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RMN no Desenvolvimento
de fármacos
José Daniel Figueroa-Villar
Grupo de Química Medicinal
Departamento de Química
Instituto Militar de Engenharia
Rio de Janeiro, Brasil
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Definição da Doença Definição de alvos
Estrutura e função do alvo
Mecanismo de ação Planejamento de Inibidores (in cerebro)
Modelos virtuais Bibliotecas
QSAR
“Screening” in silico
Projeto de novo
Potenciais antagonistas Testes de ligação
Síntese
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Aplicações Comuns da RMN
em Química Medicinal
• Determinação da estrutura e dinâmica do receptor
(proteínas, DNA)
• Determinação da estrutura, dinâmica e
conformação dos ligantes (agonistas e
antagonistas)
• Estudos da interação ligante-receptor e ligante-
ligante
• Avaliação e seleção de ligantes de media e baixa
afinidade
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Vantagens da RMN em Química
Medicinal
•É uma técnica universal para a detecção de
interações inter-moleculares. •Grande sensibilidade para interações fracas (afinidade da ordem
milimolar) que é importante para o seleção de fragmentos
moleculares para o planejamento de fármacos.
•Não é necessário o conhecimento da estrutura
ou função do alvo biomolecular. •Fornece informação estrutural detalhada sobre a forma de
interação dos ligantes.
•Pode ser feita a observação do alvo (biomolécula) ou do ligante
(fármaco).
•Os métodos por RMN testam diretamente a interação entre o
alvo e o ligante, minimizando a possibilidade de falsos positivos.
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Métodos por observação dos ligantes
• Apropriados para seleção primária:
– Eficiência da seleção normalmente alto.
– Uso de espectros 1D de rápida aquisição.
– Pode ser usado para a seleção de ligantes em misturas sem a
necessidade de deconvolução.
– Já que o alvo molecular (enzima ou DNA) não é detectado:
• O alvo não precisa ser enriquecido isotopicamente.
• Podem ser usadas baixas concentrações do alvo.
• Não há problemas com o tamanho (massa) do alvo molecular.
– Existem limitações com relação ao nível de afinidade.
– A interação não específica do ligante com o alvo pode levar a
falsos positivos.
• É necessário realizar metodologias competitivas com ligantes que
interagem com o sítio ativo.
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• Características do ligante para métodos com
detecção do ligante usando sondas convencionais:
– Necessário obter soluções com pelo menos concentração de
100 M em água (tampão).
– Para seleção através de detecção do ligante a concentração de
proteína deve ser entre 1 e 50 M.
– Para seleção através de detecção do alvo a concentração de
proteína marcada deve ser entre 100 e 300 M.
– Para proteínas até de 50 kDa simples marcação com 15N é
normalmente suficiente.
– Para proteínas com massa acima de 50 kDa marcação com 15N
e per-deuteração é necessário (TROSY), o que permite o uso de
proteínas com massa maior que 70 kDa.
– Uso de grupos metila marcados com 13C também permite o uso
de proteínas acima de 70 kDa.
– Marcação específica do sítio de interação.
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• Métodos necessários para obter informação detalhada
sobre o sítio de ligação da macromolécula:
– Ampla faixa de afinidade sem limite superior.
– Utiliza espectros multidimensionais que precisam de muito tempo
para sua obtenção (baixa velocidade de avaliação).
– Necessário usar deconvolução para avaliação de misturas de
ligantes.
– Distinção direta entre ligação específica e não específica.
– Informação direta sobre o modo de ligação.
– Detecção direta do efeito do pH.
– Já que o alvo (enzima ou DNA) é detectado:
• O alvo precisa estar enriquecido isotopicamente (15N e 13C).
• Concentrações bem altas do alvo devem ser usadas.
• Há problemas com o tamanho do alvo (<100 kDa).
– Crio-sondas e o baixo custo de marcação isotópica com 13C
permite avaliação prática de cerca de 100.000 compostos.
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Propriedades dos métodos de RMN para screening
Murray Coles, Markus Heller and Horst Kessler, Drug Discovery Today, 8(17),803-810, 2003.
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Estudos de Interação
Ligante-Receptor por RMN
• Métodos Diretos:
– Deslocamento Químico
– Acoplamento Spin-Spin
– Relaxação Nuclear
• Tempos de Relaxação
• Efeito Overhauser Nuclear (NOE)
– Difusão Molecular
• Métodos Indiretos:
– Método de Dalvit
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L + P LP
Kd = klig/kdes
obs = ( livre x flivre) + ( complexo x fcomplexo)
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SAR (Structure-activity
Relationships) by NMR
Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.
mM ou M
nM
Deslocamento Químico
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15N-HSQC: FKBP e FKBP con ligante
" 2
" 9
" ambos
Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.
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Molecular modeling:
• GH minimization using AM1
• B-DNA DD dodecamer minimized with CVFF:
d(CGCGAATTCGCG)
• Docking followed by minimization of the
assembly with CVFF (Insight Discover)
Santos-Filho et col. Bioorg. Med. Chem. Lett.,
1997, 7(13), 1797-1802.
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O
ON
H
N
H
NH2
NH2+
Br H
N
-O2C
CH3
O
d(CGCGAATTCGCG)2
Drew-Dickerson Dodecamer (DDD)
X-Ray and NMR structure: R. E. Dickerson, H. R. Drew, J. Biol. Chem., 23, 1981, 761-786.
A. Y. Denisov, E. V. Zamaratski, T. V. Maltseva, A. Sandstrom, S. Bekiroglu, K. H. Altmann, M. Egli, J. Cattopadhayaya, J.
Biomol. Struct. Dyn., 16, 1998, 547.
GHBP
Messeder et col.Bioorg. Med. Chem Lett., 1995, 5(24), 3079-3084.
Borges et col. European Journal of Medicinal Chemistry, 2004
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7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
H6 – T7
H1´-T7
H1´–T8
H6-T8
H6-C9
H2
H1´-T8
H2-A6
NOESY (50 ms mixing time)
Red: Pure DDD; Black: DDD + GHBP
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NMR
(NOESY)
MM
1997
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Tamanho molecular
T1 e T2 como função do tempo
de correlação c
Figueroa-Villar et col. Curr. Top. Med. Chem., 2009
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Excitação Nuclear
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Efeito do campo magnético B1 estático
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Efeito do campo magnético B1 girando na
frequência Larmor
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Origem de B1
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z z
x
y
Mz
M-z
Mxy=0
M0
y
x
z
= =
Magnetização Líquida Mo
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e
Magnetização Líquida
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Representação clássica de um pulso de 90o
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x
y
z
Mo Mo
z
y
x
90x0
z
y
x
z
y
x
Mxy=Mo
Mxy=0
t
t
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DETECÇÃO E TRANSFORMADA DE FOURIER
FID
Tempo
Transformada
de Fourier
Frequência
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Pulso de RF
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• Relaxação Transversal: T2
– Relaxação Spin-Spin
– Troca de energia entre os núcleos
– Determina a largura (resolução) dos sinais de RMN
2
21Tπ
1SW /
SW1/2
h
h/2
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Mxy = Mo
Mxy = -Mo
t
a
b
c
d
e.
..
x
y
z
-x
-y
-z
Det Det
-z
-y
-x
z
y
x
ab
x
z
-x
-y
-z
Det
-z
-y
-x
z
y
x
d e
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..
.
t
Mxy = -Mo
Mxy = Mo
2T
t
oxy eMM
Equação para relaxação no plano xy
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y'
x'
z
x'
z
y'
x'
z
y'
MB1
y'
z
x'
y'
z
x'
y'
z
x'
z
x'
y'
Pulso Defasamento ( Pulso ( Eco
Defasamento (3 Pulso ( Eco
B1
B1
180°90°x y
n
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
CPMG
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N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
NO2
N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
O2N N
H
N
H
NH2
NH2+Cl
-
O2N
10 mM
25 mM
50 mM
75 mM
BSA
Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286
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PPM 7.92 7.84 7.76 7.68 7.60 7.52 7.44 7.36 7.28 7.20 7.12
PPM 8.70 8.60 8.50 8.40 8.30 8.20 8.10 8.00 7.90
N
CH3
NOH
S
N OH
2-PAM (35 mM)
2-PAM (27 mM) + AChE (0.9 u/650 L)
ThioOx (47 mM)
ThioOx (36 mM) + AChE (0.9 u/650 L)
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Relaxação Longitudinal ou Spin-Rede
180x t
x
y
z z
y
x
x
y
z
z
y
x
t
z
y
x
t
z
y
x
t
Mz=-Mo
Mz=0Mz=Mo
Mz=Mo
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Mo
-Mo
0Mxyt
to
1T
t
oz e21MM
2ln
tT o
1
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180x
x
y
z z
y
x
z
y
x
z
y
x
z
y
x
Mz=-Mo
Mz=0
Mz=Mo
90x
90x
90x
90x
x
y
z
z
y
x
z
y
x
z
y
x
t
t
t
Inversão-Recuperação
D1-180x- -90x-Detecção
180 [NS]o
o
90 [NS]
d1
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Espectros para medição de T1
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Relaxação:
Variações de T1 com concentração
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
10 30 50 70 mM
T1 (
s)
H7 H3 H6 H5 H4GH2NB
NO2
H
NN NH2
NH2
H
3
6
5
4
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
10 30 50 70 mM
T1 (
s)
H2 H4 H7 H6 H5
GH3NB
7
6
5
4 2
+
HH
NN NH2
NH2
NO2
Cl-
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Molecular modeling and docking
9.40 55.9 4NBGH
0.00 182.6 3NBGH
4.99 87.5 2NBGH
Erel (kcal/mol) ID50 ( M) Compound
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NGHAs Rns
/Rs
purac pura R
ns/R
s
BSAc BSA c pura
/ c BSA
ID50
( m)
GH2NB 1,2 5,3x10-10
0,3 4,2x10-9
0,13 87,5
GH3NB 1,1 6,6x10-10
0,7 1,5x10-9
0,43 182,6
GH4NB 1,3 0,1x10-10
0,5 1,8x10-9
0,06 55,9
Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286
Determinação do
Tempo de Correlação
Molecular: c
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Variação de T1 na interação
de guanil-hidrazonas com micelas
0
0.5
1
1.5
2
2.5
2 3 4
PURO
SDS
CTABT1 (s)
Posição
OCH3
+
H
NH2
NH2
H
NN
M. N. Borges et col. Biopolymers, 2001, 62(1), 9-14.
Messeder et col. 2009
NN
H
NH2
NH2
OCH3
H3CO
IC50 3.1 M (T. cruzi)
IC50 59.1 M (T. cruzi)
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21
N
O
H3C
CH3
COONa
COOH
OH
3
CH3
COOH
H3C
CH3
G. Bai, Y. Cui, Y. Yang, C. Ye, M. Liu, A competitive low-affinity binding model for determining the mutual
and specific sites of two ligands on protein, The Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38,
588-593, 2005
Exemplo com anti-inflamatórios não esteroidais
(Ibuprofeno, Tolmetina e Ácido salicílico)
32
4 28
2
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N
CH3
N
H
OH
H
H
H
H
2.2
1.4
2.9
1.3
1.7
1.6
T1
1.15
0.94
0.79
1.16
1.44
1.01
N
CH3
N
H
OH
H
H
H
H
BSA AChE
S
N OH
HH
H H
5.48
4.18
4.55
6.17S
N OH
HH
H H
2.23
2.11
3.05
1.97
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Comparação da ancoragem de pirimetamina
Com a DHFR nativa e a mutante S108N
N
N NH2
NH2
C2H5
Cl
O N
N
NH2
NH2
R. T. Delfino et col. Biophys. Chem., 2002, 98(3), 287-300.
![Page 45: RMN no Desenvolvimento de fármacosjoinqui.qui.ufmg.br/2010/download/MC14-2.pdf · 2020-03-25 · RMN no Desenvolvimento de fármacos José Daniel Figueroa-Villar Grupo de Química](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062414/5f0a94207e708231d42c52c6/html5/thumbnails/45.jpg)
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8/12 1,8 2,1 0,3H9/11 1,3 1,7 0,4H13 0,5 0,4 -0,1H14 1,0 1,1 0,1
Pyrimethamine HCl
14
13
12
11
10
9
8
7
6
2
54
3
1
Cl-
+N
N
ClNH2
NH2
H
H3C
O N
N
NH2
NH2
H
12
3
45
7
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8 5,0 2,9 -2,1H6 4,4 3,7 -0,7H7 4,4 3,7 -0,7H9 4,5 3,6 -0,9
O N
N
NH2
NH2
H
O2N
12
3
45
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
7
Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)
H8 1,54 1,78 0,24H9 1,45 1,48 0,03
T1 na comparação da interação de inibidores
com a DHFR de Plasmodium falciparum
IC50 16.10 M
IC50 8.34 M
IC50 >2500 M
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Interação da 2,4-diamino-benzopiranpirimidina
com DHFR-NADPH por T1 Seletivo
O N
N
NH2
NH2
1
3
2
4567
8
9
Hidrogênio T1 Livre (s) T1 DHFR (s) T1 (s)
H-9 6.52 1.72 -4.80
H-8 4.78 1.80 -2.98
H-6 4.95 3.26 -1.69
O N
N
NH2
NH
HH
H6
H9
H8
O O
Asp54
NCONH2NADPH
+
-
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44
Pirimetamina (45)
Amostra Branco:
DMSO
LQB/2003
42
44
Pirimetamina (45)
Amostra Branco:
DMSO
LQB/2003LQB/2003
42
O N
N
NH2
NH2
H
O2N
12
3
45
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
7
O N
N
NH2
NH2
H
12
3
45
7
8
9 10
64a5a
9a 10a+
Cl-
N
N
ClNH2
NH2
H
H3C
+Cl
-
1
34
5
2
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Pirimetamina HCl
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N
N NH2
NH2
H2N
R
![Page 49: RMN no Desenvolvimento de fármacosjoinqui.qui.ufmg.br/2010/download/MC14-2.pdf · 2020-03-25 · RMN no Desenvolvimento de fármacos José Daniel Figueroa-Villar Grupo de Química](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062414/5f0a94207e708231d42c52c6/html5/thumbnails/49.jpg)
Inhibition of P. falciparum DHFR by Novel Flexible Ligands
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentration (ng/mL)
Su
rviv
al (%
)
PirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3B
MR1-X: IC50 80 nM
MR1-D: IC50 100 nM
MR3-F: IC50 150 nM
![Page 50: RMN no Desenvolvimento de fármacosjoinqui.qui.ufmg.br/2010/download/MC14-2.pdf · 2020-03-25 · RMN no Desenvolvimento de fármacos José Daniel Figueroa-Villar Grupo de Química](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062414/5f0a94207e708231d42c52c6/html5/thumbnails/50.jpg)
Inibidores da
Tirosinase como
potenciais agentes
para tratamento de
melanoma
CHO
R
O
O
OR
OOO+
EtOH
Reflux
R = NO2, H, OCH3
1 2
3
4
5
6
78
9
10
11 O O
OO H
HAr
H
![Page 51: RMN no Desenvolvimento de fármacosjoinqui.qui.ufmg.br/2010/download/MC14-2.pdf · 2020-03-25 · RMN no Desenvolvimento de fármacos José Daniel Figueroa-Villar Grupo de Química](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062414/5f0a94207e708231d42c52c6/html5/thumbnails/51.jpg)
H
NN
H
NH2
NH.HClOH
H
H-7
BA
H
NN
H
NH2
NH2.HClOCH3
H H
NN
H
NH2
NH2.HClOH
H
A B
DH-7-H6 (Å) com SDS 3.86 3.68
DH-7-H6 (Å) sem SDS 2.80 3.58
H6-H7 distância 2.80 Å
Ângulo diedro -3.81o
R1iNULL = j i ij + j i,k jk
R1iNS = j i ij + j i,k jk + ik
ik = R1iNS – R1i
NULL
c2c
2
c
6ij
2H
2
ij41
6
r10
1
O método NULL
d1
90 [NS]o
o
180 [NS]
180 [S]o
Gibbs et col. J. Magn. Reson. 1991, 93, 395-402.
Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.
![Page 52: RMN no Desenvolvimento de fármacosjoinqui.qui.ufmg.br/2010/download/MC14-2.pdf · 2020-03-25 · RMN no Desenvolvimento de fármacos José Daniel Figueroa-Villar Grupo de Química](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022062414/5f0a94207e708231d42c52c6/html5/thumbnails/52.jpg)
• Distância entre os hidrogênios H-2 e H-1’(r21’ Ao) por RMN e Modelagem
molecular
Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.
Complexos Fenol-Piperazina como Anti-helminticos
N
N
H
O
H
H
O
H
R2
R1
R2
R1
H
H
1: R1 = H; R2 = CH32: R1 = R2 = CH3
11'
2'
5' 6'