UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS ... Cristina... · AVALIAÇÃO DA AÇÃO...
68
UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA LÚCIA CRISTINA FERREIRA MARQUES AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DA ESPÉCIE PUNICA GRANATUM L. EM MODELO DE PERITONITE ANIMAL. São Luís 2014
Transcript of UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS ... Cristina... · AVALIAÇÃO DA AÇÃO...
UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
LÚCIA CRISTINA FERREIRA MARQUES
AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO
DAS FOLHAS DA ESPÉCIE PUNICA GRANATUM L. EM MODELO DE
PERITONITE ANIMAL.
São Luís
2014
LÚCIA CRISTINA FERREIRA MARQUES
AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO
DAS FOLHAS DA ESPÉCIE PUNICA GRANATUM L. EM MODELO DE
PERITONITE ANIMAL.
Dissertação apresentada à Universidade Ceuma, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientador: Prof. Dr. Lídio Gonçalves Lima Neto
São Luís 2014
Lúcia Cristina Ferreira Marques
AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO
DAS FOLHAS DA ESPÉCIE PUNICA GRANATUM L. EM MODELO DE
PERITONITE ANIMAL.
A Comissão julgadora da Apresentação final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / ,
considerou o(a) candidato(a)
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador____________________________________
4) Presidente (LídioGonçalvesLima Neto)_______________
Aos Meus pais.
Aos meus amados irmãos.
À minha filha de coração.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força espiritual concedida a mim nos momentos difíceis.
Ao meu namorado, Prof. Washington Reis, pelo incentivo diário na
conclusão deste trabalho.
Agradecimento especial ao meu orientador, Prof. Dr. Lídio Lima Neto,
pela real orientação, ao qual superou minhas expectativas.
À minha amiga Adriana Guará, por ter compreendido minhas ausências,
me dado cobertura na realização de tarefas no serviço e pela preocupação
constante pelo meu bem estar.
À minha amiga Mekaele Frota, pela ajuda na revisão ortográfica do
trabalho.
À minha amiga Márcia Machado, por ter sido a primeira a revisar meu
trabalho e, pela sua experiência, sugerir modificações.
À minha amiga Roseane Lustosa, pelo companheirismo durante toda
nossa trajetória do mestrado e pela real amizade.
Ao meu amigo Aruanã, pela participação ativa no trabalho, enquanto
aluno da iniciação científica.
Aos Profs. da Universidade Federal do Maranhão, Profa Dra Selma do
Nascimento Silva, Prof. Dr. Raimundo Antônio Gomes Oliveira, Profa Dra Iracelle
Carvalho Abreu, pela colaboração.
A todos os meus amigos da turma V da Biologia Parasitária, pelos
momentos de convívio.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia
parasitária, pela participação em meu crescimento acadêmico.
Ao CEPEC- Centro de Pesquisa Clínica da Universidade Federal do
Maranhão.
À FAPEMA pelo apoio financeiro.
“Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o que, com frequência, poderíamos ganhar, por simples medo de arriscar.”
(William Shakespeare)
RESUMO
O uso de plantas medicinais pelo homem é registrado ao longo da
história. O homem utiliza estes recursos naturais, em busca de fontes terapêuticas
alternativas para melhoria de sua saúde devido à facilidade na obtenção e do baixo
custo na produção de remédios que são utilizados no tratamento de diversas
doenças, entre elas a inflamação. Uma planta que é utilizada na medicina popular
para o controle do processo inflamatório é a Punica granatum L. popularmente
conhecida como Romã. Diante deste contexto, nosso trabalho teve como objetivo
investigar a ação anti-inflamatória do extrato hidroalcoólico das folhas provenientes
da espécie Punica granatum L. Para isso, quarenta ratos da espécie Rattus
norvergicus foram divididos em seis grupos (VS, ES, DS, VLPS, ELPS e DLPS),
sendo que os grupos VS, ES e DS foram administrados veículo (i.p) e os grupos
VLPS, ELPS e DLPS foram administrados 500µg/kg de LPS (i.p) como forma de
indução da peritonite. Além disso, os animais foram pré-tratados (1 hora antes) com
1ml/Kg de Salina (VS, VLPS), 250mg/kg de Extrato (ES e ELPS) e 10mg/kg de
Diclofenaco (DS e DLPS). Quatro horas após a administração do LPS, o sangue
total foi obtido, assim como o lavado peritoneal para realização da contagem total e
diferencial de leucócitos pela leitura em câmera de Neubauer e esfregaço
sanguíneo, respectivamente. Além disso, também foi avaliada a expressão gênica
do lavado peritoneal pela utilização da PCR em tempo real e a quantificação proteica
do TNF-α por ELISA. Os resultados obtidos neste estudo mostram que o extrato
hidroalcoólico da Punica granatum L. foi capaz de reduzir a migração de neutrófilos
para a cavidade peritoneal, reduzir concentrações plamática e peritoneal de TNF-α
sugerindo que alguma substância presente na Punica granatum L é capaz de
combater o processo inflamatório.
Palavras-chave: Fitoterápicos, Inflamação, Punica granatum L.
ABSTRACT
The use of medicinal plants is recorded by human throughout history. The humans
use these natural resources as alternative therapeutic sources to improve their health
due to the low cost in the production of drugs that are used to treat various diseases,
including inflammation. A plant that is used in folk medicine to control the
inflammatory process is the Punica granatum L. popularly known as Pomegranate. In
this context, our study aimed to investigate the anti-inflammatory action of
hydroalcoholic extract from the leaves of Punica granatum L. For this, forty male
Wistar rats were divided into six groups (VS, ES, DS, VLPS, ELPS and DLPS). The
animals included in the groups VS, ES and DS were administered vehicle (ip) and
the animals from VLPS, ELPS and DLPS groups were given 500μg / kg LPS (ip) in
order to induce peritonitis. Additionally, animals were pretreated (1 hour earlier than
LPS) with 1 ml / kg saline (VS, VLPS), 250 mg / kg of extract (ES and ELPS) and 10
mg / kg diclofenac (DS and DLPS). Four hours after LPS administration, the whole
blood and the peritoneal lavage were obtained to perform total and differential
leukocyte counts by Neubauer chamber, and blood smears, respectively. Moreover,
gene expression by real-time PCR were evaluated, and the protein of TNF-α by
ELISA. The results of this study showed that the hydroalcoholic extract of Punica
granatum L. was able to reduce neutrophil migration into the peritoneal cavity and
decrease the serum and the peritoneal concentrations of TNF-α suggesting that
some substance in the extract of Punica granatum L was able to regulate the
inflammatory process.
Keywords: Phytotherapic, Inflammation, Punica granatum L.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 17
2.1 Fitoterápicos.................................................................................................. 17
2.2 Punica granatum L........................................................................................ 19
2.3 Aspectos gerais da inflamação..................................................................... 22
2.4 Inflamação aguda.......................................................................................... 26
2.5 Efeitos fisiológicos do TNF-α....................................................................... 27
2.6 Modelos de peritonite experimental............................................................. 28
2.7 Anti-inflamatórios.......................................................................................... 29
2.8 Ação e efeitos colaterais dos anti-inflamatórios......................................... 30
3 JUSTIFICATIVA................................................................................................. 34
4 OBJETIVOS........................................................................................................ 35
4.1 Geral................................................................................................................. 35
4.2 Específico....................................................................................................... 35
5 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 36
5.1 O
btenção das folhas da Punica granatum L. ............................................. 36
5.2 Preparação do extrato orgânico................................................................... 36
5.3 Análise fitoquímica do extrato...................................................................... 36
5.3.1 Teste para fenóis e taninos........................................................................... 37
5.3.2 Teste para antocianidinas e flavonoides....................................................... 37
5.3.3 Testes para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas............................. 38
5.3.4 Testes para esteroides e triterpenóides....................................................... 38
5.3.5 Teste para saponina..................................................................................... 39
5.3.6 Teste para cumarina..................................................................................... 39
5.4 Estudo in vivo................................................................................................ 40
5.4.1 Animais......................................................................................................... 40
5.4.2 Modelo experimental de peritonite................................................................ 40
5.4.3 Obtenção do lavado peritoneal e sangue total dos animais.......................... 40
5.4.4 Contagem total e diferencial de leucócitos do sangue.................................. 41
5.4.5 Extração de RNA do sangue lavado peritoneal........................................... 41
5.4.6 Obtenção do cDNA.......................................................................... 41
5.4.7 Análise da expressão de RNAm pela PCR em tempo real............ 42
5.4.8 Quantificação de TNF-α por ELISA............................................................. 42
5.5 Análise estatística......................................................................................... 42
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................... 44
6.1 Análise fitoquímica do extrato hidroalcoolico da Punica granatum L.... 44
6.2 Contagem total de leucócitos no sangue................................................... 44
6.3 Número de neutrófilos no sangue............................................................... 45
6.4 Contagem total de leucócitos no lavado..................................................... 46
6.5 Número de neutrófilos na cavidade peritoneal........................................... 47
6.6 Expressão gênica do lavado........................................................................ 47
6.7 Quantificação do TNF-α plasmático............................................................. 48
6.8 Quantificação do TNF-α peritoneal............................................................. 49
7 DISCUSSÃO...................................................................................................... 51
8 CONCLUSÃO......................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 57
ANEXO..................................................................................................................... 64
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Árvore da espécie Punica granatum L. ................................................. 20
Figura 2- Fruto da espécie Punica granatum L. ................................................... 21
Figura 3- Cascata do processo inflamatório......................................................... 23
Figura 4- Processo de quimiotaxia....................................................................... 27
Figura 5- Esquema da ação dos anti-inflamatórios............................................... 33
Figura 6- Quantidade de leucócitos TOTAIS no sangue periférico...................... 45
Figura 7- Quantidade de neutrófilos no sangue periférico.................................... 45
Figura 8- Quantidade de leucócitos totais no lavado............................................ 46
Figura 9- Quantidade de neutrófilos no lavado..................................................... 47
Figura 10- Expressão gênica do TNF-α no lavado................................................ 48
Figura 11- Quantificação proteica do TNF-α no plasma....................................... 48
Figura 12- Quantificação proteica do TNF-α no lavado........................................ 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Constituintes e meio para identificação de antocianidinas e flavonoides..38
Tabela 2- Constituintes e meio para identificação de leucoantocianidinas, catequinas
e flavonas.................................................................................................................. 38
Tabela 3- Constituintes e meio para identificação de esteroides e triterpenóides... 39
Tabela 4- Metabólitos secundários encontrados na romã........................................ 44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AINEs Anti-inflamatórios não Esteroidais
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CD 14 aglomerado de diferenciação, do inglês Cluster of differentiation 14
COX Cicloxigenase IL-1
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EHPG Extrato Hidroalcoólico
ELISA Ensaio Imunoenzimático
FeCl3 Cloreto Férrico
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HCL Ácido Clorídrico
IgG Imunoglobulina
IK-β Inibidor do fator Nuclear κβ
IL1R Receptor de Interleucina 1
IL-1ra Antagonista de Receptor de Interleucina
IL-1α Interleucina 1 alfa
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IRF 3 Fator Regulatório de Interferon
LPS Lipopolissacarídeo
MF Medicamentos Fitoterápicos
MYD88 Diferenciação Mielóide 88
Na2SO4 Sulfato de Sódio Anidro
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
NF- κβ Fator Nuclear- κβ
PAI-1 Inibidor do Ativador do Plasminogênio
PCR Proteína C-reativa
PGs Prostaglandinas
PTF Produtos Tradicionais Fitoterápicos
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RNA Ácido Ribonucléico
TIRAP Proteína Adaptadora Contendo Domínio do Receptor Interleucina-toll
TLR Receptores do tipo Toll, do inglês Toll-like
TNF-α Fator de Necrose Tumoral
UV Ultravioleta
ANEXO
ANEXO 1
PATENTE
“INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO
HIDROALCOOLICO DA ESPÉCIE PUNICA GRANATUM L.”
Data de depósito: 12/04/2014 Natureza: Invenção
Cód. INPI: BR 1020120057875
6. Inventor (72):
INVENTORES
6.1 NOME: LIDIO GONÇALVES LIMA NETO
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTOR
6.3 CPF: 897068033-00
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RUA ITATIAIA, ED. ABACATE, APT 204, NOVO
TEMPO II - COHAFUMA – SÃO LUIS-MA
6.5 CEP:65075-845 6.6 TELEFONE: (98) 99709936 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: IRACELLE CARVALHO ABREU
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTORA
6.3 CPF: 634.307.203-97
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RUA C, RESIDENCIAL ALTO DO ANGELIM I,
BLOCO 10, APTO 04, ANGELIM, SÃO LUIS – MA
6.5 CEP: 65063-300 6.6 TELEFONE: 98 81318583 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: SELMA DO NASCIMENTO SILVA
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTORA
6.3 CPF: 832.421.393-72
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: R- 01, Q- 01, C- 07; CONJ. PLANALTO ANIL I; ANIL,
SÃO LUIS - MARANHÃO
6.5 CEP: 65053-500 6.6 TELEFONE: 98-32445994 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: ELIZABETH SOARES FERNANDES
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTORA
6.3 CPF: 033401406-93
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RUA PERICUMA, QD 35, LT 05, ED. BALI, APTO
1004, RENASCENÇA II, SÃO LUIS – MARANHÃO.
6.5 CEP: 65075-700 6.6 TELEFONE: (98) 9608 4393 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: RAIMUNDO ANTÔNIO GOMES OLIVEIRA
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTOR
6.3 CPF: 407273433-00
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RUA DAS QUARESMEIRAS NÚMERO 14, QUADRA
8; BAIRRO SÃO FRANCISCO; SÃO LUÍS-MA.
6.5 CEP: 65076-270 6.6 TELEFONE: (98) 32355430 6.7 FAX: (98)
32352219
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: ANDRÉ DUCATI LUCHESSI
6.2 QUALIFICAÇÃO: DOUTOR
6.3 CPF: 304.897.408-39
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RUA BEATRIZ PINHEIRO, 1360 APTO 401 BARRO
VERMELHO, NATAL, RN, BRASIL.
6.5 CEP: 59022-050 6.6 TELEFONE: (84) 30820076 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
6.2 QUALIFICAÇÃO: MESTRANDO
6.3 CPF: 037.357.043-01
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: AV. JERÔNIMO DE ALBUQUERQUE. COND. NOVO
TEMPO II, QUADRA DOS RIOS, BLOCO ANIL, AP. 101
6.5 CEP: 65047-865 6.6 TELEFONE: (98) 9133-1699 6.7 FAX:
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: LUCIA CRISTINA FERREIRA MARQUES
6.2 QUALIFICAÇÃO: MESTRANDA
6.3 CPF: 288.750.793-15
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: Rua 4 de janeiro, S/N, bl- 02, ap-402, Residencial
Quintas do sol, jd eldorado-Turu, SÃO LUÍS-MA.
6.5 CEP: 65073-360 6.6 TELEFONE: (98) 88788367 6.7 FAX
6.8 E-MAIL: [email protected]
6.1 NOME: JOÃO GABRIEL GOMES ARAUJO
6.2 QUALIFICAÇÃO: GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
6.3 CPF: 041059083-59
6.4 ENDEREÇO COMPLETO: RESIDENCIAL ITAPIRACÓ BLOCO 9, APT-201,
TURU, SÃO LUIS - MARANHÃO
6.5 CEP: 65051-165 6.6 TELEFONE: (98) 6.7 FAX
6.8 E-MAIL: [email protected]
14
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais pelo homem é registrado ao longo da
história. Em todas as épocas e culturas, o homem aprendeu a tirar proveito dos
recursos naturais locais, em busca de fontes alternativas nutricionais e terapêuticas
para, assim, aumentar suas chances de sobrevivência pela melhoria de sua saúde.
Cerca de 85% da população mundial já usou alguma planta buscando cura ou
amenização de algum sintoma de dor ou desconforto (BRASIL, 2008; ROSA, et al.
2011).
O uso dessas plantas decorre da facilidade na obtenção e do baixo custo
na produção de remédios e são utilizadas para manutenção da saúde e também na
prevenção e tratamento de diversas doenças. O cultivo de plantas de forma
doméstica é uma prática secular baseada no conhecimento popular, reflexo das
uniões étnicas entre os diferentes imigrantes que difundiram o conhecimento das
ervas locais e de seus usos, transmitidos e aprimorados entre gerações (RÊGO,
2008).
Plantas medicinais são fontes de moléculas bioativas com um mecanismo
de ação farmacológica em que dezenas de classes de substâncias têm sido
apontadas como responsáveis por esses efeitos, sendo os flavonoides e os
compostos fenólicos exemplos importantes (ZUANAZZI & MAYORGA, 2010). Esta
característica tem motivado a indústria farmacêutica a realizar pesquisas, com
objetivo de desenvolver novos medicamentos fitoterápicos visto que,
aproximadamente um terço dos medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo
foram desenvolvidos a partir de produtos naturais (FERREIRA, et al., 2011; MUNOS,
2009).
Estima-se que o mercado mundial de fitoterápicos gire em torno de 22
bilhões de dólares, e vem crescendo principalmente em países desenvolvidos, a
exemplo dos Estados Unidos e dos países Europeus que investem em tecnologia
para assegurar a qualidade dos produtos obtidos das plantas (ZUANAZZI &
MAYORGA, 2010). O Brasil é o país de maior biodiversidade do planeta, que
associada a uma rica diversidade étnica e cultural, que detém um valioso
conhecimento tradicional associado ao uso de plantas medicinais, tem o potencial
necessário para o desenvolvimento de pesquisas com resultados em tecnologias e
terapêuticas adequadas (BRASIL, 2006). Entretanto a diversidade dos biomas ainda
15
é muito pouco explorada como fonte de novas substâncias de interesse
farmacêutico (BARREIRO & BOLZANI, 2009).
O potencial terapêutico de muitas espécies de plantas medicinais
compreende uma extensa variedade de aplicações, que pode relacionar-se com
patologias de fácil manejo, até complicações mais severas (ROSSATO, 2012).
A utilização terapêutica destes remédios naturais no tratamento
convencional de diversas doenças tem como maior problema a falta de dados
científicos que comprovem a eficácia dos mesmos. O efeito farmacológico destas
plantas pode ser justificado pela ampla diversidade de metabólitos secundários
presente nelas, isto pode justificar tanto seu efeito farmacológico quanto alguns
efeitos colaterais relacionados à utilização destas plantas (ROSSATO, 2012).
Portanto, há uma clara e evidente necessidade de estudos científicos que visem à
comprovação do efeito farmacológico destas plantas medicinais, assim como a
identificação de possíveis efeitos adversos.
Na busca para comprovar a atividade antimicrobiana de plantas utilizadas
na medicina popular, Malvezzi, em 2010 realizou pesquisa com extratos brutos
isolados e associados, obtidos das folhas da Eugenia uniflora (pitanga), Psidium
guajava (goiaba) e Punica granatum L. (romã). Todos os extratos usados
isoladamente inibiram o crescimento das bactérias Staphylococcus aureus e
Escherichia coli. A associação entre os extratos das folhas das espécies E. uniflora e
P. guajava e das espécies E. uniflora e P. granatum promoveram uma maior
inibição, mesmo em menores concentrações, sobre o crescimento da bactéria S.
aureus, quando comparada com as inibições promovidas pelos extratos isolados.
Estes resultados podem servir de subsídios para novos estudos a partir destas
fontes naturais. Além da utilização de plantas para o tratamento de infecções,
diversas outras plantas também são utilizadas para o tratamento de doenças
inflamatórias, dentre elas se encontra a planta da espécie Punica granatum,
popularmente conhecida como Romã (LEE, 2010).
A Punica granatum L. pertence à famímilia Punicaceae (Lytheraceae),
tem tendência arbustiva e muito resistente à secas. Suas raízes, frutos, cascas do
tronco, flores e folhas são estudadas como adstringentes, anti-helmíntica, diurética,
antimicrobiana e anti-inflamatória. A infusão das flores e frutos é comum na cultura
popular, no tratamento de amigdalites e dores de garganta, além disso, a infusão da
caca também é utilizada como anti-helmíntico (CUNHA, 2002). Isto se deve a
16
conhecidos e descritos metabólitos secundários como taninos, alcaloides e
flavonoides (OLIVEIRA, 2006).
A identificação de novos medicamentos com propriedades farmacológicas
conhecidas principalmente com ação anti-inflamatória tem sido desenvolvidos por
diversos pesquisadores (LANSKY, 2007; LARROSA et al, 2010; ISMAIL, 2012;
WERKMAN, 2008). Esta busca se justifica pelos diversos efeitos colaterais causados
pelos anti-inflamatórios de referência no mercado, como por exemplo, inibidores
seletivos da COX-2, estes fármacos podem causar problemas, tais como doenças
cardiovasculares e renais e em doses altas são capazes de causar dano
gastrointestinal. Portanto, a utilização de produtos derivados da Punica granatum L.
para o tratamento de doenças inflamatórias somente poderá ser realizada através da
comprovação científica de sua ação anti-inflamatória, portanto o objetivo do nosso
trabalho foi avaliar a ação anti-inflamatória do extrato hidroalcoólico das folhas da
espécie Punica granatum L. em um modelo de peritonite animal.
17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Fitoterápicos
Fitoterapia (do grego therapeia = tratamento e phyton = vegetal) é o
estudo das plantas medicinais e suas aplicações na cura das doenças. A resolução
nº 17/00 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) define fitoterápico
como:
Medicamento farmacêutico obtido através de processos tecnologicamente adequados, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e garantia de sua qualidade. Não se considera fitoterápico, aquele produto que, na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2008).
Segundo Rosa (2011), a fitoterapia surgiu independentemente na maioria
dos povos. Os países com maior tradição no uso desse tipo de terapia são China e
Índia onde se registra seu uso desde 1.500 a.C., comprovando suas raízes
históricas. O crescimento do uso dos fitoterápicos no mundo representa um
importante recurso terapêutico, movimentando um elevado volume de recursos
financeiros (CARVALHO, 2008).
Atualmente, muito tem se pesquisado a respeito da fitoterapia e produtos
fitoterápicos, cerca de 50% dos medicamentos de referência, na clínica médica são
obtidos de produtos naturais ou derivados, como por exemplo, os glicosídeos
cardiotônicos, obtidos da Digitalis e usados no tratamento de insuficiência cardíaca;
emetina, usado como antiemético; vincristina, usado no tratamento do câncer;
colchicina, clássico anti-inflamatório para o tratamento das crises agudas da gota e
de sua prevenção. Estes produtos estudados e confirmados sua atividade
farmacológica fundamenta a utilização e continuidade dos estudos de diversas
espécies (OLIVEIRA, 2006; FOGLIO, et al. 2006).
No Brasil, o uso de plantas como medicamento na cura de doenças e
busca na melhoria nas condições de saúde é antigo e comum (BRASIL, 2008). Isto
se deve a um dos fatores sociais, em que milhares de pessoas, principalmente as
que residem em zona rural, não podem comprar medicamentos de referência em
farmácias, além disso, a maioria não possui acesso aos serviços de saúde, assim,
18
as plantas medicinais se tornam a primeira opção na busca da melhoria nas
condições de saúde.
A flora brasileira é constituída por uma ampla variedade de espécies
utilizadas na medicina popular em que, na sua maioria, ainda não possui uma ação
farmacológica cientificamente comprovada (GOBBO-NETO, et al., 2007). Sendo
assim, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária controla a produção, a liberação
para consumo (registro) e acompanha a comercialização dos medicamentos através
de normas para regulamentação, as quais vêm sofrendo modificações nos últimos
anos, desde a Portaria n. 6 de 1995, que estabeleceu prazos para que as indústrias
farmacêuticas apresentassem dados de eficácia e segurança dos medicamentos
fitoterápicos, passando pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) n. 17 de 2000,
que tratava do registro de medicamentos fitoterápicos Resolução RDC n. 48 de 16
de março de 2004, revogada pela RDC nº 48/2004, que por sua foi revogada pela
RDC nº 14/2010 (COUTO, et al., 2010) e, atualmente, em vigência, a RDC nº
26/2014 que regulamenta o registro de Medicamentos Fitoterápicos (MF) e o registro
e a notificação de Produtos Tradicionais Fitoterápicos (PTF) (BRASIL, 2014).
Para Rosa, et al (2011), o uso popular de plantas tem como finalidade a
obtenção dos mais variados efeitos medicamentosos de poder curativo e preventivo.
A utilização dessas espécies na medicina popular pode ser justificada pela ampla
diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas
presente em estruturas como fruto, mesocarpo, casca e extrato da folha (GOBBO-
NETO, et al., 2007).
As atividades farmacológicas de extratos e outras partes da planta e
seus metabólitos secundários têm sido usados com sucesso em pesquisas que
buscam esclarecer a bioatividade de produtos naturais derivados destas plantas e
seu potencial terapêutico em diversas doenças, incluindo no tratamento do processo
inflamatório (FOGLIO, 2006; ISMAIL, 2012).
Os constituintes químicos encontrados nas plantas são sintetizados e
degradados por inúmeras reações que compõem o metabolismo das plantas. A
síntese de compostos essenciais para a sobrevivência das espécies vegetais, tais
como: açúcares, aminoácidos, ácidos graxos, nucleotídeos e seus polímeros fazem
parte do metabolismo primário das plantas, ou seja, síntese de compostos
essenciais para a sobrevivência das plantas; os compostos sintetizados por outras
vias fazem parte do metabolismo secundário e formam os metabólitos secundários;
19
estes possuem uma larga distribuição e diversas atividades biológicas e pertencem
a diferentes classes: flavonoides, taninos, alcaloides, saponinas, terpenos,
cumarinas, benzenóides, quinóides, xantonas, lactonas e estão distribuídos em
todas as partes da planta (ROGÉRIO et al. , 2010).
Diante da grande quantidade de substâncias já isoladas de plantas
consideradas medicinais, destacam-se as substâncias pertencentes à classe dos
flavonoides, que são substâncias com importantes propriedades farmacológicas
(PANDEY, 2013). Diversos estudos já foram desenvolvidos utilizando compostos
pertencentes à classe dos flavonoides aplicados como antioxidante, antialérgico,
antiviral, anticarcinogênico e anti-inflamatório (BELLA CRUZ, 2010).
Dentre as plantas utilizadas como medicamentos anti-inflamatórios e
conhecida por possuir uma grande variedade de compostos flavonoides está a
espécie Punica granatum L. (REGO, 2008).
2.2 Punica granatum L.
A romãzeira é um arbusto lenhoso e ramificado, pertence à família
Punicaceae originária do nordeste da Índia, mas tem sido cultivada em diversas
regiões de clima tropical e subtropical. É caracterizada por possuírem folhas
pequenas, rígidas, brilhantes e membranáceas com flores vermelho-alaranjadas
localizadas nas extremidades dos ramos e que originam frutos esféricos (LORENZI
& SOUZA, 2001) como se pode observar na figura 1.
A Punica granatum L. é considerada sagrada por algumas religiões no
mundo por apresentar propriedades medicinais. O preparo de medicamentos
medicinais é obtido pela preparação de suas folhas, flores, frutos e casca e
popularmente usado em diversos problemas de saúde, principalmente os do trato
gastrointestinal, processos inflamatório, e antimicrobiano (ROSSATO, 2012).
Esta planta possui folhas simples, elípticas e espessas, de 1 a 10 cm de
comprimento, às vezes dispostas em espiral, em torno de 5 a 6 por ramo. As flores
podem surgir solitárias ou em pequenos grupos, dispostas em raminhos, suas
pétalas são alaranjadas ou vermelhas e de consistência carnosa, com ovário ínfero,
formando frutos do tipo baga, arredondadas, grandes, lisos com cor variando do
marrom à púrpura, contêm grande quantidade de sementes, cada uma encapsulada
em por uma película de polpa vermelha comestível (Figura 2). Na casca e nas
20
sementes contêm compostos como ácido gálico e ácido ursólico, respectivamente,
que também são encontrados nas flores, além de outros compostos distintos
(ROGÉRIO, 2010).
Mais estudos podem ser realizados para elucidar a química destas flores,
que também são comumente utilizadas como, adstringentes, como ação
hemostática e no tratamento de diabetes mellitus; os brotos das folhas, depois de
secos e pulverizados são utilizados no tratamento da bronquite (WERKMAN et al,
2008). Já o suco possui cor brilhante devido à presença de antocianinas e
flavonoides estas substâncias aumentam de intensidade durante o amadurecimento.
Componentes chaves da romã, como catequinas podem reduzir
resistência às drogas por meio da interação com a expressão da p-glicoproteína,
relevante potencial de emprego de suco de romã ou extrato que agem como
adjuntos a agentes citotóxicos tradicionais, e que muitas vezes já estão
comprometidos pelo rápido desenvolvimento de células tumorais resistentes.
(ISMAIL, 2012).
Pesquisa realizada em 2014 por Matthaiou et al. Avaliou, em seres
humanos, os efeitos antioxidante do suco da romã evidenciando que o consumo do
suco aumenta a capacidade antioxidante. Além disso, é descrito juntamente com o
pericarpo, no tratamento e prevenção de câncer, doenças hepáticas e disenteria
(ADAMS, et al, 2006; FARIA, et al, 2007). No pericarpo encontramos flavonoides,
taninos e complexo de polissacarídeo (TOKLU et al, 2007).
Figura 1: Arvore da espécie Punica granatum L Fonte: HTTP://commons.wikimedia,org/wiki/file: Punica_granatum.JPG
21
Parte mais ásperas da casca da árvore também possui efeitos
farmacológicos na história médica, sua química é notável em relação a outras partes
da árvore, principalmente pela extensa presença de alcaloides (MALVEZZI, 2010),
também é rica fonte de fibra dietética e de compostos bioativos, podendo ser
utilizado no desenvolvimento de formulações de alimentos nutricionais e como
antioxidante (MATTHAIOU, 2014).
Cada parte da romãzeira possui componentes químicos com atividade
farmacológica relevante para a prevenção e / ou tratamento do crescimento de
células malignas e ação anti-inflamatória (ADAMS, 2006). Componentes da romã
com controle da inflamação envolve a inibição tanto da enzima cicloxigenase (COX)
quanto da lipoxigenase e uma diminuição da formação da prostaglandina pelas
células (LANSKY, 2007). No tratamento do câncer diminuem a invasão de células
tumorais em tecido normal e metástases. Mecanismos que explicam essas ações
incluem a inibição da atividade de metaloproteinase, e diminuição da atividade de
adesão da quinase. (SARTIPPOUR, 2008).
Os componentes encontrados no extrato da Punica granatum L. sugerem
uma série de aplicações clínicas no tratamento e prevenção de doenças onde a
inflamação apresenta um papel essencial; é rica fonte de polifenóis, punicalagin,
ácido elágico, galotaninos, antocianinas e flavonoides (FISCHER, 2011).
Figura 2. Fruto da espécie Punica granatum L Fonte: HTTP://commons.wikimedia,org/wiki/file: Punica_granatum.JPG
22
2.3 Aspectos gerais da Inflamação
O processo inflamatório, envolvido em diversas patologias é uma série
complexa de alterações vasculares e celulares que se desenvolvem em resposta do
organismo ao dano tecidual e envolve diversos eventos como vasodilatação,
extravasamento de plasma e migração celular (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY,
2004).
A resposta inflamatória é fisiológica e essencial para a sobrevivência,
protege o organismo de estímulos nocivos e envolve uma ação coordenada entre o
sistema imunológico e o tecido no qual ocorreu à lesão (ABBAS, et al., 2008).
Entretanto, apesar de ser um processo fisiológico como forma de proteção ao
organismo, em algumas situações e doenças, essa resposta imunológica pode se
tornar excessiva sem qualquer benefício e com sérios efeitos adversos, como
reação inflamatória sistêmica (SIMMONS; BUCKLEY, 2005).
Dois mecanismos de defesa ocorrem durante o processo inflamatório:
uma resposta imediata e uma resposta adquirida, onde ocorre a produção de
anticorpos específicos (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). A resposta imediata
é responsável pelas características marcantes da área inflamada, a região atingida
torna-se avermelhada, edemaciada, quente e dolorosa, havendo interferência ou
alteração da sua função. Qualquer lesão de tecido como a que ocorre após o
estabelecimento e multiplicação de microrganismos induz a uma resposta
inflamatória, podendo se desenvolver para uma inflamação crônica na qual está
relacionada com diversas doenças, como por exemplo, artrite reumatoide, asma e
aterosclerose (LIBBY, OKAMOTO et al., 2010;).
No início do processo inflamatório, quando ocorre a lesão tecidual
causada por bactéria, traumatismo, substâncias químicas, calor ou qualquer outro
fenômeno, múltiplas substâncias como histamina, bradicinina, serotonina e
prostaglandinas (PGs) são liberadas pelo tecido lesado, iniciando assim, a resposta
inflamatória, (figura 3). A resposta a uma lesão tecidual é deflagrada pela liberação
de citocinas dos macrófagos, ocorre rapidamente e em geral, tem por função deter a
disseminação do patógeno até que seja iniciada uma resposta imune adquirida
(ABBAS, et al., 2008).
Os eventos vasculares que se iniciam na resposta inata se caracterizam
por alteração no calibre e permeabilidade vascular, aumentando o fluxo sanguíneo e
23
conduzindo ao extravasamento de exsudado para o interstício, com consequente
sensação de calor e formação de edema (LUSTER, et al, 2005).
A vasodilatação e o aumento da permeabilidade vascular são provocados
por mediadores, produzidos a partir do plasma e das células. Estes mediadores
amplificam a resposta inflamatória e influenciam sua evolução, já nos eventos
celulares, as células envolvidas estão normalmente presentes nos tecidos, como
células endoteliais e macrófagos ou têm acesso ao local a partir da circulação, como
plaquetas e leucócitos (COOK-MILLS, 2005).
Vários tipos de células são ativadas nos tecidos danificados, promovendo
a liberação de diversos mediadores, incluindo fatores de crescimento, citocinas e
quimiocinas (ROMANO, et al., 2009). No local da inflamação, esses mediadores têm
efeitos vasculares promovendo a vasodilatação, a estase vascular e o aumento da
permeabilidade capilar; garantem também a migração de leucócitos da circulação
para o tecido inflamado e coordenam ainda as variadas respostas de defesa local
(KELLY, et al., 2007).
Mediadores da inflamação como a interleucina-1 (IL-1) e o fator de
necrose tumoral (TNF-ά) são oriundos de monocinas (liberados pela resposta inata
dos macrófagos). Existem outros mediadores liberados pelos macrófagos e
mastócitos ativados como prostaglandinas e leucotrienos. Estes mediadores
produzem alterações nos vasos sanguíneos locais, esta ação compõe dilatação das
arteríolas e capilares, a partir das quais escapa o plasma; ocorre acúmulo de líquido
Figura 3. Cascata do processo inflamatório Fonte: COTRAN, 2000.
24
de edema na área da lesão, e a fibrina forma uma rede obstruindo os canais
linfáticos e limitando, assim, a disseminação dos microrganismos. Outro efeito dos
mediadores é induzir alterações na expressão de várias moléculas de adesão sobre
as células endoteliais e leucócitos (SHERWOOD ; TOLIVER-KINSKY, 2004).
As moléculas de adesão (selectinas e integrinas) permitem a fixação dos
leucócitos às células endoteliais dos vasos sanguíneos promovendo, assim, seu
movimento através da parede do vaso (LUSTER, et al, 2005). Em seguida os
leucócitos polimorfonucleares nos capilares aderem e migram para fora dos
capilares (extravasamento) em direção ao tecido lesionado (ABBAS, et al, 2008).
Essa migração (quimiotaxia) é estimulada por substâncias existentes no exsudato
inflamatório, incluindo alguns polipeptídios (quimiocinas); estas são sintetizadas por
macrófagos e por células endoteliais (KELLY, et al., 2007).
A interleucina 8 (IL-8) é um exemplo de quimiocinas. Estes compostos
atuam principalmente no recrutamento de monócito e neutrófilo do circulante para os
locais de infecção (LUSTER, et al, 2005). Os fagócitos ingerem os microrganismos,
e começa a digestão intracelular, em seguida o PH da área inflamada torna-se mais
ácido, e as proteases celulares induzem a lise dos leucócitos. Grandes macrófagos
mononucleares chegam ao local e ingerem restos leucocitários, bem como
microrganismos, preparando o caminho para a resolução do processo inflamatório
local. (ABBAS, et al., 2008).
Quando a lesão tecidual é causada por uma bactéria é de extrema
importância que haja uma interação entre receptores das células do sistema imune e
componentes pertencentes à bactéria. Dentre os principais receptores envolvidos no
processo inflamatório estão às proteínas Cluster of differentiation 14 (CD14) e os
receptores semelhantes ao Toll (TLR) (ROMANO, et al, 2009). Estas proteínas são
capazes de interagir com componentes celulares de microrganismos apresentando
uma grande importância no reconhecimento de patógenos e no desenvolvimento de
uma resposta inflamatória (ARMANT AND FENTON, 2002).
É através de sua região extracelular que os TLR4 e MD2 reconhecem
seus ligantes diretamente ou através da interação com o CD14 (SCHRODER AND
SCHUMANN, 2005). Os TLR4 e MD2 possuem uma região intracelular no
citoplasma que é homóloga ao receptor de interleucina 1 (IL1R), incluindo um
domínio conservado de aproximadamente 200 aminoácidos, denominado Toll-IL1R.
Além desta estrutura similar, TLR4 e IL1R também possuem uma molécula
25
adaptadora em comum, a diferenciação mielóide 88 (MyD88), que também contém
um domínio Toll-I. Uma vez o TLR4 ativado ocorre ativação de moléculas de
adaptação e, consequentemente, do complexo quinase do inibidor do fator nulear kβ
(IK-β), denominada IKK. A fosforilação mediada por IKK resulta na ubiquitinação e
fosforilação do IK-β e posteriormente, o fator nuclear-κB (NF-κB) deixará de ser
inibido ocorrendo a sua translocação para o núcleo. Este processo permite a
expressão de vários genes pró-inflamatório, como a interleucina-6 (IL-6) e o TNF-α
(TAKEDA AND AKIRA, 2007).
Existe outra via de sinalização do TLR4 que é a via independente do
MyD88. Por esta via ocorre a ativação da Proteína adaptadora contendo domínio do
receptor interleucina-toll (TIRAP), da proteína adaptadora contendo um domínio TIR
e indutora do IFN-β (TRIF) e do fator regulatório de interferon (IRF3), que ativam a
expressão de genes inflamatórios (KAISHO AND AKIRA, 2006).
Ainda, conforme o autor acima, o processo inflamatório é desenvolvido e
mantido graças à liberação de mediadores químicos solúveis (aminas vasoativas,
citocinas, fator de ativação plaquetária, radicais superóxidos e derivados do acido
araquidônico); destacando-se, dentre estes, as citocinas. Neste sentido, para
Lampinen, et al. (2004), as citocinas são classificadas como antinflamatórias ou pro-
inflamatórias e, em alguns casos, com ambas as ações, como acontece com IL-6.
Dentre as importantes citocinas mediadoras na resposta inflamatória
aguda, destacam-se a classe de IL-1, que consiste de três polipeptídios
estruturalmente semelhantes; os dois primeiros polipeptídios são representados pela
interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 1 beta (IL-1β) e a terceiro e representado
pelo antagonista de receptor de interleucina 1 (IL-1ra), além da IL-6 e o fator de
necrose TNF-α (SHERWOOD ; TOLIVER-KINSKY, 2004).
A IL-6 é uma citocina que estimula a resposta de fase aguda do fígado a
infecções e ao dano tecidual, incluindo a estimulação da expressão de proteína C
reativa, do inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1) e do fibrinogênio, está
relacionada também à diferenciação e ativação de macrófagos e linfócitos T e B
(TERRY, LOUKACI et al. 2000). O gene que codifica IL-6 não tem expressão
constitutiva significativa, mas é altamente expressa por várias células como
monócitos/macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, adipócitos e células T
(KAISHO AND AKIRA, 2006.
A principal função da inflamação é a destruição ou inativação do agente
26
causador do dano tecidual e então ocorrerá a limpeza dos debris celulares, pelos
macrófagos, na área para que o reparo tecidual possa ocorrer e, de acordo com sua
duração e formação de células diferenciadas o resultado final do processo
inflamatório pode ser a cura ou a evolução para inflamação crônica (ABBAS, et al.,
2008).
.
2.4 Inflamação aguda
A inflamação aguda é a resposta imediata e precoce a um agente nocivo.
Os principais componentes de defesa, os leucócitos, são normalmente conduzidos
na corrente sanguinea, portanto, os fenômenos vasculares desempenhem um
importante papel na inflamação aguda (AHERNE, COLLINS et al., 2011). Esta
resposta imediata três características principais: alteração do calibre vascular, que
acarreta um aumento do fluxo sanguineo; alterações estruturais da
microvasculatura, que permitem que as proteínas plasmáticas e leucócitos deixem a
circulação; e migração dos leucócitos da microcirculação e seu acúmulo no foco da
lesão (SHERWOOD ; TOLIVER-KINSKY, 2004).
O extravasamento de líquido, proteína e células sanguineas do sistema
vascular para o tecido intersticial ou cavidade corporais é conhecido como
exsudação, que é um líquido extravascular inflamatório que tem uma alta
concentração de proteínas e muitos restos celulares; traduz uma alteração
significativa da permeabilidade normal dos pequenos vasos sanguineos na área da
lesão (LUSTER, et al, 2005).
Este processo envolve a ativação e migração direcionada (quimiotaxia) de
leucócitos (neutrófilos, monócitos e eosinífilos) da corrente sanguinea para o sítio da
lesão. O recrutamento das células inflamatórias se inicia pela ativação das
moléculas de adesão da família das selectinas presentes nas células endoteliais, o
leucócito se liga fracamente ao endotélio e devido ao fluxo sanguineo, é
propulsionado a rolar ao longo da superfície endotelial. Em seguida, ocorre uma
imobilização do leucócito sobre a superfície do endotélio vascular, por meio de forte
adesão através de integrinas (presentes na superfície dos leucócitos) e moléculas
de adesão expressas na célula endotelial; o leucócito então migra pelos espaços
celulares interendoteliais e é guiado ao seu destino final, para desempenhar suas
funções, (figura 4), (COOK-MILLS, 2005).
27
O processo de quimiotaxia dos leucócitos depende da liberação de
fatores quimiotáticos no local da lesão, tais como compostos liberados pelo próprio
agente infeccioso, ou substâncias liberadas inicialmente pelas células residentes,
tais como fragmentos do sistema complemento, quimiocinas ou mediadores lipídicos
como leucotrienos. Posteriormente, as células emigradas podem liberar mais
mediadores, resultando na amplificação da resposta inflamatória (KELLY, et al.,
2007).
2.5 Efeitos fisiológicos do TNF-α
As citocinas constituem um grupo heterogêneo de glicoproteínas,
sintetizadas e secretadas principalmente por macrófagos e linfócitos, em resposta à
ativação ou lesão (BEM-BARUCH, et al, 1995). Estas proteínas modulam as
respostas imunes e inflamatórias locais ou sistêmicas, atuam na estimulação de
células, após interação específica entre ligante e receptor (ALLER,et al, 2007). As
citocinas podem exercer seus efeitos em várias células e induzir ou inibir a produção
de outras citocinas bem como modular a expressão de seus receptores
(BAUHMANN,et al, 1994).
Entre as citocinas que atuam na inflamação aguda, tem papel de
destaque o TNF-α, que são produzidos principalmente por macrófagos ativados,
sendo sua secreção estimulada por endotoxinas e outros produtos microbianos,
Figura 4. Processo de quimiotaxia. Fonte: COTRAN, 2000.
28
imunocomplexos, injúria física e uma variedade de estímulos inflamatórios
(TRACEY, et al, 1993). O TNF-α tem como principal fonte os macrófagos, mastócitos
e linfócitos T e sua principal ação é induzir a ativação e a estimulação celular
modulando mediadores inflamatórios, enzimas, proteínas da fase aguda, e ainda
outras citocinas como interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8) (BEYAERT E FIERS, 1998).
Liberado no tecido, o TNF-α age sobre os neutrófilos aumentando, a
atividade fagocítica, a citotoxicidade e a produção do ânion superóxido e de H2O2,
além de estimular a desgranulação e a aderência dessas células ao endotélio
(BARTON , et al, 1996). Como outros efeitos inflamatórios, o TNF-α ativa a
fosfolipase A2, aumenta a síntese de catecolaminas, induz a febre e a expressão de
antígenos de superfície das células endoteliais (BEYAERT E FIERS, 1998); estimula
a expressão de molécula de adesão endotelial, secreção de outras citocinas e
estimula a coagulação, a quimiotaxia e o metabolismo oxidativo de fagócitos. Além
disso, é responsável pelo aumento das proteínas de fase aguda da inflamação
(MACKAY et al., 1993).
O TNF-α é reconhecida por divervos tipos celulares, como as células
endoteliais, e resulta da ativação da sinalização para expressão de moléculas de
adesão em leucócitos e sequentemente promove a migração subendotelial de
leucócitos (TRACEY, et al, 1993). O excesso do TNF-α tem papel relevante na
patogênese de algumas doenças com artrite reumatóide (BECKHAM, et al, 1992) e
artrite idiopática juvenil (EBERHARD,, et al, 1994). Yudkin, et al, (2003) sugeriram a
hipótese de que a produção de TNF-α pela gordura ao redor da origem arteriolar
inibe o estímulo da insulina para a síntese de óxido nítrico, resultando em
incontestável vasoconstrição, mecanismo este chamado de "sinalização vasócrina".
O TNF-α é uma das principais citocinas liberadas no processo inflamatório agudo
(BARTON , et al, 1996), sendo um dos mediadores inflamatórios altamente
expressos na peritonite.
2.6 Modelos de peritonite experimental
O peritônio é uma membrana fina e transparente que reveste todos os
órgãos intra-abdominais e a face interna das paredes do abdómen. Peritonite é
uma inflamação do peritônio, membrana serosa que reveste parte da cavidade e das
vísceras abdominais. Pode ser localizada ou generalizada, e resulta, mais
29
frequentemente de uma infecção ou, mais raramente, de um processo inflamatório
não infeccioso (ABC.MED.BR, 2014). Quase sempre a peritonite é uma complicação
grave de outra enfermidade abdominal (GREKA, et al, 1994). Entretanto para
realização de pesquisas em animais, onde há necessidade da indução de peritonite,
faz-se necessário o conhecimento de modelos de indução de peritonite (SALGADO,
et al, 2001). Vários modelos são referidos na literatura: Inoculação de material fecal
fresco; implantação de cápsula gelatinosa contendo suspensão bacteriana
(WAITZBERG, et al, 1991), inoculação de suspensão bacteriana em peritônio livre;
inoculação de suspensões bacterianas qualitativa e quantitativas conhecidas; incisão
transversal padronizada no ceco (BACKER, et al, 1983). Porém, para todos estes
modelos são necessários procedimentos com certo grau de biossegurança e
técnicas especializadas o que os tornam métodos mais complicados e perigosos de
serem realizados. Como alternativa, a estes métodos, existem os modelos de
peritonite induzida por substâncias biológicas, por exemplo, carraginina, que são
polissacarídeos obtidos através do extrato de algas marinhas vermelhas e LPS,
lipopolissacarídeo, um dos principais componentes da membrana exterior de
bactérias gram-negativas, utilizado e descrito na literatura em estudos com modelo
de peritonite. Borges, et al, (2014) utilizou LPS em seu modelo de peritonite para
avaliação da ação anti-inflamatória da fração diclorometano do extrato
hidroalcoólico da Polygala sabulosa, da mesma forma Gruen, et al, (2014), avaliou
uso de peso dinâmico para a avaliação da dor abdominal e para isso utilizou um
modelo de peritonite induzido por LPS.
2.7 Anti-inflamatórios
Os fármacos anti-inflamatórios são capazes de interferir no processo
fisiológico de defesa do organismo, minimizando os danos e proporcionando maior
conforto ao paciente. Atualmente, os principais agentes anti-inflamatórios no
mercado estão divididos em dois grupos representados pelos glicocorticoides e
pelos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) (ANDERSON, 2010).
Os glicocorticoides são utilizados na terapia inflamatória e
imunossupressora em variadas patologias, como: doenças auto-imunes,
inflamatórias, asma, distúrbios alérgicos, do colágeno, dermatológicos,
gastrintestinais, hematológicas, oftálmicas, orais, respiratórios (BARNES, 2011).
30
Os glicocorticoides são também utilizados no tratamento do choque, de
doenças neurológicas, da síndrome nefrótica, de alguns tipos de neoplasias, de
tireoidite não supurativa, de tumores císticos de tendão ou aponeurose, redução de
edema cerebral e, profilaxia e tratamento de rejeição de órgão em transplante (ANTI,
et al, 2008). Outra indicação para o uso de glicocorticoides consiste em gestante
com possibilidade de parto prematuro e com maturação inadequada dos pulmões,
com o objetivo de acelerar o processo fisiológico (ANDERSON, 2010).
Como exemplos de glicocorticoides, podemos citar a hidrocortisona e a
dexametasona (BOARDMAN, 2014), entretanto, os efeitos adversos e toxicidade
associada à terapia crônica limita o seu uso, assim, os principais fármacos utilizados
no tratamento dos sintomas da inflamação são os anti-inflamatórios não esteroidais,
mas que, também, com uso a longo prazo produzem seus efeitos adversos. (DE
BOSSCHER et al., 2010).
AINE é grupo de fármacos que se apresenta quimicamente diferente;
diferem em suas atividades antipiréticas, analgésica e anti-inflamatória. São
excelentes medicamentos para tratar os efeitos indesejáveis causados pela resposta
inflamatória, diminuem o edema, a hiperemia, a febre, a dor e a rigidez. São
utilizados em variadas formas de inflamações, sejam traumáticas ou provocadas por
diferentes patologias (PATTANITTUM, 2013).
Os fármacos AINE´s são classificados em grupos, de acordo com a
substância que levou aos respectivos derivados, derivados do ácido salicílico, da
pirazolona; do para-aminofenol; do ácido acético; do ácido enólico; do ácido
fenilantranílico; do ácido propiônico. Tem sido o tratamento de primeira linha,
juntamente com os analgésicos simples, para todos os sítios de tendinite. Estes
medicamentos estão entre os mais prescritos no mundo (BACKER, 2011).
Porém, vale ressaltar que, o uso prolongado de anti-inflamatórios causam
danos, tornando-se necessário o estudo de outras substâncias, que permitam a
inibição ou diminuição dos efeitos da inflamação com menor ou nenhum sintoma
adverso.
2.8 Ação e efeitos colaterais dos anti-inflamatórios
Os anti-inflamatórios não esteroides inibem as enzimas da via ciclo-
oxigenase (COX) para formação das prostaglandinas, que são substâncias químicas
31
que contribui para a inflamação, dor e febre (PATTANITTUM, 2013). Atualmente são
conhecidas três isoformas da enzima ciclo-oxigenase (COX-1, COX-2 e COX-3),
duas delas, COX-1 e COX-2 estão relacionadas com a produção de prostaglandina;
a COX-1 é expressa constitutivamente na maioria dos tecidos, incluindo plaquetas,
protege o revestimento do estômago e ajuda a manter a função renal, está envolvida
na sinalização entre células e na homeostasia tecidual (BOTTING, 2006). A COX-2 é
induzida principalmente nas células inflamatórias, quando estas são ativadas
durante a inflamação e tende a facilitar a resposta inflamatória, entretanto, no
cérebro, rins e alguns outros tecidos, a COX-2 é expressa constitutivamente
(ABBAS, 2008). Por sua vez, a isoforma COX-3 é uma variante do gene da COX-1.
Sabe-se que esta isoforma é mais abundante no coração e no córtex cerebral
(CHANDRASEKHARAN, et al. 2002).
A maioria dos AINE são inibidores não seletivos, que inibem tanto a COX-
1, quanto a COX-2, levando a possibilidade de aparecimentos de úlceras
estomacais, por diminuir os níveis de prostaglandina do estomago, produzidas pela
COX-1(PATTANITTUM, 2013).
Ao reduzir a produção de prostaglandinas, o AINE ajuda a aliviar os
sintomas relacionados à inflamação (JACKSON, 2001) Sua administração sempre
deve ser monitorizada com exames laboratoriais complementares, com especial
atenção à função hepática e renal (SIMMONS, 2005). Eles também são conhecidos
por estarem associados com a morbidade significativa, particularmente em termos
de efeitos adversos gastrointestinais e cardiovasculares (BACKER, 2011). Por outro
lado, a ação anti-inflamatória dos glicocorticoides deve-se, em grande parte, à
inibição da transcrição do gene da enzima ciclo-oxigenase-2 e à indução da proteína
lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2, figura 5. Além disso, reduzem a
produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1(KIM, et al., 2004).
Foram desenvolvidos vários fármacos derivados semissintéticos dos
glicocorticoides e indiretamente bloqueiam a liberação do ácido araquidônico devido
estes fármacos estimularem a produção da lipocortina que tem a ação de inibir a
enzima fosfolipase A2, (figura 5), (DE BOSSCHER, 2010).
Os anti-inflamatórios esteroides agem diminuindo a produção e ação das
citocinas, reduzindo a produção de eicosanoides (prostaglandinas, leucotrienos e
tromboxanos), de imunoglobulina G (IgG) e do complemento no sangue, além de
apresentarem menor produção de histamina (ANTI, 2008).
32
Os corticosteroides estabilizam a membrana celular do mastócito, e, dos
leucócitos evitando ou diminuindo a liberação de histamina assim como de fatores
quimiotáxicos, e, de mediadores inflamatórios, o que reduz o fluxo de leucócitos para
o local da inflamação (BOARDMAN, et al, 2014). Portanto, a inflamação é
acentuadamente reduzida com o uso de glicocorticoides que também tem a ação de
evitar que os neutrófilos migrem até o local da inflamação, embora os
glicocorticoides aumentem o número de neutrófilos circulantes (TASKER, 2011),
entretanto os efeitos adversos dos esteroidais são comuns com terapia a longo
prazo: úlceras pépticas, hipertensão arterial (com a hidrocortisona e a cortisona),
edema, aumento do apetite, euforia, algumas vezes ocorre depressão ou sintomas
psicóticos e labilidade emocional, aumento da gordura abdominal, face de lua cheia
com bochechas vermelhas, adelgaçamento da pele, equimoses com facilidade,
fraqueza muscular e fadiga por perda de massa muscular na região proximal do
tronco e membros, reparação retardada de feridas, tendência à hiperglicemia
supressão da resposta à infecção, supressão da síntese de glicocorticoides
endógenos, síndrome de Cushing iatrogênica, catarata, glaucoma, osteoporose
(DUONG, 2014).
Os glicocorticoides podem provocam a osteoporose porque Inibem o
crescimento e função dos osteoblastos, inibem a duplicação das células ósseas e
síntese do colágeno I e II diminuem a absorção do cálcio intestinal e aumentam a
excreção do cálcio renal (TAVES, 2011).
A ocorrência dos efeitos adversos dos glicocorticoides está associada,
principalmente a sua ação metabólica e à administração prolongada ou em altas
doses. Geralmente a aplicação sistêmica provoca danos mais graves aos pacientes
do que a aplicação tópica, apesar do uso tópico também ser capaz de causar efeitos
adversos sistêmicos (ANTI, 2008).
33
Em 2004, o rofecoxib (Vioxx®) foi retirado do mercado devido ao aumento
de vítimas com problemas cardiovasculares. No Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária aumentou o controle sobre a venda dos AINEs seletivos para
COX-2, publicando a inclusão de seus fármacos na lista de substâncias sob controle
especial (Lista C1 da Portaria 344/98) - Resolução RDC nº. 79, de 04 de novembro
de 2008; os anti-inflamatórios só podem ser vendidos com retenção da receita
médica pelo estabelecimento farmacêutico (BRASIL, 2008).
Desta forma, novos medicamentos provenientes de produtos de plantas
medicinais podem servir de fonte de fármacos de interesse farmacológicos. Um
exemplo é o anti-inflamatório fitoterápico Acheflan®, encontrado nas formas
farmacêuticas de aerossol e creme, indicado no tratamento local de processos
inflamatórios, oriundo do óleo essencial de erva-baleeira (Cordia verbenacea,
Borraginaceae) (ACHÉ, 2014). A Punica granatum L. é outra planta que possui
relatos de sua ação anti-inflamatória na medicina popular. Porém, poucos estudos
relataram experimentalmente a sua ação anti-inflamatória. Em busca de comprovar
a ação anti-inflamatória da Romã, de Oliveira et al., 2013 testaram micropartículas
contendo o extrato hidroalcoólico da Punica granatum L. em um modelo de asma
animal e tiveram como resultado que o tratamento foi capaz de reduzir o
recrutamento leucocitário para a cavidade bronco-alveolar, justificando o uso da
Punica granatum L. como uma das plantas, mais utilizadas no tratamento de
doenças inflamatórias, pelo seu potencial efeito anti-inflamatório.
Figura 5. Esquema da ação dos anti-inflamatórios. Fonte: JACKSON, 2001
34
3 JUSTIFICATIVA
O mecanismo de ação dos anti-inflamatórios disponíveis no mercado está
relacionado à inibição de moléculas essenciais para o estímulo inflamatório e que
possuem certos efeitos fisiológicos, além de possivelmente atuar em outras
substâncias importantes para o funcionamento de determinados órgãos. Por isso,
diversos efeitos colaterais são atribuídos a eles, como por exemplo, infulficiência
renal, problemas cardiovasculares e gastro-intestinais (ANTI, et al, 2008), tornando
emergencial o estudo de novas substâncias com propriedades anti-inflamatórias.
Diante deste cenário, estudos com o objetivo de se estudar substâncias presentes
em preparações farmacêuticas a partir de plantas medicinais com potencial ação
anti-inflamatória são realizadas por diversos pesquisadores. Dentre essas plantas, a
Punica granatum L. é uma das mais utilizadas, popularmente, no tratamento de
diversas doenças, inclusive no controle da inflamação (ROSSATO, 2012).
35
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
Avaliar a ação anti-inflamatória do extrato hidroalcoólico das folhas da
espécie Punica granatum L. em um modelo de peritonite animal.
4.2 Específicos
Identificar os metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico
das folhas da espécie Punica granatum L.
Observar o efeito do extrato obtido de folhas da Romã na quimiotaxia de
leucócitos.
Avaliar o efeito do extrato da espécie Punica granatum L. sobre a
expressão gênica e proteica do TNF-α em ratos induzidos à peritonite
36
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Obtenção das folhas da Punica granatum L.
As folhas dessa espécie foram coletadas no Herbário Ático Seabra
localizado na Universidade Federal do Maranhão, em São Luís (Brasil) e identificada
pela Profa. Dra. Terezinha Rêgo, com exsicata do herbário Ático Seabra da
Universidade federal do Maranhão. A coleta foi realizada de acordo com as normas
estabelecidas na literatura e em quantidade adequada para a obtenção do extrato
em quantidade necessária para a realização das análises (MATOS, 2009).
5.2 Preparação do extrato orgânico
O extrato foi obtido a partir de folhas da Punica granatum L. previamente
desidratadas com o auxílio de uma estufa apresentando uma contínua circulação de
ar, e para obtenção do extrato hidroalcoólico realizou-se o processo físico de
maceração de 20 gramas das folhas da planta triturada em um recipiente fechado
contendo 200 ml de solução hidroalcoólica a 70%, à temperatura ambiente. O
material foi mantido em repouso sob periódica agitação manual, após oito dias a
solução foi filtrada, armazenada em um frasco do tipo âmbar e o extrato final foi
obtido após a evaporação do solvente com o auxílio de um evaporador rotativo e
armazenado 4ᵒC até o momento de ser utilizado (MATOS, 2009) O rendimento foi
determinado após a desidratação de 1mL do extrato com posterior pesagem
utilizando uma balança semi-analítica (Fluxo Tecnologia LTDA.).
5.3 Análise fitoquímica do extrato
Testes colorimétricos, de acordo com Matos, 2009 foram realizados para
a determinação da presença dos compostos secundários presentes no extrato
hidroalcoólico. Foi avaliado a presença dos seguintes metabólitos secundários:
fenóis, taninos hidrolisáveis e catéquicos, cumarinas, flavonoides, alcaloides,
triterpenos, esteroides e saponinas. Para isso, inicialmente, separou-se sete porções
de 4ml em tubos de ensaio e duas porções de 10 ml em béqueres rotulados; estes
foram deixados em banho-maria até secarem e mantidos em dessecador até a
37
ocasião para serem usados. O restante do extrato foi colocado em banho-maria até
obtenção da metade do volume, com acidificação do meio até um pH=4 e filtrou-se
o líquido acidulado. Reservou-se tanto a solução, como o resíduo insolúvel para
testes posteriores.
5.3.1 Teste para fenóis e taninos
Para determinação semiquantitativa de fenóis e taninos foram
adicionados três gotas de solução alcoólica de cloreto férrico (FeCl3) (INLAB, São
Paulo, Brasil). Após agitado foi observado se houve alguma variação de sua cor ou
formação de precipitado abundante e escuro. Comparou-se com um teste branco,
onde são usados apenas água e FeCl3. Coloração variável entre azul e o vermelho
é indicativo da presença de fenóis e a presença de um precipitado escuro de
tonalidade azul indica a presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolisáveis), e
verde a presença de taninos flobabênicos (taninos condensados ou catéquicos).
5.3.2 Teste para antocianidinas e flavonoides
Foram utilizados 3 tubos, sendo que, um destes foi acidificado utilizando
ácido clorídrico (HCl) 0,1M (ISOFAR, Duque de Caxias, Brasil) até alcançar o pH=3
e os dois tubos seguintes foram alcalinizados com hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M
(QUIMBRÁS, Simoes Filho,Brasil) até atingirem um pH de 8,5 e 11,
respectivamente.
O aparecimento de cores diversas indica a presença dos metabólitos
secundários, de acordo com a tabela seguinte:
38
Tabela 1. Constituintes e meio para identificação de antocianidinas e flavonoides
Contituintes Cor em meio
Ácido (pH=3) Alcalino
(pH=8,5)
Alcalino
(pH=11)
Antocianinas e antocianidinas vermelha Lilás Azul-púrpura
Flavona, flavonóis e xantonas ----------- ----------- Amarela
Chalconas e auronas vermelha ----------- Vermelho-
púrpura
Flavanonóis ----------- ----------- Vermelho-
laranja
Fonte: MATOS, 2009
5.3.3 Testes para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas
Foram utilizados os tubos do teste para antocianidinas e flavonoides, já
devidamente acidificados e alcalinizados com os pH de 3 e 11, respectivamente.
Aqueceu-se os mesmos com o auxílio de um bico de Bunsen, durante dois minutos.
A modificação de cor foi avaliada e o aparecimento ou a intensificação da cor pré-
existente indica a presença dos constituintes especificados na tabela seguinte:
Tabela 2. Constituintes e meio para identificação de leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.
Constituinte Cor em meio
Ácido Alcalino
Leucoantocianidinas Vermelha ----------
Catequinas Pardo-amarelada ----------
Flavanonas ----------- Vermelha-laranja
Fonte: MATOS, 2009
5.3.4 Testes para esteroides e triterpenóides
Foi colocado 2 ml de clorofórmio no resíduo seco presente em um dos
béqueres. Posteriormente a solução clorofórmica foi filtrada utilizando um funil
fechado com algodão, coberta com alguns decigramas de sulfato de sódio anidro
39
(Na2SO4) para um tubo de ensaio bem seco. Após adicionar 1 ml de anidrido
acético, e três gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Foi observado a
formação das seguintes cores, descritas na tabela 3.
Tabela 3. Constituintes e meio para identificação de esteroides e triterpenóides
Constituinte
Cor
Esteróides livres Azul evanescente→Verde permanente
Triterpenóides
pentacíclicos livres
Parda→Vermelha
Fonte: MATOS, 2009
5.3.5 Teste para saponina
Após realização do teste para esteroides e triterpenóides o resíduo
insolúvel em clorofórmio, foi redissolvido em 10 ml de água destilada e, em seguida
filtrou-se a solução. A solução foi fortemente agitada, durante três minutos, e
observou-se a formação de espuma persistente e abundante, indicativa de presença
de saponina (heterósides saponínicos).
5.3.6 Teste para cumarina
Com o auxilio de um capilar, foram colocados dois pontos do extrato
hidroalcoólico de aproximadamente 1,5 cm de diâmetro em um pedaço de papel
filtro não fluorescente e colocado para secar. Posteriormente secas foi aplicado
sobre um dos pontos do extrato uma gota da solução aquosa de KOHN. Os pontos
foram cobertos parcialmente com cartão opaco não fluorescente e levados ao
espectro da luz ultravioleta (UV) por 3 minutos. Ainda sob a luz UV foi retirado o
papel opaco e observado a emissão de fluorescência da mancha alcalinizada.
Desenvolvimento de fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não coberta
da mancha alcalinizada indica a presença de cumarina.
40
5.4 Estudos in vivo
5.4.1 Animais
Foram utilizados ratos da espécie Rattus novergicus, linhagem Wistar,
machos, com peso variando entre 200 e 280g, todos provenientes do biotério da
UNICEUMA, com livre acesso a água e alimento ad libium. A verificação do peso
dos animais foi realizada diariamente para que não ultrapassassem o limite de 280g.
5.4.2 Modelo experimental de peritonite
Quarenta e dois animais foram utilizados no projeto, sendo que estes
animais foram divididos em seis grupos (veículo+salina, VS, n=5), (extrato+salina,
ES, n=5), (diclofenaco+salina, DS, n=5), (veículo+LPS, VLPS, n=9), (extrato+LPS,
ELPS n=9) e (diclofenaco+LPS, DLPS, n=9). Foi administrado, por via oral (v.o),
uma solução salina de 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) como veículo (1ml/Kg) nos
grupos VS e VLPS, uma solução de extrato hidrolcoólico (250mg/kg) nos grupos ES
e ELPS e uma solução de diclofenaco sódico (10mg/kg) nos grupos DS e DLPS.
Após uma hora, a peritonite foi induzida nos animais pertencentes aos grupos VLPS,
ELPS e DLPS, através da administração intraperitoneal (i.p) de (500µg/kg), de
lipopolissacarídeo obtido de Escherichia coli (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e
como controle foi administrado, i.p, uma solução salina (NaCl a 0,9%, 1ml/kg) nos
animais pertencentes aos grupo VS, ES e DS.
5.4.3 Obtenção do lavado peritoneal e sangue total dos animais
Após 4 horas da indução da peritonite nos animais, o lavado peritoneal e
sangue total foram obtidos da seguinte forma: Após anestesia geral dos animais com
uma mistura de ketamina (80mg/Kg) e xilazina (10mg/kg), aplicou-se 20 ml de
solução fisiológica 0,9% estéril, i.p. Após isso, foi realizada a coleta do lavado
peritoneal por aspiração com o auxílio de uma pipeta de Pasteur. Além do lavado, o
sangue total foi coletado, por punção da artéria abdominal. O lavado e o sangue
foram então utilizados para determinação do número de leucócitos totais e
41
diferenciais, para a análise da expressão gênica de TNF, assim como para
determinação de TNF por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
5.4.4 Contagem total e diferencial de leucócitos do sangue e lavado
A contagem total de leucócitos presentes no sangue foi feita no mesmo
dia da coleta da seguinte forma: Em microtubos individualizados foram pipetados
20µl da amostra e adicionado 400µl da solução de Turk; após homogeneização foi
realizada a contagem em câmara de Neubauer. A contagem total do lavado foi
realizada em câmera de Fuchs Rosenthall. A contagem diferencial de leucócitos
presentes no sangue e no lavado foi realizado em lâmina de esfregaço sanguíneo e
lavado. A contagem total e diferencial foi realizada com o auxílio de um microscópio
ótico (ZEISS) através da contagem de 200 células.
5.4.5 Extração de RNA do sangue e lavado peritoneal
Imediatamente após a coleta do sangue e lavado, o RNA total foi
purificado das células através da utilização de um conjunto de reagentes da QIAamp
RNA blood Mini Kit e RNAeasy mini kit, respectivamente (QIAGEN, GmbH,
Alemanha) de acordo com o manual de instrução do fabricante. Posteriormente a
extração, a concentração de RNA total foi obtida por espectrofotometria no
ultravioleta (UV) utilizando-se o aparelho Genequant (Amershan Bioscience) e o
grau de pureza do RNA determinado pela relação A260/A280 (SAMBROOK;
RUSSEL, 2001).
5.4.6 Obtenção do cDNA
A síntese de cDNA a partir de RNA total foi realizada utilizando o kit de
reagentes SuperScript™ II reverse transcriptase (Invitrogen, Gathersburg, EUA) de
acordo com o manual de instrução do fabricante. Resumidamente, A síntese de
cDNA foi realizada utilizando 200 ng de RNA total, iniciadores aleatorios 200
nM (random primers) (Invitrogen, MD, EUA), dNTP 200nM (Amershan-
Pharmacia Biotech do Brasil, Brasil), DTT 20mM, transcriptase reversa 200 U
(SuperscriptTM II RT RNase H) e tampão (Tris-HCL 250mM pH 8,3, KCl
42
375mM, MgCl2 15mM) (Invitrogen, MD, EUA). A mistura foi incubada a 25 ºC
por 10 min, seguida de 50 ºC por 50 min e 70 ºC por 15 min e o cDNA obtido
foi conservado a -20 ºC até a realização da PCR.
5.4.7 Análise da expressão de RNAm pela PCR em tempo real
A quantificação relativa da expressão de TNF-α foi realizada pela
PCR em tempo real (qPCR) utilizando o sistema de sondas de detecção
TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O cDNA foi amplificado
pela qPCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores a 900nM e sondas
marcadas com FAM 250nM (Life Technologies, Foster City, CA, EUA). Os
demais reagente da qPCR foram adquiridos em solução Master Mix [MgCl2
25nM, dNTPs 10mM, Uracil N-glicosilase (UNG, AmpEraseR) 30U, enzima
Amplitaq Gold 150U e tampão de reação] (life Technologies, Foster city, CA,
EUA). Foi utilizado volume final de 25µL por reação e os ensaios foram
realizados em duplicata
Foram escolhidas duas amostras por grupo para determinação do
melhor controle endógeno. De acordp com os valores de ciclo thershold (Ct)
obtidos e testados com o auxílio da ferramenta Genenorm
(http://medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/). Foi escolhido dentre os genes
Ubiquitina (UBQ) e Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), a UBQ
por apresentar menor variação de Ct e, consequentemente, maior estabilidade.
5.4.8 Quantificação de TNF-α por ELISA
As amostras de soro (diluição 1:2) e do sobrenadante do lavado
peritoneal foram utilizadas para determinação da concentração de TNF-α de acordo
com o manual de instrução do (DuoSet® ELISA Development Systems).
5.5 Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados utilizando os programas
SigmaStat v.2.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA) e SPSS 15 (SPSS Inc., Chicago, EUA) e
43
apresentados na forma gráfica por utilização do Software Prism (Sigma Chemical,
Co., St. Louis, MO, EUA).
Para determinação do tipo de simetria das variáveis quantitativas
contínuas será realizado o teste de simetria de Kolmogorov-Smirnov. Para as
variáveis com distribuição assimétrica serão utilizados testes paramétricos, o teste
de one-way ANOVA seguindo do pós teste de Newman-Keuls para comparar mais
de duas populações quanto à tendência central dos dados. Variáveis categóricas
serão calculadas as frequências absolutas e relativas e serão comparadas por 2
(Qui-Quadrado) ou Teste Exato de Fisher. O nível de significância estabelecido foi
de p < 0,05.
44
6 RESULTADOS
6.1 Análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico da Punica granatum L.
Após testes colorimétricos específicos para avaliação dos constituintes
químicos presentes nas folhas da Romã, pode-se observar a presença de taninos,
flavonoides, triterpenos, saponinas, aos quais se apresentaram moderadamente
positivo (++). Além destes, também foram encontrados compostos relacionados às
classes das cumarinas, que se apresentaram com resultado considerado positivo (+)
(tabela 4).
Tabela 4. Metabólitos secundários encontrados na romã. Critérios adotados: +++ fortemente positivo; ++ moderadamente positivo; + positivo.
Metabólitos secundários Resultados
Tanino hidrolisáveis ++
Flavonóides(Flavonóis) ++
Triterpenos ++
Saponinas ++
Cumarinas +
Fonte: criado pela autora.
6.2 Contagem total de leucócitos no sangue
De acordo com o resultado da contagem total de leucócitos no sangue
periférico observou-se, conforme figura 6, que a média do número de leucócitos do
grupo controle positivo VLPS, (9.825 ± 2.519,7) foi significativamente maior do que a
média observada no grupo controle negativo VS, (4.550 ± 2.540,9). Os grupos ES
(7.660 ± 997,9) e DS (4.233,3 ± 2.444,0), quando comparados com o grupo controle
negativo (VS), não foram observadas diferenças estatisticamente significante na
quantidade de leucócitos, figura 6. Continuando a análise, observou-se, que os
grupos ELPS (6.557 ± 2.462,2) e DLPS (5.525 ± 2.299,8) não apresentaram redução
estatisticamente significante quando comparados ao grupo controle positivo (VLPS).
Critérios adotados
+++ Fortemente positivo
++ Moderadamente positivo
+ positivo
45
6.3 Número de neutrófilos no sangue
Na análise da quantidade de neutrófilos nos grupos estudados observou-
se, conforme figura 7, que o grupo positivo (VLPS) (6.566,3 ± 5.965,0) possui uma
quantidade maior, e estatisticamente significante, de neutrófilos quando comparado
com o grupo controle negativo (VS) (1.066,5 ± 689,4). Os grupos ES (1.932 ± 653,4)
Figura 6. Quantidade de leucócitos totais no sangue periférico. Os grupos foram identificados como: veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo.
Figura 7. Quantidade de neutrófilos no sangue periférico. Os grupos foram identificados como veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo.
**
*
Salina
LPS
Salina
LPS
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
4
8
12Veículo
Extrato
Diclofenaco
Le
uc
óc
ito
s t
ota
is (
10
³/m
m³) *
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
4
8
12Veículo
Extrato
Diclofenaco
Ne
utr
ófi
los
(1
0³/
mm
³)
46
e DS (1.539,0 ± 607,6) não tiveram aumento de neutrófilos quando comparados ao
grupo controle negativo (VS). Em contrapartida, o grupo ELPS (4,930 ± 1.703,4),
possui uma quantidade de neutrófilo estatisticamente significante comparado com o
grupo controle negativo (VS). Já o grupo DLPS (3.880,0 ± 1.508,1) não apresentou
uma quantidade de neutrófilos significante quando comparado com o grupo controle
positivo (VLPS).
6.4 Contagem total de leucócitos no lavado
Como se pode observar na figura 8, a contagem total de células no lavado
do grupo controle positivo (VLPS) (2.120,0 ± 1557,3), apesar de não ter apresentado
um número maior de leucócitos estatisticamente significante, dobrou este número
quando comparado com o grupo controle negativo (VS) (1.267,0 ± 377,1). Nos
grupos ES (1.617 ± 970,4) e DS (1.375,0 ± 170,8), observou-se que estavam com
quantidade de leucócitos similares ao grupo controle negativo VS. Os grupos ELPS
(1.143,0 ± 970,4) e DLPS (1600,0 ± 170,8) quando comparados ao grupo controle
positivo Veic+LPS observou-se que houve diminuição no recrutamento de leucócitos
para a cavidade peritoneal, apesar de não significante estatisticamente.
Figura 8. Quantidade de leucócitos totais no lavado. Os grupos foram identificados como: veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9.
Salina
LPS
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
1
2
3Veículo
Extrato
Diclofenaco
Le
uc
óc
ito
s t
ota
is (
10
³/m
m³)
47
6.5 Número de neutrófilos na cavidade peritoneal
Na figura 9, se pode observar, a quantidade de neutrófilos do grupo
controle positivo (VLPS) (1.530,0 ± 1.219,9) foi maior que o grupo controle negativo
VS (11,7 ± 14,5), e essa diferença foi estatisticamente significante (p< 0,05). Os
grupos ES (98,0 ± 173,7) e DS (41,0 ± 29,1), não apresentaram diferença estatística
em comparação ao grupo controle negativo (VS). Por outro lado, os resultados
apresentados nos grupos ELPS (224,0 ± 178,6) e DLPS (163,5 ± 113,8), em relação
ao grupo controle positivo (VLPS) apresentaram uma redução significante na
quantidade de neutrófilos.
6.6 Expressão gênica do lavado
Na análise da expressão gênica do TNF-α no lavado observou-se um
aumento significante na expressão gênica do grupo controle positivo (VLPS)
(0,11083 ± 0,0881), quando comparado com o grupo controle negativo (VS)
(0,00845 ± 0,1073). Quando observados os grupos, ES (0,00531 ± 0,00749) e DS
(0,00804 ± 0,01374) percebe-se que estes apresentaram uma expressão gênica do
TNF-α igual ao grupo controle negativo (VS). Na análise dos grupos ELPS (0,07385
Figura 9. Quantidade de neutrófilos no lavado. Os grupos foram identificados como: veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo;
# p<0,05, quando comprados com o
grupo positivo.
Salina
LPS
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
1
2
3Veículo
Extrato
Diclofenaco
Ne
utr
ófi
los
(1
0³/
mm
³)
*
# #
# #
48
± 0,05265) e DLPS (0,04685 ± 0,05026) pode observar uma redução na expressão
gênica, apesar de não significante estatisticamente.
6.7 Quantificação de TNF-A plasmático
Figura 11. Quantificação proteica do TNF-α no plasma. Os grupos foram identificados como: veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo;
# p<0,05, quando comprados com o
grupo positivo.
#
*
Figura 10. Expressão gênica do TNF-α no lavado. Os grupos foram identificados como veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo.
Salina
LPS
Salina
LPS
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0.00
0.05
0.10
0.15Veículo
Extrato
Diclofenaco
Exp
ressão
gên
ica T
NF
-
*
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
100
200
300Veículo
Extrato
Diclofenaco
TN
F-
pla
sm
áti
co
(p
g/m
L)
49
Na figura 11, ao qual mostra a quantificação proteica do TNF-α no
plasma, o grupo controle positivo (VLPS) (189,4 ± 112,0) mostrou um aumento,
estatisticamente significante, em relação ao grupo controle negativo (VS) (24,0 ±
4,9). Por outro lado, os grupos ES (24,0 ± 8,2) e DS (32,0 ± 7,7), conforme
esperado, não houve quantidade significante de TNF-α, quando comparados com o
grupo controle negativo (VS). O grupo ELPS (117,5 ± 67,0) apresentou uma redução
estatisticamente significante de TNF-α quando comparado com o grupo controle
positivo (VLPS). O grupo DLPS (149,2 ± 100,65), apesar de não apresentar uma
redução significante estatisticamente, observou-se uma redução da quantidade
proteica do TNF-α.
6.8 Quantificação de TNF-α peritoneal
No resultado da quantificação proteica do TNF-α no lavado, se pode
observar, conforme figura 12, que o grupo controle positivo (VLPS) (56,5 ± 38,8)
apresentou uma quantificação proteica maior e estatisticamente significante, quando
comparado com o grupo controle negativo (VS) (19,81 ± 8,1). Os grupos ES (22,0±
2,42) e DS (19,7 ± 1,9) apresentaram quantidades proteica de TNF- α similar ao
grupo controle negativo (VS), portanto não significante estatisticamente. Os grupos
Figura 12. Quantificação proteica do TNF-α no lavado. Os grupos foram identificados como: veículo+salina(VS) n=5 (controle negativo); Extrato+salina(ES) n=5; Diclofenaco+salina(DS) n=5; veículo+LPS(VLPS) (controle positivo) n=9; extrato+LPS(ELPS) n=9 e diclofenaco+LPS(DLPS) n=9. * p<0,05, quando comparados com o grupo controle negativo;
# p<0,05, quando comprados com o
grupo positivo.
*
# Salina
LPS
VS ES DS VLPS ELPS DLPS0
20
40
60
80Veículo
Extrato
Diclofenaco
TN
F-
peri
ton
ial
(pg
/mL
)
50
ELPS (29,8 ± 9,0) e o grupo DLPS (40,7 ± 6,8) apresentaram uma quantidade
proteica do TNF-α mais elevada que o grupo controle negativo (VS), apesar de não
ser estatisticamente significante. Em contrapartida, estes mesmos grupos, quando
comparados com o grupo controle positivo (VLPS) mostram uma redução da
quantificação proteica, sendo que, esta redução foi estatisticamente significante no
grupo ELPS.
51
7 DISCUSSÃO
As plantas medicinais possuem ampla diversidade de metabólitos
secundários com diferentes atividades biológicas presente em estruturas como fruto,
mesocarpo, casca e extrato da folha (GOBBO-NETO, et al., 2007).
Os resultados obtidos na análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico da
Punica granatum L., planta escolhida para realização do nosso estudo mostraram,
após realização do teste colorimétrico específico, de acordo com Matos, (2009), a
presença de taninos hidrolisáveis, flavonoides, triterpenos, saponinas e cumarinas.
Resultados semelhantes aos descritos na literatura. Estudo realizado por Vieira, et
al, em 2014, na cidade de Maragogi no estado de Alagoas, avaliou a atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato etanólico da casca do fruto da Punica
granatum L e na análise fitoquímica encontraram metabólitos secundários como
saponinas, flavonoides e taninos, compostos estes também presentes em nosso
estudo. Outro estudo que também corrobora com nossos resultados foi realizado por
Lansky e Newman em 2007, os autores realizaram uma revisão bibliográfica sobre o
potencial da Punica granatum L. na prevenção e tratamento do câncer e inflamação.
Segundo esta revisão, vários compostos pertencentes às classes de metabolitos
secundários observados em nosso estudo, também está presente em outras partes
da Romã além da folha.
Na etapa do nosso estudo, ao qual analisamos os resultados da
contagem total de leucócitos no sangue pode-se observar que o grupo controle
positivo (VLPS) apresentou um número maior de leucócitos quando comparados
com o grupo controle negativo (VS), isso sugere que o LPS induziu o aumento de
moléculas pró-inflamatórias relacionadas à ativação de leucócitos. De fato, o LPS é
uma endotoxina que induz a resposta imunológica promovendo a transcrição de
diversos genes para síntese de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias,
desencadeando assim, as vias de sinalização intracelular relacionadas à resposta
inflamatória aguda sistêmica (LU, et al, 2008).
Na análise dos grupos relacionados ao controle do tratamento oral com
extrato e com o Diclofenaco (grupos ES e DS, respectivamente) em comparação ao
grupo controle negativo (VS), não foi observado diferenças significante na
quantidade de leucócitos totais presentes no sangue periférico. Este resultado
52
sugere que o extrato e o diclofenaco não causam, por si só, um processo
inflamatório.
Em relação à quantidade de neutrófilos no sangue, nos grupos estudados
observou-se, que o grupo controle positivo (VLPS) possui uma quantidade maior e
significante de neutrófilos quando comparado com o grupo controle negativo (VS).
Este resultado pode estar relacionado com a produção de moléculas que estimulam
a desmarginalização de neutrófilos favorecendo assim o seu aumento no sangue
periférico (SHERWOOD, et al, 2004). Os grupos ES e DS não tiveram aumento de
neutrófilos quando comparados ao grupo controle negativo, confirmando que, não
houve indução de processo inflamatório no uso do extrato e diclofenaco.
Os resultados encontrados na comparação entre os grupos, ELPS e
grupo controle negativo (VS), mostrou uma quantidade de maior de neutrófilo no
grupo ELPS; este resultado mostra que, possivelmente, ainda não houve tempo
suficiente para ação do extrato hidroalcoólico na redução dos neutrófilos. Já o grupo
DLPS, apesar de não ter mostrado uma redução significante de leucócitos quando
comparado com o grupo positivo, na contagem total, não apresentou uma
quantidade de neutrófilos significante quando comparado com o grupo controle
negativo na contagem diferencial. Isto pode significar que, apesar do estímulo com
LPS ocorreu uma redução de neutrófilo. Kreimer, 2004 avaliou resposta terapêutica
e inflamatória de ratos com infecção peritoneal submetidos ao uso tópico de
ampicilina/sulbactam. Observou nos seus resultados, realizando contagem de
leucócitos totais e contagem diferencial no sangue do grupo induzido à peritonite,
sem prévio tratamento com ampicilina, um número estatisticamente significante de
leucócitos e neutrófilos respectivamente, corroborando com nosso estudo.
Nos resultados da análise da contagem total de células no lavado o grupo
controle positivo (VLPS), apesar de não ter apresentado um número maior de
leucócitos, estatisticamente significante, dobrou este número quando comparado
com o grupo controle negativo (VS). Este resultado está relacionado com uma
estimulação das células pelo LPS, pois se sabe que, esta endotoxina estimula a
expressão de moléculas relacionadas à quimiotaxia de leucócitos, uma vez que, esta
produção é essencial para migração destas células para o tecido justificando o seu
aumento na cavidade peritoneal (COTRAN, et al, 2000).
Foi observado que os grupos ES e DS apresentaram quantidade de
leucócitos similares ao grupo controle negativo, de fato sem estimulação no peritônio
53
não haverá migração de células para o local. Já em relação aos grupos ELPS e
DLPS, quando comparados ao grupo controle positivo observou-se que houve
diminuição no recrutamento de leucócitos para a cavidade peritoneal, apesar de não
significante estatisticamente, o que pode significar no caso do grupo ELPS, que o
extrato pode ter ação na quimiotaxia. Estudo realizado por Rocha, et al, em 2010,
com outra planta tradicionalmente usada com potencial aplicação terapêutica,
avaliou os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório das raízes da Arrabidaea
bachypoda (cipó-uma), após a indução de edema de pata, crescimento de tecido
fibrovascular e peritonite. Da mesma forma Veira, et al, 2010, ao avaliar os efeitos
antipirético e anti-inflamatório do extrato etanólico da Sonchus oleraceus (serralha),
em ratos após a indução de peritonite e edema de pata através do pré-tratamento
por via oral de 300mg/Kg deste extrato, observou a inibição do recrutamento
leucocitário para a cavidade peritoneal quando foi comparado com o grupo positivo,
ao qual foi induzido a peritonite.
Na análise da quantidade de neutrófilos no lavado observou-se que a
quantidade de neutrófilos do grupo controle positivo (VLPS) foi maior que o grupo
controle negativo (VS). Estes resultados indicam que houve um estímulo provocado
pelo LPS para que ocorra a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal
provavelmente pela ativação de quimiocinas relacionadas com a quimiotaxia de
neutrófilos (LEE, et al, 2008). Os grupos ES e DS, não apresentaram diferença
estatística em comparação ao grupo controle negativo, permanecendo nos valores
basais do grupo controle negativo. Por outro lado, os resultados apresentados nos
grupos ELPS e DLPS, em relação ao grupo controle positivo apresentaram uma
redução significante na quantidade de neutrófilos; este resultado significa que houve
uma ação do extrato na quimiotaxia de neutrófilos para a cavidade peritoneal, sendo
este processo considerado um fator importante de ação anti-inflamatória. Este
resultado reforça nossa análise anterior do número de leucócitos no lavado, em que,
apesar de não significante estatisticamente, houve diminuição no recrutamento de
leucócitos para a cavidade peritoneal, nos grupos ELPS e DLPS, quando
comparados ao grupo controle positivo VLPS. Com resultados similares, Borges, et
al, 2014 realizaram um estudo em que foi avaliado a ação anti-inflamatória do
extrato hidroalcoólico da polygata sabulosa (Timutu-Pinheirinho) em um modelo de
peritonite, em camundongos, induzida através da injeção intraperitoneal de LPS.
54
Estes autores demonstraram que a administração do extrato inibiu completamente a
infiltração celular nos camundongos pré-tratados com o extrato.
Na análise da expressão gênica do TNF-α no lavado peritoneal observou-
se um aumento significante na expressão gênica no grupo controle positivo (VLPS),
quando comparado com o grupo controle negativo (VS), o que sugere que o LPS foi
capaz de estimular a cascata de signalização via TLR4 resultando na
transnucleação do NF-kB sendo este um fator de transcrição para genes pró-
inflamatórios tais como o TNF- α (LU, et al, 2008) Quando observados os grupos,
ES e DS percebe-se que estes apresentaram uma expressão gênica do TNF-α igual
ao grupo controle negativo, nestes grupos não está havendo estímulos celulares
através dos seus receptores, para, assim, iniciar a cascata de moléculas para
formação do RNA do TNF-α. Na análise dos grupos ELPS e DLPS se pode
observar uma redução na expressão gênica, apesar de não significante
estatisticamente. Para esta etapa do nosso estudo não foram encontradas, na
literatura, análises semelhantes que corroborem com nossos resultados.
Na quantificação proteica do TNF-α no plasma o grupo controle positivo
(VLPS) mostrou um aumento, estatisticamente significante, em relação ao grupo
controle negativo (VS), mostrando que o LPS é capaz de estimular a produção de
TNF-α que é uma citocina pró-inflamatória. Por outro lado, os grupos ES e DS,
conforme esperado, não houve quantidade significante de TNF-α, quando
comparados com o grupo controle negativo. Isto mostra que o extrato não possui
nenhuma substância pró-inflamatória. O grupo ELPS apresentou uma redução
estatisticamente significante de TNF-α quando comparado com o grupo controle
positivo mostrando que, o extrato possui alguma substância que atua no controle da
produção desta citocina e isto pode justificar seu potencial efeito anti-inflamatório.
Na análise do grupo DLPS, apesar de não apresentar uma redução significante
estatisticamente, observou-se uma redução da quantidade proteica do TNF-α.
Vale ressaltar que este é o primeiro estudo a qual descreve a ação anti-
inflamatória da Punica granatum L. através da redução de TNF-α plasmático.
No resultado da expressão proteica do TNF-α no lavado se pode observar
que o grupo controle positivo (VLPS) apresentou uma quantificação proteica maior e
estatisticamente significante, quando comparado com o grupo controle negativo
(VS), confirmando a ativação da citocina pró-inflamatória TNF-α no grupo onde
houve indução da peritonite. Os grupos ES e DS apresentaram quantidades
55
proteicas de TNF- α similar ao grupo controle negativo, portanto não significante
estatisticamente. Os grupos ELPS e o grupo DLPS não apresentaram diferenças
estatisticamente significantes, quando comparados com o grupo controle negativo.
Em contrapartida, estes mesmos grupos, quando comparados com o grupo controle
positivo mostram uma redução da quantificação proteica, sendo que, esta redução
foi estatisticamente significante no grupo ELPS, isto significa que substâncias
presentes no extrato hidroalcoolico da Romã afeta a produção de TNF-α podendo
estar relacionado com a diminuição da quimiotaxia de neutrófilos ou da diminuição
da expressão gênica desta citocina. Estudo realizado por Borges et al., 2014
mostrou que a administração oral de extrato hidroalcoólicoda preparados a partir de
folhas da espécie Polygala sabulosa reduziu significantemente concentrações de
TNF-α no lavado peritoneal de camundongos suíços induzidos à peritonite por LPS,
justificando, assim, seu efeito anti-inflamatório.
56
8 CONCLUSÃO
O extrato hidroalcoólico da Punica granatum L. possui metabólitos
secundários encontrados em diversas plantas medicinais.
O extrato hidroalcoólico da Punica granatum L. foi capaz de reduzir a
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal.
As concentrações plasmática e peritoneal da citocina pró-inflamatória
TNF-α foi reduzida devido ao pré-tratamento com extrato hidroalcoólico.
Embora haja necessidade de novos estudos, o extrato hidroalcoólico da
Punica granatum L. pode ser utilizado no tratamento de processos inflamatórios,
como sugerido pela medicina popular.
57
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S.; FARIAS, A. S.); Imunologia Celular e Molecular, 6ª ed., Elsevier: Rio de Janeiro, 2008. ABC.MED.BR, 2014. Peritonite: definição, causas, sintomas, diagnóstico, tratamento, cuidados gerais, evolução, possíveis complicações. Disponível em: <http://www.abc.med.br/p/sinais.-sintomas-e-doencas/521842/peritonite-definicao-causas-sintomas-diagnostico-tratamento-cuidados-gerais-evolucao-possiveis-complicacoes.htm>. Acesso em: 1 nov. 2014. ACHÉ (detalhe do produto Acheflan). Disponível em: <http://www.ache.com.br/Production/Product.aspx?ProductId=4>. Acesso em: 10 março 2014. ADAMS, l. S.; SECRAM, N. P.; AGARWAL, B. B.; et al. (2006) “promegranate juice, total promegranate ellagitannins, and punicalagin supress inflammatory cell signaling in colon câncer cells. Journal of agricultural and Foods Chemistry. AHERNE, C. M.; COLLINS, C. B. , et al. (2011). "Neuronal guidance molecule netrin-1 attenuates inflammatory cell trafficking during acute experimental colitis." Gut. ALLER, M.A.; ARIAS, J.L.; SÁNCHEZ-PATÁN, F.; ARIAS, J.(2007) “The inflammatory response recapitulates phylogeny through trophic mechanisms to the injured tissue” Medical Hypotheses, v. 68, n. 1, p. 202-209, 2007 ANDERS, H. J. and RYU, M. (2011). "Renal microenvironments and macrophage phenotypes determine progression or resolution of renal inflammation and fibrosis." Kidney Int. ANDERSON, R., et al. (2010). "Liposomal encapsulation enhances and prolongs the anti-inflammatory effects of water-soluble dexamethasone phosphate in experimental adjuvant aethritis." Arthritis Research & Therapy. ANTI, S. M.; GIORGI, R. D. N.; CHAHADE, W. H. Anti-iflamatórios hormonais: glicocoticóides. Einstein, São paulo, v.6, n-1, p. 159-165. 2008. ARMANT, M. A. and FENTON, M. J. (2002). "Toll-like receptors: a family of pattern-recognition receptors in mammals." Genome Biol 3(8): Reviews 3011. BACKER, M.; LUDTKE, R; LANGHORST, J.; FINK, M., et al. (2011). "Effectiveness of leech therapy in chronic lateral epicondylitis: a randomized controlled trial." Clinical Journal of Pain 27(5):442-7 BACKER, C. C.; GAINES, H. O.; BAUE, A. E. (1983) “Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncure model”. Surgery. 2: 331-335
58
BARNES, P. J., (2011). "Glucocorticosteroids: current and future directions." British Journal of Pharmacology 29-43 BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. (2009) "Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de novos fármacos." Quim. Nova, nº 3, p. 679-688. BARTON, M.H.; COLLATOS, C.; MOORE, J.N.(1996) “ Endotoxin induced expression of tumor necrosis factor, tissue factor and plasminogen activator inhibitor activity by peritoneal macrophages.”. Equine Vet. J., v.28, p.382-38. BAUHMANN, H.; GAULDIE, J.(1994) “ The acute phase response”. Imunol today, v. 15, n. 2, p. 74-80. BECKHAM, J.C; CALDWELL, D.S; PETERSON, B. L. (1992) “ Disease severity in rheumatoid arthritis: relationships of plasma tumor necrosis factor alpha, soluble interlukin 2 receptor, soluble CD4/CD8 ratio, neopterin, and fibrin D dimer to traditional functional and severity measures. J clin Immunol 12: 353-61. BELLA CRUZ, A. B. et al. (2010). " Métodos in vitro na avaliação da Atividade Biológica de produtos Naturais e Sintéticos." Fármacos e medicamentos: uma abordagem multidisciplinar 175-205. BEM-BARUCH, A.; MICHEL, D.F.; OPPENHEIM, J.J. (1995) “Signals and receptors involved in recruitment of inflammatory cells”. J Biol. Chem., v. 270, n. 20, p. 11703-11706. BEYAERT, R.; FIERS, W. (1998) “ Tumor necrosis factor and lymphotoxin”. In: MIRE-SLUIS, A., THORPE, R. (Eds).Citokines. California: Academic,. p.335-360. BOARDMAN, C; CHACHI, L; GAVRILA, A;KEENAN, C.R.; PERRY M.M.; XIA, Y.C.; MEURS, H.; SHARMA, P. (2014) “Mechanisms of glucocorticoid action and insensitivity in airways disease”. Pulm Pharmacol Ther. PubMed 2014 Sep 9. pii: S1094-5539(14)00107-2. doi: 10.1016/j.pupt.2014.08.008 BORGES, F. R. M.; SILVA, M. D.; CÓRDOVA, M. M.; SCHAMBACH, T. R.; PIZZOLATTI, M. G.; SANTOS, A. S. (2014) “ Anti-inflammatory action of hidroalcoholic extract, dichloromethane fraction and steroid α-spinasterol from Polygata sabulosa in LPS-induced peritonitis in mice. Journal of Ethnopharmacology. 144-150 BOTTING, R. M. (2006) “Cyclooxygenase: Past, present and future” A tribute to John R. Vane (1927–2004). Journal of Thermaal Biology 208-219 BRASIL. Anvisa, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa aumenta controle sobre a venda de anti-inflamatórios). Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/noticias/2008/051108_1.htm>. Acesso em: 01 julho, 2014. BRASIL. Anvisa, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Coordenação de Medicamentos Fitoterápicos e Dinamizados (COFID). Superintendência de
59
Medicamentos e Produtos Biológicos (SUMED). Gerência Geral de Medicamento. Guia de orientação para registro de Medicamento Fitoterápico e registro e notificação de Produto Tradicional Fitoterápico. Instrução Normativa nº4, de 18 de junho de 2014. BRASIL. Ministério da saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de assistência farmacêutica. Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Brasília, 2006, p. 9 BRASIL. MInistério da saúde. Secretária de Ciência. Fitoterapia no SUS e o programa de pesquisa de plantas medicinais da Central de medicamentos/Ministério da Saúde, Brasilia, 2008, p.15. CARVALHO, J.C.T. (2008) “Formulário Médico-Farmacêutico de Fitoterápicos”, Ciência Brasilis, Belo Horizonte, págs. 2-9. CHANDRASEKHARAN, N. V.; DAI, H.; ROOS, K. L.; EVANSON, N. K.; TOMSIK, J.; ELTON, T.S.; SIMMONS, D.L. (2002). “COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression.” Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A 99(21) 13926-31 COOK-MILLS, J. M.; DEEM, T. L. (2005). " Active participation of endhothelial cells in inflammation. Journal of Leukocyte Biology, 487-495. COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. (Trad. BARBOSA, J. B.; De VASCONCELOS, M. M.; VOEUX, P. J.); ROBBINS. Patologia Estrutural e Funcional, 6ª ed., Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2000. COUTO, A. G.; VITORINO, J. C.; SILVA, R. M. L. (2010) " Tecnologia e Garantia da Qualidade de Fitoterápicos" Fármacos e Medicamentos: uma abordagem multidisciplinar. São Paulo, 241-308. CUNHA, A. P.; SILVA, A. P.; ROQUE, O. R. (2002) “Plantas e produtos vegetais em Fitoterapia“ Fund. Calouste Gulbenkian, Lisboa
DE BOSSCHER, K.; HAEGEMAN, G.; ELEWAUT, D. (2010). "Targeting inflammation using selective glucocorticoide receptor." Current Opinion in Pharmacology. 497-504. DE OLIVEIRA, J. F.; GARRETO, D. V., et al. (2013) "Therapeutic potential of biodegradable microparticles containing Punica granatum L. (pomegranate) in murino models of asthma". Inflamm Res 62(11): 1-80. DUONG, V.; HO, S.; NGO, K. C.; GREER, C.L.; WEEKS, D. L. (2014) “Side effects of commonly prescribed analgesic medications. Phys Med Rehabil Clin N Am. May;25(2):457-70. doi: 10.1016/j.pmr.2014.01.007. EBERHARD, B. A; LAXER, R. M; ANDERSON, U.; SILVERMANN, E. D (1994) “Local synthesis of both macrophage and T cells cytokines by sinovial fluid cells from children with juvenile rheumatoid arthritis. Clin Exper Immunol 96: 260-6.
60
FARIA, A.; MONTEIRO, R.; MATEUS, N.; AZEVEDO, L.; CALHAU, C. (2007). " Effect of pomegranate (Punica granatum) juice intak on hepatic oxidative stress." Eur. J. Nutr 46: 271-8 FERREIRA, R. S.; OLIVA, G.; ANDRICOPULO. (2011) "A.Integração das Técnicas de Triagem Virtual e Triagem Biológica Automatizada em Alta Escala: Oportunidades e Desafios em P&D de Fármacos." Quim. Nova, n. 10, p. 1770-1778. FISCHER, U. A.; CARLE, K.; KAMMERER, D. R. (2011) "Identification and qualification of phenolic compounds from pomegranate (Punica granatum L.) peel, mesocarp, aril and differently produced juices by HPLC-DAD-ESI/MSn". Food Chem. 127:807-21 FOGLIO, M. A.; QUEIROGA, C. L.; SOUSA, I. M.; RODRIGUES, A. F. (2006) " Plantas Medicinais como Fonte de Recursos Terapêuticos: Um Modelo Multidisciplinar." Ver. Multiciências. GOBBO-NETO, L.; LOPES, P. N. (2007) "Plantas medicinais: Fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários". Quiímica Nova, v-30, GREKA, F. H.; SOUZA , F. Z. A.; ARAUJO, C. F. R., et al. (1994) “Peritonite experimental em ratos. Bloqueio da absorção transdiafragmática. Acta. Cir. Bras. 9: 22-24. GRUEN, M.; LAUX-BIEHLMANN, A.; ZOLLNER, M. T.; NAGEL, J. (2014) " Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of abdominal pain in the LPS-induced peironitis model in the rat". Jounal of Neuroscience Methods ISMAIL, T.; SESTILI, P.; AKTAR, S. (2012). " Pomegranate peel and fruit estract: A review of potential anti-inflammatory an anti-infective effects." Journal of Ethnopharmacology (405): 399 JACKSON R. L.; MOROW J.D. (2001) “Analgesic-Antipyretics and Anti-inflammatory Agents and Drugs Emplyed in the Treatment of Gout em Goodman & Gilmans” The Pharmacological Basis of Therapeutics, KAISHO, T. AND AKIRA, S. (2006). "Toll-like receptor function and signaling." J Allergy Clin Immunol 117(5): 979-987; quiz 988. KELLY, M.; HWANG, J. M.; KUBES, P. (2007). " Modulating leucocyte recruitmente in inflammation" J. Allergy Clin. Immunol. 3-10 KIM, H. P.; SON, K. H.; CHANG, H. W.; KANG, S. S. (2004)” Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms.” J Pharmacol Sci 96(3): 229-45.
KREIMER, F.; Resposta terapeutica e inflamatória de ratos com infecção peritoneal submetidos ao uso tópico de Ampicilina/Sulbactam. 61f, Dissertação (mestrado em cirurgia)- Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004.
61
LAMPINEN, M.; CARLSON, M.; HAKANSSON, L. D.; VENGE, P. (2004). "Cytokine regulated accumulation of eosinhophils in inflammatory disease". Allergy. 793-805.
LANSKY, E. P.; NEWMAM, R.A. (2007). " Punica granatum (pomegranate) and its potential for prevention and treatment of inflammation and cancer". J Ethnopharmacol. 109:177-206. LARROSA, M.; GONZALEZ-SARRÍAS, A.; YÁNEZ-GASCÓN, M. J. et al. (2010) " Anti-inflammatory properties of a pomegranate extract and its metabolite urolithin-A in colits rats model and effect of colon inflammation on phenolic metabolism" Journal of Nutritional Biochemistry. LEE, C. J.; CHEN, L. G.; LIANG, W. L.; WANG, C. C. (2008) " Anti-inflammatory effects of Punica granatum L. in vintro and in vivo. Food Chemistry 118 (2), 315-322 LIBBY, P.; OKAMOTO, Y., et al. (2010). "Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice." Circ J 74(2): 213-220. LORENZI, H.; SOUZA, H. M. Plantas ornamentais no Brasil-arbustivas, herbáceas e trepadeiras. 3ª Ed. Nova Odessa: Plantarum, 2001. 1088p. LU, Y. C.; YEH, W. C.; OHASHI, P.S.(2008)“LPS/TLR4 signal transduction pathway. Citokine. 42(2):145-51 LUSTER, A. D.; ALON, R.; VON ANDRIAN, U.H.(2005) " Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets". Nat Immunol. 6:1182–1190. MACKAY, F.; LOESTER, H.; STUEBER, D.; GEHR, G.; LES-SLAUR, W (1993) “Tumor necrosis factor alpha (TNF-α)-induced cell adhesion to human endothelial cells is under dominant control of one TNF receptor type TNF-R55. J Exp Med., v. p.1277-1286. MALVEZZI, C. K.; Atividade antimicrobiana de produtos naturais para obtenção de novos biofármacos: estudo dos extratos brutos e suas associações. 113 f. Tese (Doutourado em ciências)- Escola de engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Lorena, 2010. MATOS. F. J. A. Introdução a Fotoquímica Experimental. 3 ed. Fortaleza: Universidade Federal do Ceara- UFC, 2009 150 P. MATTHAIOU, C. M; GOUTZOURELAS, N.; STAGOS, D.; SARAFOGLOU, E.; JAMURTAS, A.; KOULOCHERI, S. D.; HAROUTONIAN, S. A.; TSATSAKIS, A. M.; MUNOS, B.; (2009) " Lessons from 60 years of pharmaceutical innovation". Nat. Rev. Drug. Discov., p. 959 – 968. OLIVEIRA, M. J. R.; SIMÔES, M. J. S.; SASSI, C. R. R. Fitoterapia nos sistema de Saúde Pública (SUS) no Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 8, n.2, p. 39-41, 2006.
62
PANDEY, A. K. (2013). "Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: Na orverview".The Scientific World Journal. PATTANITTUM, P.; TURNER, T.; GREEN, S.; BUCHBINDER, R. (2013). "Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) for trating lateral elbow pain in adults."Editorial Group: Cochrane Musculoskeletal Group. REGO, T. J. A. Fitogeografia das plantas medicinais no Maranhão. 3ª Ed. ED UFMA: São Luis, 2008. ROCHA, C. Q.; VILELLA, C. F.; CAVALCANTE, G. P.; SANTOS, M. H.; GIUSTI-PAIVA, A. (2010) “Anti-inflammatory and antinocicepitive effects of Arrabidaea brachypoda “ Jounal of Ethnopharmacology. 396-401. ROGERIO, A. P.; SÁ-NUNES, A.; ALBUQUERQUE, D. A. (2010). "The activity of medicinal plants and secondary metabolities on eosinophilic inflammation". Pharmacological Research 62. ROSA, C.; CÂMARA, S. G; BÉRIA, J. U. (2011). "Representações e intenção de uso da fitoterapia na atenção básica à saúde". Ciência & Saúde Coletiva. vol.16 no.1 RJ. 2011. ROSSATO, A. E. Fitoterapia Racional: Aspectos Taxonômicos, Agroecológicos, Etnobotânicos e Terapeuticos. 1ª Ed. 213 P. DIOESC: Florianópolis, 2012. ROMANO, C.; MAZOLLA, C. N., et al. (2009). "Toll-like receptor-4 (TLR4) mediates human beta-defensin-2 (HBD-2) induction in response to Chlamydia pneumoniae in mononuclear cells." FEMS Immunol Med Microbiol 57(2): 116-124. SALGADO Jr, W.; CUNHA, F. Q.; SANKARANKUTY, A. S.; SANTOS, J. S. (2001). “Desenvolvimento de modelo de peritonite bacteriana para avaliação do tratamento mediante acesso laparotômico e vídeo-laparoscópico”. Acta. Cir. Bras. 10: 103-110. SAMBROOK, J. RUSSEL, D. W. Molecular Cloning. 3rd edition. 3 vol. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 2001 SARTIPPOU, M.R.; SEERAM, N.P; RAO, J.Y.; MORO, A.; HARRIS, D.M.; HENING, S.M, et al. (2008). " Ellagitannin-rich promegranate extract inhibits angiogenesis in prostate cancer in vitro and in vivo." Int. J. Oncol 32: 475-80 SCHRODER, N. W. AND SCHUMANN, R. R., (2005). "Single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptors and susceptibility to infectious disease." Lancet Infect Dis 5(3): 156-164. SHERWOOD, E. R.; TOLIVER-KINSKY, T. (2004). Mechanism of the inflammatory response. Best Pract. Res. Clin. Anaesthesiol. 18. 385-405 SIMMONS, D. L.; BUCKLEY, C. D. (2005). " Some new,and not so new, anti-inflammatory targets". Current opinion in Pharmacology, 394-397.
63
TAKEDA, K. AND AKIRA, S., (2007). "Toll-like receptors." Curr Protoc Immunol 14: Unit 14 12. TASKER, J. G.; HERMAN, J. P. (2011) "Mechanism of rapid glucocorticoide feedback inhibition of the hypothalamic-pituitary-adrenal axix." Stress 698-406 TAVES, M. D.; GOMEZ-SANCHEZ, C. E.; SOMA, K. K. (2011) “Extra-adrenal glucocorticoids and mineralocorticoids: evidence for local synthesis, regulation, and function.” American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism, Bethesda, v. 301, n. 1, p. 11-24. TERRY, C. F.; LOUKACI, V.i, et al. (2000). "Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin 6 transcriptional regulation." J Biol Chem 275(24): 18138-18144. TOKLU, H.Z.; DUMLU, M.U.; SERHILI, O.; ERCAN, F.; GEDIK, N.; GOKMEN, V.et al. (2007) "Pomegranate peel extract prevents liver fibrosis in billary-obstructed rats." Pharm pharmacol 725 - 718 TRACEY, K.J.; CERAMI, F.A. (1993) “tumor necrosis fator: na update reviews of its Biology”. Crit Care Med., v. 21, p. 415-422. VIEIRA, A. C. S.; CAMPESSATO, E. A. Avaliação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato etanólico de Punica granatum L. (ROMÃ).60f. Dissertação (Mestrado em enfermagem)- Escola de enfermagem e farmácia da Universidade Federal de Alagoas, Maceió 2014. WAITZBERG, D. L.; ORKU, S. M. M.; SOARES, S. R. C; et al (1991) “Padronização de um modelo de peritonite em ratos”. Acta. Cir. Bras. 6: 37-40. WERKMAN, C.; GRANATO, D. C.; KERBAUY, W. D.; SAMPAIO, F. C.; BRANDÃO, A. H.; RODE, S. M. " Aplicações terapeuticas da Punica granatum L. (romã). Ver. Bras. PI. Med., Botucatu, v.10, n.3, p. 104-111, 2008. YUDKIN, J. S. (2003) “Adipose tissue, insulin action and vascular disease: inflammatory signals”. Int J Obesity.27:S25-8. ZUANAZZI, J.A.S; MAYORGA, P. (2010). " Fitoprodutos e Desenvolvimento Econômico." Quimica Nova, v.33, n.6, p. 1421-1428, 2010.
