Sistema de HPLC - Bem Vindo - UFSMw3.ufsm.br/larp/media/hplc_geral_colorido.pdf · 2011-05-18 · 5...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

Conceitos Básicos

Instrumentação

Aplicações

Prof. Dr. Renato Zanella

LARP/UFSM, Brasil

HPLC

Princípio da técnica HPLC

Modos de separação

Instrumentação

- Separação (gradiente x isocrático)

- Detecção

Fase Móvel (FM) / Fase Estacionária (FE)

Aplicações

TÓPICOS QUE SERÃO ABORDADOS

Cromatografia Liquida

de Alta Eficiência - HPLC

A cromatografia pode ser conceituada como um método

físico-químico de separação, no qual os constituintes da

amostra a serem separados são particionados entre duas

fases, uma estacionária (FE) geralmente de grande área e

outra que percola através da primeira, a fase móvel (FM).

INTRODUÇÃO

HPLC - Equipamento

Sistema de HPLC



Histórico

A Cromatografia Líquida foi inicialmente utilizada comouma técnica preparativa lenta. As teorias existentes nãoexplicavam corretamente o desempenho das colunascromatográficas, o papel da fase móvel e da faseestacionária.

Cromatografia líquida clássica

1903 - Tswett - 1° trabalho em cromatografia líquida

1935 - Adams e Holmes – 1ª resina de troca iônica

1940s - Cromatografia moderna – 1os tratamentos teóricos

1941 - Martin e Synge - cromatografia líquido-líquido

1960s - grande desenvolvimento da cromatografia líquida

1970s - primeiros equipamentos comerciais

HPLC - Histórico

Tswett 1903

A fase estacionária (FE) é geralmente utilizada uma só

vez, porque a amostra pode ser adsorvida de forma

irreversível;

O enchimento da coluna deve ser repetido para cada

separação;

Desperdício de tempo e mão-de-obra

A aplicação da amostra requer tempo e prática;

A vazão do eluente é promovida pela ação da gravidade;

As frações individuais da amostra são coletadas

manualmente o que requer várias horas.

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HPLC - Histórico

Tswett 1903

HPLC - Equipamento

Dificuldades Iniciais

- Baixa vazão - gravidade

- Fase Estacionária - estabilidade, empacotamento

- Detectores - tamanho das celas, rapidez de resposta

Menor HPLC

comercial

HPLC - Aplicações

Aplicações

Proteínas e aminoácidos

Pesticidas

Fármacos

Explosivos

HPAS

Vitaminas

Pigmentos

Açucares

Polímeros

Íons metálicos



Usos e Limitações

Na Cromatografia Líquida os compostos a

serem analisados não necessitam ser voláteis

ou termicamente estáveis, mas é necessário que

sejam solúveis na fase móvel (FM) que possuam

uma possível interação com a FE e que possam

adequadamente ser detectadas.



Estratégia de Desenvolvimento das Análises por HPLC

Preparo da amostra;

Escolha da FE (coluna)

Escolha da FM (Isocrática; Gradiente; Aditivos);

Volume de injeção;

Otimização do cromatograma;

Detecção;

Aquisição e tratamento dos dados;

Calibração e quantificação;

(Re)Validação.

HPLC - Modos de Separação

Modos de separação (mecanismos)

Adsorção (CLS) SÍLICA - altamente polar

Partição (CLL)

Fase Normal FASE LIGADA - baixa polaridade

Fase Reversa FASE LIGADA - apolar

Par Iônico FASE LIGADA - apolar (adição de íons)

Troca Iônica FASE LIGADA - trocador iônico

Exclusão POLíMEROS - cavidades

http://www.dof.virginia.gov/images/pesticide-diazinon-photo.gif

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I- Líquido-Sólido ou por ADSORÇÃO

É baseada na interação do soluto com os centros

ativos fixos de um adsorvente sólido, finamente

dividido, que atua como FE.

ADSORVENTE

ELUENTE SOLUTO

Soluto e eluente são atraídos pelos sítios polares da FE

FM FE


FE = sólido. Ex.: sílica ou alumina

FM = solventes apolares, comumente hexano,

contendo pequenas quantidades de

modificadores polares como dicloromentano

e 2-propanol.

Utilizada para separação de: ácidos graxos,

álcoois, aminas, antioxidantes, corantes,

fenóis, lipídios, vitaminas lipossolúveis, etc.

ADSORÇÃO


II- Líquido-Líquido ou de PARTIÇÃO

Desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para a

separação de vários aminoácidos;

Baseia-se na distribuição das moléculas do soluto

entre duas fases líquidas imiscíveis, de acordo

com as solubilidades relativas. Os componentes

mais solúveis na FE são seletivamente retidos por

ela, enquanto os menos solúveis são

transportados mais rapidamente pela FM;


A separação do soluto é baseada nas diferenças

relativas de solubilidade na FE e na FM

FM FE

PARTIÇÃO


Inicialmente o maior inconveniente era asolubilidade da FE na FM. Isso poderia serresolvido de duas maneiras:

saturando a FM por meio de uma pré-coluna, colocadaantes do injetor, que contenha alto percentual de FE,

utilizando materiais que contenham FE quimicamenteligada a um suporte sólido.

É utilizada para compostos de polaridadeintermediária, com massas moleculares < 2000 u.

PARTIÇÃO

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Líquida ligada em suporte sólido:

As fases quimicamente ligadas são as mais

importantes da HPLC. Todas elas se baseiam nas

possibilidades do grupo silanol reagir no

hidrogênio ou por substituição da hidroxila.

PARTIÇÃO HPLC - Modos de Separação

Principais fases quimicamente ligadas

1. Fases apolares : os principais grupos não polares oupouco polares ligados à silica são:

a) Grupos alquílicos com cadeias de 2, 4, 8, 18 e 22átomos de carbono.

C4 (butila): tR menor que das fases C8 e C18. Utilizadapara separação de peptídios e proteínas.

C8 (octila): Recomendada para materiais ligeiramenteou altamente polares como peptídios pequenos,esteróides, nucleosídeos, fármacos polares.

PARTIÇÃO


C18 (octadecilsilica ou octadecila; ODS, RP-18): para materiais

apolares ou moderadamente polares, tais como ácidos

graxos, PAHs, ésteres, vitaminas lipossolúveis, etc.

b) Grupos fenílicos: são grupos fenila ou alquilfenila ligadas à

sílica. Possuem poucas aplicações. Recomendada para

grupos moderadamente polares.

PARTIÇÃO HPLC - Modos de Separação

Tratamento Endcapping com trimetilclorosilano


2. Fases polares : neste caso os grupos ligados à

sílica são polares. Exemplos:

Amino (NH2)

Ciano (CN)

Diol

Cromatografia em fase reversa


Com base nas polaridades relativas da FE e FM a HPLC pode ser dividida em duas categorias:

Cromatografia em fase normal

A FE é mais polar que a FM

(FE polar e FM apolar)

A FE é mais apolar que a FM

(FE apolar e FM polar)

FN

FR

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Características da Cromatografia em FN e FR

Fase Normal (FN) Fase Reversa (FR)

Polaridade da FE Alta Baixa

Polaridade da FM Baixa - Média Média - Alta

Fase móvel típica Heptano/triclorometano Metanol/água

Ordem de eluição 1° os menos polares 1° os mais polares

P/ tR do soluto polaridade da FM polaridade da FM

(aumento da força de eluição da FM)

P/ tR do soluto polaridade da FM polaridade da FM

Escolha do modo (Em geral):

• Se a amostra for insolúvel em

água ou apolar – use FN;

• Se for solúvel ou insolúvel em

água, mas polar – use FR



FASE REVERSA Vantagens

Freqüentemente compostos não iônicos e ionizáveis podem ser separados usando a mesma coluna e FM com vários aditivos (tampão de pH e reagentes de par iônico);

As colunas de fase hidrofóbica ligadas são reprodutíveis erelativamente estáveis;

A FM predominante, a água, é de fácil obtenção; amostras emsolventes aquosos podem ser diretamente injetadas;

Os modificadores mais utilizados, metanol e acetonitrila, estãoprontamente disponíveis e adequadamente puros;

A ordem de eluição é freqüentemente previsível, baseado no grauhidrofóbico da molécula do soluto.


III - Exclusão por tamanho (SEC)

Efetua a separação de acordo com

o tamanho efetivo das moléculas.

A coluna é recheada com material

com poros de tamanho controlado.

Fases Estacionárias

poliestireno poroso

sílica - poros controlados

gel - base orgânica ou aquosa

Fases Móveis

aquosa - filtração em gel

orgânica - permeação em gel

Aplicações:

Separações de polímeros, proteínas,

Gorduras, ... por tamanho. Moléculas

maiores eluem primeiro.


III - Exclusão por tamanho (SEC)


IV - Troca IônicaDeterminação de cátions e ânions

Resinas trocadoras de íons: As modernas resinastrocadoras de íons são fabricadas a partir de polímerosporosos com superfície modificada com grupostrocadores iônicos.

Trocadores catiônicos:

Forte: sulfônico

Intermediário: fosfônico

Fraco: carboxílico

Trocadores aniônicos:

Forte: amônio quaternário

Intermediário: dietilamino

Fraco: p-amino carboxílico

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IV - Troca Iônica


Mecanismo+

FEContra-íonÍon do soluto

Um composto iônico

que forma um par iônico

com um componente da

amostra, de carga

oposta, é adicionado à

FM. Este par iônico, é

um sal, que se comporta

como uma molécula

orgânica neutra, que

pode ser separada por

cromatografia em fase

reversa.

V - Par Iônico O pré-requisito é que o contra-íon forme um íon par com características

hidrofóbicas e seja atraído pela FE apolar.

Para separações que não são adequadas por FR ou troca iônica.


Reagentes de Par Iônico

Para cátions: ácido octanosulfônico

Para ânions: sais de tetrabutilamônio

Vantagens da Cromatografia de Par Iônico (IPC):

Adição de reagentes aumenta retenção;

Grau de aumento de retenção depende da hidrofobia

do reagente;

IPC tem maior eficiência do que troca iônica;

IPC pode alterar permanentemente a FE;


VI- Quiral

As fases quirais são materiais que quando

empregadas como FE ou introduzidos na fase

móvel, permitem a separação de isômeros

ópticos de misturas racêmicas ou dos

compostos racêmicos em matrizes de uso geral.

VII- Afinidade

Emprega interações específicas entre um tipo de

molécula do soluto e uma segunda molécula que

está ligada covalentemente (imobilizada) na FE.

HPLC - Fase Móvel

FASE MÓVEL (FM)

A escolha da fase móvel depende:

Tipo de coluna

Substâncias a serem separadas

Em geral:

Se a amostra for insolúvel em água ou não-polar use FN

Se a amostra for solúvel em água ou não-solúvel mas polar use FR

HPLC - Fase Móvel

FASE MÓVEL (FM)

Cuidados com os solventes

Eliminação de impurezas

água, solventes orgânicos

solução tampão

Uso de filtros no reservatório da FM

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HPLC - Fase Móvel

Desgaseificação da FM

Vácuo Ultra-som Corrente de hélio

HPLC - Fase Móvel

Principais características que a FM deve apresentar:

Ter alto grau de pureza ou ser facilmente purificável;

Dissolver a amostra sem decompor os componentes;

Não decompor ou dissolver a FE;

Ter baixa viscosidade;

Ser compatível com o detector utilizado;

Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente

para todos os componentes da amostra.

Deve-se levar em conta ainda:

Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, a partição, a

adsorção e portanto a separação;

Propriedades físicas que dificultem o manuseio das bombas,

detectores e das colunas;

Propriedades que afetam a segurança;

Custo.

HPLC - Fase Móvel

Seleção do solvente

Pode ser usado puro ou mistura de dois ou mais solventes.Geralmente a mistura de apenas dois solventes é suficiente.

Fatores que devem ser considerados:

Força do solvente (º): Uma medida relativa da polaridade dosolvente (habilidade de deslocar o soluto). Escala baseada emsílica ou alumina;

Índice de Polaridade (P’): um índice relativo usado para osmétodos que utilizam fase reversa.

HPLC - Fase Móvel

Parâmetros de alguns solventes utilizados em HPLC:

Solvente Parâmetro de Polaridade Viscosidade

Solubilidade ( ) ( P’) ( a 25 °C, cP)

Hexano 0,1 0,30

Triclorometano 4,1 0,57

Tolueno 8,9 2,3 0,55

Diclorometano 10,68 3,4 0,43

Etanol 4,3 1,08

THF 9,88 4,0 0,46

Acetonitrila 13,14 6,2 0,34

Metanol 15,85 6,6 0,54

Água 25,52 10,2 0,89

HPLC - Fase Móvel

FORÇA DE ELUIÇÃO

FASE NORMAL FASE REVERSA

Hexano Água

Tolueno Metanol

Acetona Acetonitrila

Acetonitrila Acetona

Metanol Tolueno

Água Hexano

Fraco

Forte

HPLC - Fase Móvel

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HPLC - Fase Móvel HPLC - Fase Móvel

HPLC - Fase Móvel

Preparing Buffered Mobile Phases for Reversed Phase HPLCWhen Should a Mobile Phase be Buffered?

In RP HPLC, the retention of analytes is related to their hydrophobicity. Themore hydrophobic the analyte, the longer it is retained. When an analyte isionized, it becomes less hydrophobic and, therefore, its retention decreases.Acids lose a proton and become ionized when pH increases and bases gain aproton and become ionized when pH decreases (See Figure).

As acids lose a proton and become

ionized (with increasing pH), their

retention decreases. As bases gain

a proton and become ionized (with

decreasing pH) their retention

decreases.

Therefore, when separating mixtures containing acids and/or bases by RPHPLC, it is necessary to control the pH of the mobile phase using anappropriate buffer in order to achieve reproducible results.

HPLC - Fase Móvel

The robustness of an HPLC method is often dependent on mobile phase pH

For the most robust methods, it is recommended that separations be developed at amobile phase pH where the retention of analytes are little affected by changes in pH.When separating bases, for example, acidic mobile phases usually show betterreproducibility than neutral mobile phases. As can be seen in the Figure,methylamphetamine is fully protonated at a pH less than 3 and its retention is notaffected by slight changes in mobile phase pH. However, at a pH of 7, closer to itspKa, a change in pH of only 0.2 units will shift retention by almost 9%.

A change in mobile phase pH from 7.0 to 7.2

will cause the retention of methylamphetamine

to increase from 13.6 minutes to 14.8, an

almost 9% increase. However, at a mobile

phase pH of 2.8, there is a negligible change in

retention with an increase of 0.2 pH units.

When developing a reversed phase method for

basic compounds, like methylamphetamine,

you can expect a more robust method when

using acidic mobile phases.

HPLC - Fase Móvel

Selecting the Right Buffer

Often reversed phase methods are developed using buffers that have little or no bufferingcapacity at the specified mobile phase pH. Methods that specify a phosphate buffer in the pHrange of 4 to 6, or an acetate buffer in the range of 6 to 7 are not uncommon. These buffers arenot just useless in these pH ranges, they complicate the preparation of mobile phaseunnecessarily and give the analyst a false sense of controlling the reproducibility.

Optimum buffering capacity occurs at a pH equal to the pKa of the buffer. In general, you canexpect most buffers to provide adequate buffering capacity for controlling mobile phase pHonly within 1 unit of their pKa.

Since it is becoming more common to find HPLC interfaced to MS, volatile buffers for LC-MSapplications are indicated.

Buffer Concentration

The concentration of the mobile phase buffer usually

has little effect on retention in reversed phase HPLC,

just as long as the buffer concentration is high

enough to control pH. A buffer concentration in the

range of 25 to 50 mmol L-1 is adequate for most

reversed phase applications.

HPLC - Fase Móvel

Influência do pH da FM na ordem de eluição em FR

C18, 150 x 4.6 mm, MeCN/water (20/80) with different mobile phase pH (10mM

phosphate buffer adjusted with HClO4).

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HPLC - Fase Estacionária

COLUNAS ANALÍTICAS (FE)

Permitem a separação de pequenas quantidades do

material a ser analisado;

São constituídas de um tubo de algum material inerte.

O aço inoxidável é o material mais freqüentemente

utilizado;

Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às

pressões em que será usada e a possíveis sobre-

pressões ocasionais;


Diâmetro interno (d.i.) entre 3 a 5 mm. As colunas com

microdiâmetros apresentam d.i. entre 0,05 e 2 mm;

Comprimento das colunas entre 10 e 50 cm, com

exceção da cromatografia por exclusão onde as vezes

utilizam-se colunas de comprimento maior ou várias

colunas conectadas em série;

São normalmente retas, pois apresentam uma perda na

eficiência quando são dobradas.

HPLC - Fase EstacionáriaHPLC - Fase Estacionária


Estrutura da sílica(5 µm) esférica eirregular

Superfície da

FE C-18Forno da coluna


Efeito multicanal (Difusão de Eddy)

Inicial FE Final

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Pré-coluna (coluna guarda)

São de 2-5 cm de comprimento com o mesmo d.i. da coluna eapresenta as mesmas características;

Tem como objetivo reter sólidos que podem entupir os filtros dacoluna e em muitos casos reter materiais que por reações químicaspodem precipitar sobre a FE;

É colocada entre o injetor e a coluna;

Tem o mesmo recheio da coluna ou similar da usada na coluna.


Fases Estacionárias

Suportes Exemplos Uso (%)

Sílica Alta área superficial, 75

Poros grandes

Polímero Polimetacrilatos; PS-DVB 20

Polietilenoglicol; Polidextrinas

Alumina Neutra, Ácida 2

Outros Carbono grafite, zircônia 3


Eficiência das colunas de HPLC

Tamanho da Diâmetro dos Área Eficiência

Partícula (µm) Poros (Å) Superficial (m2/g) (pratos/m)

3 120 170 100 000

5 120 170 60 000

7 300 100 40 000

Alargamento dos picos em

função da vazão da FM e do

diâmetro das partículas da FE


Diferentes d.i. das colunas e as respectivas vazões da FM

utilizadas nas diferentes escalas de trabalho da HPLC


Characteristics of Various LC Modes

LC mode Inner diameter Injection volume Flow rate

(mL/min)

Conventional 3–6 10 –50 L 0.5–2

Microbore 0.5–2 mm 0.5–2 L 10–300

Packed micro-capillary 0.2–0.5 mm 0.1 L 1–10

Drawned packed capillary 50 –200 mm 10 nL 0.1

Open tubular 5–25 mm 1 nL 0.1


Sistema para HPLC preparativa

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Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity for

Concentration-Limited Samples

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

200 ng Biphenyl

Column: Zorbax SB C18

0.3mm

0.5mm

1mm

4.6mm

Less peak dispersion


Escolha da fase estacionária mais adequada

Classe da Alcano, alceno, Éter, cetona, Álcool, Amina

Substância alcino, aromático tioéter, éster, amida, Ác. Carbox.

Polaridade Apolar Média Polar

Solubilidade Hexano, éter, THF, dioxano, cetona, água,

Tolueno, acetonitrila, acetato de metanol

diclorometano etila

Fase normal Fase reversa Fase reversa

Sílica gel C18, C8, C4, fenil C18, C8, fenil

FE (adequada) Alumina CN, NH2, Diol

Fase normal

sílica gel

HPLC - Bomba

Bombeamento da Fase Móvel

Devem operar a pressões de até 500 atm com a mesma

precisão e exatidão de operações a pressão quase

ambiente;

As vazões empregada vão de 0,005 até 5 mL/min;

Não devem ser corroídas pela fase móvel;

Reprodutibilidade e constância da vazão.

HPLC - Bomba

Tipos de Bombas

a. Pressão constante:

a.1. Bombas pneumáticas- o líquido é deslocado mediante

a pressão exercida por um gás inerte a alta pressão:

pode ser feita diretamente sobre o líquido ou sobre o

recipiente comprimível que o contém.

Vantagens: - pressão regulada pelo cilindro

- sistema barato

- não há pulsação

Desvantagens: - pressão limitada pelo cilindro

- dissolução de gás no solvente

- não se pode fazer gradiente

- não se pode reciclar

HPLC - Bomba

b. Fluxo constante:

b.1. Bombas tipo seringa- um êmbolo ou pistão é

movimentado de forma contínua e uniforme por um

motor de precisão comprimindo o líquido contido em

uma câmara de um certo volume.

Vantagens: - fluxo constante

- não há pulsação

Desvantagens: - reabastecimento lento

- o fluxo é parado durante o

reabastecimento

- não se pode fazer gradiente

Solução: pode-se utilizar colunas de microdiâmetro onde o

volume da fase móvel necessário é pequeno.

HPLC - Bomba

b.2. Bombas reciprocadoras ou de pistões- mediante o

movimento de pistões e através de sistemas de válvulas,

ocorre o bombeamento da FM.

- Utiliza-se uma bomba com dois pistões, de tal forma que

quando um succiona a FM o outro expulsa o líquido para

fora da bomba.

Vantagens: - fluxo constante

- pode-se fazer gradiente

- alimenta o sistema continuamente

Desvantagens: - pode ocorrer pulsação do fluxo

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HPLC - Bomba

Detalhes do funcionamento

de uma bomba de HPLC

Sistema gradiente com mistura

da FM a baixa pressão

Sistema gradiente com mistura

da FM a alta pressão

HPLC - Bomba

Exemplo de cromatogramas obtidos com separação

isocrática (inferior) e gradiente (superior)

Tempo (min)

HPLC - Sistema de Injeção

Sistema de introdução da amostra

Existem basicamente 3 tipos de injetores: seringa, válvula

e automáticos.

1. Injetores tipo seringa:

Vantagens: são baratos

Desvantagens: - aplica a amostra diretamente na coluna

- dificuldade de injetar volumes precisos

- deve-se vencer a pressão da bomba

2. Injetores tipo válvula:

Introdução da amostra é efetuada com um “loop” externo

Vantagens:

- injeta volumes precisos

- “loop” de diferentes tamanhos

(mais utilizados: 20 e 100 µL)



Injetor do tipo válvula Rheodyne

Posição de carregamento Posição Injeção


3. Injetores automáticos:

- São injetores de válvula controlados por microprocessador;

- Permite Injetar diferentes volumes das amostras que sãocolocadas em um carrossel, conforme programação prévia;

- A pressão da seringa é suficiente para a amostra passar a válvulade controle.

Vantagens: - todas as do injetor tipo válvula

- injeta amostras automaticamente

Desvantagens: - preço

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HPLC - Detectores

DETECTORES PARA HPLC

Tem a função de monitorar o efluente da coluna e

fornecer a medida detectada do soluto;

Funciona de acordo com diferentes princípios, mas

todos geram sinal elétrico que é proporcional a alguma

propriedade do analito;

A resposta do detector pode ser relacionada com a

quantidade de analito, portanto o detector deve ser

calibrado com cada espécie de interesse;

A escolha do detector é de acordo com as

características dos analitos.

HPLC - Detectores

DETECTOR SINAL CROMATOGRÁFICO

HPLC - Detectores

Características ideais de um detector:

Alta sensibilidade;

Boa estabilidade e reprodutibilidade;

Resposta linear;

Resposta rápida, independente da vazão;

Insensível a trocas de temperatura e pressão;

Alta confiabilidade e fácil uso;

Seletividade, precisão, exatidão;

Não destruir a amostra.

Sistemas de Detecção:

Qualquer propriedade química ou física que pode ser medida em

solução pode, em princípio, ser utilizada para a detecção.

Propriedades da solução: mede alguma mudança ocorrida na FM. Ex. Índice

de refração e eletroquímicos.

Propriedades do soluto: mede uma propriedade específica do soluto.

Ex. Espectrofotométrico UV-vis e DAD.

HPLC - Detectores

Principais detectores:

Espectrofotometria UV e Visível

- Detector por Arranjo de Diodos (DAD)

Fluorescência (FD)

Índice de Refração (RI)

Espalhamento de Luz (ELSD)

Espectrometria de Massas (MS)

Eletroquímicos: Constante dielétrica, Amperométrico,

Condutométrico, Polarográfico e Potenciométrico

HPLC - Detectores

Choosing a Detector

RI UV/VIS Fluoresc MS

Response Universal Selective Selective Selective

Sensitivity4

microgram 5

nanogram3

picogram1

picogram

Linear Range 10 10 10 10

Flow Sensitive Yes No No Yes

Temperature Sensitive

Yes No No No

HPLC - Detectores

1. Detector Espectrofotométrico (UV e Visível)

É o detector mais popular em HPLC;

Mede as variações na absorção da luz na regiãode 190 a 370 nm (UV) e de 370 a 700 nm (Visível).

1.1. Tipos:

Comprimento de onda fixo (ex. 254 nm);

Comprimento de onda variável;

Detector de Arranjo de Diodos (DAD).

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HPLC - Detectores

1.2. Aplicações:

- Compostos que absorvem no UV-Vis

1.3. Vantagens:

- Alta sensibilidade;

- Não é destrutívo.

- Permite trabalhar com gradiente;

- Responde a larga faixa de concentração;

- Relativamente insensível a variação de T e vazão da FM;

1.4. Desvantagens:

- Detecta somente substâncias que absorvem no UV-Vis

HPLC - Detectores

Esquema de um Detector Espectrofotométrico

com variável

HPLC - Detectores HPLC - Detectores

HPLC - Detectores

UV and MS (SIM) chromatograms of nicotine and its metabolites. Mobile phase: 85% CH3CN/

9% H2O/ 6% 50 mM pH 2.7 Ammonium formate buffer; Flow rate: 0.5 mL/min; Injection volumen: 5 μL;

Nicotine: 10 ng/μL, SIM=163 m/z; Cotinine: 9.8 ng/μL, SIM =177 m/z; HOC: 6.7 ng/μL, SIM=193 m/z;

Cone voltage: 70V, Dwell time: 0.5 second, Probe temperature: 500 C; Needle voltage: 4 kV.

HPLC - Detectores

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Esquema do Detector de Arranjo de Diodos (DAD)

HPLC - Detectores

HPLC - Detectores

Take peak spectrum

Compare

Chlortoluron ?

250 300

W a v e l e n g t h (nm)

250 300

W a v e l e n g t h (nm)

UV-Vis Spectra Acquired with Diode Array Detector (DAD)

Cromatograma de isoflavonas (100 μg mL-1) com os respectivos espectros obtidos por DAD. Coluna: Nova

Pak C-18 (150 x 3,9 mm), 4 μm; Fase móvel: água + 0,1% ácido acético glacial, pH 3,5 (A); acetonitrila + 0,1 %

ácido acético glacial (B). Vazão: 1,0 mL min-1. Gradiente: 21% de B por 8 min; 21% até 27% B em 4 min; 27%

de B por 3 min; 27% até 31% B em 5 min; 31% para 40% B em 3 min; 40% até 50% B em 2 min; 50% de B por 5

min; 50% até 21% B em 5 min; 21% B por 3 min. Volume de injeção: 10 μL. Detecção: UV-vis com varredura

espectral de 200 a 400 nm, monitorado em 254 nm. Temperatura da coluna: 35 ºC. (Tese Marcelo Ribani, 2008)

Isoflavonas

por

HPLC-DAD

HPLC - Detectores

UV chromatogram at 270 nm of three sulfa drugs and a plot of UV Spectra

collected from each peak's Apex, Inflection and two offset points, to demonstrate

comparison of spectra collected at various points across the peak.

HPLC - Detectores

Quantificação de HPAs

por HPLC-DAD

2. Detector de Fluorescência

Baseia-se na medida da luz emitida pelas substânciaspreviamente irradiadas com luz UV.

2.1. Aplicação: Na detecção de compostos fluorescentes,(vitaminas (ex. riboflavina), micotoxinas, HPAs, etc) ecompostos derivatizados (ex. aminas).

2.2. Vantagens:

- Muito sensível

- Não é destrutivo

- Permite gradiente

2.3. Desvantagens:

- Poucas substâncias são

naturalmente fluorescentes

HPLC - Detectores

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2. Detector de Fluorescência

HPLC-FluorescênciaAminoácidos em plasma

HPLC-FD após derivatization pré-coluna com o-phthaldialdehyde (OPA)Coluna: Ultrasphere ODS; Gradiente (THF:metanol: acetato de sódio 0,05 M (pH 5,9) 1:19:80 até metanol:

acetato de sódio 0,05 M (pH 5,9) 4:1); Vazão: 1 mL/min; volume de injeção: 20 µL;

λ Excitação 330 nm — λ Emissão 450 nm

Preparo de amostra (plasma):• Desproteinização com ácido tricloroacético 10% e centrifugação;

• Adição de 100 µL de solução OPA e 300 µL de borato de sódio;

• Adição de padrão interno;

• Após 1 min injetar 20 µL

HPLC - Detectores

One of the most used derivatizating agents

is DnsCl which reacts with either primary

and secondary amino groups,

and even tertiary amines in extreme

reaction conditions, providing very stable

derivatives and combining the unique

feature of being both fluorescence and

detectable in the UV region.

Mechanism of the derivatization

reaction: Derivatization reaction of BAs with

dansyl-chloride

3. Detector de Índice de Refração

Baseia-se na medida da diferença do índice de refração daFM na presença das substâncias. Para aplicações gerais.

3.1. Detecta: Quantidade

3.2. Vantagens:

- Praticamente todas as substâncias são detectáveis

- Não é destrutivo

3.3. Desvantagens:

- Sensibilidade menor que UV

- Sensível a diferenças de T, vazão e pressão da FM

- Não permite fazer gradiente

HPLC - Detectores

3. Detector de Índice de Refração

Esquema de dois detectores de índice de refração

HPLC - Detectores

4. Espalhamento de Luz (Evaporative Light-Scattering Detector - ELSD)

As partículas de uma amostra passam através da cela onde são aquecidas comum feixe de luz incidente e a quantidade de luz espalhada é medida com umafotomultiplicadora. Em alguns equipamentos um gás é usado para concentrar aspartículas na câmara de detecção.

Representação do detector

de espalhamento de luz

destacando as etapas da

detecção

Aplicação principal:

análise de lipídeos

HPLC - Detectores

17

HPLC - Detectores

5. Detector de Massas (LC-MS e LC-MS/MS)

Fornece o registro da separação cromatográfica einformações a respeito da identidade dos analitos.

Os analitos, após separação, são fragmentados no detector permitindo a identificação e quantificação.

5.1. Vantagens:

- Fornece massa molecular dos analitos

- Identifica os fragmentos

5.2. Desvantagens:

- Requer operador experiente

- São caros

HPLC - Detectores

++

Heated nitrogen drying

gas

Dielectric capillary

entrance

Nebulizer (gas

shown in red)

Solvent spray

Electrospray Ions

-4000 V

Evaporation Rayleigh

Limit

Coulomb

Explosion

Evaporation Analyte Ion

API - Electrospray Ionization

100http://www.noble.org/PlantBio/MS/ion_tech_main.html

Electrospray Ionization (ESI)

(Eletronebulização)

Componentes principais de um sistema LC-MS

Ion Optics Detector

Spray Chamber

VL Model

SL Model has one Skimmer

Mass Filter

LC-MS/MS

Compound Mass

1. morphine 286 > 152

2. oxymorphone 302 > 227

3. hydromorphone 286 > 185

4. codeine 300 > 152

5. 6-MAM 328 > 211

6. oxycodone 316 > 240

7. hydrocodone 300 > 199

Total Ion Chromatogram

Multiple reaction monitoring (MRM)

18

LC-MS/MSCarbamate analysis by LC/MS

Column: Ultra Carbamate, 100 x 4.6 mm, 3 µm

Conc.: 100 µg/L each

Mobile Phase: A: 90:10 water:methanol + 10 mM ammonium formate

B: 10:90 acetonitrile:methanol + 10 mM ammonium formate

Gradient: 90:10 A:B to 10:90 A:B from 0-15 min; Flow-rate: 0.25 mL/min

Mode: ESI+

HPLC - Detectores

6. Detectores Eletroquímicos:

6.1. Detector da Constante Dielétrica: Mede as mudanças

na polaridade da FM que passa através da cela.

6.2. Detector Amperométrico: Um potencial

conhecido é aplicado através de um

eletrodo (ex. carbono vítreo), e a

ocorrência de redução ou oxidação de

uma espécie pode ser medida. O

potencial do eletrodo de trabalho e

auxiliar é mantido constante.Geralmente, o trabalho é limitado a uma

classe específica em cada análise.

HPLC - Detectores

6.3. Detector de Condutividade:

Adequado para a detecção de íons em solução;

Baseia-se na medida da condutância (G) das soluções

eletrolíticas dos efluentes da coluna ou supressora. [G = 1/R]

Microcélula termostatizada e sob aplicação de um potencial (V).

A Lei de Ohm [I = (V-Ed)/R] é obedecida e a corrente medida (I)

dependerá do potencial aplicado entre os dois eletrodos.

HPLC - Detectores

HPLC - Quantificação

Resposta do

Detector

HPLC - Quantificação

Obtenção da

curva analítica

Verificação da

Linearidade

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