TERAPIA GÊNICA:Onde estamos e para onde iremos!

esperança ou ilusão?

Melissa Gava ArmeliniLaboratório de Reparo de DNADepartamento de Microbiologia

ICB -USP

Terapia Gênica“Intervenção médica baseada na modificação do

material genético de células vivas, resultando em benefício terapêutico.” (FDA, 1993)

Revolução da Medicina!!!

Alvos de Terapia Gênica

Doenças hereditárias:Imunodeficiência (ADA)

Fibrose cística

Hemofilia

Xeroderma Pigmentosum

Doenças adquiridas:Câncer

AIDS

Doenças com protocolos envolvendo Terapia Gênica

Estratégias de Terapia Gênica

In Vivo

Ex Vivo

? ? ?Mas como introduzir genes em um

organismo?

??? ??

1) Diretamente por injeção de DNA

•Útil para imunizações

2) Uso de lipossomos

3) Vetores virais.

Vetor Vantagens Desvantagens

Retrovírus(RNAss)

•Tempo maior de expressão do transgene•Alta eficiência de transdução ex vivo•Experiência clínica ex vivo• Baixa imunogenicidade

•Baixa eficiência de transdução in vivo•Tamanho do inserto limitado a 8 Kb•Infecta apenas células proliferativas•Integração aleatória podendo causar alterações gênicas •Manipulação e armazenamento extremamente difíceis

Terapia gênica para a síndrome X-SCID

Resultados:

As crianças começam a recuperar o sistema imunológico. Não precisam mais de injeção de imunoglobulinas!

Problemas:

Até 2005 apareceram 3 casos de leucemia, entre pacientes tratados com retrovírus: inserção do retrovírus próximo a um oncogene.

Uso de adenovírus para terapia gênica

Vetor Vantagens Desvantagens

Adenovirus(DNAds)

•Alta eficiência de infecção e transdução in vivo e ex vivo•Infecta células proliferativas e não proliferativas•Mais clinicamente testado•Capacidade de infectar vários tipos celulares

•Forte resposta imune•Tamanho do inserto limitado a 7,5 Kb•Condições de armazenamento e manipulação moderadamente difíceis•Permite apenas umaaplicação (se tanto).•Expressão transiente(epissomo)

+ + XPD

pCMV

KanR XPD

EGFPPI- ISce

I- ICeu

pSHIRES-XPD7,9 Kb

Dupla digestão

PI-Sce I/I-CeuI

AMPLIFICAÇÃO DO PLASMÍDEO

DIGESTÃO DO PLASMÍDEO COM PAC I

Transfecçãoem células HEK 293

Produção das partículas

recombinantes

Clonagem do cassete no pAdeno-X

Construção de um vetor

adenoviral

Produção de adenoGFP em células HEK 293

Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER)

Remove lesões que distorcem DNA;

Envolve múltiplas proteínas;

Subdividido em 2 vias: GGR e TCR

GGR: reparo do genoma global

TCR: reparo das fitas transcritas

Xeroderma pigmentosum (XP)

Síndrome rara

Herança autossômica recessiva;

Elevada incidência de câncer de pele;

Problemas neurológicos;

XP clássicos (XPA-XPG): deficientes em NER;

Xeroderma Pigmentosum Society

“Crianças da Lua”

Síndrome XP nos ajudou a entender vários aspectos da carcinogenesis: será que podemos ajudá-los?

O estudo começa in vitro...Luz visível Luz UV

2 meses após a infecção

Muotri et al. 2002.

Células de pacientes XP-D são mais resistentes a UV quando infectadas com AdXPD

Armelini et al, 2005

Principais conclusões dos ensaios in vitro

A transdução de XPA, XPC, XPD e XPV foi eficiente na correção do defeito molecular em células provenientes de pacientes XP;

Células XP

+ AdXPA

+ AdXPC

+ AdXPD

+ AdXPV

Expressão do transgene por, pelo menos, 2 meses!!

Sucesso na correção fenotípica de células provenientes de pacientes XP!!!!

Mas... e in vivo?

Detecção de GFP em camundongos infectados com AdXPA

Marchetto et al 2004

AdXPA protege camundongos XPA da UVB

3 semanas após UVMarchetto et al 2004

Histologia da pele de camundongos irradiados

XPA XPA + AdXPA selvagem

3 semanas após UV

Marchetto et al 2004

AdXPA previne formação de tumores induzidos por UVB em camundongos XPA-/-

Marchetto et al 2004

•1999/Setembro: Falecimento do jovem de 18 anos - JesseGelsinger submetido à terapia gênica com adenovírus recombinante

•Doença a ser tratada: Ornitina transcarbamilase (OTC-deficiência em uma enzima do ciclo da uréia, promovendo o acúmulo de substâncias tóxicas no fígado como amônia)

•Administração de vírus foi muito alta, causando violenta resposta imune

•O garoto morre poucos dias depois de falência generalizada dos órgãos

Questões que permanecem...

Adenovírus diretamente na pele de humanos?

De que vale uma terapia por apenas 2 meses?

Quantas vezes?

Uso de imunossupressores?

Uso de vetores menos imunogênicos, ex. AAV (vírus adeno-associado).

Vetor Vantagens Desvantagens

Virus AdenoAssociado(AAV) (DNAss)

•Transduzeficientemente uma grande variedade de células in vivo•Expresão prolongada in vivo (até 4 anos) •Baixa imunogenicidade•Nenhuma relação com infecções humanas•Integração preferencial(braço curto do cromossomo 19)• Diferentes sorotipos

•Condições de armazenamento e manipulação muito difíceis •Tamanho do inserto limitado a 4,5 Kb•Pouca experiência clínica•Pode ser neutralizado por anticorpos

Esquema da construção de um vetor adeno associado (AAV)

Plasmídeo principal

Plasmídeo “helper”+

Co- transfecção

Células HEK 293

72 horas, lisado celular

Gradiente de iodixanol

Partículas viraispurificadascromatografia

1) AAV infecta pele????

primer foward primer reverse

XPA EGFP

Neg

ativ

e co

ntro

l

AA

V-X

PA

-EG

FP

8

AAV-XPA-EGFP 1 AAV-XPA-EGFP 2 AAV-XPA-EGFP 5A B C A

XPA-EGFP

β - actin

A B C A B C

2) Quais os tipos celulares da pele que o AAV écapaz de infectar?

XPA-/- + AAV-XPA-EGFP 2XPA-/-

1

wt XPA-/-XPA-/- +AAV8

XPA-/- +AAV2

Tempo após a irradiação em

semanas

2

3

TERAPIA GÊNICA:

MUITA ESPERANÇA!!!

Agradecimentos

Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck – ICB/USPDr. Alysson Renato Muotri

Dra. Maria Carolina Nasser Marchetto

Dra. Keronninn Moreno de Lima Bessa

Ricardo Alexandre Leite

Carolina Quayle

Prof. Dr. Errol Friedberg – University of Texas

Suporte: