendência à contração pode

dever-se também a perda dos fatores que se opõem ao encurtamento do músculo liso,51

por

alterações intrínsecas ao músculo liso e por perda da retração elástica do parênquima

pulmonar.

CONCLUSÃO

O veneno de C. d. cascavella provoca alterações mecânicas e histopatológicas no

tecido pulmonar, porém este estudo não permitiu esclarecer seu mecanismo exato de ação

mecânica ehistopatológica nas vias aéreas não pôde ser esclarecido através deste estudo.

Estudos mais específicos sobre repercussões pulmonares do veneno de C. d.

cascavella se fazem necessários, a fim de se estabelecer se o processo de provocação da

injúria aguda se encontra na paralisia muscular e mionecrose sistêmica, levando a fatores

59

desencadeantes causadores de uma inflamação, ou se há uma ação direta dos fatores tóxicos

do veneno sobre o tecido pulmonar levando a alterações morfoestruturais e de propriedades

mecânicas.

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67

Figura 01: Efeito do veneno total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0

µg/Kg em valores médios de Resistência Newtoniana (A), Resistência Tecidual (B),

Elastância Tecidual (C) e Histeresividade (D). Os valores estão expressos em média ± desvio

padrão.* p < 0,05 versus Controle.

A B

C D

68

Figura 02: Efeito do veneno total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0

µg/Kg em valores médios de Complacência (A) e Capacidade Inspiratória (B). Os valores

estão expressos em média ± desvio padrão.* p < 0,05 versus Controle.

B A

69

Figura 03: Efeito do veneno total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0

µg/Kg após desafio com Metacolina em valores médios de Resistência Newtoniana (RN). Os

valores estão expressos em média ± desvio padrão.* p < 0,05 versus Controle.

70

Figura 04. Fotomicrografias de cortes representativos de tecido pulmonar exposto ao veneno

total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0 µg/Kg (H&E, 100x). Em (A):

Atelectasia (setas) de intensidade moderada, presente nos grupos de 6h,12h e 24h; (B):

Enfisema (setas) de intensidade leve, presente nos grupos de 1h, 3h, 6h, 12h e 24h; (C):

Edema (seta) no grupo de 24h; (D): Infiltrado inflamatório (linfócitos e plasmócitos) (seta)

presente em intensidade moderada nos grupos de 3h e 6h; (E): Presença em intensidade

aumentada de Tecido Linfoide associado aos Brônquios (BALT) (seta) nos grupos de 6h e

12h. Microscópio Nikon trinocular; ®View Software – Versão 7.3.1.7.

A B

C D

E

71

Figura 05: Fotomicrografias de cortes representativos de tecido pulmonar exposto ao veneno

total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0 µg/Kg (H&E, 100x). Presença

de congestão (seta) de mesma intensidade (leve) em todos os grupos. Em (A): Grupo

Controle; (B) Grupo 1h; (C): Grupo 3h; (D): Grupo 6h; (E): Grupo 12h e (F): Grupo 24h.

Microscópio Nikon trinocular ; ®View Software – Versão 7.3.1.7.

A B C

D E F

72

Figura 06: Fotomicrografias de cortes representativos de tecido pulmonar exposto ao veneno

total da C.d.cascavella por via intraperitoneal na dose de 3,0 µg/Kg (H&E, 100x). Em (a):

Hemorragia de intensidade leve (seta), presente no grupo de 6h; (b): hemorragia de

intensidade moderada (seta), presente nos grupos de 1h, 3h e 12h e (c): Hemorragia de

intensidade grave (seta), no grupo de 24h. Microscópio Nikon trinocular; ®View Software –

Versão 7.3.1.7.

a b c

73

7 CONCLUSÕES

Concluímos que o veneno de C. d. cascavella provoca alterações mecânicas e

histopatológicas no tecido pulmonar, porém seu mecanismo exato de ação mecânica

ehistopatológica nas vias aéreas não pôde ser esclarecido através deste estudo.

Estudos mais específicos sobre repercussões pulmonares do veneno de C. d.

cascavella se fazem necessários, a fim de se estabelecer se o processo de provocação da

injúria aguda se encontra na paralisia muscular e mionecrose sistêmica, levando a fatores

desencadeantes causadores de uma inflamação, ou se há uma ação direta dos fatores tóxicos

do veneno sobre o tecido pulmonar levando a alterações morfoestruturais e de propriedades

mecânicas.

74

8 PERSPECTIVAS

Utilizar os conhecimentos acerca das alterações em mecânica pulmonar, assim

como da histopatologia de tecido pulmonar promovidas pela ação farmacológica do veneno

bruto da serpente C. d. cascavella como ponto de partida para posteriores estudos com a

utilização desse veneno, assim como a utilização de substâncias isoladas contidas nele, afim

de investigações acerca de seus mecanismos fisiofarmacológicos.

Estudos posteriores serão essenciais para se determinar os fatores

desencadeadores causadores de processo inflamatório sobre o tecido pulmonar levando a

alterações morfoestruturais e de propriedades mecânicas.

75

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