Material Hplc 1
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA – CLAE (HPLC)
ELAINE LOPES JULHO/2012
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INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
Vem do grego “CHROMA”,
que significa “COR”
Vem do grego “GRAPHE”,
que significa “ESCREVER”
Métodos cromatográficos, de uma forma geral, permitem a separação, quantificação e
identificação de espécies químicas, ENTRETANTO a Cromatografia Líquida é uma
técnica de separação de grande resolução, mas não identifica com precisão o
composto.
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INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Entre as vantagens desta técnica Diversidade de suas aplicações;
Desvantagens custo dos equipamentos, tempo para formação de um técnico ;
Uma expressão usada é que “os tempos de retenção são característicos, porém não
são exclusivos”.
Emprega-se outras técnicas espectrometria de massas, espectrometria de
infravermelho ou ressonância magnética;
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INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Princípio da Técnica
Separação pela distribuição destes
componentes em duas fases que se
encontram em contato;
Durante a passagem da fase móvel pela
estacionária, os componentes da
mistura são seletivamente retido pela
fase estacionária;
A retenção seletiva pode operar por
mecanismos entrópicos e entálpicos.
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Cromatografia Líquida Clássica colunas de vidro;
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Perfomance Liquid
Chromatography (HPLC) auxílio de uma bomba de alta pressão;
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Tipos
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Adsorção-Cromatografia Líquido-sólido Competição pelos sítios ativos da fase
estacionária;
Partição-Cromatografia líquido-líquido Baseada nas diferenças de solubilidade dos
componentes;
Troca iônica Diferentes tendências dos componentes iônicos da amostra a permutar
com os íons da fase estacionária;
Exclusão Os componentes são separados conforme o tamanho efetivo das
moléculas.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Classificação pelos mecanismos de separação
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Cromatografia em Fase Normal
Fase Móvel APOLAR
Fase Estacionária POLAR
Exemplo uso de sílica gel com hexano ou diclorometano.
Cromatografia em Fase Reversa
Fase Móvel POLAR
Fase Estacionária APOLAR
Exemplo: uso de sílica gel modificada (C18) com metanol/água.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
Fase Móvel Fase Estacionária
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K’a = Tra-to
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
Fator de Capacidade (K’) de “A” Velocidade
com que um dado composto migra ao longo da
coluna.
Tempo morto(to) Amostra não retida na coluna;
Tempo de retenção da fase móvel.
Resolução Medida quantitativa da separação
de dois picos consecutivos. OBS: Quando R = 1,5
separação é completa; Quando R = 1,0 os
picos estão somente 90% resolvidos.
Tempo de Retenção de “A” (Tra) Amostra introduzida no sistema até o ponto máximo do
pico da amostra.
Tra = tr-to
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Figura: Resolução entre dois picos.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
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Eficiência da coluna Número de pratos teóricos (N);
Quanto maior o valor de N MAIOR a eficiência da coluna;
Exemplos de Eficiências de Colunas:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
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HPLC Fármacos
Cosméticos
Polímeros
Corantes
Aminoácidos, etc.
Alimentos
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Aplicabilidade
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SISTEMA CROMATOGRÁFICO Esquema Básico do Aparelho
O sistema cromatográfico é composto de:
Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel (Solvente ou Solventes)
Sistema de Introdução da Amostra
Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase Estacionária)
Sistema de Detecção
Sistema de Registro e Tratamento dos Dados
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Pressão máxima de operação, fluxo, reprodutibilidade e constância do fluxo;
Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado;
Deve apresentar resistência a líquidos corrosivos, a facilidade de troca de fase
móvel e a limpeza do sistema;
É importante o estudo do manual da bomba;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Bombas cromatográficas – Aspectos Importantes
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Precisão das medidas Reprodutibilidade com a qual as amostras podem ser
introduzidas na coluna.
Injeção Manual pouca repetibilidade;
Injeção Automática maior repetibilidade;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Introdução da Amostra (Injeção) – Aspectos Importantes
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Podem ser universal ou seletivo;
Os detectores seletivos são compatíveis com eluição em gradiente e são usados
quando se quer minimizar interferentes;
Sensibilidade a razão entre o sinal gerado e a quantidade de amostra que
produziu o sinal;
Ruído é a variação do sinal que não é atribuído à amostra;
Linearidade deve-se guardar uma relação linear com a concentração da amostra;
Estabilidade o detector deve ser indiferente as variações de temperatura e fluxo.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Aspectos Importantes
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Ultra Violeta
Seletivo Detecta a quantidade de luz UV absorvida;
Proporcional a concentração da amostra;
É relativamente insensível as mudanças de fluxo e de temperatura
Índice de Refração
Universal Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado;
Menor sensibilidade do que detectores de UV;
Não há destruição da amostra;
Muito sensível a mudança de temperatura e pressão.
Fluorescência
Mais sensível Compostos que fluorescem;
Massas
Combina sensibilidade, versatilidade e universalidade – alto custo
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Tipos
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CROMATOGRAMA
17
Identificação dos picos
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Em todo sistema cromatográfico a coluna é o “ coração” do sistema;
Segmento de tubo de aço inoxidável;
Diâmetro uniforme;
Capaz de resistir a altas pressões;
Paredes internas finamente polidas;
O aço inoxidável é o material mais usado.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
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A capacidade da coluna Comprimento, diâmetro e material de empacotamento.
Diâmetro interno de cerca de 0,45 micra para separações analíticas e na faixa de 2,2 micra para
preparativas;
O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno
de 25-30 cm.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
O tamanho e a configuração das partículas
variam segundo a aplicação cromatográfica.
Estas partículas geralmente são de sílica ou
alumina e podem ser recobertas com outras
substâncias.
As partículas devem ter a menor variação de
diâmetro possível.
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Quanto maior o tamanho da partícula porosa mais lento o processo de difusão;
Em consequência, mais lenta a transferência de massa entre a fase estacionária e a
fase móvel.
Conforme diminui o tamanho da partícula a profundidade dos poros diminui,
permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
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Fase Normal
Fase estacionária polar Sílica, alumina, grupo amino(-NH2), grupo nitrilo (-CN);
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico);
O componente menos polar é eluído primeiro;
O componente mais polar é eluido depois;
Fase Reversa
Fase estacionária não polar–grupos octil (C8H17), octadecil (-C18H37);
Fase móvel relativamente polar (água, metanol,acetonitrila).
O componente mais polar é eluído primeiro;
O componente menos polar é eluido depois;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Fase Normal x Fase Reversa
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SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
Sílica gel
Figura: Estrutura da sílica gel mostrando um possível poro da partícula
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SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
Sílica gel
Figura: Diferentes formas de ligação entre moléculas de água e os grupos silanóis da superfície
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Registrar ou manipular os dados obtidos
Registrador;
Computador
Vantagens do Computador
Aumentar a versatilidade, exatidão e precisão;
Processar os dados;
E também controlar parâmetros de análise.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados
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SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados
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Os solventes devem possuir:
Alto poder de solubilização das amostras;
Baixa reatividade;
Compatibilidade com o detector utilizado;
Baixa viscosidade;
Altíssimo grau de pureza (Grau HPLC);
Exemplos de solventes
FASE MÓVEL Características dos Solventes
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Verdadeiro motor das separações cromatográficas;
Deve ser livre de impurezas;
Recomenda-se sua filtração e sua desgaseificação antes do uso;
Armazenamento em garrafas de vidro;
FASE MÓVEL Importância e recomendações para uma separação cromatográfica
A água é um solvente
comum na CLAE.
Entretanto, esta deve
ser purificada. Sua
armazenagem em
tambores plásticos não
é recomendada.
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Isocrática quando se mantém a composição da fase móvel constante;
Programação de gradiente quando altera-se a composição da fase móvel
durante a execução da análise.
FASE MÓVEL Tipos de Eluição
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Antes de desenvolver um método, é preciso definir alguns parâmetros:
Qual coluna?
Qual fase móvel?
Qual detector?
PARÂMETROS DE ANÁLISE O que usar??
![Page 30: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/30.jpg)
A regra básica é:
Fase Estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma Fase Móvel de
polaridade diferente;
Se o analito apresentar na sua estrutura parte polar e apolar Usar coluna de fase
reversa;
Começar a eluição com uma fase móvel com alto poder de eluição:
Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;
Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;
Obs: Nestas condições todos os componentes devem eluir no volume morto.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??
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PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??
Início da eluição:
Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;
Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;
Para aumentar a retenção, adicionar:
Fase Normal – Hexano ou Heptano;
Fase Reversa – Aumentar a porcentagem de solvente mais fraco (H2O)
![Page 32: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/32.jpg)
Baixar o fluxo;
Trocar a coluna;
Reduzir a concentração da amostra e/ou volume da amostra.
Obs: A amostra deve ser filtrada e solúvel na FM.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Como melhorar a eficiência da separação??
![Page 33: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/33.jpg)
Fazer uma limpeza prévia na amostra usando um cartucho de extração de sílica ou
fase reversa;
O uso de uma pré-coluna também é recomendado;
Sempre correr um branco antes de começar a analisar a amostra;
A escolha do detector deve ser feita considerando se a amostra contém grupos
cromóforos;
PARÂMETROS DE ANÁLISE Ajustes necessários
![Page 34: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/34.jpg)
Vantagens: Análises mais rápidas;
Melhora na separação;
Maior simetria dos picos.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Análise com gradiente de eluição – Quando usar??
![Page 35: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/35.jpg)
Mistura contendo 5 componentes;
FM: Hexano;
Eluição: Isocrática (tempo de análise longo);
Picos largos no final do cromatograma;
E o 5º componente não saiu.
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 1
![Page 36: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/36.jpg)
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 2
Mesma mistura contendo os 5 componentes do exemplo anterior;
FM mais forte: Diclorometano;
Eluição: Isocrática;
O 5º componente foi eluído; Tempo de análise reduzido;
Perda de resolução entre os picos 1 e 2, 3 e 4
![Page 37: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/37.jpg)
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 3
Mesma mistura contendo os 5 componentes dos exemplos anteriores;
Empregou-se um gradiente de eluição resolução dos picos foi resolvida;
FM: 100% de Hexano até a eluição do 2º pico; A partir daí, adição de DCM a uma taxa
de 2%/min;
Composição final da FM é 100% DCM.
![Page 38: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/38.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Amostras:
Obter sempre o MÁXIMO de informações sobre a amostra;
Sempre filtrar!
Testar a solubilidade com a fase móvel;
Sempre que possível, usar a FM para dissolver a amostra
![Page 39: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/39.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Fase Móvel:
Usar SEMPRE solventes grau HPLC;
Filtrar a FM;
Usar filtro no reservatório da FM;
Evitar o uso de solventes alcalinos em colunas à
base de sílica;
FM com pH < 2 pode provocar o rompimento da
ligação Si-C
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CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Para desenvolvimento, usar solvente de um mesmo fabricante até o final da pesquisa;
Causa: altera o Tr, pode parecer uma “dobra” de pico, interferência no sinal, etc.
![Page 41: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/41.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Utilização de um solvente do fabricante B necessita de uma etapa de
purificação Remoção de contaminantes coluna de alumina
![Page 42: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/42.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Colunas:
Deixar a coluna equilibrar com a FM;
Nunca deixar a coluna exposta a fontes instáveis de radiação térmica;
Evitar queda da coluna;
Controlar a pressão do sistema.
![Page 43: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/43.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Não deixar que o leito da coluna seque;
Antes de usar uma coluna nova, avaliar sua eficiência;
Guardar a coluna no solvente adequado;
Nunca guardar uma coluna com soluções-tampão ou solventes halogenados;
Fechar as conexões da coluna.
![Page 44: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/44.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Mudanças em parâmetros T e P durante uma análise influenciam a resposta do
detector ;
Impurezas produzem a diminuição da resposta do detector e interferência;
Limpeza da célula do detector:
Passar solvente pelo sistema sem coluna;
Pode-se usar HNO3 6 N, MeOH, ACN, clorofórmio e hexano
Pisos achatados soluções concentradas resposta do detector não linear
![Page 45: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/45.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Bombas:
Mudanças bruscas de pressão do sistema pode ser consequência de
vazamento, bolhas, etc.;
Verificar miscibilidade dos solventes; Exemplo: Uma FM com água mudando
para hexano;
Fase móvel deve ser filtrada.
![Page 46: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/46.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa perda de resolução?
Componentes fortemente retidos na coluna;
Coluna fisicamente danificada;
Perda de eficiência da coluna;
Coluna com sobrecarga de amostra.
![Page 47: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/47.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa diminuição do Tr?
Perda de sítios ativos da coluna;
A coluna pode ter sido má regenerada;
Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna. na coluna
O que causa aumento do Tr?
Fluxo baixo;
Solvente com baixo poder de eluição. na coluna
![Page 48: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/48.jpg)
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa alargamento na forma do pico?
Força iônica da FM pode estar muito baixa;
Adsorção da amostra;
Perda de fase ligada – baixa eficiência;
Sobrecarga de amostra.
![Page 49: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/49.jpg)
GRADIENTE ADEQUADO Resolução
Inadequado Solvente forte em todo cromatograma
Inadequado no início Solvente A é muito forte e
causa uma eluição rápida
Inadequado no final A troca do solvente A por B não
foi suficientemente forte e causa uma eluição rápida
![Page 50: Material Hplc 1](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022061616/55721038497959fc0b8cd460/html5/thumbnails/50.jpg)
GRADIENTE ADEQUADO Resolução
O que fazer para aumentar a resolução?
Diminuir a força do solvente;
Se for FN diminuir a polaridade;
Se for FR aumentar a polaridade;
Diminuir as condições iniciais;
Aumentar o tempo do gradiente;
Dobrar o fluxo.
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