Ensino de Biologia e Geologia

Princpios de Microbiologia Quinta-feira 11h-13h00

ANTIBITICOS Relatrio P9

RESUMO

Os antibiticos so substncias qumicas produzidas por

microorganismos que em concentraes muito baixas inibem

selectivamente outros microorganismos. Neste trabalho experimental

testar-se-o os efeitos de alguns antibiticos sobre trs estirpes bacterianas.

Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que

OBJECTIVO

O objectivo deste trabalho verificar a susceptibilidade de E.coli, de

Rhizobium e Actinomices aos antibiticos inibidores de sntese proteica.

INTRODUO

As estirpes microbianas frequentemente inibem o crescimento umas

das outras. Para alm de excretarem produtos finais resultantes do

metabolismo como lcoois e cidos, que podem limitar o crescimento de

alguns microorganismos, produzem substncias qumicas mais complexas e

bastante diferentes das restantes, tambm com efeito inibidor do

crescimento: os antibiticos. Os antibiticos so produtos microbianos ou

seus derivados que em concentraes muito baixas matam ou inibem

selectivamente outros microorganismos. Ao contrrio dos desinfectantes e

anti-spticos, que so aplicados a matrias inertes ou nos tecidos externos,

os antibiticos podem ser aplicados internamente.

Alguns antibiticos so produzidos por bactrias como actinomicetas

do gnero Streptomyces e outros por fungos, particularmente estirpes de

Penicillium e Aspergillus.

Os antibiticos constituem um grupo diversificado de compostos que

se podem agrupar em famlias com estrutura qumica semelhante. Assim,

antibiticos do mesmo grupo, normalmente tm tipos de actividade

semelhante e so usados na prtica para fins semelhantes. Em traos gerais

os antibiticos podem dividir-se quanto ao seu modo de aco em trs

grupos: Inibio da sntese da parede celular (penicilina), danificao da

membrana citoplasmtica, inibio da sntese proteica (estreptomicina),

inibio da sntese dos cidos nucleicos, inibio do metabolismo celular.

A sensibilidade dos microorganismos a antibiticos varia bastante. As

bactrias Gram positivas so normalmente mais sensveis a antibiticos do

que as Gram negativas, embora existam antibiticos que s actuem nestas

ltimas. Um antibitico que actue contra estes dois tipos de bactrias um

antibitico de largo espectro, normalmente mais usado para fins clnicos.

Neste trabalho experimental, para verificar a susceptibilidade de um

microorganismo a antibiticos, utilizou-se o mtodo do disco em placa

(mtodo de difuso). Neste mtodo colocam-se discos de papel de feltro

impregnados com vrios tipos de antibitico, superfcie de um meio onde

foi inoculado o microorganismo que se pretende estudar. Os discos de

antibitico so colocados na superfcie do meio com o auxlio de uma pina

esterilizada. Atravs de um antibiograma possvel avaliar a

susceptibilidade do microorganismo ao antibitico. O microorganismo ir

crescer durante a incubao, mas volta do disco embebido em antibitico

no se observar crescimento caso seja sensvel ao antibitico. O tamanho

da zona de inibio (Halo de inibio) causada pela difuso de um

antibitico no meio, est directamente relacionada com o grau de

susceptibilidade do microorganismo ao antibitico em causa. Quanto maior

for o Halo de inibio maior a susceptibilidade do microorganismo ao

antibitico. O dimetro do halo depende outros factores como a

concentrao inicial de antibitico, a quantidade de inoculo, tempo de

incubao, taxa de difuso do antibitico atravs do Agar, entre outros.

Assim, os antibiticos devem ser incubados nas mesmas condies. Outro

aspecto a ter em conta, o facto de substncias qumicas diferentes

difundirem-se a taxas diferentes podendo ser inactivadas em graus

diferentes pelo meio de cultura. Portanto no se pode analisar o dimetro da

zona de inibio para comparar directamente a eficcia de dois antibiticos

diferentes.

A concentrao mais baixa de um frmaco que impede o crescimento

de um determinado agente denominado por concentrao mnima

inibitria (CMI). Assim, cada disco deve ter uma concentrao especfica

de acordo com o antibitico que possui . A concentrao mais baixa de um

frmaco que destri o agente designa-se por concentrao mnima letal

(CML).

No trabalho experimental realizado, utilizou-se soluo salina para

controlo positivo e utilizaram-se como antibiticos a Kanamicina, a

Estreptomicina e a Espectinomicina, todos eles antibiticos

aminoglicosdeos inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam

ao nvel dos ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA

mensageiro, ou seja bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo,

conduzindo morte das clulas. As bactrias utilizadas para estudar a sua

sensibilidade aos antibiticos supra referidos, foram a E.coli, Rhizobium e

Actinomices. A Escherichia coli uma bactria que est presente na nossa

flora intestinal, Gram negativa e trata-se de um microorganismo

anaerbio facultativo. O Rhizobium uma bactria do solo, Gram negativo

e aerbio estrito. Por fim, Actinomices um microorganismo presente no

solo, Gram positivo e anaerbio.

Palavras-chave: Antibitico, Estreptomicina, Espectinomicina,

Kanamicina.

MATERIAL E REAGENTES

Material:

- Rolhes de algodo estril

- Discos de papel esterilizado

- Placas de Petri com agar nutritivo (3)

- Estufa de incubao

Reagentes:

- Cultura de E. coli - Cultura de Rhizobium - Cultura de Actinomices - Soluo de Kanamicina - Soluo de Estreptomicina - Soluo de Espectinomicina - Soluo salina

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Inoculao em massa

1. Transferimos 10 ml de soluo salina estril sobre a placa com crescimento bacteriano de E. coli

2. Espalhmos com uma pipeta de Pasteur 3. Suspendemos as bactrias com auxilio de um rolho de algodo estril e

inoculmos, humedecendo uniformemente, a superfcie do agar de uma

placa nova com o rolho.

4. Deixmos secar na estufa durante cerca de 10 minutos

Teste de susceptibilidade

5. Retirmos um disco de papel embebido de cada soluo de antibitico,

assim como de soluo salina e colocmo-los, identificando-os, na placa.

6. Repetimos os cinco passos anteriores para a cultura de Rhizobium e de

Actinomices

7. Deixmos a incubar na estufa com as seguintes temperaturas:

a. E. coli 37C b. Rhizobium e Actinomices 30C

8. Observmos e medimos os crculos de inibio, registando os resultados

RESULTADOS

Kan- kanamicina

STR- Estreptomicina

EPC- Espectinomicina

Salino- soluo salina estril

Zona de inibio de crescimento

E.coli

Disco

Actinomices

Rhizobium

ANTIBITICO Dimetro de inibio [cm]

E. coli Rhizobium Actinomices

Kanamicina 2,9 3,3 2,8

Estreptomicina 2,8 3,5 3,4

Espectinomicina 3,3 2,8 2,7

Soluo salina 2,2 1,0 1,5 Tabela 1: Registo de resultados dos crculos de inibio

Grau de sensibilidade

Resistncia Maior Intermdia Menor

E. coli Espectinomicina Kanamicina Estreptomicina ?

Rhizobium Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina ?

Actinomices Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina ? Tabela 2: Registo de sensibilidade aos antibiticos

Discusso dos resultados e concluso

Os halos de inibio, so como o prprio nome indica, zonas onde

no se verifica crescimento de microorganismos. Nesta actividade

verificou-se a formao de halos de inibio, ou seja o antibitico difundiu-

se prevenindo o crescimento de bactrias. Em alguns casos observaram-se

dois halos (Rhizobium). O halo interior corresponde a uma zona onde no

h crescimento bacteriano, o halo exterior corresponde a uma zona em que

houve algum crescimento devido ao aparecimento de bactrias mutantes.

Para uma melhor compreenso dos resultados convm relembrar que a

E. coli e a Rhizobium so Gram + e a actinomices Gram -, sendo a

primeira anaerbia facultativa, a segunda aerbia restrita, e a ltima

anaerbia. Os trs antibiticos utilizados so antibiticos aminoglicosdeos

inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam ao nvel dos

ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA mensageiro, ou seja

bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo, conduzindo morte das

clulas. Embora os nossos resultados estejam por vezes incorrectos, devido

a contaminaes, mau manuseamento do material, e outros erros aos quais

fomos alheios, recorremos comparao com valores de outros grupos e

podemos chegar a algumas concluses. O SPC um antibitico de pequeno

espectro, o STR de grande espectro, porque conseguiu penetrar na

camada de peptidoglicano das Gram + como nas Gram -. Em toda a

experincia a soluo salina deveria ter funcionado como controlo positivo,

mas tal no foi possvel porque num dos grupos anteriores ocorreu

contaminao contudo ainda apresentava um halo de inibio pequeno em

relao aos outros antibiticos. Conclumos que a E. coli mais susceptvel

ao SPC e menos susceptvel ao STR. Rhizobium e Actinomices

apresentaram maior sensibilidade ao STR e menor sensibilidade ao SPC .

como j foi referido o Rhizobium apresentava contaminao, pois era

possvel observar crescimento filamentoso tpico de fungos filamentosos.

Embora no tenha sido observado, era de esperar que o Actinomices fosse

o mais sensvel, visto tratar-se de uma bactria Gram +, como explicado

na introduo.

Para finalizar convm relembrar que todas estas concluses s foram

possveis atravs da comparao de resultados dos vrios grupos, visto que

os dados tericos no se concretizaram na prtica.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Brock Biology of Microorganisms. Madigan, Martinko e Parker.

Prentice Hall, 8th ed., 1997

Manual da disciplina e apontamentos da aula

Microbiology- Concepts and Applications. Pelczar, Chan e Krieg. McGraw-Hill, 1993.

Microbiology. Prescott, Harley e Klein. WCB, 5th ed., 2002.

Protocolo experimental Condies ambientais de crescimento microbiano (P9)

http://soils.(ses.ut.ede/ch/biol4684/microbes/rizobium.html

www.fmv.utl.pt/democ/sft/toxicelogia/toxclin.PDF

www.epa.gov/opptintr/biotech/fra/fra002.htm

www.micro.msb.le.ac.uk/video/Gram.html