Relatorio de HPLC
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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DE LISBOA
Doseamento da cafeína em
bebidas, por CromatografiaLíquida de Alta Eficiência(HPLC)
Bioquímica Experimental I
Docente: Carlos Cordeiro
26/11/2013
Trabalho realizado por:
-Ana Isabel Gouveia nº 44356
-Ana Rita Janela nº 43232
-Maria Beatriz Sousa nº 43193
-Patricia Sequeira nº 43242
-Violeta Railean nº 43219
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ÍndiceResumo .......................................................................................................................................... 3
Reagentes e materiais ................................................................................................................... 4
Tratamento de resultados ............................................................................................................. 5
Conclusão .................................................................................................................................... 11
Bibliografia .................................................................................................................................. 12
Anexos ......................................................................................................................................... 13
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Resumo
Com esta actividade experimental pretendia-se determinar o teor em cafeína de diversas
bebidas, neste caso foram a Coca-Cola e Pepsi por cromatografia líquida de alta
eficiência, HPLC.
Para determinar a quantidade de cafeína, aplicou-se o método do padrão externo às
amostras, que consiste na injecção de várias soluções padrão. A análise qualitativa
consistiu na avaliação e comparação dos tempos de retenção(tr ) dos vários picos obtidos
com os dos padrões de cafeína preparados anteriormente. O cálculo das concentrações foi
efectuado por interpolação da curva de calibração resultante da representação da área
obtida por cada pico de cafeína dos padrões em função das respectivas concentrações,
tendo-se obtido uma concentração de 0,073 mg/cm3 de cafeína na Coca-Cola e 0,0854
mg/cm3 de cafeína na Pepsi.
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Reagentes e materiais
Materiais e equipamentos:
Sistema de HPLC com bomba binária, injector com loop interno (20µdm3), coluna
de fase reversa, detector (UV/vis) e registador/integrador
Seringa Hamilton (100 µdm3)
Balões volumétricos (25, 50 e 500 cm3)
Pipetas graduadas (5 e 10 cm3)
Gobelets (50 e 500 cm3)
Balança analítica
Reagentes:
Padrão de cafeína
Eluente: Metanol para HPLC/água Milipore na porporção 30% / 70% (v/v)
Ácido Clorídrico (6 mol dm-3)
Amostras de bebidas (Coca-Cola e Pepsi)
Alterações ao Protocolo:
Uma vez que foram utilizados volumes fixos e o método utilizado apresenta uma altareprodutibilidade, não foram feitas medições duplicadas das amostras.
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Tratamento de resultados
A cromatografia líquida de elevada eficiência, HPLC, é a técnica cromatográfica mais
usada e versátil. Neste tipo de cromatografia a fase móvel é um solvente líquido que
contém a amostra a analisar e a fase estacionária contém partículas muito finas e dedimensões muito reduzidas. Para que as separações sejam eficientes é necessário que as
partículas sejam muito pequenas e regulares, uma fase móvel com bombas de alta pressão
para que o fluxo ao longo da coluna seja constante e ainda um sistema de detecção
eficiente.
A eluição de uma coluna cromatográfica pode ser realizada com um único sistema de
eluente, ou seja, a composição do solvente mantém-se constante e, neste caso aplica-se o
método da eluição isocrática. Alternativamente, para uma eluição onde há a alteração da
composição do eluente, esta é dita de eluição em gradiente.
Análise qualitativa das amostras
A análise qualitativa de amostras em HPLC é feita através dos tempos de retenção,
uma vez que o tempo de retenção (tR ) é único para cada substância.
Esta análise pode ser feita por duas vias: utilização dos tempos de retenção
ajustados, em que se ajusta o tempo de retenção da substância e do padrão correspondente
e, de seguida, comparam-se os dois valores; Co-cromatografia: adição de um composto
que su postamente está presente na amostra (“ spiking ”), em que se cromatograma
sucessivamente uma amostra sem adição e uma amostra com adição de quantidade
conhecida do composto que se supõe estar presente e, seguidamente, procede-se à
comparação dos dois cromatogramas.
Neste trabalho laboratorial, a análise é feita através dos tempos de retenção.
Através dos tempos de retenção das várias soluções padrão de cafeína, utiliza-se o valor
médio de tR e comparam-se os tR das várias substâncias presentes nas amostras de coca-
cola e pepsi com o valor médio do padrão.
O ajuste dos tempos de retenção não é efectuado, uma vez que não se observa o
pico de eluição nos cromatogramas, cujo tempo de retenção é necessário ao ajuste.
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As soluções padrão de cafeína foram preparadas por diluição de uma solução de
cafeína já preparada. Assim, a amostra padrão 1 é a mais diluída e a padrão 5 menos
diluída.
Amostra Tempo de retenção (tR )Padrão 1 4.904
Padrão 2 4.838
Padrão 3 4.783
Padrão 4 4.745
Padrão 5 4.725
Tabela 1. Tempos de retenção para as várias amostras padrão de cafeína.
Assim, o tempo de retenção médio do padrão de cafeína é:
tR (médio) =.+.+.+.+.
= 4.799
Foram analisadas, seguidamente, duas amostras: coca-cola e pepsi, cujos
cromatogramas obtidos foram os seguintes, dados em intensidade por tempo, em minutos:
Amostra de coca-cola
Ilustração 1. Cromatograma obtido para amostra de coca-cola, por HPLC.
Os tempos de retenção das diferentes substâncias presentes na amostra para este
cromatograma são, por ordem sequencial dos picos:
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Pico Tempo de retenção (tR )
1 2.423
2 2.652
3 3.107
4 3.384
5 3.587
6 3.717
7 4.770
Tabela 2. Tempos de retenção dos picos observados no cromatograma da amostra de coca-cola.
Por comparação com o valor de tR médio do padrão de cafeína (4.799), conclui-se que o
pico correspondente à cafeína, na amostra de coca-cola, é o pico 7, pois apresenta umtempo de retenção semelhante (4.770).
Amostra de pepsi
Ilustração 2. Cromatograma obtido para amostra de pepsi, por HPLC.
Os tempos de retenção das diferentes substâncias presentes na amostra para este
cromatograma são, por ordem sequencial dos picos:
Pico Tempo de retenção (tR )
1 2.426
2 2.696
3 3.105
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4 3.708
5 4.298
6 4.755
Tabela 3. Tempo de retenção para os picos observados no cromatograma da amostra de pepsi.
Por comparação com o valor de tR médio do padrão de cafeína (4.799), conclui-se que o
pico correspondente à cafeína, na amostra de pepsi, é o pico 6, pois apresenta um tempo
de retenção semelhante (4.755).
A resolução dos cromatogramas não foi perfeita uma vez que os valores de tR das amostras
padrão de cafeína divergiram todos e os valores de tR das amostras de pepsi e coca-cola
também divergiram em relação ao padrão. Isso significa que as condições experimentaisde realização da cromatografia foi diferente, pois não houve reprodutibilidade nos tR..
Obteve-se, portanto, uma maior resolução na amostra de pepsi, uma vez que os valores
de tR foram mais precisos do que na amostra de coca-cola.
Contudo, foi possível observar que ambas as amostras possuíam cafeína, por análise
qualitativa dos seus cromatogramas em relação aos de uma amostra padrão de cafeína.
Análise Quantitativa das Amostras:
Para uma análise quantitativa numa cromatografia pode-se recorrer a dois métodos: o
método do padrão interno ou o método do padrão externo. Nesta actividade experimental
recorreu-se ao método do padrão externo que nos permite estabelecer uma recta de
calibração com o composto padrão (cafeína) através da injecção de diferentes quantidades
de padrão na coluna. Assim define-se a relação entre a área/altura do pico e a quantidade
de composto padrão injectado. Não se realizaram as amostras em duplicado porque como
se estavam a usar volumes fixos, devido à técnica do loop ,o processo apresenta uma alta
reprodutibilidade.
Para tal é necessário calcular-se a concentração de cafeína em cada uma das 5 amostras
padrão preparadas.
Os cálculos vão ser exemplificados para o padrão 1, no entanto o mesmo raciocínio foi
aplicado para os restantes padrões:
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Sabe-se que a amostra inicial de cafeína continha 15mg e fora diluída para um balão
volumétrico de 25 cm3. Assim a concentração inicial de cafeína era:
[cafeína] =m
Vsolução
⇔ [cafeína] =15 mg
25 cm
= 0,6 mg/cm
Desta solução inicial, cuja concentração de cafeína era 0,6mg/cm3, retirou-se 1 cm3 para
um balão de 25 cm3 para preparar o padrão 1. Portanto a massa de cafeína retirada para o
padrão 1 da solução inicial era 0,6 mg.
[cafeína] =m
Vrtirdo
⇔ m = [cafeína] × Vrtirdo = 0,6 × 1 = 0,6 mg
Como essa massa de cafeína foi transferida para um balão volumétrico de 25 cm3
, aconcentração no padrão 1 era de 0,024g/cm3.
[cafeína]pdrão =m
Vpdrão
⇔ [cafeína]pdrão =0,6
25 = 0,024 mg/cm
Procedeu-se da mesma forma para os restantes padrões e obteve-se a Tabela 4:
Padrão Massa de
cafeína(mg)
Volume da
solução(cm3)
[Cafeína]
(mg/cm3)
Área do pico
(cm3)
1 0,6
25
0,024 1864029
2 1,2 0,048 4292674
3 1,8 0,072 6822136
4 2,4 0,096 7985578
5 3 0,120 9360273
Tabela 4 Concentração da cafeína nas várias soluções padrão preparadas
Deste modo construi-se a recta de calibração que relaciona a área dos picos do padrões
preparados com a sua concentração em cafeína:
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Gráfico 1- Gráfico que relaciona a concentração de cafeína em função da área do pico dos diferentes padrões
Assim, pode calcular-se a concentração a concentração em cafeína de cada uma das
amostras, procedendo do seguinte modo (exemplificado para a Coca-cola):
y = 80000000 45932 ⇔ 1920963 = 8000000 45932
⇔ =1920963 − 45932
80000000 ⇔ = 0,0234 mg/cm
Este valor corresponde à concentração de cafeína na solução de 25 cm 3, na qualse colocaram 8 cm3 de coca-cola. Desta forma, para obter a concentração original de
cafeína na coca-cola, faz-se o seguinte cálculo:
[cafeína]solução =mí
Vsolução
⇔ mí = 0,0234 × 25 = 0,585 mg
[cafeína]oriil =mí
Vrtirdo
⇔ [cafeína]oriil =0,585
8 = 0,073 mg/cm
Concentração de cafeína na coca-cola: 0,073 mg/cm3
Concentração de cafeína na Pepsi: 0,0854 mg/cm3
y = 8E+07x + 459320
R² = 0,9723
1500000
2500000
3500000
4500000
5500000
65000007500000
8500000
9500000
10500000
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
Á r e a d o p i c o e m
c m 3
Concentração de cafeína em mg/cm3
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Conclusão
Como já foi dito, com este trabalho experimental pretendia-se realizar o doseamento da
Cafeína em bebidas comerciais, que neste foram a Coca-Cola e a Pepsi, aplicando a
técnica cromatográfica HPLC( Cromatografia Líquida de Alta Eficiência).´
Para a realização de uma análise quantitativa aplicou-se o método do padrão externo,
preparando-se várias amostras padrão que continham a substância a analisar (cafeína)
diluída no eluente. Para a análise qualitativa fez-se uma comparação dos tempos de
retenção, tr , dos vários picos obtidos e das suas áreas com os valores obtidos dos padrões.
Assim, foi possível identificar se as bebidas analisadas continham ou não cafeína e se
tinham então em que quantidade.
Concluiu-se que ambas as amostras continham cafeína e, após identificar, através de uma
análise qualitativa, a que picos do cromatograma de cada amostra, correspondia a eluição
desta substância, foi possível recorrer a uma análise quantitativa para saber a
concentração de cafeína em cada amostra.
A Coca-Cola continha 0,073 mg/cm3 de cafeína, enquanto a Pepsi continha 0,0854
mg/cm3.
Verificou-se, então, que a Pepsi apresenta uma concentração superior de cafeína do quea Coca-Cola.
Assim, pode-se concluir que a actividade correu como esperado e, portanto, foi um
sucesso.
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Bibliografia
David. L. Nelson, Michael. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry , 5ª ed.,
W. H. Freeman, 2009.
Skoog, D. A., West, D.M., Holler, F.J. e Crouch, S.R., Fundamentals of Analytical
Chemistry, 7ª ed., Thomson-Brooks/Cole, Belmont, 2004
Holme, D.J. e Peck, H., Analytical Biochemistry, 3ª ed., Longman, London,1998
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AnexosCromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,024 mg/cm3)
Cromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,048 mg/cm3)
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Cromatograma obtido para o padrão de cafeína (0,120 mg/cm3)
Cromatrogama obtido para a Amostra de Coca-Cola
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Cromatograma obtido para a Amostra de Pepsi