INTRODUÇÃO A determinação de um analito em qualquer amostra biológica se baseia primariamente na reação do analito que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais reagentes visando a formação de um produto, que pode ser identificado visualmente ou medido através de um equipamento. Os produtos formados podem ter as mais variadas apresentações, podendo ser uma aglutinação de partículas, turvação, formação de cor ou formação de um produto sem cor, que pode ser identificado ou medido através de fotômetros ou contadores de radiação. Portanto, o trabalho no Laboratório Clínico se baseia, quase na sua totalidade, no uso de reagentes que produzem as reações desejadas, formando os produtos indicadores da reação. Reagentes para pesquisa visual ou qualitativa Os reagentes utilizados para pesquisa visual podem ser partículas de látex, células, principalmente hemácias, onde são aderidos antígenos ou anticorpos, destinados a reagir com a substância cuja presença se deseja identificar. As partículas têm a função de mostrar visualmente a reação ocorrida, que se manifesta pela presença ou ausência de aglutinação. Os reagentes podem ainda ser anticorpos específicos para antígenos que desejamos pesquisar ou quantificar e que desenvolvem reações cujo produto pode ser uma turvação ou uma precipitação em um meio sólido. Um dos exemplos correntes é a dosagem de imunoglobulinas por imunodifusão radial. Outra forma de identificação visual consiste na coloração de células onde os corantes reagem com substâncias presentes dentro das células, mostrando cores diferentes em função das reações ocorridas. A pesquisa visual utiliza também reagentes (antígenos ou anticorpos) imobilizados em membranas ou microplacas, que reagem com a substância a ser pesquisada. A ocorrência da reação antígeno-anticorpo é mostrada pela ação de reagentes auxiliares que desenvolvem cor, podendo até mesmo mostrar símbolos de fácil interpretação. A cromatografia de coluna ou camada delgada é também um modelo de pesquisa visual, que permite a separação de vários componentes em uma amostra biológica. A identificação dos analitos é realizada através dos mais variados processos de coloração ou pode ser feita através da própria cor dos analitos separados, como na separação cromatográfica das hemoglobinas. Em muitos casos pode-se utilizar um instrumento para quantificar os analitos separados. A pesquisa visual, quando qualitativa, é denominada genericamente como um "teste" que gera uma decisão de confirmar a ausência ou presença do analito. É um resultado em que a resposta é sim ou não, positivo ou negativo.

Reagentes para análise instrumental Na grande maioria das vezes, os reagentes utilizados na análise instrumental ou quantitativa devem gerar produtos, cuja quantidade pode ser medida com a utilização de um equipamento. Os dados obtidos são comparados com padrões para se obter a concentração do analito presente na amostra. Durante muito tempo os reagentes empregados na pesquisa instrumental utilizaram somente substâncias químicas, orgânicas ou inorgânicas, capazes de gerar um produto mensurável. Para gerar os produtos, estes reagentes em muitos casos, devem produzir grandes quantidades de energia ou necessitam da adição de energia externa fornecida por incubações em temperaturas elevadas. Estes reagentes químicos apresentam os seguintes problemas: a) dificuldades de manuseio por serem em muitos casos reagentes cáusticos; b) como o ensaio pode requerer o emprego de mais de um reagente e estes reagentes não

podem ser combinados para formar reagente único ou porque o sistema de reagentes requer incubações em temperaturas elevadas, dificilmente aplicáveis nos analisadores automáticos modernos;

c) em muitas situações utilizam sistemas analíticos complexos ou demorados, que por diversas razões não podem ser aplicados em aparelhos automáticos.

O desenvolvimento de métodos eficientes de fermentação e separação, permitiram a obtenção de enzimas purificadas de custo bastante acessível, fazendo com que as enzimas possam ser utilizadas como reagentes, substituindo os reagentes químicos em muitos sistemas analíticos. As enzimas passaram a fazer parte da formulação de um número cada vez maior de sistemas analíticos com as seguintes vantagens operacionais: a) emprego de reagentes pouco agressivos e de fácil utilização; b) facilidade para utilização de reagentes únicos, reduzindo as operações manuais; c) aplicação em analisadores automáticos, por empregarem reagentes únicos poucos

agressivos que não requerem incubações em temperaturas elevadas; d) custos operacionais totais muito similares aos dos reagentes químicos, porque reduzem

as operações manuais e são facilmente automatizados, reduzindo o custo teste/homem-hora.

As enzimas são também produtos químicos, mas devido a características próprias destes reagentes, os sistemas analíticos utilizando enzimas são denominados enzimáticos. Os usuários dos reagentes enzimáticos sentiram a necessidade de distinguir estes reagentes dos reagentes químicos e criou-se então a denominação de reagentes colorimétricos para os reagentes químicos e de reagentes enzimáticos para aqueles utilizando enzimas. Entretanto, muitos reagentes enzimáticos formam produtos coloridos, sendo colorimétricos também. Assim, para distinguir os dois tipos de reagentes, devemos denominar como enzimáticos os reagentes que utilizam enzimas, e como reagentes químicos aqueles que não utilizam enzimas. Os reagentes para dosagem do colesterol formam produtos coloridos, mas podem utilizar reagentes químicos ou enzimáticos. Assim, os métodos para dosagem de colesterol devem ser denominados como químico e enzimático e não como colorimétrico e enzimático.

Os métodos quantitativos têm a denominação genérica de "ensaios". A água como reagente A água é o suprimento de laboratório mais barato. Talvez, por este motivo, sua qualidade seja tão negligenciada, apesar de ser um reagente importante e o mais largamente utilizado. A água utilizada no laboratório deve ser PURA e este termo pode significar coisas diferentes, dependendo da situação. Se falamos que a água de um rio é pura, estamos afirmando que não é poluída e é adequada para natação, pescaria e esportes náuticos. Pureza da água de uso doméstico significa que ela é livre de microrganismos patogênicos, agentes tóxicos e própria para consumo humano. No Laboratório Clínico, a água é utilizada como reagente químico. Neste caso a denominação água pura significa que ela é usada como H2O e nada mais. A água de torneira contém quantidades variáveis de microrganismos, matérias orgânicas e inorgânicas dissolvidas ou em suspensão, com quantidades que dependem da região e estação do ano. Portanto, a água de torneira, apesar de ser adequada ao uso doméstico, não é própria para uso no Laboratório Clínico e deve ser purificada por meios apropriados. Hoje, nem mesmo a água de chuva é pura, devido à poluição atmosférica que ocorre nas grandes cidades e regiões industrializadas. O efeito das impurezas da água nos diversos testes de laboratório tem sido estudado sistematicamente e existem evidências de numerosas causas de erro. O cloro utilizado na água servida à população, na concentração em torno de 1,0 mg/l, pode introduzir erros de até 25% na dosagem de cloretos e interfere com vários procedimentos em bacteriologia e enzimologia. Traços de metais aceleram ou inibem várias reações e introduzem erros, muitas vezes consideráveis, nas dosagens de enzimas ou em procedimentos que utilizam enzimas como reagentes. A dimensão do erro gerado pela impureza da água depende em muito da concentração do analito. Um miligrama de sódio por litro de água pode introduzir um aumento de 4,3 mEq/l na dosagem de sódio se a diluição utilizada for de 1:100, representando um erro de 3,1%, em uma concentração de sódio de 140 mEq/l. Por outro lado, 1,0 mg de potássio por litro de água introduz um aumento de 2,5 mEq/l. Em uma amostra com potássio de 4,0 mEq/l, o erro é de 62%. Fica então claro que a água a ser utilizada no laboratório deve ser purificada para que não produza interferências nos testes ou ensaios. Vários são os processos de purificação que estão disponíveis para utilização no laboratório e a tabela que se segue relaciona os vários procedimentos de purificação da água e sua eficiência na remoção dos principais interferentes.

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Principais contaminantes e eficiência da purificação

Tabela 1: E = excelente; B = boa; P = pobre (remoção pequena ou nula)

Uma combinação dos processos de purificação da água para uso no Laboratório Clínico, que é eficiente e de baixo custo, consiste de: 1. filtro inicial para reter partículas e bactérias. 2. filtro de carvão ativado para eliminar matérias orgânicas. 3. sistema deionizador de leito misto ou separado para reter íons. Uma coluna de leito

misto é mais eficiente que duas colunas de leitos separados, com os mesmos volumes de resinas.

O processo de deionização, devido ao baixo custo de manutenção porque economiza água e energia elétrica, tem aplicação muito comum nos Laboratórios Clínicos, mas o sistema pode apresentar os seguintes problemas: 1. pequena sensibilidade no sistema de informação da qualidade da água processada,

permitindo a utilização de água imprópria. 2. contaminação com bactérias, que deteriora rapidamente as resinas. 3. liberação de silicatos, substâncias alcalinas e potentes oxidantes, que interferem nas

reações, principalmente as enzimáticas. A água deionizada pode ser utilizada com sucesso no Laboratório Clínco, supondo que os cuidados de controle da qualidade sejam tomados e que a água seja testada todas as vezes em que se obtiver um novo lote. A água de uso no laboratório foi classificada em quatro graus de pureza, em função da concentração de contaminantes mais importantes. Os quatro graus de pureza da água são mostrados na tabela abaixo. Todas as especificações foram estabelecidas no momento da produção da água.

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Especificações da água como reagente

NM = não mensurável; ufc = unidades formadoras de colônias; PZ = próximo de zero Existe ainda uma especificação para a água que é usada em HPLC, cultura de células e tecidos, análise de cromossomas e testes de HLA, que é denominada água tipo 'Especial'. A medida da resistividade deve ser feita com um condutivímetro. Os silicatos podem ser facilmente medidos, conforme será mostrado adiante quando for abordado o controle da qualidade da água. O número de bactérias pode ser determinado utilizando uma cultura quantitativa. Para obter uma água que somente contenha partículas menores que 0,22 mm, deve-se filtrá-la em um filtro com poro de diâmetro igual a 0,22 mm. A água de tipo I só existe nesta forma no momento de sua produção, pois a resistividade irá diminuir porque metais ou matéria orgânica podem se desprender do recipiente de armazenamento. Portanto, quando um reagente requerer este tipo de água, ele deve ser preparado imediatamente após a produção da água. Deve-se minimizar o armazenamento da água tipo IIa, para que se mantenha uma consistência de qualidade específica para a aplicação da água. Os sistemas de armazenamento da água de tipos IIb e III devem ser construídos com materiais que não facilitem a contaminação química ou bacteriana. Certos cuidados devem ser tomados após obter água destilada ou deionizada, pois não tem sentido obter uma água de boa qualidade e contaminá-la durante o processo armazenamento. Não se deve armazenar a água tipo IIb ou III por mais de uma semana, e o recipiente de armazenamento deve ser lavado, todas as vezes em que se adicionar novo lote de água. Não utilizar tubos de borracha como saídas da água e deve-se constantemente lavar as vedações da torneira.

De modo geral, como a água deionizada se encontra em um estado antinatural e tem a tendência a retornar ao estado anterior à purificação, deve-se evitar armazená-la, qualquer que seja a aplicação. Quando se usar água deionizada, é recomendável obter a quantidade suficiente para um dia de trabalho, utilizando a porção que sobrar para recompor a água do banho-maria.

-------------------------------------------------------------------------------- Aplicações da água como reagente

Tabela 3

Para a preparação dos diversos regentes é necessário selecionar o tipo de água mais adequado, em função da qualidade requerida. A tabela acima mostra a aplicação dos tipos de água na preparação dos reagentes utilizados no laboratório. Assim, se desejamos preparar um reagente enzimático, devemos utilizar água Tipo IIa, no mínimo e os reagentes para fluorescência quantitativa devem ser preparados com água tipo I, imediatamente após sua produção.

-------------------------------------------------------------------------------- Controle da qualidade da água O controle da qualidade da água deionizada pode ser realizado por verificação do aparecimento de alcalinidade, utilizando solução alcoólica de fenolftaleina a 1%. Adicionar uma gota de fenolftaleina a 10 ml de água. O aparecimento de cor vermelha indica perda da qualidade da água. Outro procedimento de controle consiste em verificar a quantidade de silicatos, que são os primeiros elementos a aparecerem na água quando ela começa a se tornar imprópria para utilização. Como os reagentes para dosagem de silicatos são os mesmos empregados para dosar fósforo inorgânico, pode-se utilizar o branco da dosagem de fósforo. A absorbância do branco, quando lida contra água em 650 nm ou filtro vermelho (640-700), não deverá ser maior que 0,010 ou não deve ocorrer formação de cor azul visível, que corresponde a uma concentração de silicatos maior que 0,10 mg/l. Esta informação indica que a água deionizada está imprópria, contendo uma concentração de silicatos acima do máximo aceitável, devendo ser feita a regeneração ou troca da resina.

Limpeza do material de laboratório A utilização de material limpo é fundamental para a qualidade dos resultados, pois a introdução de contaminantes pode inibir ou potencializar as reações de modo indesejável. Os contaminantes no material de trabalho poderão atuar como reagentes adicionais, que irão agir como inibidores ou ativadores e até mesmo podem ser da mesma qualidade do analito, produzindo resultados falsamente elevados.Os diversos procedimentos no laboratório podem requerer formas distintas de limpeza do material. Assim, na dosagem de traços de elementos como cálcio, ferro, cobre e outros, deve-se tratar a vidraria com ácido clorídrico a 50% ou nítrico a 30% e lavar exaustivamente com água de torneira e água deionizada. Entretanto, um modelo básico que tem aplicação geral no laboratório pode ser proposto. Em primeiro lugar devemos nos preocupar com a prevenção, para impedir que reagentes e proteínas fiquem aderidos a pipetas, ponteiras e tubos de ensaio. A vidraria deve ser imersa, logo após o uso, em uma solução de detergente a 0,5 ou, no máximo, a 1,0%. Soluções de detergentes muito concentradas dificultam sua remoção da vidraria e os detergentes aderidos podem atuar como inibidores ou ativadores de outras reações. A vidraria deverá ficar imersa na solução de detergente por um mínimo de 1 hora ou tempo maior quando a contaminação for muito grande. As pipetas e tubos de ensaio devem ser enxaguados exaustivamente com água de torneira e lavados pelo menos duas vezes com água deionizada ou destilada. Secar em estufa a 80 °C. As ponteiras, imediatamente após serem usadas, devem ser colocadas em um frasco de boca larga, contendo solução de detergente a 0,5% ou de hidróxido de sódio a 1%. O frasco deve ser suficientemente grande para permitir que todas as ponteiras fiquem imersas na solução. Para lavar as ponteiras, tampar o frasco e agitar várias vezes por um período de aproximadamente 30 minutos. Pode-se usar um agitador mecânico. Lavar em seguida, exaustivamente, com água de torneira, usando o mesmo processo de agitação. Enxaguar finalmente com água deionizada ou destilada e secar em estufa a 37 °C. As cubetas devem ser lavadas com água deionizada, imediatamente após as leituras. As cubetas usadas para as dosagens de ferro e cálcio, capacidade de ligação de ferro e magnésio devem ser lavadas com ácido clorídrico ou nítrico e enxaguadas com água de torneira e água deionizada. Cubetas de fluxo devem ser lavadas com solução de hipoclorito de sódio a 1%, ou hidróxido de sódio a 1%. Lavar em seguida com água deionizada. As multicubetas dos sistemas automáticos de análise devem ser colocadas, imediatamente após o uso, em solução de detergente (0,5 - 1,0%), lavados então com água de torneira e enxaguadas com água destilada ou deionizada. Secar em estufa a 37 °C. Como a limpeza de ponteiras e multicubetas é uma tarefa difícil e trabalhosa, muitas vezes não garantindo a limpeza química do material, deve-se avaliar a relação custo benefício entre executar esta tarefa ou descartar estes materiais.

Reações As reações correspondem ao resultado da atuação de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto. Existem vários modelos de reação e aquele a ser escolhido para determinado sistema analítico irá depender dos reagentes a serem utilizados ou disponíveis e das facilidades instrumentais. Reações de aglutinação Utilizam partículas ligadas a antígenos ou anticorpos que reagem com um analito produzindo uma reação visível a olho nú ou ao microscópio. Nos formatos analíticos utilizando microplacas a aglutinação se manifesta pela formação de um tapete no fundo da escavação, enquanto a ausência de aglutinação é mostrada por uma deposição das partículas em forma de botão. Em muitas reações de aglutinação utiliza-se o modelo da inibição de aglutinação e as reações positivas se manifestam pela ausência de aglutinação. Reações de turvação e precipitação Ocorrem por precipitação de um analito, na maioria das vezes uma proteína, por ação de um reagente, que pode ser químico ou um anticorpo. As turvações podem ser observadas visualmente ou medidas por fotometria ou nefelometria e, nestes dois casos, a proteína precipitada permanece na forma de suspensão. As precipitações podem ocorrer em meio sólido ou líquido e quase sempre são analisadas visualmente. Reações colorimétricas São aquelas em que os produtos formados têm uma cor e as intensidades das cores são medidas na faixa visível do espectro (380 - 680 nm). Reações ultravioleta São reações cujos produtos formados absorvem energia radiante ("luz") na porção do ultravioleta próximo, mais especificamente em 365 ou 340 nm. As reações colorimétricas ou ultravioleta podem ser utilizadas em vários modelos, como reações de ponto final e reações cinéticas. Reações de ponto fnal As reações de aglutinação, turvação ou precipitação são, em muitas situações, reações de ponto final, mas o termo é especialmente dedicado àquelas reações que formam um produto cuja concentração chega a um ponto máximo, permanecendo inalterada por um determinado tempo em função da estabilidade do produto. Estas reações podem ser colorimétricas ou ultravioleta (UV). Um número bastante elevado de ensaios utiliza as reações de ponto final e a concentração do produto formado é medida através de leituras

fotométricas. Podemos mencionar alguns exemplos, como as dosagens químicas ou enzimáticas de ácido úrico, colesterol, glicose e triglicérides. A reação de ponto final é a mais empregada no laboratório devido à sua flexibilidade de aplicação instrumental, pois pode ser utilizada em metodologias manuais e automatizadas. Sua aplicação em métodos manuais é facilitada pela estabilidade do produto da reação, permitindo ensaiar muitas amostras simultaneamente, com a manutenção da qualidade nos ensaios. A figura 1 mostra graficamente uma reação de ponto final.A divisão em três etapas mostra o início e incremento na formação do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do produto por perda da estabilidade.

Figura 1: a: início da formação do produto; b-c: período de estabilidade onde a medida fotométrica é realizada; c: perda da estabilidade do produto.

Reações cinéticas São reações onde a velocidade da formação do produto é medida durante um intervalo de tempo, que pode ser horas, minutos ou segundos e a denominação cinética é decorrente do relacionamento da reação com o tempo. Muitos consideram que as reações cinéticas são aquelas em que se mede a formação de produto usando pequenos intervalos de tempo, minuto a minuto, na faixa ultravioleta do espectro (340 ou 365 nm). Estas reações, sem dúvida, são cinéticas, mas também o são aquelas reações em que se mede a formação de um produto em 5, 10 ou 30 minutos de incubação. As dosagens de fosfatase alcalina, amilase, entre outras, são realizadas utilizando reações cinéticas. As reações que utilizam medidas contínuas da formação de produtos, muitas vezes chamadas de espectrofotométricas, devem ser denominadas "reações de cinética contínua".

A figura 2 mostra, graficamente, uma reação de cinética contínua, sendo também dividida em 3 etapas para melhor entendimento do comportamento da reação.

Figura 2: a-b: fase inicial da reação onde a velocidade não é constante; b-c: reação com velocidade constante onde pode-se obter as diferenças de absorbância/minuto (D 1 - D 9),

usadas para calcular o resultado; c: redução da velocidade de reação por consumo do substrato.

As reações que utilizam um tempo fixo de incubação e a formação de produtos é interrompida por qualquer processo, muitas vezes chamadas de colorimétricas, devem ser denominadas mais corretamente como "reações cinéticas de tempo fixo". Cada modelo de reação tem seus méritos, que vamos discutir a seguir, mostrando os benefícios de cada um dos modelos metodológicos. Vantagens da reação de cinética contínua: 1. Elimina o uso de brancos, porque a primeira leitura é usada como branco. 2. A monitorização frequente ou contínua da absorbância permite a verificação da

velocidade da reação, possibilitando, utilizar nos cálculos, os intervalos onde a velocidade da reação é constante.

3. Os pequenos tempos de incubação minimizam possíveis inibições por produtos da reação e também reduzem o tempo total de operações.

4. Os métodos são mais específicos porque a velocidade da reação, na maioria das vezes, não é afetada por interferentes, tais como bilirrubina, hemoglobina ou turvação da amostra.

5. Os métodos permitem eliminar dos cálculos da atividade enzimática ou da concentração do analito a fase inicial da reação, onde a velocidade é dependente do sistema de reações e pode não ser constante.

6. Muitas reações que utilizam o ultravioleta são mais facilmente adaptáveis a uma grande variedade de determinações da atividade enzimática.

7. Extensa documentação clínica mostra excelente correlação entre os resultados das dosagem de enzimas por reação de cinética contínua UV e o diagnóstico final.

8. Habitualmente, as reações têm melhor precisão. 9. São facilmente automatizáveis. Um dos cuidados mais importantes nas reações de cinética contínua é o controle da temperatura. Muitos usuários executam a reação em equipamentos desprovidos de controle de temperatura, assumindo que a temperatura será de 25 °C. Em muitas situações a temperatura dentro do fotômetro poderá estar acima ou abaixo de 25 °C, fornecendo resultados falsamente elevados ou diminuídos. Quando não se dispõe de um fotômetro com temperatura controlada, deve-se utilizar de reações cinéticas de tempo fixo. Vantagens da reação cinética de tempo fixo 1. Como as reações são interrompidas após um tempo de incubação, pode-se processar

bateladas de testes. 2. Nos procedimentos manuais, o envolvimento dos técnicos é menor. 3. Não requer fotômetros com temperatura controlada, possibilitando a incubação em

banho-maria com temperatura constante. 4. Todas as dosagens de enzimas podem ser interrompidas, mas nem todas podem utilizar

uma reação de cinética contínua. 5. Quando a reação é colorimétrica, pode-se utilizar de um sistema de reagentes que

formam produtos com maior absortividade molar e obter uma sensibilidade melhor que nas reações de cinética contínua.

6. Em muitos analisadores modernos podem ser facilmente automatizadas. 7. Pode-se, em muitos casos, utilizar padrões primários. 8. Nas reações que utilizam NAD/NADH, necessita-se de menor quantidade da coenzima,

reduzindo o custo do reagente. 9. As reações colorimétricas não requerem espectrofotômetros de alta resolução, podendo

ser aplicadas em colorímetros. 10. Em muitos casos pode-se eliminar as reações acopladas, muitas vezes necessárias nas

reações de cinética contínua, reduzindo os problemas de otimização e de custos de reagentes.

11. Nas dosagens de amostras com elevada atividade enzimática, pode-se reduzir o tempo de incubação e eliminar a diluição da amostra, que sempre introduz erros nos ensaios, principalmente valores falsamente elevados.

As reações cinéticas de tempo fixo requerem também um rigoroso controle do tempo e da temperatura de incubação, para que os resultados tenham a qualidade esperada. Um dos erros mais comuns neste tipo de reação ocorre no controle do tempo de incubação. Deve-se marcar o tempo no momento em que a amostra entra em contato com o substrato, que já deve estar na temperatura de incubação, isto é, dentro do banho-maria. Quando houver várias amostras a serem dosadas, pipetá-las com intervalos de tempo, 10 a 15 segundos. Quando o tempo se completar, interromper a reação com os mesmos intervalos.

Um mesmo analito pode ser dosado tanto por uma reação de cinética contínua como por uma reação de cinética de tempo fixo e podemos citar como exemplo a dosagem da g-Glutamil Transferase. As reações cinéticas são geralmente aplicadas nas dosagens de enzimas, mas podem ser utilizadas para dosagem de analitos, habitualmente ensaiados por reações de ponto final. A creatinina é comumente dosada com uma reação de ponto final, mas pode-se também utilizar uma reação cinética de dois tempos. Neste caso, a reação de ponto final é aplicada em metodologias manuais e a reação cinética é utilizada, principalmente, em metodologias automatizadas. Outro analito medido por reações de ponto final e reações cinéticas é a uréia. Quando se dispõe de facilidades instrumentais para medidas fotométricas contínuas em tempos reduzidos, pode-se medir em modo cinético de dois tempos vários analitos habitualmente ensaiados por reações de ponto final. Se uma dosagem de glicose, usando a enzima glicose oxidase, é medida em 15 minutos na reação de ponto final, pode-se realizar a mesma dosagem usando um instrumento capaz de medir a reação em um tempo de 5 minutos ou menos, quando se tem a certeza de que as medições das amostras desconhecidas, padrões e controles serão feitas no mesmo tempo de reação e que a velocidade de reação é a mesma para amostras, controles e padrões. As reações de cinética de dois tempos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de reação, reduzir a influência de interferentes (creatinina) ou estender a linearidade do sistema analítico (uréia UV). Comumente, as reações cinéticas de 2 tempos utilizam a fase inicial da reação com uma leitura aos 30 segundos, que servirá como branco, e outra leitura aos 90 segundos. Utiliza-se então o DA correspondente a um minuto para calcular a concentração do analito.

Figura 3: uma das diferenças de absorbância: (B-A, C-B ou D-C ) pode ser usada para cálculo do resultado.

A escolha da diferença mais adequada irá depender da melhor linearidade, da eliminação de interferentes ou da melhor sensibilidade. Observar que a velocidade da reação é maior nos tempos iniciais, onde logicamente a sensibilidade é maior.

Existem reações cinéticas de dois tempos em que os intervalos são maiores, como no caso da frutosamina, quando é necessário um tempo mais longo na fase inicial para maximizar a eliminação de interferentes. Deve-se enfatizar que o controle da temperatura também é fundamental nas reações cinéticas de dois tempos. As reações cinéticas de dois tempos são reações cinéticas de tempo fixo, em que a primeira leitura é usada como branco e o tempo de incubação é reduzido para se obter melhor desempenho ou agilizar o procedimento. CONCLUSÕES As reações representam a base do trabalho no Laboratório Clínico e o conhecimento dos vários modelos é relevante para uma atuação adequada e intervenção em muitas dificuldades técnicas encontradas no dia a dia do trabalho. Para finalizar, procuramos sintetizar nas duas figuras abaixo, as principais reações utilizadas no Laboratório, classificando-as de acordo com o produto ou o modelo da reação.

Figura.4: Reações Segundo o Produto Formado

Fig.5: Reações Segundo o Procedimento

Intervenção em problemas técnicos Um problema técnico ocorre quando existe uma dificuldade em se obter o resultado de um determinado ensaio ou quando a reação não se mostra com o desempenho adequado ou esperado. A criação de um modelo de orientação, capaz de identificar todas as causas de problemas e com habilidades suficientes para indicar as formas de solução, é uma tarefa bastante difícil, pois são inúmeras as causas e fatores responsáveis por problemas técnicos. Entretanto, estas dificuldades não impedem a criação de um modelo experimental tentativo e com muitas possibilidades de fornecer ajuda efetiva.

-------------------------------------------------------------------------------- Modelo experimental tentativo A forma inicial para abordar um problema técnico consiste em definir o erro que está ocorrendo, o que pode facilitar a identificação do problema e permitir sua correção adequada. Se os resultados de padrões ou de controles apresentam uma variabilidade muito grande, seja nas dosagens em duplicata ou no dia a dia, está ocorrendo um Erro Aleatório. Este erro pode ser devido às seguintes causas: amostra inadequada, erros na medida da amostra, temperaturas ou tempos incorretos de incubação, técnica mal conduzida, vidraria contaminada, defeitos no fotômetro e água de má qualidade. Se os resultados mostram valores consistentemente elevados ou diminuídos, está ocorrendo um Erro Sistemático, que tem como causas principais os seguintes fatores: amostras inadequadas, seja por erros de medida, de conservação ou de preparo, temperaturas ou tempos incorretos de incubação, erros de calibração, erros de comprimento de onda, presença de interferentes, reagentes contaminados, inadequadamente conservados ou preparados de modo incorreto, defeito no fotômetro, bias do analista e água de má qualidade. Quando ocorre um problema técnico, deve ser feito um esforço sistemático para encontrar a causa e introduzir as medidas de correção. Deve-se, em primeiro lugar, fazer uma revisão de todo o processo operacional, procurando as causas mais óbvias como: pipetas utilizadas, principalmente a usada na medida da amostra; avaliar se não houve omissão ou troca de reagentes; verificar o desempenho do fotômetro e a correção dos cálculos dos resultados.

É evidente que um conhecimento adequado da metodologia, das causas de erro e a experiência com a metodologia irão contribuir decisivamente para identificar as causas do problema e encontrar um solução. Deve ser criado um esquema de avaliação dos problemas, que, para conveniência, pode ser dividido em 3 sub-unidades: pré analítica, intra-analítica e pós-analítica. A idéia é estabelecer pontos de verificação em cada passo da metodologia, visando identificar o erro e ajudar na solução do problema técnico ou de qualidade. Cada método deve ter seu esquema próprio, pois eles diferem em etapas e procedimentos. Relacionaremos a seguir um roteiro básico contemplando as três sub-unidades analíticas. É evidente que etapas na sub-unidade intra-analítica deverão ser suprimidas ou inseridas.

-------------------------------------------------------------------------------- Etapa pré-analítica Preparo do paciente • paciente foi corretamente preparado? • paciente está em uso de medicamentos provavelmente interferentes? Obtenção da amostra 1. Foi conferida a identificação do paciente? 2. A amostra foi obtida no momento adequado? 3. Foi utilizado o anticoagulante correto? 4. A amostra foi preservada corretamente? 5. A identificação está correta? Não houve troca de amostras? Processamento da amostra 1. As células foram separadas no tempo correto? 2. Foi realizada extração ou outro processo preparativo? 3. armazenamento foi correto (refrigeração, proteção da luz)? 4. A amostra está turva ou hemolisada e é adequada para o teste? -------------------------------------------------------------------------------- Etapa intra-analítica Passo 1 - Pipetagem da amostra 1. A vidraria e ponteiras estão corretamente limpas?

2. As ponteiras estão bem conservadas e são de boa qualidade, adequadas para a pipeta automática?

3. Foi utilizada a pipeta correta? 4. procedimento de pipetagem foi correto, com a amostra pipetada no fundo do tubo de

ensaio? 5. Não houve troca de amostras? Passo 2 - Adição do reagente n° 1 1. reagente foi corretamente preparado a partir da solução estoque (quando for o caso)? 2. reagente está dentro de sua validade e foi armazenado corretamente? 3. Ocorrem modificações visuais no reagente (turvação, precipitação, modificação da

cor)? 4. Foi pipetado o volume recomendado? 5. A mistura reagente/amostra foi correta? Passo 3 - Adição do reagente nº 2 Mesmas observações do passo 2 Passo 4 - Incubação 1. tempo e temperatura de incubação estão corretos? 2. A adição de amostra ao substrato foi efetuada na temperatura de incubação? 3. Na dosagem de enzimas, após a mistura de amostra e substrato, foi observado o tempo

crítico de incubação? 4. nível de água do banho-maria estava superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio? Passo 5 - Medida fotométrica 1. Foi realizada a manutenção preventiva do aparelho? 2. As funções Absorbância e/ou Transmitância estão operando corretamente? 3. Foram verificados os Zeros mecânico e elétrico? 4. A cubeta estava limpa e corretamente posicionada? 5. volume de reagente na cubeta foi suficiente para leitura? 6. filtro ou comprimento de onda estavam corretos?

-------------------------------------------------------------------------------- Etapa pós-analítica Cálculos 1. Os cálculos estão corretos? Refazê-los, se feitos manualmente. 2. resultado está dentro da linearidade do método? 3. Foi feita diluição da amostra e a diluição não considerada no momento dos cálculos?

Curva de calibração ou fator 1. A curva de calibração ou fator estão corretos? 2. valor do fator está próximo daqueles anteriormente obtidos? 3. Foi feito arredondamento em fatores menores que 1,0? 4. Valores dos controles 5. Os valores dos controles estão dentro dos limites estabelecidos? 6. Observam-se tendências ou desvios na análise dos mapas de controle? Resultados ou relatórios 1. Estão legíveis para impedir erros na interpretação? 2. Estão limpos, com datilografia de boa qualidade? 3. Não ocorreram erros de transcrição? 4. É possível comparar os resultados com o quadro clínico do paciente, para confirmação

de resultados fora da faixa de referência? Os problemas técnicos ocorrem em situações inesperadas, muitas vezes em metodologias que estão operando em condições estáveis no laboratório. Portanto, na ocorrência de uma dificuldade com determinado método, deve-se procurar uma das causas de erro mencionadas acima, para encontrar a solução para o problema.