Métodos e Técnicas em Biologia MolecularDepartamento de Zoologia, Universidade de Coimbra

Expressão e Purificação de uma proteína de fusão com a Glutationa S-transferase

Importância deste trabalho

A expressão de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas.

Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção e purificação da proteína por cromotografia de afinidade e, finalmente, analisá-la por electroforese em gel de policrilamida utilizando o anticorpo específico contra a proteína purificada.

Glutationa S-Transferase

A GST é uma proteína que quando expressa em E.coli, apresenta actividade enzimática.

Proteínas de fusão com a GST também apresentam actividade enzimática.

As proteínas de fusão são produzidas em grande quantidade pela E.coli e são facilmente purificáveis por cromatografia de afinidade com Glutationa-Sepharose.

Cromatografia de afinidade

Baseia-se na capacidade das proteínas reconhecerem moléculas biológicas, com as quais interagem específica e reversivelmente.

Durante a aplicação da amostra, a proteína que reconhece o ligando fica ligada na fase estacionária, enquanto as outras proteínas passam através da fase estacionária e são eluídas em conjunto.

Protocolo

B.1. Preparação do extracto de E. coli

1. Adicionar ao sedimento de 100 ml da cultura de bactérias 5 ml de PBS + 1% Triton X-100 + inibidores de proteases;

2. Lisar as células bacterianas por sonicação no gelo (6×5 seg); agitar durante 30 min a 4ºC;

3. Centrifugar o lisado de células bacterianas a 12 000×g, durante 10 min, a 4ºC, de modo a eliminar a fracção celular insolúvel; recolher aliquota do sobrenadante da centrifugação (20 ml; desnaturar proteína por diluição 1:1 com 2× solução desnaturante e fervura).

Protocolo

B.2. Purificação da proteína de fusão

1. Preparar a resina Glutationa-Sepharose: usar 350 ml da mistura 75% de Glutationa-Sepharose; lavar a resina com 10 ml de PBS; centrifugar, decantar o sobrenadante e adicionar 262.5 ml de PBS, de modo a obter uma mistura de resina a 50%;

2. Adicionar o lisado celular à resina e agitar durante 30 min a 4ºC;

3. Sedimentar a resina por centrifugação e descartar o sobrenadante; lavar a resina três vezes com 5 ml de PBS cada vez;

4. Incubar a resina com 262.5 ml (volume da resina) de 10 mM glutationa reduzida em 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, durante 10 min; sedimentar a resina e recolher sobrenadante (fracção eluída); realizar mais duas eluições como esta (opcional).

Protocolo

C. Quantificação da proteína recombinante purificada

Fazer uma diluição de cada uma das amostra eluídas da coluna de Glutationa-Sepharose;

Ler a absorvância dessas amostras a 280 nm;

Calcular a concentração de proteína de fusão nas amostras, tendo em conta que, para a proteína GST:

A280nm=1 ⇒ [GST]=0.5 mg/ml