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Em qualquer ensaio bioquímico a conservação das amostras em estudo é de extrema importância poi,s em última análise, é

do correcto acondicionamento das mesmas que dependerá a reprodutibilidade e eficiência de todo o trabalho. Em cinética

enzimática e nos processos de purificação de proteínas a estabilidade das amostras consegue-se baixando a temperatura de todos os passos que não constituam o ensaio cinético para a

quantificação de actividade. No trabalho experimental a realizar em que se estudam os parâmetros de actividade óptima

da enzima peróxidase de rabanete a temperatura de trabalho será, sempre que possível, 4ºC. Nestas notas breves são feitas ainda algumas considerações sobre a utilização de tampões,

justificando o seu emprego em função da actividade enzimática, mas também de acordo com requisitos de conservação do

extracto bruto onde se encontra a enzima.

Tampões biológicos Tampões comuns em biologia molecular Misturas de tampões processos de disrupção celular Processameto de extractos Estabilização de extractos enzimáticos Conservação de extractos enzimáticos e enzimas puras

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Tampões Biológicos Razões do uso de tampões e algumas características Os organismos vivos resistem a variações internas de pH devido à produção de sistemas tampão ao nível celular, formando ácidos e bases fracas como o ácido carbónico, láctico e amónia. Entre os principais sistemas tampão dos organismos vivos encontram-se o tampão fosfato, bicarbonato e diferentes estados de ionização de aminoácidos e proteínas. O facto dos diferentes processos biológicos serem condicionados pelo pH do meio deve-se fundamentalmente a quatro razões: 1 .O processo pode ser catalizado na presença estrita de hidrogeniões (H+) 2. O H+ pode ser um reagente ou um produto da reacção 3. Podem alterar a permeação de membranas biológicas devido à ionização de grupos

funcionais que interferem na conformação de proteínas que constituem canais 4. As variações de pH são fundamentais para que algumas proteínas completem a sua

função biológica As soluções tampão usadas em investigação de sistemas biológicos apresentam a propriedade do pH não se alterar significativamente por uma pequena quantidade de ácido e base e uma mistura terá uma boa capacidade tampão dentro da gama pKa ±1 sendo que a mesma depende da concentração total das espécies AH e A-. No trabalho experimental a realizar: - Purificação e Cinética da Peroxidase de Rabanete – iremos usar pelo menos cinco tampões diferentes em momentos distintos do trabalho experimental. Tratando-se da mesma amostra em estudo, a selecção de diferentes tampões a usar depende do processo a que nos reportamos num determinado ensaio. Por exemplo, devemos escolher tampões distintos mesmo que apresentem a mesma gama de capacidade tampão quando purificamos enzimas, aferimos a sua actividade in vitro ou permeabilizamos células e queremos estudar a mesma actividade in situ.

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Devido aos numerosos e morosos passos associados à purificação de enzimas, o critério de economia começa a tornar-se importante logo de início. Recorre-se muitas vezes a um tampão barato como o Tris-HCl. Outro dado importante é a carga global do tampão que, em processos de cromatografia em coluna, pode competir com os grupos de troca da matriz reduzindo a eficiência desta. Em contradição com este cenário, existe aquele em que após se ter purificado total ou parcialmente a enzima em estudo se pretende determinar os parâmetros cinéticos associados à sua actividade. Neste último caso, é fundamental que o tampão não absorva no comprimento de onda abrangido pelo método espectrofotométrico escolhido (se for o caso) e não afecte a linearidade do produto formado no decurso da reacção. Em ensaios de dependência de temperatura, é necessário que esta variável não interfira grandemente com a capacidade tampão do composto, Tab. 1.1. Tabela 1.1 – Exemplos de tampões usados em biologia molécular e suas características mais importantes. Tipos de Tampão Características Fosfatos Inibe cináses, descarboxilases e enzimas que

tenham como substratos ésteres de fosfato. Promove o desenvolvimento de microorganismos.

Bicarbonato Decompõe-se facilmente segundo a reacção HCO3-

� CO2 . Requer um sistema fechado. Tris-HCl Forma bases de Schiff com aldeídos e cetonas. O

pH varia com a temperatura. Interfere com o método de Lowry. Possuí propriedades anti-sépticas.

Borato Complexa com o glicerol, oses e ácidos nucleicos, só deve ser usado para pH entre 8,5 e 10,0

Aminoácidos Apresentam interferências semelhantes ao tampão fosfatos. Formam complexos com iões metálicos di e trivalentes

Aminas Primárias, Ácidos Carboxílicos Formam complexos Mn2+/3+ de onde resulta libertação de H+. Formam-se precipitados insolúveis. Podem causar quelatação de iões metálicos necessários à actividade enzimática.

Tampões “GOOD” – PIPES, HEPES - Baixam a capacidade de ligação a metais. Pouco sensíveis a variações de temperatura. Interferem com o método de Lowry.

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Preparação de alguns tampões comuns usados em sistemas biológicos. A informação que aqui se apresenta sugere linhas gerais de preparação de tampões. Em todos os casos é necessário, após aferir o volume total, verificar o pH da solução com um eléctrodo de pH sensível a variações na ordem de 0,1 unidades de pH. Tampão Acetato; pH entre 3,6 e 5,6

(a) 0,1M de ácido acético (5,8 mL em 1000mL) (b) 0,1M acetato de sódio; 8,2g/L [Mr(NaCH3COO) = 82g/mol] Misturar o ácido e o sal nas proporções da tabela e ajustar o volume final a 100mL com água desionizada. O pH final deve ser confirmado com um elétrodo sensível, Tab. 1.2.

Tabela 1.2 – Relação entre os volumes de ácido e de sal para a preparação de tampão acetato 3,6<pH<5,6. Vol. Ácido acético/mL

46,3 41,0 30,5 20,0 14,8 10,5 4,8

Vol. Acetato de sódio/mL

3,7 9,0 19,5 30,0 35,2 39,5 45,2

pH 3,6 4,0 4,4 4,8 5,0 5,2 5,6

Tampão Fosfato; pH entre 5,8 e 8,0

(c) 0,1M de fosfato de sódio monobásico, anidro (12 g/L) (d) 0,1M de fosfato de sódio dibásico, anidro (4,2g/L) Misturar os sais nas

proporções da tabela e ajustar o volume final a 200mL com água desionizada. O pH final deve ser ajustado com um elétrodo sensível, Tab. 1.3.

Tabela 1.3 – Relação entre os volumes dos sais para a preparação de tampão fosfato 5,8<pH<8,0.

Vol. Fosfato de sódio monobásico/mL

92,0 81,5 73,5 62,5 51,0 39,0 28,0 19,0 13,0 8,5 5,3

Vol. Fosfato de sódio dibásico/mL

8,0 18,5 26,5 37,5 49,0 61,0 72,0 81,0 87,0 91,5 94,7

pH 5,8 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0

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Tampão Tris-HCl; pH entre 7,2 e 9,0 (e) 0,1M de Tris(hidroximetil)aminometano; 12,1g/L (Mr = 121,0 g/mol) (f) 0,1M de ácido clorídrico Misturar 50mL de Tris e o volume de ácido indicado na tabela. Ajustar o volume final a 200mL com água desionizada. O pH final deve ser confirmado com um elétrodo sensível, Tab. 1.4.

Tabela 1.4 – Relação entre o volume de ácido e de sal para a preparação de tampão Tris-HCl 7,2<pH<9,0. Vol. Ácido clorídrico/mL

44,2 41,4 38,4 32,5 21,9 12,2 5,0

pH 7,2 7,4 7,6 7,8 8,2 8,6 9,0

Mistura de tampões

Muitas vezes podemos recorrer a soluções mistas de tampões de forma a varrer uma gama de pH mais alargada, Fig. 1.1. Neste caso, deve ter-se em conta que a mistura de vários tampões tem um efeito de diluição das espécies químicas em equilibrio de cada um deles. Não devem por isso fazer-.se misturas de muito tampões, nunca mais de três em iguais volumes. A programação das soluçãos de tampões mistas deve fazer-se consultando previamente as tabelas de pKa dos compostos tampão.

Figura 1.1 – Esquema resumo das gamas de pH abrangidas por alguns dos principais tampões usados em biologia molecular.

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Trabalho Experimental (1) A realização do trabalho experimental proposto requer o uso de tampão Tris-HCl em todos as operações excepto durante o estudo da actividade enzimática com o pH. Uma vez que não conhecemos o pH óptimo de funcionamento da enzima começamos com aquele para o qual o Tris-HCl é mais vulgarmente utilizado, ou seja, pH 7,6. �

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Fraccionamento celular A análise de proteínas intracelulares por processos cromatográficos está dependente da disrupção celular prévia. A escolha do método de fraccionamento depende do tipo de amostra biológica usada, nomeadamente do tipo de membranas e parede celular, se se tratam de células individualizadas ou de tecidos e do tipo de análise a efectuar: - purificação de proteínas totais ou de proteínas de uma fracção celular particular. Em geral, podem ser definidos três tipos de métodos de lise celular em função da forma mais ou menos vigorosa da ruptura aplicada: 1) suaves, 2) moderados e 3) vigorosos. A distribuição de métodos químicos, biológicos e mecânicos não apresenta uma correspondência particular com a esquematização anteriormente referida, Tab. 1.5.

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Tabela 1.5 – Processos comuns de extracção bioquímica, (ΘΘΘΘ método químico; ΒΒΒΒ método bioquímico; ΞΞΞΞ método mecânico).

Processo Cond. Típicas Fonte de proteína Comentário Suaves

Lise celular (choque osmótico) 2 vol água para 1 vol de células pré-lavadas

Eritrócitos, periplasma de E. coli, proteínas intracelulares

Recuperação baixa mas reduzida libertação de proteases. ΞΞΞΞ

Detergentes 0,1 a 1,0% em volume para a suspensão de células/tecidos

Bactérias, Proteínas membranares. Culturas de células.

Possíveis interferências a 280 nm. ΘΘΘΘ

Digestão enzimática Lisozima, 0,2mg/mL, 37ºC, 15 min Bactérias. Proteínas intracelulares.

Escala laboratorial apenas. Combinada com disrupção mecânica. ΒΒΒΒ

Potter Elvjehem Instruções do equipamento Tecidos de fígado ΞΞΞΞ Maceração - Músculo ΞΞΞΞ Moderados

Homogenizador de lâminas Instruções do equipamento Tecidos musculares, a maioria dos tecidos de animais. Plantas ΞΞΞΞ

Maceração com abrasivos Ex. com o uso de areia. Batérias. Tecidos de plantas. ΞΞΞΞ Vigorosos

Ultrasonicação. Moinho de esferas Instruções do equipamento Suspensões celulares: proteínas

intracelulares

A libertação a pequena escala de ácidos nucleicos pode causar problemas de viscosidade ΞΞΞΞ

Manton-Gaulin Suspensões celulares gerais Processos em larga escala apenas. ΞΞΞΞ

French-press Bactérias e células de plantas. ΞΞΞΞ

Precipitação Fraccionada Extracelular: recombinantes excretados, anticorpos monoclonais, lisados celulares

Os precipitados devem ser resolubilizados ΘΘΘΘ

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Trabalho Experimental (2) A amostra de que vamos partir é a raíz tuberculosa de uma planta. De acordo com a Tab. 1.5 verifica-se que os métodos mecânicos são normalmente aplicados para este tipo de amostras. Vamos usar uma varinha mágica.

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Centrifugação A centrifugação é uma das técnicas mais utilizadas na obtenção de material biológico. Esta permite a separação dos componentes celulares, desde que estes apresentem massas específicas ou densidades diferentes.

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Centrifugação diferencial Nesta técnica, o fraccionamento do material a separar é conseguido por centrifugações sucessivas a diferentes velocidades, começando por velocidades mais lentas e terminando com velocidades elevadas, recolhendo e separando os diferentes sobrenadantes e depósitos, que deverão ser constituídos por material de massa molecular distinta. Moléculas assimétricas sedimentam mais lentamente do que moléculas simétricas. Por outro lado moléculas pequenas que se encontrem perto do fundo, sedimentam conjuntamente com as de maior massa molecular - cosedimentação - não dando sedimentos puros. Por esta razão a centrifugação diferencial só é aplicável na separação de espécies cujas dimensões difiram largamente. Um aspecto prático importante relaciona as acelerações de trabalho com as rotações por minuto ou rpm. A aceleração numa centrifuga é normalmente expressa em termos de múltiplos de aceleração gravítica, g = 9,80 ms-2. A relação entre as duas grandezas encontra-se através da expressão (1.1) devendo notar-se que para o mesmo valor de g as rotações por minuto produzidas serão sempre função do raio do rotor (r). Para efeitos de apresentação de resultados é sempre mais correcto apresentar os valores de n g.

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(1.1)

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Clarificação Após a remoção dos componentes celulares mais pesados, como organelos, núcleos, membranas, periplasma, etc., é muitas vezes necessário usar métodos de clarificação adicionais. A filtração é um desses métodos e emprega-se, sempre, antes de passos cromatográfico, sendo tanto mais bem sucedida quanto menor for o volume da amostra. A selecção dos filtros a usar dependerá do tipo de precisão que o passo de purificação seguinte obrigar. Por exemplo, se a amostra for processada por precipitação diferencial com sulfato de amónio é pura perda de tempo passa-la em filtros mais finos do que 1,5 µm, ao passo que, se for aplicada em colunas de cromatografia a selecção do filtro nunca deverá ser feita para poros superiores a 1,0 µm. Trabalho Experimental (4) Um dos processos em estudo no trabalho prático é a precipitação com sulfato de amónia. Por esta razão, a preparação do extracto bruto será feita com papel de filtro grosseiro.

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Estabilização e Conservação Os trabalhos de cinética enzimática no que respeitam à extracção de proteínas de amostras biológicas são normalmente morosos e é vulgar optar um uma sequênciação do programa de trabalhos que, por exemplo, envolva num só passo a obtenção do extracto bruto, noutro a precipitação fraccionada e a resuspensão da proteína alvo (se for o caso), noutro a diálise e finalmente e também em passos individuais a separação por cromatografia, fazendo de cada passo a corrida numa coluna cromatográfica diferente. A cinética enzimática poderá ser medida em cada um dos passos intermédios e no final com vista à determinação da eficiência da separação. A este respeito deve medir-se ainda, em todos os passos, a quantidade da proteína total em solução. Ao longo de vários passos de purificação é sempre verdade que, se estivermos a ser eficientes, vamos fazendo diminuir a quantidade de proteína total mas mantendo sempre o máximo da proteína alvo em solução, de preferência no menor número de passos. Esta visão deve estar sempre presente pois só em circunstâncias muito especiais se trabalha desde o início com um enzima puro. Se admitirmos que a obtenção do extracto bruto finaliza o primeiro passo do trabalho experimental precisamos de guarda-lo mantendo, ao máximo, as suas propriedades iniciais, ou seja, a sua actividade máxima. Ao longo do tempo, todas as enzimas aumentam a sua entropia conformacional. Em solução vão adquirindo uma conformação que varia progressivamente entre limites mais amplos. Uma boa analogia para o conceito de entropia conformacional pode ser dada por uma mola que, com o tempo, vai perdendo elasticidade. As proteínas perdem a sua estrutura normal pois só o simples facto de interagirem com o meio envolvente (normalmente aquoso) leva à perda da sua forma original. Forma e função estão intimamente relacionadas. Perder a primeira significa destruir a segunda. Muitas vezes, mesmo algumas horas depois da preparação de um extracto bruto ou obtenção da fracção mais pura de uma proteína, esta pode perder a sua função se se proceder a uma diluíção elevada da mesma. Nestes casos a adição de glicerol a entre 5 a 10% à solução diluída evita a perda de actividade.

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Com o conhecimento das condições de estabilidade da proteína alvo e outras propriedades de interesse (relativas aos contaminantes, por exemplo), o uso de aditivos deve ser sempre mantido no mínimo essencial. Desta forma podem ser evitados problemas de interferência com ensaios de monitorização da amostra e necessidade de passos de purificação adicionais, Tab. 1.6. Tabela 1.6 – Substâncias comuns usadas na preparação de extractos brutos, para purificação de proteínas posterior. Aditivo Condições Objectivo Tampão Tris-HCl 20mM, pH 7.4 Manter o pH, minimizar a acidificação

por disrupção lisossomal NaCl 100mM Manter a força iónica EDTA 10mM Reduzir danos por oxidação. Quelar iões

metálicos. Sacarose ou glicose 25mM Estabilizar membranas Detergentes Tab. 3 Extracção e purificação de proteínas

membranares e solubilização de proteínas

DNAase; RNAse 1µg/mL Degradação de ácidos nucleicos, redução da viscosidade da amostra

APMSF 0,4 – 4mM Proteases de serina Benzamidina-HCl 0,2mM Proteases de serina Pepstatina 1µM Proteases aspárticas Leupeptina 10 – 100µM Proteases de cisteína e serina Quimostatina 10 – 100µM Proteases da papaína e quimiotripsina Antipaina-HCl 1 – 100µM Proteases da papaína, cisteína e serina EDTA 2 – 10mM Proteases dependentes do zinco e ferro EGTA 2 – 10mM Proteases dependentes do cálcio DTT e DTE 1 – 10mM Manter os resíduos de cisteína

reduzidos. Mercaptoetanol 0,05% “ Glicerol 5 – 10% Estabilização de proteínas pela diluição.

Especificamente, a preparação de um extracto bruto que não é processado no momento acarreta um problema adicional. Todos os organismos têm proteases como proteínas constitutivas da maior parte das células. Por exemplo, as células do musculo esquelético fazem uso das proteases para degradar outras proteínas musculares em condições de jejum prolongado. Desta forma produzem aminoácidos que em certos casos podem dar origem a glucose, molécula energética primária para as células. Quando se processa à disrupção celular as proteases e a proteína alvo ficam livres em solução; por isso a necessidade de haver uma certa rapidez no processamento de extractos brutos.

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Trabalho Experimental (5) Uma vez que a obtenção do extracto bruto marca o fim da primeira aula prática existe necessidade de o estabilizar.

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