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UNIVERSIDADE CEUMA – UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA São Luís 2016 Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de Terminalia catappa contra isolados de Candida albicans Enzo Elder Costa Ribeiro
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UNIVERSIDADE CEUMA – UNICEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
São Luís
2016
Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de Terminalia
catappa contra isolados de Candida albicans
Enzo Elder Costa Ribeiro
Enzo Elder Costa Ribeiro
Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de
Terminalia catappa contra isolados de Candida albicans
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da Universidade
CEUMA para obtenção do Título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Área de Concentração: Microbiologia
Orientador: Profa.Dra.Cristina de Andrade Monteiro
São Luís
2016
RibeiroEEC, Enzo Elder Costa Ribeiro Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de Terminalia catappa contra isolados de Candida albicans
SãoLuis,2016.
. Dissertação (Mestrado) – Universidade CEUMA. Orientadora: ProfDra. Cristina de Andrade Monteiro 1.Terminalia catappa. 2. Candida albicans 3. Antifúngico
CDU:
Nome: Enzo Elder Costa Ribeiro
Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de
Terminalia catappa contra isolados de Candida albicans
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária da Universidade CEUMA para obtenção do título de Mestre.
Aprovado em: __________/___________/___________
Banca Examinadora
Prof. Dr. ______________________________________
Instituição: ____________________________________
Assinatura:_____________________________________
Profa. Dr. _____________________________________
Instituição: ____________________________________
Assinatura:_____________________________________
Prof.Dr________________________________________
Instituição: _____________________________________
Assinatura:______________________________________
Ribeiro EEC. Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de
Terminalia catappa contra isolados de Candida albicans, São Luís,
Universidade CEUMA, 2016
RESUMO
O aumento de infecções fúngicas nas últimas décadas é alarmante e Candida
spp tem sido destaque entre outros fungos devido sua frequência e relevância
clínica, e a alta prevalência de candidíase em pacientes com síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS). O objetivo deste estudo foi investigar os
efeitos antifúngicos, antibiofilme e citotóxicos, integridade de membrana e
viabilidade lisossomal do extrato hidroalcóolico das folhas de Terminalia
catappa contra isolados de Candida albicans. Além de verificar as ações
combinatórias do extrato com a droga fluconazol. A concentração inibitória
mínima e concentração fungicida mínima foram determinadas pelo método de
microdiluição enquanto que a concentração inibitória fracionada foi avaliada
pelo método “checkerboard”. O extrato mostrou excelente atividade contra
todos os isolados testados (CIM variando de 0,22 a 0,45 mg/mL e CFM de 3,6
a 58,5mg/mL). A maioria das amostras foi resistente ao antifúngico fluconazol.
O extrato não apresenta citotoxicidade para PBMC as concentrações entre 1 e
0,001 mg/mL. Além disso, o extrato foi capaz de intensificar a atividade do
fluconazol contra os isolados (CIF=0,2), e interferir na capacidade de formação
e redução do biofilme. O extrato mostrou-se capaz de causar dano à
membrana e ao lisossomo fúngico, além de ser rico em diversos metabólitos
secundários. Pôde-se constatar que o extrato possui excelente atividade
antifúngica e sinérgica com a droga fluconazol contra Candida albicans
Palavras-chave: Antifúngico; Sinergismo; Candida albicans; Terminalia
catappa; Biofilme.
Ribeiro EEC. Antifungal activity of the hydroalcoholic extract of Terminalia
leaves catappa against Candida albicans isolates, Sâo Luís, Universidade
CEUMA, 2016
ABSTRACT
The increase in fungal infections in recent decades is alarming and Candida
spp has been featured among other fungi due to their frequency and clinical
relevance, and the high prevalence of candidiasis in patients with acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS). The aim of this study was to investigate
the antifungal effects, antibiofilm and cytotoxic, lysosomal membrane integrity
and viability of the hydroalcoholic extract of Terminalia leaves catappa against
Candida albicans isolates. In addition to checking the combinatorial actions of
the extract with fluconazole drug. The minimum inhibitory concentration and
minimum fungicidal concentration was determined by the microdilution method
while the fractional inhibitory concentration was evaluated using the
"checkerboard". The extract showed excellent activity against all isolates tested
(MIC ranging from 0.22 to 0.45 mg / mL and CFM 3.6 58,5mg / mL). Most
samples were resistant to the antifungal fluconazole. The extract non-cytotoxic
to PBMC concentrations between 1 and 0,001 mg / ml. Moreover, the extract
was capable of enhancing the activity of fluconazole against isolates (CIF =
0.2), and interfere with formation of capacity and reduction of biofilm. The
extract was shown to be capable of causing damage to the membrane and
fungal lysosome, besides being rich in various secondary metabolites. It could
be observed that the extract has excellent antifungal and synergistic activity
with fluconazole against Candida albicans drug
Keywords: Antifungal; Synergism; Candida albicans; Terminalia catappa;
Biofilm.
Key-words:
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Prospecção fitoquímica de classes de metabólitos secundários
presentes no extrato hidroalcoólico de T. catappa .....................................…..41
Tabela 2 - Avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto hidroalcoólico de
T. catappa contra isolados orais e de secreção vaginal de C. albicans por teste
em ágar difusão............................................................................................…..42
Tabela 3 - Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida mínima do
extrato hidroalcoólico bruto das folhas de T.catappa contra amostras clínicas de
C.albicans.....................................................................................................…..44
LISTA DE FIGURA
Figura 1 - Avaliação da atividade antifúngica das amostras de Candida
separados por grupo com extrato hidroalcoólico de T.catappa pelo teste em
ágar difusão..................................................................................................…..43
Figura 2 - Avaliação da CIM e CFM das amostras separados por grupos com
extrato hidroalcoólico de T.catappa...................................................................45
Figura 3 - Teste de combinação entre fluconazol e o extrato hidroalcoólico bruto
das folhas de T. catappa .............................................................................…..46
Figura 4 - Ensaio de morte (Killing assay) ..................................................…..47
Figura 5 Ensaio de citotoxicidade do extrato hidroalcoólico de T.
catappa...........................................................................................................…48
Figura 6 - Avaliação do efeito do extrato hidroalcoólico bruto das folhas de T.
catappa na formação de biofilme de C. albicans.........................................…..49
Figura 7 - Avaliação do efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa no
biofilme pré-formado de C. albicans.............................................................…..50
Figura 8 - Viabilidade da membrana lisossomal da célula fúngica em contato
com o extrato hidroalcoólico de T.catappa...................................................…..51
Figura 9 - Efeito do extrato hidroalcoólico de T.catappa sobre a integridade da
membrana de Candida albicans...................................................................…..52
Figura 10 - Atividade hemolítica do extrato hidroalcoólico de T.
catappa.........................................................................................................…..53
Sumário
1. Introdução ................................................................................................... 13
2. Material e Métodos ..................................................................................... 14
2.1 Material vegetal e preparação do extrato ................................................ 14
2.2. Análise Fitoquímica ................................................................................ 15
2.3. Amostras e condições de crescimento ................................................... 15
2.4. Ensaios Antifúngicos .............................................................................. 16
2.4.1. Determinação da atividade antifúngica usando método de difusão em
agar............................................................................................................ 16
2.4.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM) .................................................... 17
2.4.3. Avaliação in vitro do efeito combinatório do extrato de Terminalia
catappa e Fluconazol (FCZ) ...................................................................... 18
2.5. Efeitos da Terminalia catappa na formação de biofilme de Candida
albicans e biofilme pré-formado .................................................................... 19
2.6. Ensaio de Citotoxicidade (MTT) ............................................................. 20
2.7. Estabilidade da membrana lisossomal ................................................... 21
2.8. Determinação da integridade da membrana .......................................... 22
2.9. Atividade hemolítica ............................................................................... 22
2.10. Análise estatística ................................................................................ 23
3. Resultados .................................................................................................. 23
3.1. Análise fitoquímica ................................................................................. 23
3.2. Teste em agar difusão ........................................................................... 24
3.3. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima
(CFM) ............................................................................................................ 24
3.4. Avaliação in vitro do efeito combinatório do extrato de Terminalia
catappa e Fluconazol (FCZ) .......................................................................... 24
3.5. Ensaio de morte (Killing Assay) ............................................................. 25
3.6. Ensaio de Citotoxicidade (MTT) ............................................................. 25
3.7. Efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa sobre a formação de
biofilme de C. albicans .................................................................................. 25
3.8. Efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa sobre biofilme pré-formado
de C. albicans. .............................................................................................. 26
3.9. Estabilidade da membrana lisossomal ................................................... 26
3.9. Determinação da integridade de membrana .......................................... 27
3.10. Atividade Hemolítica ............................................................................ 27
4. Discussão ................................................................................................... 28
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 34
CAPÍTULO 1
13
Atividade antifúngica, do extrato hidroalcoólico das folhas de Terminalia 1
catappa contra isolados de Candida albicans 2
1. Introdução 3
4
Nas ultimas décadas, o aumento da incidência de infecções fúngicas 5
oportunistas tem sido relacionado ao aumento de pessoas em risco como 6
pacientes em condições imunossupressoras como aqueles com SIDA (Bouza e 7
Munoz, 2008). As infecções de mucosa mais comuns são aftas, candidíase 8
vaginal, candidíase cutânea, onicomicose e candidíase mucocutânea crônica. 9
O principal problema da candidíase é que ela está associada a uma taxa de 10
mortalidade de 10-49 % em pacientes imunocomprometidos (Pfaller, Diekema 11
2007) e que a mesma pode ser encontrada em todo o resto da população 12
imunocompetente (Li et al 2006; Raman et al, 2013). 13
Candida albicans é responsável pela maioria das infecções, mas diversas 14
outras espécies de Candida emergentes também têm sido associadas com a 15
doença (Kim J, Sudbery, 2011). Eles representam um sério risco para a saúde 16
pública, porque são altamente resistentes aos antifúngicos existentes (Gullo et 17
al, 2012). 18
Estas limitações ao tratamento, a existência do mecanismo de resistência já 19
descritos para as drogas (Masia e Gutierrez, 2002; Mukherjee et al, 2013) 20
associada à patogenicidade dos isolados clínicos fundamentam a urgente 21
necessidade de identificação de substâncias mais eficazes e com novos 22
mecanismos de ação no combate às infecções por Candida. 23
14
Neste contexto, o uso popular de plantas medicinais com atividade antifúngica 24
ganha destaque. Terminalia catappa, é uma planta popularmente conhecida no 25
Brasil como “amendoeira”, “amendoeira-da-praia”, “amendoeira-da-Índia”, 26
“cuca”, “guarda-sol”, “castanheira da Índia”, “castanhola” e “chapéu-de-Sol” 27
(Silva et al, 2015). Terminalia catappa pertence à família Combretaceae e tem 28
sido reivindicada por ter efeitos terapêuticos relacionados a doenças hepáticas 29
(Govind, 2011) ela é usada como estimulante cardíaco e suas folhas são 30
amplamente utilizadas como medicina popular no sudeste da Ásia para o 31
tratamento de dermatose e hepatite (Chen et al, 2000). Alguns estudos têm 32
relatado que o extrato das folhas de Terminalia catappa e frutas têm efeito 33
anticancerígeno, antioxidante, anti-inflamatório, efeitos antidiabéticos e 34
atividade hepatoprotetora (Chen e Li, 2006) atividade antimicrobiana e 35
antifúngica (Fyhrquist et al., 2002), mas os componentes eficazes e 36
mecanismos relacionados bem como um atividade antivirulência e sinérgica 37
permanecem desconhecidos. 38
No presente trabalho, a ação antifúngica, antivirulência e sinérgicas com 39
fluconazol do extrato das folhas de amendoeira-da-praia foram investigados 40
contra Candida albicans e isolados clínicos. 41
42
2. Material e Métodos 43 44
2.1 Material vegetal e preparação do extrato 45
46
Folhas de Terminalia catappa foram coletadas em Setembro de 2015 na cidade 47
de São Luís, estado do Maranhão, Brasil; A espécie foi identificada e 48
catalogada no laboratório do Departamento de Biologia – CCBS, Herbário do 49
15
Maranhão – MAR, com o seguinte número de identificação - (8.918) na 50
Universidade Federal do Maranhão - UFMA. 51
As folhas foram secas em estufa de secagem a 40ºC, em seguida trituradas, 52
pesadas e maceradas em frasco âmbar, protegidos da luz, submetidos a 53
frequentes agitações durante 10 dias em etanol 70% (v:v) na proporção de 1:5 54
(p/v). Os filtrados foram reunidos e depois concentrados pelo método de 55
rotaevaporação entre 50 e 60°C, resultando no extrato hidroalcoólico, que foi 56
mantido sob refrigeração a 4°C para usos posteriores. 57
58
2.2. Análise Fitoquímica 59
60
No teste de triagem fitoquímica foram realizados ensaios semi-quantitativos 61
com o extrato hidroalcoólico de Terminalia catappa, utilizando reagentes 62
específicos para a detecção de diferentes classes de metabólitos secundários: 63
antocianinas, antocianidinas, alcalóides, fenóis, esteróides, chalconas e 64
auronas, flavonóides, flavonas e xantonas, flavononas, saponinas, catequinas, 65
leucoantocianidinas, taninos condensados e hidrolisáveis e triterpenóides 66
conforme descreve a metodologia de Matos (2009). 67
68
2.3. Amostras e condições de crescimento 69
70
Extrato hidroalcoólico foi testado contra n=4 (CA45, CA42, CA39, CA34) 71
isolados clínicos provenientes de pacientes com SIDA manifestando candidíase 72
oral (CO) e um n=4 de (MRSM, VLFA, LMS, NMM) isolados provenientes de 73
amostras de secreção vaginal (CV). Todas as amostras clínicas são da espécie 74
16
Candida albicans. Candida albicans ATCC 90028 e SC5314 foram utilizadas 75
como controle. As amostras fúngicas são oriundas do Laboratório de Pesquisa 76
em Micologia Médica (LAPEMM) Universidade Ceuma. As amostras foram 77
reativadas em meio liquido RPMI-1640 Sigma (Sigma–Aldrich, UK) a 37°C por 78
48 horas. Os isolados foram semeados em Sabouraud Dextrose Agar DAS 79
(Sabouraud Dextrose Agar – Difco Laboratories Inc. Detroit, EUA) e incubadas 80
durante 48 horas a 37°C, após isso foram colhidas e suspensas em Tampão de 81
Fosfato Salino (PBS) ph 7,0 e padronizadas a aproximadamente 1x107 82
UFC/mL em uma absorbância de 0,26 a 520 nm. 83
84
2.4. Ensaios Antifúngicos 85
86
2.4.1. Determinação da atividade antifúngica usando método de difusão 87
em agar 88
89
O potencial antifúngico do extrato foi inicialmente avaliado pela técnica de 90
difusão em meio SDA (Sabouraud Dextrose Agar – Difco Laboratories Inc. 91
Detroit, EUA) (Moody et al, 2004). O inóculo padronizado foi espalhado em 92
placas SDA que foram em seguidas perfuradas com cilindros estéreis, 93
formando poços onde foram inoculados 50 µl do extrato a 117 mg/mL. As 94
placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas, após esse período as zonas de 95
inibição foram mensuradas. Como controle foi utilizado fluconazol 128 μg/mL. 96
Os ensaios foram feitos em triplicata. 97
98
17
2.4.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e 99
Concentração Fungicida Mínima (CFM) 100
101
Determinações da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram realizadas 102
através do ensaio de microdiluição em placas pré-esterilizadas de poliestireno 103
com fundo plano de 96 poços, seguindo as recomendações do Clinical and 104
Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). O extrato bruto foi submetido 105
primeiramente a um processo de secagem e em seguida ressuspenso em meio 106
RPMI-1640 Sigma (Sigma–Aldrich, UK) tamponado com ácido 107
morfolinopropanossulfônico (MOPS- Sigma (Sigma–Aldrich, UK) pH 7,0 filtrado 108
em membrana. Em seguida, o extrato foi adicionado aos poços de 109
microtitulação contendo meio RPMI 1640 Sigma (Sigma–Aldrich, UK). Desta 110
forma permitindo duas diluições em série com concentrações finais entre 117 111
mg/mL a 0028 mg/mL. O inóculo padronizado foi adicionado a cada poço 112
atingindo uma concentração final de 1x103 UFC/mL num volume final de 200 113
µL. As placas foram incubadas a 37ºC durante 48 h. Controle do crescimento 114
fúngico foi feito em poços sem o extrato. CIM foi definida como a menor 115
concentração do extrato no qual nenhum crescimento visível pode ser 116
detectado. A fim de determinar a concentração mínima fungicida (CFM), 10 µl 117
de todos os poços que apresentavam resultados iguais ou maiores do que a 118
CIM foram semeadas em placas de SDA (Sabouraud Dextrose Agar – Difco 119
Laboratories Inc. Detroit, EUA). Após 24 h de incubação a 37°C, o CFM foi 120
considerado a concentração mais baixa do extrato que inibiu o crescimento 121
celular visível. Todos os testes foram realizados em triplicata. 122
123
18
2.4.3. Avaliação in vitro do efeito combinatório do extrato de Terminalia 124
catappa e Fluconazol (FCZ) 125
126
Extrato de Terminalia catappa e fluconazol foram avaliados em combinação 127
usando o método do teste “checkerboard”(Santos et al, 2006) contra amostra 128
de Candida albicans ATCC 90028. A faixa de concentração para o fluconazol 129
foi de 1 a 64 µg/mL e para o extrato foi 0,055 a 3,2 mg/mL. A leitura foi 130
realizada para 100% de inibição do crescimento. 131
A interação entre estas substâncias foi quantitativamente avaliada pela 132
determinação da concentração inibitória fracionária (CIF). A fórmula para o 133
cálculo da CIF foi: CIF = [CIM FCZ em combinação / CIM FCZ] + [CIM extrato 134
em combinação /CIM extrato]. A CIF foi calculada para todas as combinações 135
possíveis para o mesmo isolado e o resultado final foi expresso como a média 136
das CIFs. Além disso, a curva de interação foi construída. A interação foi 137
classificada como sinergismo quando a CIF ≤0,5, indiferente se 0,5> CIF ≤ 4,0 138
e antagonismo para CIF>4.0 (Odds, 2003). 139
140
2.4.4. Ensaio de morte (Killing Assay) 141
Para a realização desse teste foram utilizadas colônias de Candida albicans 142
cultivadas em Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar – Difco Laboratories Inc. 143
Detroit, EUA) com 48 horas de crescimento. Os microrganismos foram 144
ressuspensos em tampão de fosfato de potássio 5 mM, pH 7,0, a densidade 145
ótica foi determinada espectrofotometricamente utilizando-se um filtro de 620 146
nm, com valor final de aproximadamente 0,35. Em uma microplaca de 96 poços 147
foi realizado uma diluição seriada do extrato a 117 mg/mL de Terminalia 148
19
catappa, com um volume de 50 µl, em seguida foram adicionados 50 µl da 149
suspenção de Candida albicans previamente preparada. Após 1,5 h de 150
incubação a 37°C, 50 µl de cada poço foi diluído 180 vezes em tampão fosfato 151
e uma alíquota de 25 µl da suspensão diluída foi semeada em placas de cultura 152
contendo meio Sabouraud. Após 48 horas de incubação, a viabilidade celular 153
foi avaliada por contagem de colônias, utilizando comparações com o número 154
de células numa amostra do grupo controle incubadas sem a presença do 155
extrato. (Helmerhorst et al., 2006). 156
157
2.5. Efeitos da Terminalia catappa na formação de biofilme de Candida 158
albicans e biofilme pré-formado 159
160
A formação de biofilme foi preparado como descrito por (Tsang, et al., 2012; 161
Seneviratne et al., 2016;) com algumas modificações. Cultura de 24 horas 162
crescidos em Sabouraud a 37°C foram colhidas e suspensas em meio de 163
levedura à base de nitrogênio (YNB) Sigma (Sigma–Aldrich, UK) suplementado 164
com glicose 100 mM a 37°C “overnight”. Células de levedura em fase 165
exponencial de crescimento foram removidas e lavadas duas vezes em tampão 166
fosfato salino (PBS; pH 7,0). Em seguida as células foram ressuspensas em 167
YNB suplementado com glicose 100 mM com turbidez equivalente 3,0 na 168
escala padrão de McFarland. 100 µl da suspensão de leveduras foi transferida 169
para uma placa de poliestireno de 96 poços e incubadas por 1,5 h a 37ºC. 170
Após a fase de adesão o meio foi aspirado e lavado gentilmente com PBS para 171
remover as células não aderentes. Meio YNB (200 µl) contendo extrato nas 172
20
concentrações do CIM, 1/2CIM, 1/4CIM, foram adicionados em cada poço, e 173
incubados por 24 h a 37°C. 174
Para quantificação das células após a formação do biofilme, o meio foi retirado, 175
e os poços foram gentilmente lavados com solução PBS, com a finalidade de 176
remover as células não aderidas, em seguida com auxilio de uma ponteira 177
estéril o biofilme foi removido, diluído serialmente e semeado em triplicata 178
utilizando a técnica de microgota, a contagem de microrganismos viáveis foi 179
concretizada em placas de Petri contendo meio Sabouraud (Izumida, 2014) 180
com modificações. 181
Para investigação dos efeitos do extrato de Teminalia catappa em biofilme pré-182
formado, biofilme de Candida foi preparado por 24 h a 37°C como descrito 183
anteriormente. Após o período de formação foram adicionados poços contendo 184
biofilme o extrato nas concentrações CIM, 2xCIM, 4xCIM. Após o período de 24 185
h de incubação a 37°C as amostras foram processadas e semeadas pela 186
técnica de microgota com descrito anteriormente. 187
188
2.6. Ensaio de Citotoxicidade (MTT) 189
190
Atividade da desidrogenase mitocondrial foi mensurada usando MTT [3-(4,5-191
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] Sigma (Sigma–Aldrich, 192
UK). Amostras de 5 mL de sangue periférico foram coletadas de 5 (cinco) 193
pessoas e homogeneizados com histopaque Sigma-Aldrich, na proporção de 194
1:1. Após centrifugação, PBMC (Periferal Blood Monocluear Cell) foram 195
coletados a partir do anel leucocitário formado. As células foram lavadas com 196
PBS (Phosphate Buffered Saline) e ressuspensas em Meio de cultura DEMEM 197
21
suplementado com soro fetal bovino 1% (SBF) e antibiótico (Estreptomicina, 198
Penicilina e Anfotericina B) 1%. As células foram adicionadas em microplacas 199
de 96 poços (1,5x106) e tratadas com o extrato nas concentrações de 0,001 a 200
10 mg/mL, PBS foi usado como controle negativo. Após incubação por 24 201
horas CO2 5%, foi adicionado o corante MTT à placa e encubado por 3 h. Em 202
seguida a placa foi centrifugada por 5 minutos a 1200 RPM, e a cultura foi 203
removida e os resultados dos cristais de formazan foram dissolvidos pela 204
adição de 100 µl de DMSO 99,9% com posterior leitura no espectofotômetro a 205
550 nm (Moffa, 2015) com algumas modificações. 206
207
2.7. Estabilidade da membrana lisossomal 208
209
Ensaio utilizando o marcador Laranja de Acridina (LA) foi realizado para 210
mensurar a estabilidade da membrana lisossomal da estirpe ATCC 90028, 211
avaliando alteração na fluorescência vermelha (método de absorção LA). As 212
células foram padronizadas a 1x103 em tubos de ensaio com 1 mL de RPMI 213
1640 tamponado com MOPS (Sigma Aldrich). O extrato foi adicionado nas 214
concentrações referentes à CIM, 2xCIM e 4xCIM. Células submetidas a choque 215
térmico (10 min/100ºC e 10 min/-20°C) foram utilizadas como controle positivo 216
de morte. O precipitado contendo as células foi lavado com PBS (2X). Após 12 217
h de incubação a 37°C as células foram separadas por centrifugação 3500 rpm/ 218
10 min. Em seguida as amostras foram incubadas a 37°C na presença de 1 219
mM de LA (Sigma-Aldrich) por 10 minutos. O precipitado contendo as células 220
foi lavado com PBS (2X). Por fim, as células foram ressuspensas em PBS e 221
analisadas por citometria de fluxo (BD Accuri C6, San Jose, CA; canal FL3) 222
22
utilizando o próprio software do aparelho para a aquisição e análise de dados 223
(Silva et al., 2015). Pelo menos 7.000 eventos foram avaliados por ensaio (n = 224
2). 225
226
2.8. Determinação da integridade da membrana 227
228
A determinação da integridade da membrana plasmática da estirpe ATCC 229
90028 foi avaliada utilizando 2 mg/mL de IP (iodeto de propídio) liga-se no DNA 230
de células mortas. A linhagem foi incubada durante 12 h como descrito 231
anteriormente no ensaio com LA, e analisadas utilizando citometria de fluxo. 232
Fluorescência celular foi determinada por citometria de fluxo (BD Accuri C6, 233
San Jose, CA; canal FL2) utilizando o próprio software do aparelho para a 234
aquisição e análise de dados. Pelo menos 7.000 eventos foram avaliados por 235
ensaio (n = 2) (Silva et al., 2016). 236
237
2.9. Atividade hemolítica 238
239
Atividade hemolítica foi investigada incubando eritrócitos humanos em 240
suspensão a 20% com diferentes concentrações do extrato durante 1 h a 37°C. 241
Resumidamente, uma suspensão de glóbulos vermelhos foi centrifugada (3000 242
rpm durante 10 min), e lavadas 3 vezes com PBS tal como descrito 243
anteriormente (Cavalheiro et al, 2009) com algumas modificações. Foram 244
obtidas as concentrações de 100 mg/mL; 50 mg/mL; 25 mg/mL; 12,5 mg/mL; 245
6,25 mg/mL; 3,13 mg/mL. Após as diluições do extrato, foi adicionado 300 µl da 246
solução de hemácias a 20% em eppendorfs respectivamente. A solução foi 247
deixada em repouso por 1 h na estufa a 37°C. Após a incubação, as amostram 248
23
foram centrifugadas por 5 min/3000 rpm. Em seguida transferido 200 µl para 249
uma placa de 96 poços para realização da leitura em espectrofotômetro a 550 250
nm. A ausência (controle negativo) ou presença de hemólise 100% (controle 251
positivo) foi determinada substituindo as amostras com um volume igual de 252
solução (PBS) e com água destilada, respectivamente. A hemólise foi calculada 253
por densidade ótica em relação ao controle negativo e positivo. 254
255
2.10. Análise estatística 256
257
Os resultados estatísticos foram analisados pelo teste não paramétrico de 258
Friedman, teste t de Student e Análise de Variância, com valor de (p<0,05) foi 259
considerado como significativo. 260
261
3. Resultados 262
263
3.1. Análise fitoquímica 264
265
A Tabela (1) apresenta as principais classes de metabólicos secundários 266
identificadas no extrato de Terminalia catappa, realizado utilizando reações 267
colorimétricas. Os principais metabolitos secundários encontrados foram fenóis 268
e taninos hidrolisáveis como fortemente positivios, flavonóides, flavonas e 269
xantonas como moderadamente posisitivos e saponinas, leucoantocianidina 270
foram detectadas como fracamente positivos. 271
272
24
3.2. Teste em agar difusão 273
274
O extrato bruto das folhas de Terminalia catappa mostrou atividade antifúngica 275
contra todos os isolados de C. albicans testados. Os diâmetros das zonas de 276
inibição variaram de 16,3 ± 0,57 mm a 20,3 ± 0,57 (Tabela 2). A inibição do 277
crescimento apresentou-se homogênea para os dois grupos testados (grupo 278
dos isolados orais-CO, e grupo dos isolados de secreção vaginal-CV) não 279
havendo diferença estatisticamente significante (p<0,05). O efeito antifúngico 280
do fluconazol contra os isolados testados foi significativo em relação ao extrato 281
(p<0,05) (Figura 1). 282
283
3.3. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida 284
Mínima (CFM) 285
286
Os valores de CIM e CFM variaram de 0,22 a 0,45 mg/mL e de 3,6 a 58,5 287
mg/mL, respectivamente (Tabela 3). Não houve diferença significativa para os 288
valores médios de CIM e CFM quando os mesmos foram comparados entre os 289
grupos de isolados avaliados (p<0,05) (Figura 2). 290
291
3.4. Avaliação in vitro do efeito combinatório do extrato de Terminalia 292
catappa e Fluconazol (FCZ) 293
294
A curva de interação entre o fluconazol e o extrato de amendoeira frente a um 295
isolado de Candida albicans 90028 está apresentada na Figura 3. Em relação à 296
média da CIF (CIF: 0,20), a interação entre o extrato e o antifúngico resultou 297
em um efeito sinérgico em todas as concentrações avaliadas. 298
299
25
3.5. Ensaio de morte (Killing Assay) 300
301
O ensaio de morte (Killing Assay) com extrato de T.catappa realizado nos três 302
grupos de Candidas albicans foram analisados em porcentagem de 303
crescimento. O teste apresentou para o grupo (C.O) uma diferença significativa 304
(p<0,05) a partir da concentração 3,65 mg/mL (30%) comparado ao controle de 305
crescimento. No entanto para o grupo de (C.V) as amostras apresentaram 306
redução de crescimento significativa em todas as concentrações avaliadas, 307
partindo de 0,11 mg/mL (34%). Para o grupo padrão houve redução 308
significativa na concentração de 0,45 mg/mL (41%) e ainda a partir de 1,82 309
mg/mL (Figura 4). 310
311
3.6. Ensaio de Citotoxicidade (MTT) 312
313
De modo a avaliar a citotoxicidade do extrato bruto das folhas de Terminalia 314
catappa, foram realizados ensaios de MTT sobre a viabilidade de células 315
PBMC. Os resultados expressos na Figura 5 mostram que as concentrações do 316
extrato entre 1 a 0,001 mg/mL possuem valores de porcentagem de viabilidade 317
celular estatisticamente semelhantes ao grupo controle, podendo-se considera-318
las não citotóxicas para as células humanas. No entanto as concentrações com 319
valores entre 10 e 5 mg/mL reduziram significativamente (p<0,05) os valores 320
em porcentagem de viabilidade celular em relação ao controle. 321
322
3.7. Efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa sobre a formação de 323
biofilme de C. albicans 324
325
26
A avaliação do efeito do extrato hidroalcoólico bruto das folhas de Terminalia 326
catappa na produção de biofilme 24 h pelas amostras testadas nas 327
concentrações de CIM, 1/2CIM e 1/4CIM pode ser observado na Figura (6). A 328
linhagem de referencia Candida albicans 90028 foi quem apresentou maior 329
susceptibilidade ao extrato e uma redução significativa da formação de biofilme 330
(p<0,05) para todas as concentrações testadas. Em relação à amostra SC5314 331
houve redução significativa do biofilme na concentração CIM do extrato. Em 332
contrapartida a amostra oral de Candida albicans apresentou um aumento 333
significativo na produção de biofilme em todas as concentrações avaliadas 334
quando comparada ao controle. 335
336
3.8. Efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa sobre biofilme pré-337
formado de C. albicans. 338
339
A ação antifúngica do extrato de Terminalia catappa também foi avaliada no 340
biofilme pré-formado de 24 h das amostras em estudo Figura (7). A amostra do 341
grupo oral apresentou diminuição significativa (p<0,05) do biofilme nas 342
concentrações 2xCIM e 4xCIM em relação ao controle. Para a amostra padrão 343
Candida albicans 90028, houve redução significativa na concentração 4xCIM. A 344
amostra ATCC SC5314 não apresentou redução significativa para nenhuma 345
das concentrações testadas. 346
347
3.9. Estabilidade da membrana lisossomal 348
349
A fim de avaliar a estabilidade lisossomal da célula fúngica em contato com o 350
extrato de Terminalia catappa em diferentes concentrações, foi utilizado o 351
27
Laranja de Acridina (LA) e sua fluorescência foi analisada por FACS, os 352
resultados foram expressos em porcentagem, como demonstra Figura 8. As 353
células do controle apresentaram uma forte emissão de fluorescência (LA) no 354
canal vermelho, confirmando que essas células tinham lisossomas intactos, 355
enquanto as células tratadas com choque térmico apresentaram uma redução 356
de 75% de fluorescência. O grupo tratado na concentração de CIM apresentou 357
redução de 62% e nas concentrações 2xCIM e 4xCIM apresentaram somente 358
3% na fluorescência, ou seja houve dano de 97% na membrana lisossomal. 359
360
3.9. Determinação da integridade de membrana 361
362
Para avaliar o efeito do extrato de Terminalia catappa sobre a integridade da 363
membrana de Candida albicans ATCC 90028, a amostra foi tratada com 364
diferentes concentrações (CIM, 2xCIM e 4xCIM) por 12 horas e depois foram 365
marcadas com Iodeto de Propídio (IP). As células do grupo controle negativo 366
apresentaram baixa intensidade de fluorescência, indicando apenas 9% de 367
desintegração da membrana. As células submetidas ao choque térmico 368
também demonstraram baixa fluorescência (15% de células marcadas). 369
Posteriormente no grupo tratado com o extrato de Terminalia catappa nas 370
concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM foi observado um aumento de 17, 20 e 371
27% respectivamente indicando que o extrato também promove instabilidade 372
da membrana celular em linhagens resistentes a FCZ (Figure 9). 373
374
3.10. Atividade Hemolítica 375
376
28
Os estudos de atividade hemolítica foram feitos utilizando suspensão de 377
eritrócitos humanos a 20%. O extrato de Terminalia catappa não foi capaz de 378
causar lise às células vermelhas até a concentração máxima testada (100 379
mg/mL) Figura(10) no tempo de 1 h de incubação. O controle negativo com 380
tampão PBS não apresentou hemólise, entretanto o controle positivo de lise 381
com água destilada apresentou hemólise acentuada. Todas as concentrações 382
testadas expressaram diferença significativa em relação ao controle positivo de 383
lise (p<0,05). 384
385
4. Discussão 386
387
O presente estudo descreve a atividade antifúngica e antibiofilme do extrato 388
hidroalcoólico bruto das folhas de Terminalia catappa e ação sinérgica deste 389
extrato com a droga fluconazol contra isolados clínicos de Candida albicans, 390
além da análise citotóxica do extrato. O extrato bruto de Terminalia catappa 391
mostrou excelente atividade antifúngica contra todas as amostras testadas com 392
concentrações inibitórias variando entre 0,22 e 0,45 mg/mL. O mesmo não foi 393
observado para o Fluconazol no teste em agar difusão, droga de escolha para 394
tratamento de candidíase, onde 80% das amostras mostraram resistência ao 395
antifúngico. Estes dados são mais efetivos que os da literatura. Por exemplo, 396
Chanda et al (2011), utilizando o método de difusão em ágar verificaram 397
atividade antifúngica dos extratos metanólico, em acetona e em 398
dimetilformamida contra somente 25% das linhagens fúngicas testadas. 399
Entretanto, Mandloi et al (2013) investigaram, os extratos etanólico e 400
metanólico das folhas de Terminalia catappa e Terminalia arjuna e verificaram 401
29
uma atividade antifúngica contra alguns fungos filamentosos patogênicos, 402
principalmente pelo extrato metanólico de T. catappa, o que se assemelha aos 403
resultados em relação a atividade antifúngica. Estes resultados também são 404
similares, em relação ao tamanho dos halos de inibição, aos de Gandhi, 405
Venkatalakshmi, Brindha (2015) que avaliaram a atividade antifúngica do 406
extrato aquoso, acetato de etila e hexânico da casca de Terminalia catappa 407
contra algumas espécies fúngicas. O método empregado foi o de ágar difusão 408
e o extrato hexânico foi o que exibiu atividade antifúngica mais potente. 409
Os resultados mostraram que o extrato possui ação fungicida a partir da 410
concentração de 3,6 a 58,5 mg/mL. O efeito antifúngico mostrado pelo extrato 411
provavelmente está relacionado a sua composição química. Este estudo 412
mostrou que o extrato hidroalcoólico de T catappa é rico em fenóis, 413
flavonoides, flavonas e taninos hidrolisáveis. Estas são pequenas moléculas 414
produzidas por plantas que são capazes de inibir muitos microorganismos. 415
Estudos tem mostrado produtos naturais isolados de Terminalia catappa como 416
triterpenóides (ácido ursólico, ácido asiático), flavonóides (isovitexina, vitexina, 417
e rutina), ácido gálico, taninos hidrolisados como punicalagina, punicalina, 418
terflavinas A e B, tergallagina, tercataina, ácido chebulagic, geranina e 419
corilagina (Fan et al, 2004). 420
Os taninos punicalagina e punicalina, Ambos os quais contem uma unidade 421
gallagyl são componentes característicos em algumas espécies de Terminalia, 422
Mininel et al. (2014) também verificaram que no extrato hidroalcoólico de T. 423
catappa, taninos foi o componente mais abundante observado, e anomeros 𝛼- 424
e 𝛽-punicalagin foram os maiores compostos. Devido a ação fungistática do 425
fluconazol e que algumas vezes o mesmo não é eficaz contra candidíase, além 426
30
de ser a droga de escolha no tratamento destas infecções este estudo verificou 427
o efeito combinatório entre diferentes concentrações do extrato de T. catappa e 428
fuconazol. Combinações do extrato de T. catappa com fluconazol 429
consideravelmente aumentou a atividade anti-Candida. Até onde se conhece 430
este é o primeiro trabalho a relatar atividades otimizadas combinando-se as 431
concentrações do extrato de T catappa com o fluconazol. Esta ação 432
intensificada é mais provável devido os componentes do extrato agir 433
sinergicamente contra as amostras. Além disso, as ações simultâneas de 434
metabólitos em alvos diferentes poderiam aumentar sua bioatividade e deveria 435
também reduzir o mecanismos de resistência pelo fungo. 436
Estes resultados obtidos com o extrato hidroalcoólico das folhas de T. catappa 437
são promissores. Portanto, o possível mecanismo de ação do extrato contra 438
Candida também foi investigado usando-se técnicas de citometria de fluxo. 439
Quando a linhagem padrão ATCC 90028 foi exposta ao extrato na presença do 440
marcador iodeto de propídio, uma diminuição no número de células viáveis 441
comparado com o controle foi observada nas concentrações usadas no 442
tratamento (CIM, 2xCIM, e 4xCIM). Desta forma, este resultado indica que o 443
extrato promoveu a instabilidade da membrana celular, provavelmente, 444
causando danos na membrana plasmática em C. albicans e o eventual 445
comprometimento da função das células, o extrato de T. catappa pode causar 446
uma perda da integridade da membrana, resultando em aumento da 447
permeabilidade da membrana celular. O aumento da absorção de PI em 448
células de Candida é uma indicação de que os compostos do extrato podem 449
promover a morte celular, considerando-se que este marcador pode ligar-se 450
apenas ao DNA nuclear de células mortas (XU, Chunling et al, 2010). 451
31
A análise da integridade da membrana lisossomal fúngica também confirmou 452
estes dados, pois o extrato induziu uma permeabilização da membrana 453
lisossomal o que pode levar à liberação de enzimas e desregulação da 454
homeostase celular ocasionado a morte do fungo (Klionsky, et al, 1990; 455
Messina,Halaby, 2011). 456
Interessantemente este resultado poderia também explicar a atividade 457
sinérgica observada entre o extrato de T. catappa e o fluconazol discutida 458
acima. Em concentrações menores (0,014 mg/mL), como as que foram usadas 459
no teste de sinergismo, o extrato seria capaz de aumentar a permeabilidade 460
celular facilitanto a atuação do fluconazol na célula fúngica. A desestabilização 461
da membrana celular também explicaria a ação fungicida do extrato. 462
A capacidade de formar biofilmes representa um dos maiores problemas em 463
hospitais devido a resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos (Fanning 464
et al, 2012) fazendo que novas terapias sejam necessárias além das espécies 465
de Candida serem capazes de aderir às células hospedeiras e aos dispositivos 466
hospitalares (Eisenberg, 2010). 467
O extrato apresentou excelente propriedade antibiofilme contra amostras C. 468
albicans. O extrato reduziu significativamente a formação de biofilme da 469
linhagem de referência Candida albicans 90028 em todas as concentrações 470
testadas e a amostra SC5314 na concentração do CIM. O extrato também foi 471
efetivo em quebrar o biofilme formado do isolado Ca45 nas concentrações de 472
2xCIM e 4xCIM (p< 0.05) e da linhagem de referência na concentração de 473
4xCIM (p< 0.05). 474
Estes achados são relevantes porque biofilmes são frequentemente associados 475
com sensibilidade reduzida aos antifúngicos convencionais e com a maioria 476
32
das infecções por Candida. Poucos estudos documentaram a atividade 477
antibiofilme do extrato das folhas T. catappa. Estudos de atividade antibiofilme 478
derivados de plantas da família Combretaceae são escassos. 479
Os testes de citotoxicidade do extrato de T. catappa para células PBMC não 480
mostraram citotoxicidade entre as concentrações de 1 a 0,001 mg/mL. É 481
importante ressaltar que os valores de CIM encontrados foram entre 0,22 e 482
0,45mg/mL e estão na faixa sem citotoxicidade. 483
Em um estudo a toxicidade oral aguda do extrato e frações avaliadas em ratos, 484
os autores estabeleceram uma dose oral limite de 2000 mg/kg em ratos 485
machos e fêmeas. Portanto estes podem ser classificados como de baixa 486
toxicidade aguda categoria de perigo 5 de acordo com o Sistema Globalmente 487
Harmonizado das Nações Unidas de Classificação e Rotulagem de Produtos 488
Químicos (Nunes et al, 2014). 489
O extrato hidroalcoólico de T.catappa não apresentou atividade hemolítica para 490
nenhuma das concentrações examinadas. Um estudo avaliando a inibição da 491
atividade hemolítica induzida por 2,2’-azobis (2-amidinopropano) (AAPH), 492
utilizando a fração hidrofílica do extrato metanólico das folhas de T.catappa, 493
mostrou que o extrato possui propriedades capazes de proteger as hemácias 494
exibindo um forte efeito inibitório dependente da dose contra a hemólise de 495
eritrócitos nas concentrações entre 50 e 500µg/mL (Wen et al, 2011). 496
Com este estudo pôde-se constatar que o extrato hidroalcoólico das folhas de 497
Terminalia catappa (amendoeira), demonstrou atividade antifúngica frente às 498
linhagens de Candidas testadas, tanto em agar difusão, quanto à sua 499
concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM) 500
33
sendo este ultimo em menor intensidade. Apresentou ótima atividade sinérgica 501
em combinação com Fluconazol, o seu potencial citotóxico baixo demonstrado 502
e uma baixa atividade contra biofilme. Podemos então considerar este, um 503
estudo de grande relevância pela eficiência de sua atividade devido o 504
surgimento de microrganismos resistentes. 505
506
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679
680
681
682
683
684
39
Tabela 1│Prospecção fitoquímica de classes de metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico de T. catappa
METABÓLITOS T.catappa
Antocianinas/Antocianidinas - Alcalóides - Fenóis +++ Esteróides - Chalconas e Auronas - Flavonóides, Flavonas e Xantonas ++ Flavononas - Saponinas + Catequinas - Leucoantocianidinas + Taninos condensados - Taninos hidrolisáveis +++ Triterpenóides -
Legenda: (+) fracamente positivo; (++) moderadamente positivo; (+++) fortemente positivo; (-) ausente. 685
686
687
688
689
690
691
692
693
694
695
696
697
698
699
700
40
Tabela 2. Avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto 701 hidroalcoólico de T. catappa contra isolados orais e de secreção vaginal 702 de C. albicans por teste em ágar difusão. 703
Isolados
Diâmetro das zonas de inibição do extrato bruto de
T. catappa (em mm)
T. catappa Fluconazol CN*
CA 34** 16,3 ± 0,57 0 0
CA 39** 16,6 ± 0,57 0 0
CA 45** 18,6 ± 0,57 0 0
CA 42** 18,3 ± 0,57 0 0
MRSM*** 16,6 ± 0,57 11 ± 0 0
VLFA*** 17,6 ± 0,57 0 0
NMM*** 16,0 ± 0 15 ± 0 0
LMS*** 19,6 ± 0,57 0 0
SC5314 17,6 ± 0,57 0 0
ATCC 90028 20,3 ± 0,57 0 0
Extrato na concentração de 117 mg/mL, Fluconazol na concentração de 128 µg/mL. Para o controle negativo foi utilizado água destilada.*CN = Controle Negativo; ** = isolado oral; *** = isolado vaginal 704
705
706
707
708
709
710
711
712
713
714
41
0
5
10
15
20
25
ND
ATCC
ND
CO CV
T.catappa
Fluconazol
** *
*
Halo
de I
nib
ição
(m
m)
715 Figura 1. Avaliação da atividade antifúngica das amostras de Candida 716 separados por grupo com extrato hidroalcoólico de T.catappa pelo teste 717
em ágar difusão. Concentração do extrato (117 mg/mL), Fluconazol na 718 concentração de (128 µg/mL). Controle Negativo com água destilada. ATCC = 719 linhagens padrão; CO = isolados orais; CV= isolados vaginais; *(p<0,05). 720
721
722
723
724
725
726
727
728
729
730
731
732
733
. 734
42
Tabela 3. Concentração inibitória mínima e Concentração fungicida 735 mínima do extrato hidroalcoólico bruto das folhas de T.catappa contra 736 amostras clínicas de C.albicans 737
Linhagem CIM CFM
CA 34* 0,45 58,5
CA 39* 0,45 14,6
CA 45* 0,45 58,5
CA 42* 0,45 58,5
MRSM** 0,22 29,2
VLFA** 0,45 3,6
NMM** 0,22 58,5
LMS** 0,45 58,5
SC5314 0,45 14,6
ATCC 90028 0,45 29,2
Diluições seriadas partindo da concentração de 117mg/mL do extrato; CIM = concentração inibitória mínima. CFM= concentração fungicida mínima. * = isolado oral; ** = isolado vaginal 738
739
740
741
742
743
744
745
746
747
748
749
750
751
752
753
754
43
0.0
0.5
1.0
20
40
60
80
ATCC CO CV
CIM
CFM
T.
cata
pp
a (
mg
/mL
)
755 Figura 2. Avaliação da CIM e CFM das amostras separados por grupos 756 com extrato hidroalcoólico de T.catappa. Concentração inicial do extrato 757
(117 mg/mL), CIM = Concentração Inibitória Minima; CFM = Concentração 758 Fungicida Mínima; ATCC = linhagens padrão; CO = isolados orais; CV= 759 isolados vaginais 760
761
762
763
764
765
766
767
768
769
770
771
772
773
774
775
776
777
778
44
C. albicans 90028
0 400 800 1200 1600 20000
8
16
24
32
40
48
56
64
Extrato T.catappa (µg/mL)
Flu
co
nazo
l (µ
g/m
L)
779 Figura 3. Teste de combinação entre fluconazol e o extrato hidroalcoólico 780 bruto das folhas de T. catappa 781
782
783
784
785
786
787
788
789
790
791
792
793
794
795
796
797
798
799
800
801
802
45
%CO_Killing
C+
0,11
0,22
0,45
0,91
1,82
3,65
7,31
14,6
29,2
558
,511
7
0
20
40
60
80
100
*
% C
rescim
en
to (
CO
)
Terminalia catappa (mg/mL)
%CV_Killing
C+
0,11
0,22
0,45
0,91
1,82
3,65
7,31
14,6
29,2
558
,511
7
0
20
40
60
80
100T. catappa L.
C+
***
Terminalia catappa (mg/mL)%
Cre
scim
en
to (
CV
)
C+
0,11
0,22
0,45
0,91
1,82
3,65
7,31
14,6
29,2
558
,511
7
0
20
40
60
80
100
*
*
%ATCC_Killing
Terminalia catappa (mg/mL)
% C
rescim
en
to (
AT
CC
)
A B
C
803 804
Figura 4. Ensaio de morte (Killing assay). Extrato na concentração inicial de 805 117 mg/mL submetido a diluições seriadas, encubadas durante 1,5h. Controle 806
negativo sem presença do extrato. (A) isolados do grupo oral; (B) isolados do 807 grupo vaginal; (C) grupo linhagem padrão. 808
809
810
811
812
813
814
46
0
50
100
150
200
Controle 10 5 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001
Extrato T.catappa
(mg/mL)
*
*
Controle
T. catappa
Via
bil
idad
e P
BM
C
(%
em
rela
ção
ao
co
ntr
ole
)
815 Figura 5. Ensaio de citotoxicidade do extrato hidroalcoólico de T. catappa. 816 Concentração inicial utilizada de 10 mg/mL, a partir desta foi diluído nas 817 concentrações de 5, 1, 0,5, 01, 0,05, 0,01, 0,005 e 0,001mg/mL. Controle de 818
viabilidade com ausência do extrato; *(p<0,05). 819
820
821
822
823
824
825
826
827
828
829
830
831
832
833
834
835
836
837
47
Formação do Biofilme
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
90028 SC5314 CA45
*
**
C+
CIM1/2CIM1/4CIM
Lo
g (
ufc
/mL
)
838
Figura 6. Avaliação do efeito do extrato hidroalcoólico bruto das folhas de 839 T. catappa na formação de biofilme de C. albicans. A interferência do 840 extrato sobre a formação de biofilme 24 h de isolados de C. albicans foi 841
avaliado nas concentrações CIM, 1/2CIM e 1/4CIM. No teste controle de 842 crescimento não há presença do extrato; (C+) Controle de crescimento; CIM= 843
Concentração Inibitória Mínima; CA45= isolado oral; *(p<0,05). 844 845
846
847
848
849
850
851
852
853
854
855
856
857
858
859
860
861
862
48
Biofilme pré-formado
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
90028 SC5314 CA45
* * * C+
CIM
2xCIM
4xCIM
Lo
g (
ufc
/mL
)
863
Figura 7. Avaliação do efeito do extrato hidroalcoólico de T. catappa no 864 biofilme pré-formado de C. albicans. O extrato nas concentrações CIM, 865 2xCIM e 4xCIM foram avaliados no biofilme pré-formado de 24h. Controle 866
negativo não há presença do extrato. (C+) Controle de crescimento; CIM= 867 Concentração Inibitória Mínima; CA45= isolado oral; *(p<0,05). 868
869
870
871
872
873
874
875
876
877
878
879
880
881
882
883
884
885
886
49
Via
bil
ida
de
Lis
os
so
ma
l
Re
lati
va
(%
)
Co
ntr
ole
Ch
oq
ue T
érm
ico
CIM
2X
CIM
4X
CIM
0
5 0
1 0 0
1 5 0
887
Figura 8. Viabilidade da membrana lisossomal da célula fúngica em 888 contato com o extrato hidroalcoólico de T.catappa. O extrato nas 889
concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM foram avaliados em contato com as 890 células fúngicas por 12h. A fluorescência do laranja de acridina foi analisado 891 por citometria,canal FL3.Controle negativo não há presença do extrato; CIM = 892
Concentração Inibitória Mínima. 893
894
895
896
897
898
899
900
901
902
903
904
905
906
907
908
909
910
911
50
CN
Choque
CIM
2xCIM
4xCIM
0
50
100
Membrana integra
Membrana não integra
T.catapa (mg/mL)
Cé
lula
s (
%)
912
Figura 9. Efeito do extrato hidroalcoólico de T.catappa sobre a integridade 913 da membrana de Candida albicans. O extrato nas concentrações CIM, 2xCIM 914
e 4xCIM foram avaliados em contato com as células fúngicas por 12h. A 915 fluorescência do iodeto de propídio foi analisada por citometria,canal FL2. 916 Controle negativo não há presença do extrato; CIM = Concentração Inibitória 917
Mínima. 918
919
920
921
922
923
924
925
926
927
928
929
930
931
932
933
934
935
936
51
Contr
olePB
S
100m
g
50m
g
25m
g
12,5
mg
6,25
mg
3,13
mg
0
2
4
6
Extrato de T.catappa(mg/mL)
*A
tivid
ad
e h
em
olí
tica
(OD
550n
m)
937
Figura 10. Atividade hemolítica do extrato hidroalcoólico de T. catappa. O 938 extrato nas concentrações de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 3,13mg/mL, foram 939
avaliados em contato com eritrócitos humanos por 1h. Amostras foram lidas por 940 espectrofotometria a 550 nm. Controle positivo foi avaliado na presença de 941 agua destilada. Controle negativo na presença de tampão PBS. 942
943
944
945
946
947
948
949
950
951
952
953
954
955
956
957
