Relatório Final³rio Final Relativo ao período de Agosto/2002 - Agosto/2003 Submetido ao PIBIC/...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOLABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI (LIKA)

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE ALGINATO-QUITOSANA EMICROESFERAS DE PLGA NA ENCAPSULAÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS

ANTIMALÁRICOS

Relatório FinalRelativo ao período de Agosto/2002 - Agosto/2003

Submetido ao PIBIC/ FACEPE 2002

ORIENTADORA: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães

ALUNO: Agenor Tavares Jácome Júnior

RECIFE-2003

Desenvolvimento de Microesferas de Alginato-Quitosana e Microesferas de PLGA na Encapsulação de Princípios Ativos Antimaláricos 1

AGRADECIMENTOS

A Deus, Ser onipresente em minha vida, pelo constante cuidado e direção.”O Senhorcom sabedoria fundou a Terra, com inteligência estabeleceu os céus. Pelo Seuconhecimento os abismos se rompem” (Provérbios 3:19,20b).

A Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães, pela orientação, confiança, amizade epor ter me dado a oportunidade da iniciação científica.

Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho,Diretor do Laboratório de Imunopatologia KeisoAsami – LIKA/UFPE, e Prof. Dr.Luiz Bezerra de Carvalho Júnior,o qual tenho grandeadmiração, responsável pelo setor Bioquímica- LIKA, onde o presente trabalho foirealizado.

Ao mestrando Lúcio Figueira Pimentel,pelo apoio, amizade, paciência e imprescindívelajuda.

Aos meus Pais, Agenor Tavares Jácome e Maria Dalva Jácome, pelo constante apoio eincentivo, bem como as palavras de conforto nas horas mais difíceis.

A minha namorada, Paula R. Luna de Araújo,pelo amor, paciência, compreensão e porsua valorosa contribuição na confecção desse relatório.

Aos colegas de bancada, Simone Bezerra dos Santos, Hercília Rolim,Noemia Santos,Catarina Simonete, Rosângela, Roseane Ribeiro Costa, Marcela Vanderley, DayseVasconcelos, Robson Amaro, Mariane Crajubá, Taciana Estanislau e João Paulo, pelocompanherismo e grande amizade.

Aos amigos de Bioquímica – LIKA, especialmente Givanildo Oliveira, Luciana Oliveira,Luciana da Mata e Ian Porto, pela amizade, ajuda e pelos bons momentos de alegria.

Aos funcionários do LIKA/ UFPE, especialmente, seu Otaviano e Moises, pela atençãono suporte técnico.

A FACEPE pelo financiamento deste trabalho.

A todos aqueles que contribuíram para a realização deste trabalho, meus sincerosagradecimentos


Introdução

A malária humana, uma doença parasitária que tem como agentes etiológicos quatro espécies deprotozoários do gênero Plasmodium (P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. falciparum), é transmitida aohomem através da picada de fêmeas do inseto do gênero Anopheles sendo a “infestação humana maisdevastadora no mundo inteiro, com 300 a 500 milhões de casos clínicos e quase 3 milhões de mortes acada ano” (Hardman, 1996).

Na América Latina, o maior número de casos é verificado na Amazônia Legal (divisão políticado território nacional que engloba nove Estados: Amazonas, Pará, Acre, Roraima, Rondônia, Amapá,Mato Grosso, Tocantins e Maranhão) sendo registrados 99,7% dos 632.813 casos no Brasil (Figura 1)(FUNASA, 2001).

Cada espécie de Plasmodium produz um padrão de doença bastante característico relacionado emparte com o momento de seu ciclo intra-eritrocítico assexuado. As infecções por Plasmodium vivax e P.ovale só raramente são fatais e caracterizam-se por picos febris com intervalos de cerca de 48 horas –malária terçã benigna. Com o P. malariae, os picos febris ocorrem com intervalos de 72 horas –malária quartã benigna. Plasmodium falciparum é responsável pelas mais altas parasitemias e pelamaior parte da mortalidade.Nesse padrão de infecção a febre ás vezes é irregular,porem, o mais dasvezes, mostra uma periodicidade com intervalos de 48 horas – malária terçã maligna. No Brasil,prevalecem as infecções causadas pelo P. vivax e P. falciparum (Cotran, 1991; FUNASA, 2001).

A natureza maligna do Plasmodium falciparum pode estar relacionada com os seguintes fatores:parasita indiscriminadamente todas as hemácias com receptores para glicoforina, resultando emparasitemias muito altas que se instalam bruscamente; induz proeminências pegajosas nas membranashemáticas, que resultam em entupimento dos pequenos vasos e hipoxemia tecidual ou necroseisquêmica. Essa forma freqüentemente letal da doença caracteriza-se por qualquer um ou por todos osseguintes elementos: acometimento cerebral com delírio evoluindo para coma, choque hipotérmico(malária álgida),edema pulmonar agudo, CID insuficiência renal com hemoglobinúria e insuficiênciahepática (Cotran, 1991)

Em todas as formas a destruição das hemáceas resulta em anemia e, ao mesmo tempo, é liberadoo pigmento malárico produzido pela digestão do grupo heme por parte do parasita. As hemáceaslesadas e o pigmento malárico são removidos do sangue pelo sistema fagocitário mononuclear,induzindo assim esplenomegalia e hepatomegalia, assim como a pigmentação observada nesses órgãosaumentados e na medula óssea.

O tratamento adequado e oportuno da malária é hoje o principal alicerce para o controle dadoença. Os antimaláricos podem ser classificados de diferentes maneiras de acordo com suascaracterísticas químicas, farmacológicas, seu local de ação no ciclo biológico do parasito, as finalidadescom que podem ser utilizados, seu modo de obtenção, dentre outras. A tabela 1 resume osantimaláricos levando-se em consideração sua categoria química, mecanismo de ação, vantagens edesvantagens de seu uso.


Figura 1 – Malária (todas as formas) – lâminas positivas e óbitos, Brasil, 1980 – 2001.Fonte: MS/FUNASA/CENEPI


Tabela 1- Antimaláricos classificados de acordo com sua categoria química, mecanismo de ação,vantagens e desvantagens de seu uso.(adaptado de FUNASA, 2001)

Composto CategoriaQuímica

Mecanismode ação

Vantagens Desvantagens

Cloroquina 4 –aminoquinolina

Digestão deprodutos da

hemoglobina

Rápida atividade esquizonticida;atividade gametocitocida para P. vivax e P.malariae;Ação antipirética e antiinflamatória;São raros os efeitos colaterais graves em dosesterapêuticas;

Poucas cepas de P. falciparum são aindasensíveis à cloroquina

Amodiaquina 4 –aminoquinolinaDigestão deprodutos da

hemoglobina

Rápida atividade esquizonticida; atividade gametocitocida para P. vivax e P.malariae;Ação antipirética e antiinflamatória;São raros os efeitos colaterais graves em dosesterapeuticas

P. falciparum já é resitente em todas asáreas endêmicas do mundo

Primaquina 8 –aminoquinolinaInibe a respiraçãomitocondrial do

parasito

Ação profilática causal, sendo altamente ativacontra gametócitos de todas as espécies deplasmódios e contra hipnozoítos do P. vivax

Alta toxidade em uso prolongadonecessário para atuar contra as fasesassexuadas sanguíneas;Contra-indicada na gravidez (hemólise emfetos) e para crianças menores de 6 anos(hipoplasia e aplasia medular);

Quinina QuinolinometanolDigestão deprodutos da

hemoglobina

Eficaz contra P. falciparum (droga de escolhapara a malária por P. falciparum em associaçãocom doxiciclina ou tetraciclina)

Alta capacidade de se ligar a proteínas;Distribui-se por todos os fluidos do corpo;Atravessa a barreira placentária e ahematoencefálica;Necessidade de uso associado a outrasdrogas, devido a baixa adesão quando emuso isolado;Muitos Efeitos colaterais(chinchonismo);

Mefloquina QuinolinometanolDigestão deprodutos da

hemoglobina

Potente Esquizonticida sanguíneo altamenteativo contra P.vivax e P. malariae;Eficaz contra os gametócitos de P. vivax;

Alta capacidade de ligação a proteínas;Meia vida muito longa (10 – 40 dias);Esofagite após ingestãoPotencial para induzir manifestaçõesneuropsiquiátricas graves;

Halofantrina QuinolinometanolDigestão deprodutos da

hemoglobina

Ação esquizonticida sanguínea sobre todas asespécies de plasmódio;

Não atua sobre gametócitos e hipnozoítos;Custo elevado;Variabilidade de sua biodisponibilidade;Resistência cruzada com a mefloquina;Cardiotoxidade em certos grupos de riscoapós dosagem padrão;Não deve ser usada por gestantes oulactentes;

Artemisininae seus

derivados

Éter de lactonasesquiterpênica

Metabolismo dasproteínas

Esquizonticidas sanguíneos potentes de açãorápida;

Neurotoxidade dose/dependente

Tetraciclina Derivados denaftaceno

Síntese dasproteínas

Antimicrobiano de amplo espectro com açãopotente contra as fases sanguíneas e intra-hepáticas do P. falciparum (em combinaçãocom a quinina)

Contra-indicado na gravidez e em criançasmenores de 8 anos, pois prejudica acalcificação óssea no feto, pode resultar emosteogênese anormal e hipoplasia doesmalte dentário, atravessam a barreiraplacentária e são encontradas no leitematerno;Deve ser sempre empregada emcombinação com outro antimalárico;

DoxiciclinaDerivados de

naftacenoSíntese dasproteínas

Difere das tetraciclinas pelo fato de er maiscommpletamente absorvida ,mais lipossolúvel emeia vida mais longa;Usada no tratamento da malária por P.falciparum;

Mesmas contra-indicações da tetraciclina;Deve ser sempre empregada emcombinação com outro antimalárico;

Clindamicina LincosaminasSíntese dasproteínas

Antimicrobiano de amplo espectroesquizonticida sanguíneo eficiente;Tratamento da malária por P. falciparum;

Mais cara e mais tóxica que doxicilina etetraciclina;Deve ser sempre empregada emcombinação com outro antimalárico;


Nos últimos anos, numerosos estudos demonstraram que a distribuição de um fármaco noorganismo pode ser modificada pelo uso de vetores coloidais. Estes carreadores podem proteger oprincípio ativo da degradação e/ou inativação; melhoram a biodisponibilidade por aumento dapenetração celular e proporcionam a liberação do fármaco no sítio de ação desejado, eliminando ouminimizando os efeitos colaterais da terapêutica convencional.

Micropartículas são partículas esféricas de tamanho entre 1 a 1000 ì m. Microesferas sãomicropartículas porosas que promovem a liberação controlada de fármacos. Elas são constituídas de umsistema matriz contendo o fármaco uniformemente distribuído através da matriz polimérica (Figura 1).O processo de microencapsulação possui larga aplicação em processos biológicos para pesquisafundamental e para a industria devido as suas características de biocompatibilidade ebiodegradabilidade. O termo microcapsulas ou dispositivo do tipo de reservatório consiste, em geral,em uma camada de polímero que atua como um filme protetor, isolando o princípio ativo (figura 2)(Vandernberg et al, 2001; Mandal et al, 2001; Youan et al, 2001).

São reportadas aplicações como o encapsulamento de leveduras para a produção de álcool,imobilização de células de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais, encapsulação deinsulina para tratamento de diabetes (Gaser∅d, 1998), liberação de drogas, vacinas, DNA, proteínasterapêuticas e peptídeos por via oral (Vandernberg et al,I 2001).

Microesferas de alginato-quitosana podem ser produzidas por diferentes métodos. Um deles é oprocedimento em dois estágios, onde as micropartículas de alginato-cálcio são formadas pelogotejamento de uma solução de alginato de sódio sobre um banho contendo íons de cálcio. Asmicropartículas formadas são então transferidas para uma solução de quitosana para formar umamembrana na superfície. Esferas com uma matriz de alginato e membrana de um complexo alginato-quitosana, também podem ser obtidas em um processo de apenas um estágio, bastando deixar cair gotasda solução de alginato de sódio em uma solução de quitosana contendo íons cálcio (Gaser∅d, 1998).

Quando alginato é gotejado sobre uma solução de quitosana, a interação eletrostática dos gruposcarboxil do alginato com os grupos amina da quitosana, resultam na formação de uma membrana.Existem muitas vantagens do revestimento com quitosana, como melhoria das propriedades deencapsulamento de drogas e bioadesividade, bem como prolongar as propriedades de liberação dasdrogas (Shu, 2001). Outra vantagem do uso destes produtos naturais hidrofílicos que envolvem o usode solventes aquosos é a minimização de problemas toxicológicos e ambientais associados ao uso desolventes orgânicos, muito utilizados para a solubilização de polímeros orgânicos (Zhou, 2001).

A quitosana é um derivado diacetilado da quitina, um biopolímero natural, com grande interessecomo matriz para liberação controlada, devido a sua excelente biocompatibilidade e baixa toxicidadeque é facilmente degradado por enzimas e esta degradação não é tóxica. Tanto o alginato quanto aquitosana são matérias primas de grande potencial no nordeste brasileiro sendo extraídos de algasmarinhas e da carapaça de crustáceos, respectivamente (Craveiro et al, 1999).

Microesfera Microcápsula

Figura 2 - Micropartículas


Um outro método utilizado neste trabalho foi a formação de microesferas, tendo como matrizpolimérica o PLGA (Copolímero de Ácido Lático e Glicólico), num processo de emulsificaçãomúltipla.Este método envolve emulsificação de água/óleo/água (w/o/w) e é o melhor para encapsulardrogas solúveis em água como peptídeos, proteínas e vacinas. Uma solução tamponada ou aquosa dadroga (fase aquosa interna) é adicionada na fase orgânica que consiste do polímero e solventeadequado, com agitação para formar uma emulsão primária (o/w). Esta emulsão é adicionada sobagitação dentro de um volume maior de água com um tensoativo (fase aquosa externa) para formar aemulsão múltipla (w/o/w). A emulsão é homogeneizada a temperatura ambiente para remoção dosolvente pelo processo da evaporação. As microesferas sólidas são obtidas e então lavadas e coletadaspor filtração ou centrifugação. Estas são então secas nas condições apropriadas ou são liofilizadas paradar o produto final - microesferas injetáveis. Parâmetros da formulação (natureza e concentração dosconstituintes) e variáveis do processo (aparelhagem, tempo e velocidade de agitação, liofilização)afetam significativamente o produto final das microesferas e a liberação da droga (Jain, 2000)

PLA (polímero de ácido lático), PGA (polímero do ácido glicólico) e PLGA são polímerossintéticos biodegradáveis e biocompatíveis constituídos por ésteres de ácido lático e ácido glicólico. Ámedida que vão sendo hidrolisados produzem os respectivos ácidos que são inteiramente metabolizadosaté CO2 e H2O. Devido a sua biocompatibilidade, têm sido usados como enxerto cirúrgico, implantes evários dispositivos prostéticos (Zimmerman e colaboradores, 1987, Hay e colaboradores, 1988).Estespolímeros também foram aprovados pela vigilância sanitária americana FDA para uso do sistema deliberação controlada (Kumar et al.,2001; Hans e Lowman, 2002; Kang e Schwendeman, 2002).

Doenças, como a malária, podem se utilizar destas técnicas de encapsulamento para odesenvolvimento de novas alternativas terapêuticas.

Estima-se que sejam gastos anualmente cerca de 1 bilhão de dólares na prevenção e controle damalária, sendo a maior parcela deste montante, utilizado na África onde cerca de 1 milhão de mortesocorrem a cada ano, sendo 700.000 destas mortes em crianças. Estipula-se ainda que o controle damalária teria um benefício a curto período estimado entre 3 e 12 bilhões de dólares por ano (WHO,2000).

O desenvolvimento de formas farmacêuticas de liberação controladas por microencapsulamentoutilizando microesferas de PLGA ou microesferas de Alginato-quitosana poderá permitir um melhorcontrole da cinética de liberação da droga, resultando em níveis plasmáticos terapêuticos, com menoresefeitos tóxicos e também consistir num passo importante para o desenvolvimento de uma novaterapêutica antimalárica, o que pode repercutir para a melhoria da qualidade de vida de milhões depacientes, além do impulso técnico, cientifico e financeiro, potencialmente adquiridos.

O presente trabalho tem como objetivo desenvolvimento de microesferas de alginato-quitosanae microesferas de PLGA na encapsulação de princípios ativos antimaláricos o qual foi dividido em 2etapas, as quais foram subdivididas em fases, referentes a um conjunto de atividades específicas com afinalidade de melhorar a compreensão das atividades desenvolvidas, cada qual contendo seusrespectivos materiais, metodologias, resultados e discussão.


ETAPA I

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE ALGINATO-QUITOSANA NA ENCAPSULAÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS

ANTIMALÁRICOS

Agosto/ 2002 – Fevereiro/2003


Materiais

1. Reagentes

§ Alginato de Sódio viscosidade 1100cp25°C 2% Henrifarma LTDA;

§ Alginato de Extração de alta viscosidade1;§ Alginato de Extração de baixa viscosidade1;§ Quitosana Grau Prático Sigma Co;§ Quitosana 85 % deacetilada Sigma Co;§ Quitosana de Extração1;§ Água Milli-Q;§ Cloreto de sódio P.A;§ Cloreto de Cálcio P.A;§ Ácido Acético P.A;§ Ácido Clorídrico P.A;§ Acetato de sódio PA;

3. Equipamentos

§ Potenciômetro pH METRE F-8L Horiba§ Microscópio Olympus CH-2§ Bomba Peristáltica Cromatocráfica ATTO§ Agitadores Magnéticos IKEMOTO 908 e YAMATO M-41§ Agitadores Mecânicos§ Espectrofotômetro UV Hitachi U-3200§ Viscosímetro rotativo Brook Fild§ Banho de Ultrassom

1 Desenvolvido e cedido pela Dra. Maria Lúcia da Universidade Federal do Ceará (UFC)

2. Vidrarias

§ Balão volumétrico§ Bastão de Vidro§ Becker§ Erlenmeyers§ Pipetas volumétricas§ Pipetas Graduadas§ Provetas§ Outras


Fase 1 – Obtenção de Microesferas de Alginato-Quitosana

Metodologia

1. Estudo dos componentes

1.1 Alginato – Apresenta-se na forma floculada, ou em pó finamente dividido, de coloraçãocreme. O alginato destina-se a formação de microesferas. Para incorporação na formulação,variou-se os tipos de alginato, a concentração e a técnica de solubilização.

Tipos: Alginato de extração de alta viscosidade1, alginato de extração de baixaviscosidade1 e alginato de sódio da Henrifarma LTDA.

Concentração: Foram testadas concentrações que variaram de 1 a 2% (p/v) de alginatona solução aquosa.

Solubilização: Foram testadas a agitação magnética, mecânica e agitação com pré-solubilização utilizando bastão de vidro. Todas as agitações utilizaram a água Milli-Qcomo solvente.Medida de Viscosidade: Foi feita a medição da viscosidade da solução de alginato desódio a 1% e a 2% (p/v) utilizando um viscosímetro rotativo Brook Filds a 50 rpm epêndulo 4.

1.2 Quitosana – Apresenta-se na forma escamosa de coloração creme. Este componentedestina-se ao revestimento da microesfera formada pelo alginato. Para incorporação docomponente na formulação, variou-se os tipos de quitosana, concentração e técnica desolubilização.

Tipos: Quitosana de extração1, quitosana 85% deacetilada Sigma e quitosana grauprático Sigma.

Solubilização: Utilização de meios ácidos, ácido acético ou tampão acetato pH 5.0, comaquecimento não superior a 60ºC. Acredita-se que o tamponamento da solução dequitosana em pH 5,0 promove uma melhor interação eletrostática dos gruposcarboxil do alginato com os grupos amina da quitosana cuja faixa de pH indicada éentre pH 4,00 a pH 6,00 (Gaser∅d, 1999)

1.3 Banho de Gelificação – Banho contendo íons que tem por finalidade promover aestrutura em “casca de ovo” no alginato formando com isso as microesferas. Testou-se acomposição do banho de gelificação, utilizando apenas CaCl2 ou este em conjunto comNaCl, variando-se também a concentração dos mesmos. Inicialmente, o banho degelificação continha apenas 50 mM de CaCl2, mas na literatura é relatado o uso de NaClpara uma melhor homogeneidade do tamanho das gotas formadas (Gaser∅d, 1998).

1 Desenvolvido e cedido pela Dra. Maria Lúcia da Universidade Federal do Ceará (UFC)


2. Estudo das Técnicas de Preparo

2.1 Método de Etapa Única - One-stage (OS)

5 a 10 mL de uma solução de Alginato de sódio 1 a 2% (p/v) foi gotejada diretamentesobre 100 ml de uma solução de Quitosana 0,15% (p/v) e Cloreto de cálcio. Lavou-se 4 vezesou 5 vezes com 50 mL de água tipo Milli-Q. Filtrou-se e secou-se a temperatura ambiente.

2.2 Método de Duas Etapas - Two-stage (TS)

5 a 10 mL de uma solução de Alginato de sódio 1 a 2% (p/v) foi gotejada sobre umbanho de gelificação contendo 50 a 100ml de uma solução de Cloreto de cálcio, variando-se oprocesso pela adição de NaCl para uma melhor homogeneidade do tamanho das gotasformadas; Transferiu-se as gotas formadas para uma solução de quitosana 0.15% (p/v),previamente dissolvida em ácido acético ou em tampão acetato pH 5,0 deixando-se em contatodurante 30 minutos. Lavou-se 4 ou 5 vezes com 50 mL de água Milli-Q. Filtrou-se e Secou-sea temperatura ambiente (figura 3).

2.3 Gotejamento

A solução de Alginato foi gotejada manualmente, sob fluxo de ar axial (bomba devácuo) ou com fluxo controlado por uma bomba peristáltica, utilizando-se uma agulha (0,70mm, 0,45mm 0,38mm, 23G ou 25G) acoplada a uma seringa, em um banho de gelificação contendosolução de quitosana (método de etapa única) ou somente no banho de gelificação (método deduas etapas) com ponta da agulha distante 10mm da solução.

Figura 3 – Método de preparação de microesferas em dois Estágios

Sol.Alginato dissolvido

Sol . CaCl2

Leve agitação

Sol . ácida deQuitosana

Filtração elavagem

MicroesferasFinais


2.4 Lavagem

No método de preparo, foi variada a lavagem das microesferas ao final do processo deobtenção devido a quantidade e observação da presença de resíduos não dissolvidos na mesma.

2.5 Secagem

Após a formação das microesferas estas foram transferidas para placa de Petri ecolocadas para secagem à temperatura ambiente expostas ao meio ambiente, a temperaturaambiente em dessecador ou em estufa a 45°C ± 0,5 °C.

Resultados e Discussão

1. Estudo dos componentes

1.1 Alginato

Tipos: Dos alginatos testados, o que apresentou melhor resultado foi o alginato de sódioda Henrifarma LTDA. Os alginatos de extração tendo alta e baixa viscosidade tiveramdificuldades de solubilização além de promoverem entupimento do sistema degotejamento;

Concentração: A melhor concentração de alginato foi a de 1,5%, tendo estaconcentração promovido solubilização completa, probabilidades menores deentupimento do sistema de gotejamento, microesferas resistentes à quebra da malha ecom tamanho reduzido de 2mm a 1mm. Na concentração de 1% também se obtémtamanho reduzido, mas esta deixa as microesferas menos resistentes.

Solubilização: A pré-solubilização da solução de alginato com bastão de vidro seguidade homogenização magnética mostrou-se mais eficaz que a solubilização em agitadormagnético ou mecânico, levando um tempo menor, em torno de 5 minutos, enquanto asolubilização direta, seja a magnética ou a mecânica, levou em torno de 60 minutos, nãopromovendo uma completa solubilização;

Concetraçãodo alginato

Viscosidade

1% 458,37 cP2% 3441,91 cP

Tabela 2- Viscosidade das soluções de alginato medida emviscosímetro.Tempo: 5 minutos Pendulo:4


1.2 Quitosana.

Tipos: A quitosana de escolha foi a de grau prático da Sigma pois esta apresentou aformação de microesferas de aspecto mais uniforme e resistente.

Solubilização: Observou-se que escamas menores de Quitosana obtidas por tamização erepicamento apresentaram melhor solubilidade em ácido acético 1% e agitaçãomagnética a 150 rpm (Tabela 3).

Tipo de Quitosana

Tamanho das Escamas

Quitosana GrauPrático

Quitosana 85%deacetilada

0,5 a 1cm 180 minutos 120 minutos

0,1 a 0,5cm 20 minutos 15 minutos

Tampão acetato pH 5,0 promoveu solubilização mais lenta (Tabela 4) euma diminuição da resistência das microesferas formadas, mas estas adquirirammaior uniformidade.

QuitosanaUtilizada

QuitosanaGrau Prático(em tampão)

Quitosana85% Deacetilada

(em tampão)Tempo de

Solubilização30 minutos 20 minutos

1.3 Banho de Gelificação .

A solução de escolha foi a contendo 50 mM de Cacl2 e 200 mM de NaCl baseando-sena literatura de suporte (Gaser∅d, 1998).Soluções contendo só CaCl2 ou este em conjuntocom NaCl aparentemente apresentavam resultados iguais na forma, tamanho, resistência ehidratação das microesferas de alginato formadas.

2. Estudo das Técnicas de Preparo

2.1 Método de Etapa Única - One -stage (OS)2.2 Método de Duas Etapas - Two-stage (TS)

O uso da metodologia de etapa única ou de duas etapas foi indiferente, apresentando osmesmos resultados no que se refere à formação de microesferas, tamanho, resistência eencapsulação.

Tabela 3 - Tempo de solubilização das soluções de quitosanacontendo escamas

grandes e pequenas.

Tabela 4 – Tempo de solubilização de quitosana em tampão.Foram utilizadas escamas pequenas


2.3 Gotejamento

Foram testados quatro sistemas de gotejamento: manual (embolo tracionado com amão), sob fluxo axial de ar (bomba de vácuo) e com fluxo controlado por bombaperistáltica a uma velocidade de 1 gota/secundo. Destes, o gotejamento com bombaperistáltica foi o único que promoveu a formação de gotas com tamanho uniforme;

0,38mm e 25G 0,70mm e 23GMicroesferas hidratadas 1500µm 3000µm

Microesferas secas 500 a 1000µm 1500µm

Após homogenização da solução de alginato, se fazia necessário um período de repousoda solução para que bolhas não fossem incorporadas ao sistema de gotejamentoprejudicando o bombeamento e a uniformidade da solução;

O uso de bomba peristáltica ou fluxo axial de ar objetivava um maior controle euniformidade do gotejamento sendo o diâmetro da agulha de extrema importância para aformação e tamanho da gota que determinava a forma da microcapsula;

A inclinação da agulha promovia a formação de gotas espiculadas, optando-se, com isso,deixar a seringa perpendicular ao banho de gelificação 10 mm distante da superfície deste;

2.4 Lavagem

A lavagem e a filtração das microesferas hidratadas, após os 30 minutos de contato com obanho de quitosana, são necessárias para retirar o excesso de quitosana presente e separa-las parasecagem.

2.5 Secagem

Temperatura AmbienteContato com o Ar

Temperatura AmbienteDessecador

Estufa45°C ± 0,5

Resultados

Apresentou secagem maisrápida que as demais(presença de microesferassecas 2 horas após início dasecagem); microesferasfracamente aderidas a placa dePetri; cor caramelada;

Secagem mais lenta emcomparação as demais(24 – 48 horas) e maioradesão à placa de petri;

Secagem maislenta em

comparação asdemais (24 – 48horas) e maior

adesão à placa depetri;

Tabela 5 – Tamanho de microesferas obtidas por diferentes tipos de agulha

Tabela 6 – Secagem das microesferas. Comparação de métodos


O processo de secagem pela estufa foi o que apresentou tempo de secagem mais rápido edesprendimento total da placa de Petri, mas promoveu uma modificação nas microesferas dando a elasuma coloração verde, provavelmente devido a degração dos componentes da formulação;

Mesmo a secagem a temperatura ambiente em contato com o ambiente tendo apresentadomelhores resultados, optou-se pela secagem a TA em dessecador, pois esta expunha menos aformulação ao ambiente;

2.6 Melhor técnica de preparo

O gotejamento de 10 mL de uma solução de alginato 1,5% (p/v) ocorreu em um banho degelificação contendo 50 mM de Cacl2 e 200 mM de NaCl com formação de microesferas hidratadas deaspecto esférico regular deixadas em contato com o banho durante 30 minutos sob agitação mecânica(800rpm). Após isso, adicionou-se à suspensão uma solução de quitosana 0,15% tamponada em acetato(pH 5,0), a qual recebeu a designação de “banho de quitosana”, ficando as microesferas por mais 30minutos em contato com essa solução sob agitação mecânica (800 rpm). Ao fim do processo, foramfeitas lavagens 4 x 50 ml de água sendo a ultima lavagem por membrana filtrante (filtro A4 a vácuo),com microesferas hidratadas colocadas em placa de Petri (figura 4) e dessecador durante 24-48 horas atemperatura ambiente . Após esse período, observou-se microesferas secas, achatadas, fracamenteaderidas a placa de Petri com cor caramelada e diâmetro de 500 a 1000 µm (figura 5);

Figura 4 – Microesferas dealginato-quitosana hidratadasapós lavagem

Figura 5 – Microesferas dealginato-quitosana secas após24 horas em dessecador


Fase 2 – Estudo do Princípio Ativo

A malaria é caracterizada por cefaléia ocasional, náuseas, vômitos, astenia, fadiga, anorexia efebre ligeira. O ataque agudo de malária caracteriza-se por um conjunto de paroxismos febris queapresentam quatro períodos sucessivos: o de frio, calor, de suor e apirexia tendo esses sintomas maiorseveridade na malária causada pelo P. falciparum, o qual é responsável por 70% das mortes pormalária.

O uso de quinina na farmacoterapia da malária, principalmente nas formas de infestação porPlasmodium falciparum resistente à cloroquina, ainda é a alternativa mais aceitável, porém mesmoapós doses terapêuticas padrões pode-se obter concentrações tóxicas e uma sintomatologia conhecidapor chinchonismo caracterizada por zumbidos, cefaléias, náuseas e distúrbios visuais, podendo agravar-se quando em terapia continuada, com efeitos gastrointestinais, cardiovasculares e dérmicos (Hardman,1996). Este é um dos problemas a serem minorados, a partir do uso de novas fomas de administraçãode medicamentos que possam melhorar a biodisponibilidade e diminuir a toxicidade de fármacos.Assim, após um extensa pesquisa bibliográfica, o sulfato de quinina parece ser o antimalárico idealpara o desenvolvimento de uma formulação de liberação controlada.

Metodologia

1. Caracterização físico-química e controle de qualidade do fármaco antimalárico aser utilizada durante o experimento

Os dados abaixo foram transcritos do Certificado de Análise do sulfato de quinina obtido dofornecedor (Henrifarma LTDA).Produto – Sulfato de quinina (di-hidratado)Especificações – BP93 (Farmacopeia Britânica de 1993)Formula – (C20H24N2O2)H2SO4 . 2H2OPeso Molecular – 783,0Aspecto – Pó cristalino branco ou quase branco ou agulhas finas incoloresSolubilidade – Um pouco solúvel em água e álcoolPaís de Origem – AlemanhaLote NR – 4249Data de Fabricação – 13/06/2000Data de Validade – 01/06/2005Observação – Recipientes Herméticos e protegidos da luz

Determinação física§ Cor e limpidez da solução - Solução é límpida e incolor§ pH – o pH da suspensão a 1% é de 6,3 (5,7 a 6,6)§ Rotação específica - -242,4° ( -237° a -245°)

Determinações Químicas§ Teor em Base anidra – 100,2%peso (99,0 a 101,0 %peso)§ Metais pesados - < 10ppm§ Perda por dessecação – 4,70% (3,0 a 5,0%)§ Resíduos de ignição - < 0,1%§ Substâncias insolúveis em álcool clorofórmio - < 0,1%


2. Desenvolvimento de Técnica de Doseamento e Curva Padrão

Conforme a Farmacopeia Americana, a técnica de doseamento do sulfato de quinina é realizadapor uma titulometria em meio não aquoso. Seguindo as tendências de Boas Práticas de Fabricação(BPF) e Boas Práticas em Laboratório (BPL), a tendência geral é que estas técnicas titulometricassejam substituídas por técnicas mais específicas, sensíveis e seguras. Entre estas técnicas destacam-se aespectrofotometria e a Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE).

Desde modo objetivamos o desenvolvimento de uma metodologia de doseamento de sulfato dequinina por espectrofotometria.

2.1 Determinação do comprimento de onda de maior absorbância emespectrofotômetro

Foi feito um espectro de absorção do sulfato de quinina na faixa de 230nm a 350 nm.

2.2 Determinação de curva padrão de sulfato de quinina

A curva padrão foi feita a partir de uma solução mãe de sulfato de quinina, em HCl 0.1N, comconcentração de 1mg/mL, efetuando-se diluições sucessivas para obtenção de concentrações finais queforam de 2 µg/ml até 10µg/ml.A determinação das absorbâncias foi feita em espectrofotômetro, nocomprimento de onda de 250nm em triplicata, em função de suas concentrações, com a determinaçãoda equação da reta e sua regressão linear, realizado com auxílio do software Excel da Microsoft Co.


Resultados e discussão

2. Desenvolvimento de Técnica de Doseamento e Curva Padrão

2.1 Determinação do comprimento de onda de maior absorbância emespectrofotômetro

Comprimento de Onda (nm) Absorbância230 0.6743240 0.8102250 1.0246260 0.4157270 0.2031280 0.1744290 0.1634300 0.1620310 0.1667320 0.1810330 0.1437340 0.1578350 0.1386

Figura 6– Expectro de absorção da solução de sulfato de quinina em HCl 0,1 N 10µg/mL realizado em espectrofotometro Hitachi U-3200.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360

Tabela 7 – Absorbâncias de solução de sulfato de quinina em HCl 0,1 N 10µg/mLem espectrofotômetro Hitachi U-3200.


2.2 Determinação de curva padrão de sulfato de quinina

Solução Mãe50 mg em BV 50 mLConc = 1 mg/mL

L1 L2 L3 Média CV DPP2 20 uL / BV 10 mL 0,1611 0,1623 0,1624 0,16193 0,4467 0,000723P4 40 uL / BV 10 mL 0,3153 0,3149 0,3143 0,31483 0,1599 0,000503P6 60 uL / BV 10 mL 0,4655 0,4678 0,4652 0,46617 0,3051 0,001422P8 80 uL / BV 10 mL 0,6158 0,6189 0,6194 0,61803 0,3156 0,00195P10 100 uL / BV 10 mL 0,7394 0,7356 0,7383 0,73777 0,2650 0,001955

Figura 7 - Curva Padrão de Sulfato de Quinina (concentração (µL/mL) / absorbância)

A metodologia desenvolvida parece apresentar condições adequadas para o doseamento desulfato de quinina em solução diluída de ácido, servindo como técnica de análise da matéria primautilizada. A presente metodologia deverá ainda ser testada quanto aos parâmetros de validação os quaisserão realizados nas próximas fases do projeto, conjuntamente com o desenvolvimento em paralelo deuma análise desta matéria prima em CLAE.


FASE 3 – Encapsulamento do Sulfato de Quinina em esferas de Alginato-Quitosana

Metodologia

1. Obtenção das microesferas contendo o princípio ativo

Trata-se de uma adaptação da melhor técnica de preparo descrita nos “Resultados eDiscussões” da fase 1.

A incorporação do princípio ativo se dá na solubilização de 1,5g de alginato em 100 mL desolução contendo sulfato de quinina a 0.1% (p/v) . Teve-se por fim uma solução aquosa de alginato1.5% (p/v) contendo sulfato de quinina a 0.1% (p/v). O gotejamento ocorreu em um banho de gelificação contendo 50 mM de CaCl2 e 200 mM deNaCl com formação de microesferas hidratadas de aspecto esférico regular deixadas em contato com obanho 30 minutos sob agitação mecânica (50rpm). Após isso, adicionou-se à suspensão uma soluçãode quitosana 0,15% (p/v) tamponada em acetato (pH 5,0), ficando as microesferas por mais 30 minutosem contato com essa solução sob agitação mecânica (50 rpm). Ao fim do processo, foram feitaslavagens 4 x 50 ml de água, sendo a última lavagem por membrana filtrante (filtro A4) a vácuo, commicroesferas hidratadas colocadas em placa de Petri e dessecador durante 24-48 horas .

2. Desenvolvimento da técnica de doseamento do sulfato de quinina na formulação

O doseamento do sulfato de quinina na formulação se deu por espectofotometria. Trata-se deuma aplicação da metodologia de doseamento descrita na fase 2 desse presente relatório, a qual fazialeitura, em comprimento de onda de 250 nm, de uma solução de sulfato de quinina dissolvida em ácidoacético 0,1N em concentrações que estivessem dentro da curva do sulfato de quinina.

2.1 Extração do sulfato de quinina

Foram realizado testes para avaliação da capacidade de diferentes soluções em solubilizar asmicroesferas. Pesou-se 10 mg das microesferas, transferindo-as para um balão volumétrico de 10 mL ecompletou-se volume com soluções descritas nos teste abaixo:§ Solução de citrato de Sódio 55 mM (Gaser∅d, 1998)§ Solução de HCl 0,1N/ Etanol (1:1)§ Solução de HCl 1N§ Solução de ácido acético 1%§ Solução de HCl 1N/ Etanol (1:1)§ Citrato de sódio 55 mM/ HCl 0,1N (1:1)§ Citrato de sódio 55 mM/ HCl 1N (1:1)§ Citrato de sódio 100 mM/ HCl 1N§ Citrato de sódio 100 mM

A mistura foi mantida sob ultrassom e ao final observou-se a solubilização ou não dasmicroesferas.


2.2 Método Direto

Pesou-se de 10 mg de microesferas, transferiu-se para um balão volumétrico de 10mLcompletando volume com citrato de sódio 55 mM. A mistura foi mantida sob ultrassom por 1 hora.Transferiu-se 1 ml dessa amostra para um balão volumétrico de 10 mL completando-se o volume comHCl 0,1N. Determinou-se a absorbância em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 250 nm.

2.3 Taxa de Rendimento

É obtido através da soma do peso do alginato (matriz) com o peso do sulfato de quinina(princípio ativo) comparado ao peso das microesferas ao final do processo.

Matriz + Princípio Ativo ------------------- 100% Peso das Microesferas no Final do processo ------------------- Y

Y = Taxa de rendimento

Resultados e discussão

1. Obtenção das microesferas contendo o princípio ativo

Observou-se microesferas secas, achatadas, fracamente aderidas a placa de Petri com corcaramelada e diâmetro de 0,5 – 1 mm, muito semelhante as microesferas resultantes da melhorformulação da fase 1.

2. Desenvolvimento da técnica de doseamento do sulfato de quinina na formulação

2.1 Método DiretoPesou-se de 10 mg de microesferas a qual equivalia a 0,744mg de sulfato de sulfato de quinina

de acordo com rendimento de 134,4 mg da formulação. Transferiu-se para um balão volumétrico de10mL completando volume com citrato de sódio 55 mM obtendo com isso uma concentração de0,0744 mg/mL de sulfato de quinina tratando-se em ultrassom por 1 hora. Coletou-se 1 ml dessaamostra e transferiu para balão volumétrico de 10 mL contendo HCl 0,1N. Após leitura emespectrofotômetro a 250 nm obteve-se uma absorbância de 0,00493 (média de 3 amostras – L1, L2 eL3) que era equivalente a 0,53µg/mL. Tomando-se 7,44 como 100%, 0,53 equivale a 7,12%.


2.2 Extração do sulfato de quinina

15 minutos 30 minutos 60 minutos 120 minutosSolução de citrato de Sódio 55 mM + ++ +++ +++Solução de HCl 0,1N/ Etanol (1:1) � � � �

Solução de HCl 1N � � � �Solução de ácido acético 1% � � ��

Solução de HCl 1N/ Etanol (1:1) � � � �Citrato de sódio 55 mM/ HCl 0,1N(1:1) �� Citrato de sódio 55 mM/ HCl 1N (1:1) � � � �

Citrato de sódio 100 mM/ HCl 1N �� Citrato de sódio 100 mM + ++ +++ +++

As soluções que apresentaram quebra evidente com pouco resíduo visível foram a solução decitrato de sódio 55 mM e a solução de citrato de sódio 100 mM. Optou-se pela solução de citrato desódio 55 mM por ser de menor concentração

2.3 Taxa de Rendimento

Alginato 150 mg Microesferas 134,4 mgSulfato de Quinina 10 mg Total 160 mg

Se 160 mg equivale a 100% de rendimento, 134,4 mg irá equivaler a 84%

Legenda:+ Leve Quebra++ Quebra evidente com muito resíduo visível+++ Quebra evidente com pouco resíduo visível

� Leve entumescimento�� Entumescimenrto�� Grande entumescimento comrompimento da microcápsula

Tabela 8 – Teste para quebra das microesferas e liberação do Sulfato de Quinina para doseamento


ETAPA II

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE PLGA NA ENCAPSULAÇÃODE PRINCÍPIOS ATIVOS ANTIMALÁRICOS

Março / 2003 – Agosto / 2003


Materiais

1. Reagentes

§ Ácido poli (D,L- lático-co-glicólico)(PLGA50/50, viscosidade 0,44 dL g-1)

§ Polietilenoglicol (PEG 4000)§ Sulfato de quinina (di-hidratado)Henrifarma;§ Álcool Polivinílico (PVA)§ Diclorometano grau analítico§ Água Milli-Q;§ Dietilamina (Sigma)§ Clorofórmio§ Acetonitrila grau HPLC§ Ácido ortofosfórico Merck§ Trialose Sigma

3. Equipamentos

§ Potenciômetro pH METRE F-8L Horiba§ Microscópio Olympus CH-2§ Bomba de vácuo§ Agitadores Magnéticos IKEMOTO 908 e YAMATO M-41§ Agitadores Mecânicos§ Sistema HPLC – High Performace Liquid Cromatograph (Shimadzu SPD – 6AV)§ Banho de Ultrassom§ Ultra-turrax T25, IKA§ Centrifuga Kubota KN-70§ Deep Freezer§ Liofilizador EZ-DRY FTS System§ Espectrofotometro Hitachi U-3200§ Coluna cromatográfica Fase Reversa Bondapak C18 (10ì m de diâmetro, 125 Å, 300mm x 3,9

mm I.D, Waters)

Metodologia

1.Obtenção de microesferas de sulfato de quinina

1.1. Preparo da Fase Aquosa Externa (PVA)

Trata-se de uma solução aquosa do tensoativo (PVA) à 0,5% p/v. A solubilização foi realizadaem agitador magnético com temperatura não superior a 40°C durante 30 minutos. Foram realizadaspreparações com soluções de PVA com diferentes faixas de pH. Após medição do pH a solução foisubmetida a filtração utilizando membrana Millipore® de 0,45 ì m.

2. Vidrarias

§ Balão volumétrico§ Bastão de Vidro§ Becker§ Erlenmeyers§ Kit de filtração à vacuo§ Pipetas volumétricas§ Pipetas Graduadas§ Provetas§ Dessecador§ Frascos de penicilina§ Frascos âmbar§ Outras


1.2. Preparo da Fase Aquosa Interna (PEG/Sulfato de Quinina)

400 mg de PEG 4000 foram solubilizados em 5 mL de água sob agitação magnética. Apóshomogeneização do PEG, adicionou-se o Sulfato de quinina aguardando-se o tempo necessário para ahomogeneização. As quantidades de sulfato de quinina variaram entre 25 e 50 mg.

1.3. Preparo da Fase Oleosa (PLGA)

450 mg do copolímero (PLGA) foram solubilizados em 10 mL de diclorometano. Asolubilização se deu sob agitação magnética.

1.4. Formação da Emulsão Simples (w/o)

A fase oleosa foi adicionada à fase aquosa interna sob agitação mecânica (ultra-turrax) a 8000rpm por 60 segundos em um banho de gelo, sendo formada a emulsão simples (Figura 8)

1.5. Formação da Emulsão Múltipla (w/o/w)

A emulsão simples foi adicionada a fase aquosa externa (fase contínua) sob agitação mecânica(ultra-turrax) a 8000 rpm por 30 segundos em um banho de gelo, sendo formada a emulsão múltipla(Figura 8).

1.6.Evaporação do Solvente

A emulsão múltipla foi mantida sob agitação a 400 rpm em agitador mecânico por 4 horas paraevaporação do solvente do polímero (Diclorometano) e conseqüente formação das microesferas peladiminuição da solubilidade do polímero no sistema, sua precipitação na forma de microesfera eaprisionamento do princípio ativo na malha polimérica formada (Figura 8). A formação dasmicroesferas foi acompanhada por observação periódica ao microscópio óptico.

Figura 8 – Formação de microesfera por evaporaçãodo solvente


1.7. Isolamento das microesferas por centrifugação

As microesferas foram isoladas por centrifugação a 2800 rpm por 5 minutos. Foram feitas 3centrifugações lavando-se três vezes com água Milli-Q® para remover o excesso de emulsificantes(PVA e parte do PEG).

1.8. Liofilização da amostra

Antes da liofilização, as microesferas foram previamente dispersadas com solução aquosa detrealose 1% (crioprotetor. Protege as microesferas quando estas são submetidas a congelamento rápido)e congeladas a uma temperatura de –80°C por um período de 12 horas.A liofilização foi realizadaoperando-se a 200 bars durante 16 horas . A estocagem das microesferas de PLGA foi feita a 4°Cdevidamente protegidas da luz.

2. Eficiência de encapsulação do Sulfato de Quinina

A quantidade de sulfato de quinina nos resíduos de lavagem da preparação e nas microesferasfoi determinada pelos métodos espectrofotométrico e CLAE (Cromatografia Líquida de AltaEficiência) como descrito abaixo:

EspectrofotometriaA metodologia para doseamento do sulfato de quinina por espectrofotometria já foi discutida na

etapa I deste trabalho.Os resíduos da formulação, que resultou na formação da microesfera, foramcentrifugados e levados para balão volumétrico de 100 mL, tendo o seu volume completo com águaMilli-Q® . Uma aliquota dessa solução (100 µL) foi pipetada para um balão de 5 mL, completando-seo volume com solução de H2SO4 0,1 N.

A curva padrão foi feita a partir de uma solução mãe de sulfato de quinina, em H2SO4 0,1 N,com concentração de 1mg/mL, efetuando-se diluições sucessivas para obtenção de concentrações finaisque foram de 1 µg/ml até 10µg/ml.A determinação das absorbâncias foi feita em espectrofotômetro, nocomprimento de onda de 250nm em triplicata, em função de suas concentrações, com a determinaçãoda equação da reta e sua regressão linear, realizado com auxílio do software Excel da Microsoft Co.

Analise do Sulfato de Quinina por método de Cromatográfico (HPLC)Uma variação do método proposto pela Farmacopéia Americana (USP) foi desenvolvido para

quantificar o sulfato de quinina contido nas microesferas de PLGA. O sistema de HPLC (ShimadzuSPD – 6AV) é composto por um detector UV/VIS e um injetor manual com um loop de 20 ì L. Acorrida cromatográfica foi feita usando uma coluna Bondapack C18 (partículas com 10ì m de diâmetro,125 Å, 300mm x 3,9 mm I.D, Waters) e uma fase móvel constituída por Água: Acetonitrila: Ácidoortofosfórico 7%: Dietilamina 10% nas proporções de 860: 100: 20: 20 partes, com o pH ajustado em2,6. Alíquotas da amostra foram injetadas e eluídas com a fase móvel num fluxo de 0,8 mL min –1. Opico do Sulfato de Quinina foi verificado no comprimento de onda de 250 nm com um tempo deretenção em torno de 10 minutos. A quantidade de sulfato de quinina nas microesferas foi determinadapela reta de ajuste dos pontos da curva padrão. A curva de calibração foi preparada com concentraçõesque variaram de 10 ì g.mL -1 a 50 ì g.mL –1. A solução padrão (0,2 mg.mL -1) foi preparada com 10 mgde Sulfato de Quinina em 50 mL de fase móvel sob 10 minutos de agitação ultrassônica. Desta soluçãopadrão, foram retiradas alíquotas para a diluição dos pontos da curva. Cada experimento foi feito emtriplicata.


3. Rendimento da formulação

É obtido através da soma do peso do PLGA (matriz polimérica) com o peso do sulfato dequinina (princípio ativo) comparado ao peso das microesferas ao final do processo.

Matriz + Princípio Ativo ------------------- 100% Peso das Microesferas no Final do processo ------------------- Y

Y = Taxa de rendimento

4. Caracterização das microesferas de PLGA contendo o Sulfato de Quinina

Analise MorfológicaO processo de produção das microesferas foi acompanhado por microscopia óptica para

a avaliação da formação e homogeneidade. A medição do diâmetro médio das microesferas foianalisada por microscopia óptica utilizando uma ocular milimetrada sendo os resultados tratadosestatisticamente com auxílio do software Excel da Microsoft Co. Para realizar a medição, umaamostra de microesferas foi suspensa em água Milli-Q® para obter uma suspensão homogênea.


Resultados e Discussão

1.Obtenção de microesferas de sulfato de quinina

Otimização da formulaçãoHouve a formação de microesferas em todas as formulações testadas. A formulação que

apresentou melhor eficiência foi a F3 pelo método cromatográfico (tabela 9)

Tabela 9 – Otimização da formulação das microesferas contendo Sulfato de Quinina. A eficiência foifeita por método cromatográfico.

F1 F2 F3 F4 F5PLGA 50:50 (mg) 450 450 450 450 450

Relação polímero droga 18:1 18:1 18:1 18:1 9:1PEG 4000 400 400 400 400 400

PVA 0,5% (mL) 50 50 50 50 50PH solução de PVA 8,6 Em torno de 6 10,3 11,1 5,5Sulfato de Quinina 25 25 25 25 50Tipo de Secagem liofilização Dessecador Liofilização Liofilização Liofilização

Peso Microesferas (mg) 415 315 469,3 544 446,3Rendimento (%) 87,37 66,32 98,8 114,53 89,26Eficiência (%) 1,56 1,62 23,91 12,95 2,43

Influencia do pH da fase aquosa externa na eficiência

A formulação, com pH da fase aquosa externa (solução de PVA) de 10,3, apresentou melhoreficiência pelo método espectrofotométrico (tabela 10).

Tabela 10 – Efeito do pH da fase aquosa externa na encapsulação do sulfato de quinina nasmicroesferas de PLGA. DP = Desvio Padrão. Método Espectrofotométrico

Polímero pH da Fase AquosaExterna

Diâmetro dasMicroesferas

(µµm ± DP)

Eficiência deEncapsulação

(% )PLGA 50/50 8,7 3,73 ± 1,69 43,4

PLGA 50/50 10,3 3,67 ± 1,59 56,2

PLGA 50/50 11,1 3,20 ± 1,32 46,0A formulação que apresentou melhor eficiência foi a F5, conseqüentemente melhor taxa de

encapsulação pelo método de CLAE (tabela 9).


3. Eficiência de encapsulação do Sulfato de Quinina

3.1 Espectrofotometria3.1.1 Curva Padrão

Solução Mãe25 mg em BV 25 mLConc = 1 mg/mL

Concentração L1 L2 L3 Média CV DPP1 1 µg/mL 0,0722 0,0720 0,0724 0,0722 0,2261 0,0002P2 2 µg/mL 0,1508 0,1451 0,1499 0,1486 2,08 0,0031P4 4 µg/mL 0,3037 0,3014 0,3098 0,3050 1,43 0,0044P6 6 µg/mL 0,4432 0,4665 0,4662 0,4587 2,91 0,0134P8 8 µg/mL 0,6252 0,6018 0,6044 0,6105 2,10 0,0128P10 10µg/mL 0,7584 0,7723 0,7666 0,7657 0,91 0,0070

3.1.2 Leitura de Resíduos de lavagem

Formulações Diluição L1 L2 L3 Média CV DPF1 100 µL/BV 5 mL 0,2103 0,2117 0,2102 0,2107 0,4 0,0008F3 100 µL/BV 5 mL 0,1742 0,1743 0,1712 0,1732 1,02 0,0018F4 100 µL/BV 5 mL 0,2119 0,2142 0,2120 0,2127 0,61 0,0013

Y= 0,07702 x - 0,00451R = 0,99999

Figura 9 – Determinação da curva padrão controle do sulfato de quinina. Gráfico foi plotado noOrigin e dados foram tratados no Excel da Microsoft Co. Cv = Coeficiente de Variância. DP=Desvio Padrão

Tabela 11 – Leitura das formulações F1, F3 e F4. L1, L2, L3 são as leituras feitas em triplicata


Formulações[ ] Sulfato de

Quinina(µg/mL)

Sulfato de Quininaem solução (mg)

Total de Sulfatode Quinina (mg)na formulação

Sulfato deQuinina emsolução (%)

Sulfato deQuinina em

microesferas(%)

F1 2,68 14,15 25 56,6% 43,4%F3 2,19 10,95 25 43,8% 56,2%F4 2,70 13,5 25 54,0% 46,0%

3.2 Analise do Sulfato de Quinina por método cromatográfico (HPLC)

3.2.1 Curva Padrão

Solução Mãe 10 mg em BV 50 mLConc = 0,2 mg/Ml

Concentração Área 1 Área 2 Area 3 Média CV DP10 µg /mL 5029,5 5107,5 5062,75 5066,583 0,77 39,1420 µg/mL 10196 10090,75 10202,5 10163,08 0,62 62,7330 µg/ mL 15459,75 15421,5 15587,25 15489,5 0,56 86,7940 µg /mL 20823,5 21008,75 21104,25 20978,83 0,68 142,7550 µg /mL 25695,75 25225 25721 25547,25 1,09 279,36

Tabela 12 – Determinação da eficiência de encapsulação das formulações F1, F3 e F4 pelo métodoespectrofotométrico

Y = 517,77x – 84,075R = 0,9992

Figura 10 – Determinação da curva padrão controle do sulfato de quinina pelo método cromatográfico.


FormulaçãoÁrea média da

triplicataDP CV

Concentraçãoteórica (µg/mL)

Concentraçãoprática

((µg/mL)

Eficiência(%)

F1 965,875 17,15 1,78 130,12 2,03 1,56F2 1308 21,92 1,68 165,08 2,69 1,62F3 13572,5 31,11 0,23 110,27 26,37 23,91F4 6201,5 17,68 0,29 93,75 12,14 12,95F5 1080,5 5,66 0,52 117,63 2,25 1,91

3. Caracterização das microesferas de PLGA contendo o Sulfato de Quinina

Em todas as formulações houve a formação da emulsão simples e múltipla, bem como aformação das microesferas (figura 7).O diâmetro médio das microesferas foi de 3,53 ± 0,29023.

Figura 7 – Micrografia das microesferasde PLGA contendo Sulfato de Quinina.

Tabela 13 – Leitura das formulações e determinação da eficiência pelo método cromatográfico.Amostras foram lidas em triplicata


CONCLUSÕES

¥ Foram obtidas microesferas de PLGA contendo Sulfato de Quinina em todas asformulações, sendo a formulação F3 a que apresentou melhor eficiência deencapsulação tanto pelo método cromatográfico (HPLC) quanto pelo métodoespectrofotométrico;

¥ A formulações com pH da fase aquosa externa de 10,3 (F3) e 11,1 (F4)apresentaram eficiência de encapsulação do sulfato de quinina de 23,91% e12,95% pelo método cromatográfico e de 56,2% e 46% pelo métodoespectrofotométrico respectivamente;

¥ A diferença de 32,29% na F3 e de 33,05% na F4, quando se compara os métodoscromatográfico e espectrofotométrico, pode ser devido a uma extração incompletado sulfato de quinina das amostras submetidas a HPLC;

¥ O Sulfato de Quinina em pH acima de 8,7 diminui a sua afinidade pela faseaquosa externa e aumenta a afinidade pela fase oleosa, resultando numa melhoreficiência de encapsulação.


Referências Bibliográficas

CRAVEIRO, A.A.; CRAVEIRO A.C. & QUEIROZ D.C. Quitosana – A Fibra do futuro. PADETEC-Parque de Desenvolvimento Tecnológico – UFC, 1999. 122p.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V; ROBBINS, S.L.; Patologia estrutural e funcional. Ed Guanabarakoogan. 4ª ed, p 332 – 335, 1991.

FUNASA (Fundação Nacional de Saúde) – Manual de Terapêutica da Malária. 2001

GASER∅D, O., SMIDSR∅D, O., SKJAKBRAEK, G. Microcapsules of alginate-chitosan – I – aquantitative study of the interaction between alginate and chitosan. Biomaterials, v.19, p.1815-1825,1998.

GASER∅D, O., SANNES, A., SKJAK-BRAEK, G. Microcapsules of alginate-chitosan – II – a studyof capsule stability and permeability, v.20, p.773 -783, 1999.

HANS, M. L.; LOWMAN, A.M. Biodegradable nanoparticles for drug delivery and targeting. CurrentOpinion in Solid State and Materials Science, 1, 2002.In Press

HARDMAN, G. J. & LIMBIRD, E. L. GOODMAN & GILMAN – As Bases Famacológicas daTerapêutica. 9 ed. Mc Graw Hill, 1996.

HAY, D.L.; VON FRAUNHOFER, J.A.; CHEGINI, N.;MASTERSON, B.J. Locking mechanismstrength of absorbable ligating devices. Journal of Biomedic Material Research, 22, 179 – 185, 1988.

JAIN, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide)(PLGA) devices.Biomaterial, 21, 2475 – 2490, 2000.

KANG, J.; SCHWENDEMAN, S.P. Comparison of the effects of Mg(OH)2 and sucrose on the stabilityof bovine serum albumin encapsulated in injetable poly( D,L-lactide-co-glycolide) implants.Biomaterials, 23, 239 – 245, 2002.

KUMAR, N.; RAVIKUMAR, M.V.N.; DOMB, A. J. Biodegradable Block Copolymers. AdvancedDrug Delivery News, 53, 23 – 44, 2001.

MANDAL, T.K.; BOSTANIAN, L.A.; GRAVES, R.A.; CHAPMAN, S.R.; IDODO, T. U. Porousbiodegradable microparticles for delivery of pentamidine. European Journal of Pharmaceutical andBiopharmaceutics. 52, 91 – 96, 2001.

SHU, X. Z.; ZHU, K.J. The release behavior of brilliant blue from calcium-alginate gel beads coated bychitosan: the preparation method effect. Eur. J. Pharm. Biopharm. 53, 193-201. 2001.

VANDENBERG, G.W.; DROLET, C.; SCOTT S. L. & DE LA NOUE, J. Factors affecting proteinrelease from alginate-chitosan coacervate microcapsules during production and gastric/intestinalsimulation. J Controlled Release. 77, 297-307 p. 2001.


WORLD HEALTH ORGANIZATION – Economic Costs of Malaria are Many Times Higher ThanPreviously Estimated. Press Release WHO/28, 25/04/2000 [on line 04/05/2002]. Disponível emwww.who.int/home-page

YOUAN, B.B.C.; JACKSON, T.L.; DICKENS, L.; HERMANDEZ, C.; OWUSUBIOABA, G. Proteinrelease profiles and morphology of biodegradable microcapsules containing an oil core. Journal ofControlled Release, 76, 313 – 326, 2001.

ZIMMERMAN, M.; PARSONS, J.R.; ALEXANDER, H. The design and analysis of a laminatedpartially degradable composite bone plate for fracture fixation. Journal of Biomedic Material ResearchApplied Biomaterial Suppl., 21, 345 – 361, 1987.

Zhou S.; Deng X. & Li X. Investigation on a novel core-coated microspheres protein delivery system.J Controlled Release. 75, 27-36 p. 2001.

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