POTENCIAL PROGNÓSTICO DO DNA PLASMÁTICO EM …

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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR

POTENCIAL PROGNÓSTICO DO DNA PLASMÁTICO EM

CIRURGIA DE REVASCULARIZAÇÃO MIOCÁRDICA

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e

Molecular da ULBRA para obtenção do grau de Mestre.

ROBERTO LUIZ DE BORBA BORGES

Orientadora: Dra. Andrea Regner

Co-orientador: Dr. Nilo Ikuta

ULBRA 2006

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INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS

- Universidade Luterana do Brasil (ULBRA): Centro de Pesquisas em Ciências

Médicas, Laboratório de Diagnóstico Molecular.

- Instituto de Cardiologia / Fundação Universitária de Cardiologia (IC-FUC):

Serviço de Pré e Pós-operatório, Cirurgia e Cardiologia Molecular.

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DEDICATÓRIA

Dedico essa pesquisa, como uma modesta compensação, àqueles a quem

sacrifiquei o insubstituível tempo e a preciosa atenção. Estão nesta grande lista os meus

dois filhos, João Victor e Laura, meu irmão Thiago, minha mãe e meu pai (em

memória). À minha enorme e bela família e meus verdadeiros amigos, especialmente

àqueles que estiveram, de alguma forma, ligados a esse projeto

Dedico, por fim, meu trabalho a todos aqueles que estiveram comigo de corpo e

alma, mas também àqueles que só de alma estiveram.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos a quem dediquei esse estudo, especialmente aos meus mestres

da ULBRA e do IC-FUC (Dr. Renato Kallil), a meus colegas de mestrado e,

particularmente, a minha compreensiva e tolerante orientadora, com quem aprendi como

produzir melhor um ensaio clínico, mas também como exercer a disciplina e exercitar o

cérebro.

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ÍNDICE

RESUMO...................................................................................................... 06

ABSTRACT.................................................................................................. 08

INTRODUÇÃO............................................................................................. 10

JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 23

OBJETIVOS.................................................................................................. 24

MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 25

RESULTADOS............................................................................................. 29

DISCUSSÃO...................................................................................................37

PERSPECTIVAS.............................................................................................40

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................41

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RESUMO

As doenças cardiovasculares levam milhares de pacientes, todos os anos, a

submeterem-se a procedimentos de revascularização miocárdica. A recuperação desses

pacientes tem variado de acordo com a técnica utilizada. Vários métodos tentam

estratificar o risco pós-operatório. A dosagem da troponina ou das enzimas cardíacas e

os exames de imagem e cardiografia são os meios mais utilizados até então. Sabendo-se

que em variadas situações de estresse tecidual ocorre liberação de DNA no plasma,

propomos utilizá-lo como um marcador da evolução no período de recuperação na

Unidade de Terapia Intensiva (UTI).

Observamos a curva desse marcador partindo de 3 momentos de coleta: pré-

operatório, pós imediato e no dia da alta da UTI. Alguns pacientes, com má evolução,

tiveram sua amostra coletada antes da alta. O método de quantificação do DNA foi a

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em tempo real. Uma coorte foi desenhada até

que 25 pacientes tivessem as 3 amostras disponíveis. Um grupo controle constituído de

6 homens hígidos foi composto a fim de compará-los com as amostras do pré-

operatório, que se mostrou coincidente. No grupo estudado, foram incluídos homens e

mulheres maiores de 18 e menores de 70 anos, independente da sintomatologia, que

tivessem cumprido os critérios de inclusão e não tivessem sofrido Infarto Agudo do

Miocárdio (IAM), Acidente Vascular Encefálico (AVE) ou cirurgia de grande porte nas

últimas 8 semanas.

A análise da curva do DNA em relação a alguns dados do pós-operatório – para

avaliação de morbidade - foi estabelecida como desfecho primário. Assim, investigamos

a associação dos sintomas, da dosagem da Creatinoquinase, fração MB (CKMB) e dos

tempos de pinçamento aórtico, de circulação extra-corpórea, de internação na unidade

de recuperação e de uso de tubo orotraqueal com os níveis de DNA e a variação destes

no plasma. Secundariamente, traçamos uma relação entre o número de ramos

coronarianos comprometidos, observados à cinecoronariografia, e o número de ramos

enxertados (C/R). Apesar do aumento significativo da quantidade de DNA do pré para o

pós-operatório imediato, não houve correlação entre esse aumento e os desfechos

primários. No entanto, houve uma importante associação entre o aumento dos níveis

plasmáticos do DNA e a razão crescente de C/R. Esta razão em níveis ótimos (C/R</=1)

demonstrou-se benéfica, considerando-se a concentração do DNA no plasma. Além

disso, para os desfechos primários, observamos que nos pacientes mais graves, a

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concentração do ácido nucléico cresceu em proporções significativas. Contudo, o

número de pacientes avaliados a partir desse ponto de corte mais alto precisaria ser

maior para validar os achados.

Podemos concluir que a quantificação do DNA no plasma de pacientes

submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica segue um modelo crescente

semelhante a outros processos de injúria tecidual. Para os desfechos primários, não

houve correlação entre a curva do marcador molecular e a morbidade medida por

aqueles desfechos. Pacientes mais graves podem apresentar essa relação, no entanto,

estudos com amostras maiores devem ser desenhados com esse fim. A concentração de

DNA livre plasmático associou-se de forma significativa com as relações C/R maiores

que 1, independentemente do grau de viabilidade pré-avaliada. Mesmo aqueles que são

candidatos a revascularização parcial (menos enxertos do que ramos comprometidos)

por terem áreas consideradas inviáveis aos métodos disponíveis, poderiam ter algum

benefício, baseado nos dados moleculares sugestivos de maior extensão de dano nesses

casos. O fundamento para esta proposta baseia-se no fato de que métodos mais

complexos, ainda que de maiores custos, como a tomografia por emissão de pósitrons,

por exemplo, podem ampliar a margem da área de viabilidade miocárdica e, a partir

desses dados, buscar-se-ia incrementar a área a ser reperfundida, alcançando a relação

C/R mais próxima de 1 possível. Dessa forma, a liberação do DNA seria reduzida

durante o procedimento cirúrgico, sugerindo menor dano do miocárdio.

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ABSTRACT

Cardiovascular diseases lead thousands of patients to myocardial

revascularization procedures. Recovery of these patients presents variation, according to

the technical procedure applied. Several strategies have been used to stratify the pos-

revascularization risk. Troponin, other myocardial enzymes, imaging methods and

echocardiography have been the most investigated methods in this scenario. Knowing

that cellular stress may result in plasma DNA release, in the present study we aim at

investigating free plasma DNA as a biomarker of post surgery patient evolution in the

Intensive Care Unit (ICU).

Three samples of plasma DNA were collected: before the revascularization

procedure, immediately after the revascularization and on the day of ICU discharge. The

method used for plasma DNA quantification was Real Time-Polymerase Chain

Reaction (PCR). Thirty patients were enrolled in this prospective study, but only 25

patients completed the 3 blood sample collection, and, thus, were effectively

investigated. A control group constituted of 6 healthy individuals was included in the

study. The study group (revascularization candidates) was composed of men and

women over 18 and less than 70 years-old that were not submitted to tissue’s stress in

the last 6 weeks.

Plasma DNA levels were correlated to different clinical outcome variables.

Thus, plasma DNA levels were correlated with the following clinical outcome variables:

presence of symptoms, CKMB levels, duration of aortic tweezing, duration of extra-

corporeal circulation, duration of ICU stay and duration of endotraqueal intubation.

Further, we established a ratio between the number of coronaries compromised and the

number of grafts (C/R). Despite the significant increase in plasma DNA levels after the

revascularization procedure, there was no correlation between these levels and the

presence of symptoms, CKMB levels, duration of aortic tweezing, duration of extra-

corporeal circulation, duration of ICU stay and duration of endotraqueal intubation.

However, there was a significant correlation between the immediate post-

revascularization DNA levels and an increasing C/R ratio.

Therefore, we may conclude that plasma DNA levels in patients submitted to

myocardial revascularization follows an increasing pattern, as occurs in other processes

of tissue`s injury. In the present study, there was no correlation between plasma DNA

levels and clinical outcome variables. However, further studies, investigating a greater

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number of patients, may demonstrate this correlation. Nevertheless, DNA plasma

concentrations were significantly correlated with C/R rations greater than 1. Thus, it

seems that most extensive revascularization could be beneficial, considering that that

currently used diagnostic procedures may not be evaluating thoroughly the ischemic

territory. More complex diagnostic methods, such as positron emission tomography,

despite greater cost, may extend the myocardial viability area, establishing a goal of

greater reperfusion area and of a ratio of C/ closer to 1. Therefore, plasma DNA release

would be reduced during the revascularization procedure, suggesting lesser myocardial

injury.

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INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade no

Brasil. Nos países desenvolvidos tem havido uma tendência de declínio de óbitos por

esta causa. Em nosso país, alguns estados do sul e sudeste também já demonstram esta

tendência. Além das mudanças de comportamento, o desenvolvimento de métodos

diagnósticos e terapias cada vez mais eficazes, contribuem para a redução da

mortalidade (Timerman et al., 2001). Campanhas de prevenção podem melhorar esses

achados.

As síndromes coronarianas (SC) podem se apresentar de forma aguda, com ou

sem supradesnivelamento de ST ao eletrocardiograma (ECG) – geralmente com

posterior formação de onda Q de necrose – ou crônica. O diagnóstico das SC requer o

uso de métodos gráficos em um primeiro momento e, posteriormente pode-se avaliar o

risco pela sua estratificação usando um aparato de métodos por imagem. Além desses

métodos, a avaliação clínica da dor torácica complementada por exames de laboratório,

descreve o algoritmo de atuação perante um quadro suspeito. Enzimas de necrose,

proteínas apoptóticas e inflamatórias e, principalmente a troponina, desempenham papel

fundamental no diagnóstico (Luna et al., 2001). Métodos moleculares, utilizando a

PCR, têm sido avaliados na pesquisa de potenciais marcadores para o estresse tecidual.

O método final de avaliação passa frequentemente pela cinecoronariografia, que

definirá então, a estratégia terapêutica. Tratamento clínico, angioplastia percutânea e

cirurgia representam atualmente a quase totalidade das opções (César, 2001). A terapia

gênica, associada ou não a um desses métodos, vem complementar de forma cada vez

mais corrente, as alternativas à disposição (Topol & Serryus, 1998).

No campo do diagnóstico molecular já podemos detectar apoptose por técnicas

como ‘TUNEL’(Terminal U Nick End-Labeling) ou eletroforese de DNA. Infelizmente,

esses métodos não permitem avaliar morte celular ‘in vivo’, além de não detectarem

estágios iniciais daquele processo (Ewald et al; 2000). Uma alternativa seria o uso de

anexina V como marcador ligado ao Tc-99m em estudos de cintilografia (Narula &

Zaret, 2002). A evidência de que, nas SC a apoptose era um fenômeno presente e muitas

vezes complementar à necrose, principalmente nas lesões de isquemia-reperfusão,

acabou por deslocar a atenção para outras possibilidades diagnósticas por métodos

moleculares. Há interesse clínico e fisiopatológico no desenvolvimento de novos

biomarcadores para inflamação, hemostasia, trombose e estresse oxidativo, que possam

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identificar indivíduos de alto risco para eventos cardiovasculares. Proteína C Reativa

ultra-sensível, fibrinogênio plasmático, Interleucinas (IL-18 e IL-6), Metaloproteinase

(MMP-9), Homocisteína, Lipoproteína [Lp (a)], Inibidor da Ativação do Plasminogênio

(PAI-1) e medida de Óxido Nítrico (NO), além de proteínas apoptóticas e anti-

apoptóticas [Fas e Heat Shock Protein (HSP-70), respectivamente)], não foram capazes

isoladamente, de avaliar redução de risco pelos seus controles. A associação de dois ou

mais fatores, aí sim, tiveram potencial prognóstico (Ridker et al., 2004).

Pacientes vítimas de AVE randomizados para isquemia, isquemia transitória e

AVE hemorrágico e, cujo desfecho primário era o escore de Rankin modificado,

tiveram o DNA extraído e analisado para o gene da Beta-globulina no estudo de Rainer

e colaboradores. A concentração média do DNA no plasma foi maior em pacientes que

morreram em relação aos que sobreviveram. O DNA plasmático correlacionou-se com o

volume do hematoma cerebral e a concentração acima de 1400 Kgenoma-

equivalentes/litro tiveram sensibilidade de 100% e especificidade de 74,4% para

predição de morte hospitalar após AVE, indicando que o DNA circulante tem potencial

prognóstico em relação à severidade do AVE e prediz morbidade e mortalidade na

emergência (Rainer et al., 2003).

Há diversas situações em que podemos ainda utilizar o DNA plasmático, além

da aplicação deste método em pacientes de risco para cardiopatia isquêmica e vítimas de

AVE. A análise quantitativa dessa molécula mostrou, por exemplo, ser útil no

diagnóstico pré-natal em um estudo que identificou DNA fetal a partir do soro materno,

já desde a sétima semana de gestação (Lo et al., 1998). Outro estudo observou o

aumento do DNA livre na circulação de pacientes após trauma. O uso de PCR

quantitativa com amostra seriada de plasma de duas populações – uma com coleta a

cada vinte minutos por três horas e outra com coleta diária na UTI – demonstrou

potencial prognóstico ao se observar um aumento significativo do DNA naqueles

severamente comprometidos e com falência de órgãos, decrescendo a valores de

referência em três horas quando a injúria era menor. Na UTI, os pacientes que

desenvolveram disfunção de múltiplos órgãos tiveram níveis mais altos de DNA livre

no plasma, mesmo após vinte e oito dias da injúria. A detecção menor desse aumento

em pacientes traumatizados e a relação com a progressão intra-hospitalar fornecem uma

evidência para o uso desse método como preditor de evolução (Lam et al., 2003).

Por fim, o DNA tem sido fonte de pesquisa para diagnóstico das mais diversas

patologias, incluindo as cardiopatias, como a pouco discutidas; no entanto, o DNA livre,

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além das situações já citadas (AVE, trauma e DNA fetal no soro materno), a sua

dosagem nesta forma, ainda se mostrou útil em algumas neoplasias. A confirmação de

sua utilidade nestes casos se deu através da detecção de mutações oncogênicas no DNA

plasmático. Alguns estudos ainda tentaram relacionar a quantificação do ácido nucléico

livre com o estadiamento da neoplasia, buscando assim, estabelecer alguma predição

prognóstica. Quando se fala em ácido nucléico, sem especificações, estamos, na

verdade, cogitando o uso do RNA livre, que apesar de ser mais propenso à degradação,

já foi observado em várias formas de neoplasias, assim como fragmentos de DNA a

partir de células apoptóticas e necróticas (Fackelmayer et al., 2003).

A Cirurgia de Revascularização Miocárdica (CRM), ainda que bem planejada e

tecnicamente bem efetuada, expõe, a cada procedimento, o paciente a um risco

crescente. A degeneração dos enxertos e a progressão da doença aterosclerótica

induzem a oclusão de 15% das pontes de safena no primeiro ano. A curto prazo a

detecção de IAM é dificultada na UTI pela incomunicabilidade e pela confusão de

sintomas anestésicos. O peri-operatório carece, dessa forma, de um meio eficaz de

predição da evolução pós-operatória. O valor prognóstico da troponina após CRM não

está estabelecido, mas sugere ser mais preditivo de complicações do que o aumento de

CKMB. Assim, a CRM deve ser reservada a pacientes com isquemia refratária ao

tratamento clínico ou angioplastia e àqueles com complicações mecânicas do Infarto

Agudo do Miocárdio (IAM) como a comunicação interventricular e a ruptura do

músculo papilar causando insuficiência mitral. Uma vez definida a opção por CRM e

sabendo que pacientes com comprometimento triarterial, angina instável, fração de

ejeção inferior a 30%, tempo de Circulação Extracorpórea (CEC) maior do que 120

minutos e com lesão carotídea estão correndo maior risco de IAM, algumas medidas

podem ser tomadas para reduzir este risco. A cardioplegia sanguínea, de substratos

(aspartato, glutamato) e de reperfusão modificada (secundária, normotérmica – hot shot

– hipocalemica) mostrou benefício de sobrevida e menor morbidade quando comparada

ao uso de cristalóide gelado em pacientes submetidos à CRM de urgência ou com

insuficiência cardíaca aguda (Figueiredo, 2005). Este tipo de cardioplegia poderia

assim, incrementar os achados quantitativos de DNA livre plasmático. Além dos

indícios de benefício da cardioplegia com sangue, o uso de Balão Intra-Aórtico (BIA)

precocemente e a seleção do conduto para o enxerto coronariano com destaque para a

anastomose da artéria torácica interna esquerda, também conferiram proteção

miocárdica pós-operatória (Charlson & Isom, 2003).

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A estratificação de risco pós-operatória pós-hospitalar conta com métodos

consagrados como o teste de esforço e a cintilografia miocárdica; no entanto, a evolução

intra-hospitalar tem sido alvo de estudos para potenciais marcadores. Novamente a

troponina I foi testada em um trabalho conduzido a fim de avaliar o poder de predição

da evolução em curto e médio prazo em pacientes submetidos a cirurgias vasculares.

Houve, neste caso, correlação com os níveis quantitativos daquela proteína apenas com

a evolução imediata, o que já seria interessante; porém, esses resultados contrastam com

os achados de outros experimentos (Kim et al., 2002). Ainda assim, quando comparada

à CKMB, a troponina leva vantagem quando se busca avaliar a presença de lesão

miocárdica pós-operatória (Figueiredo, 2005).

A despeito das condições de risco para CRM já descritas, há que se considerar

que existem diferenças no peso que cada uma dessas condições apresenta sobre os

diferentes gêneros. Um estudo identificou 21 preditores independentes de risco,

enquanto que 12 fatores relacionaram-se ao sexo feminino. Dos 21, 12 estiveram

presentes só no gênero masculino e nove encontrados em comum. Cirurgia de

emergência, cirurgia cardíaca prévia, Doença Vascular Periférica (DVP) , Hipertrofia de

Ventrículo Esquerdo (HVE), Insuficiência Cardíaca (IC) aguda ou compensada, Doença

Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC), Índice de Massa Corporal (IMC) superior a 29,

diálise, Insuficiência Renal (IR) pós-operatória, fibrinólise sete dias antes da cirurgia e

AVE transoperatório foram preditores apenas em homens enquanto que arritmia

ventricular maligna, calcificação aórtica e IR pré-operatória apresentaram risco somente

em mulheres (Toumpoulis et al., 2005). Tal risco refere-se à alta mortalidade nesses

grupos, além das co-morbidades e complicações pós-operatória que incluem angina de

peito ocorrendo em 20% dos pacientes no primeiro ano da CRM, arritmias

(especialmente a fibrilação atrial), mediastinite, insufuciência renal, sangramento pós-

operatório e síndrome vasoplégica (taquicardia, oligúria, e hipotensão arterial), quadro

que não responde ao uso de catecolaminas pelo fato de não haver déficit de perfusão.

Corticóides, noradrenalina, metoprolol e azul de metileno ou vasopressina podem

induzir a uma resposta favorável (Koch et al., 1999).

A possibilidade de haver dano neurológico merece menção à parte por incidir em

até 80% dos pacientes submetidos à CRM e por representar a segunda causa de

mortalidade operatória depois de baixo débito cardiovascular. A degeneração

neurológica tem como substratos a hipóxia, a embolia, a hemorragia e os distúrbios

metabólicos. Os déficits do tipo 1 estão associados à AVE, isquemia transitória, coma e

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encefalopatia anóxica e respondem por 21% da taxa de mortalidade. Ateroma de aorta

proximal, doença cérebro-vascular, uso de BIA, Diabetes Melito (DM), Hipertensão

Arterial Sistêmica (HAS), angina instável e idade avançada predispõem a este tipo de

dano. A ateromatose aórtica, que é o mais forte preditor de AVE após CRM, muitas

vezes é subestimada pela tomografia e o ecocardiograma. O uso de ultra-sonografia

intra-operatória é o melhor meio de diagnóstico e prevenção do AVE embólico. Uma

vez detectada, algumas estratégias como canulação de femorais ou subclávias em

substituição à aorta, parada cardíaca em fibrilação com resfriamento, sem pinçar a aorta,

cirurgia sem CEC, cirurgia minimamente invasiva e uso de enxertos arteriais in situ,

podem prevenir o AVE. O déficit do tipo 2 é responsável por uma taxa de 10% de

mortalidade e é caracterizado por comprometimento da função cognitiva e da memória

de forma geralmente reversível. O tempo de CEC é o principal determinante desse tipo

de dano e os fatores preditivos são o alcoolismo, a arritmia prévia (fibrilação atrial), a

HAS, a CRM prévia, a DVP e a IC congestiva. A cirurgia sem CEC poderia reduzir o

risco desse dano (Figueiredo, 2005).

Apesar dos cuidados referidos, um estudo refletiu o poder devastador do dano

neurológico na CRM. Um grupo de pacientes submetidos ao´´bypass``coronariano teve

a perfusão cerebral avaliada por cintilografia. Setenta e cinco por cento desses

apresentaram alterações perfusionais regionais. Houve ainda forte correlação com

pacientes hipertensos, diabéticos e tabagistas, sugerindo serem fatores de predição.

Cinco por cento de todos os incluídos sofreram AVE e todos estavam dentro do grupo

com perfusão alterada (Moraca et al., 2005).

Como já vimos acima, o tipo e o tempo de CEC estão intimamente relacionados

às complicações pós-operatórias, especialmente ao dano neurológico. Alguns autores

observaram que durante CEC prolongada os monócitos são estimulados a expressar

fator tissular facilitando o surgimento de fenômenos tromboembólicos (Kappelmayer et

al., 2005). Outros autores notaram o efeito hemodinâmico alterado em cães normais e

infartados submetidos à CEC com tórax fechado. Em ambos os grupos a pressão da

aorta proximal não se elevou a despeito dos elevados volumes infundidos. A elevação

da resistência vascular, só foi possível quando a aorta abdominal foi obstruída por

balão. No entanto, neste caso, houve redução da função ventricular esquerda. A fim de

analisar o efeito metabólico da hipotermia associada à CEC, também se observou maior

efeito cardioprotetor nos cães sob redução moderada e até mesmo profunda da

temperatura em relação àqueles mantidos normotérmicos (Kunh et al., 2005). Estes

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achados em cães infartados e em choque contrastam com os achados em humanos

submetidos à CRM com função ventricular deprimida agudamente, onde a cardioplegia

com sangue torna-se mais segura.

A técnica, o tipo e as terapias coadjuvantes à CRM também interferem nos

resultados deste procedimento. Desde que Favaloro sistematizou a CRM em 1968 com

as pontes de safena, várias modificações nas técnicas cirúrgicas foram surgindo. O uso

de enxertos arteriais, em vez de veia safena trouxe vantagens por apresentarem menor

incidência de aterosclerose. A artéria radial, a gastroepiplóica e a epigástrica inferior são

alternativas razoáveis, no entanto, a artéria torácica interna esquerda é a preferida em

pacientes com menos de 70 anos, sem uso de insulina e com função de ventrículo

esquerdo sem disfunção grave. As pontes de safena ficam reservadas para pacientes

mais idosos, com lesões menores e quando é feita a endarterectomia coronariana direita.

A cirurgia do miocárdio sem CEC é reservada a pacientes com

comprometimento da artéria interventricular anterior e da coronária direita; nos demais

casos este método induziu à menor patência vascular e a um maior número de

reoperações e angioplastias. A CRM sem CEC permitiu o desenvolvimento da

minitoracotomia nos mesmos casos mencionados com a vantagem de se evitar a

esternotomia (Oliveira e Lisboa, 2005).

A CRM também foi superior ao tratamento clínico em pacientes com

miocardiopatia isquêmica dilatada com redução de morbimortalidade (Oliveira et al.,

2005).

Técnicas alternativas como a revascularização transmiocárdica a laser de CO2

em pacientes com lesões difusas sem IC e CRM com injeções de células-tronco

associadas a fatores de crescimento foram capazes de induzir à neoangiogênese e

melhora da função cardíaca (Kofidis et al.,, 2005). Apesar dos benefícios do uso de

células tronco de medula óssea terem sido observados a curto prazo, a longo prazo estes

ganhos não se mantiveram em relação à função de ventrículo esquerdo (Meyer et al.,

2006).

Entre os marcadores de dano neurológico correlacionado à cardiopatia isquêmica

ou ao pós-operatório de CRM, a proteína S-100 é a que tem mostrado maior potencial

prognóstico para infarto cerebral e outras lesões naquele grupo de pacientes. Esta

proteína constitui o maior componente do citosol, predominando em células astrogliais

e consiste de duas subunidades: alfa e beta. A S-100 beta/beta está presente nas células

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gliais e de Schwann enquanto que a alfa/beta está nas gliais e a alfa/alfa está nos

músculos estriados, coração e rins (Büttner et al., 1997).

O aumento no líquido cefalorraquidiano e no soro da proteína ácida ligante ao

cálcio, pode ocorrer por sua liberação quando há um dano cerebral agudo, como AVE

hemorrágico, isquêmico, trauma e hipóxia cerebral. Em pacientes com infarto no

território da artéria cerebral média ocorreu aumento sérico desse marcador e as

concentrações foram maiores naqueles com déficits mais severos na admissão (Büttner

et al., 1997).

Vários estudos indicam o dano neuronal e astroglial em pacientes submetidos à

CRM. Um grupo que pesquisou a medida de enolase neuro-específica e de S-100 em

três tipos distintos de cirurgia cardíaca com bypass cardiopulmonar (CPB) hipo ou

normotérmico concluiu que a injúria celular neuronal e astroglial foi maior nas CRM e

nas substituições de arco aórtico durante moderada hipotermia nas primeiras, e profunda

hipotermia nas aórticas sugerida pelo incremento sérico das proteínas dosadas (Derkach

et al., 2000). Por outro lado, outro estudo não observou diferença na liberação de S-100

beta ao comparar CRM com CPB normotérmico e moderadamente hipotérmico,

sugerindo não haver maior injúria no primeiro grupo, como se haveria de supor

(Dworschak et al., 2004). Da mesma forma, a dosagem da S-100 beta, juntamente com

outras enzimas como a enolase, a CKMB e a mioglobina, indicou que o aumento da S-

100 logo após CRM não se devia somente à sua liberação cerebral, mas também de

tecidos extra-cerebrais (Missler et al., 2002). Outro experimento que sugeriu que a

liberação de marcadores de resposta inflamatória cerebral poderia advir da liberação

desses de outras fontes foi o que mediu IL-6, 8 e 10; enolase e S-100 beta no pós-

operatório de CRM com CPB (Mielck et al., 2005). Um estudo anterior, contudo, dosou

a S-100 48 horas após CRM em pacientes que já haviam sofrido AVC e o aumento

dessa proteína correlacionou-se com o tamanho da área infartada. O acompanhamento

de até 39 meses conferiram àquele marcador um valor preditivo negativo de médio

prazo para mortalidade (Jonsson et al., 2001).

Uma revisão dos marcadores de isquemia cerebral após CRM identificou algum

poder de predição nos seguintes marcadores: adenilcinase, CK (fração BB), lactato,

enolase neuro-específica, proteína S-100, proteína básico-mielínica, Desidrogenase

Lática (DHL), aminotransferase (TGO), glutationa, neuropeptídeos vasointestinal e 7B2

específico. Alguns como o lactato, a CKBB e a S-100 se relacionam com o período de

isquemia durante a CEC (Johnsson, 1996). Outro trabalho, mais recente, identificou

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ainda outros marcadores nessas condições, acrescentando o Fator de Necrose Tumoral

(TNF), outras citocinas e moléculas de adesão à gama de opções para pesquisa de

resposta inflamatória e injúria cerebral após CRM (Nakamura et al., 2005).

A utilização da proteína S-100 também se mostrou útil na pesquisa de outros

desfechos, como a mortalidade tardia e a lesão de isquemia-reperfusão cardíaca após

CRM. No primeiro caso, foi observado que mesmo elevações discretas daquele

marcador eram capazes de indicar um pior prognóstico com aumento da morbidade

relacionada à perda de função renal e cardíaca, cirurgia de emergência e dano

neurológico e ainda incremento da mortalidade no seguimento de até 42 meses

(Johnsson et al., 2003). Em relação à isquemia cardíaca no peri-operatório de CRM, a

S-100, que é uma mediadora da função do miócito pelo seu papel na contratilidade da

célula muscular mediada pelo cálcio, também sugeriu que esse marcador está

diretamente envolvido no dano miocárdio peri-operatório com período longo de

isquemia seguida de reperfusão. A investigação da translocação e localização do S-100

A1 em operados tiveram desfecho significativamente diferentes dos achados em

corações humanos sob condições normais (Brett et al., 2001). O dano neurológico,

apesar de não ter sido um alvo de avaliação de nosso estudo, é uma fonte de

preocupação em procedimentos de grande porte como a CRM. Contudo, é possível que

a liberação de DNA plasmático torne-se maior diante desse tipo de dano, contribuindo

para a análise da evolução pós-operatória.

Assim como na CRM, a proteína S100 teve também seu potencial medido na

predição da evolução de pacientes com SCA e IC de causa isquêmica, depois de saber-

se de sua função na contratilidade do miócito. A S100 B é um regulador negativo

intrínseco da hipertrofia miocárdica expressa após o IAM. Uma comparação entre as

formas selvagem (WT), superexpressa transgênica (TG) e Knock-out (KO) em ratos

infartados indicou que os grupos WT e principalmente KO mantiveram uma resposta

hipertrófica. A forma TG não desenvolveu hipertrofia e ainda aumentou a apoptose. A

pressão diastólica final pós-IAM foi mais baixa na KO do que na WT, o que sugere que

a supressão da expressão de S-100 B aumentou a hipertrofia, reduziu a apoptose e foi

benéfica na preservação da função cardíaca. Concluíram os autores desse estudo que a

S-100 regula a resposta hipertrófica e o remodelamento no período de pós-IAM

precoce. Além disso, seria um potencial novo alvo terapêutico (Tsoporis et al., 2004).

Nas SCA a S-100 foi capaz de diferenciar pacientes com IAM daqueles com

angina instável em um estudo que mediu essa proteína juntamente com a CKMB nos

18

dois grupos. Mais pacientes apresentaram elevação de S-100 do que de CK no grupo

infartado, ocorrendo o oposto em pacientes com angina. Estes achados identificaram a

S-100, portanto, como preditora de pior prognóstico nas SCA (Usui et al., 1990). Um

outro experimento com ratos comparou a S-100 com a troponina – um tradicional

marcador de injúria cardíaca - em corações submetidos à isquemia e reperfusão. A fim

de pesquisar se o coração seria uma fonte extra-cerebral da proteína, um grupo controle

foi perfundido por um tempo maior. Os valores crescentes de S-100 e troponina ao

longo de maiores períodos de isquemia sugeriram que o coração isquêmico é uma fonte

extra de proteína S-100 B (Mazzini et al., 2005). Já em relação à proteína S-100 A1, a

geração de ratos com deleção do gene correspondente induziu a um maior trabalho

cardíaco em situações de estresse hemodinâmico, mesmo em heterozigotos, o que

surpreendeu os pesquisadores, apesar de manter-se a contratilidade normal nesse grupo

(Du et al., 2002). Ainda em relação ao S100 A1, outro experimento que utilizou entrega

do gene da proteína por via intracoronária mediada através de adenovírus reativou a

expressão protéica no miócito, normalizando a função contrátil do miocárdio em ratos,

oferecendo uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da insuficiência cardíaca

(Most et al., 2004). Já o S-100 A6, mais um membro da família, tem sido implicado na

regulação e no crescimento celular. Enquanto a S-100 B é induzido no pós-infarto e

limita a resposta hipertrófica, a S-100 A6 também é expressa no coração de ratos

infartados; no entanto, inibe a indução de genes fetais, beta-miosina de cadeia pesada e

prostaglandinas, sugerindo que funcione como um modulador negativo de gene cardíaco

diferenciado, ação comparável ao seu papel no ciclo celular (Tsoporis et al., 2005).

O arsenal de métodos para diagnóstico e prognóstico tem servido para permitir

abordagens terapêuticas e preventivas na cardiopatia isquêmica. Métodos como as

dosagens de S-100 e troponina, discutidos acima, foram eficazes como marcadores nas

SCA e também no pós-operatório de CRM, que é alvo do nosso tema. No entanto, os

achados ainda são contraditórios quando se analisa individualmente cada um desses

biomarcadores; e apenas associando-se vários desses – o que torna a avaliação menos

factível e mais custosa – temos dados de predição altamente confiáveis.

Por fim, em relação à CRM, os pacientes refratários ao tratamento clínico e

aqueles com quadro mais grave: angina instável, HAS, IAM prévio e com lesão de

tronco de coronária esquerda são candidatos indiscutíveis ao procedimento. Uma

metanálise de 1984 dos estudos CASS, Europeu e VA já suportavam esses dados.

Estudos recentes também confirmam melhora em desfechos clínicos de morbidade e

19

mortalidade de curto a longo prazos, conforme uma revisão publicada no manual da

SOCESP (Jatene & Fernandes, 2005).

Com a ausência de métodos de avaliação específicos, continua-se a busca por

marcadores de evolução em pós-operatório de CRM. Há indícios de benefícios com a

troponina como vimos, no entanto, retringem-se à lesão miocárdica pós-operatória. A

CKMB é uma enzima capaz de sinalizar prognóstico em SCA, mas não é superior a

troponina na detecção de IAM à recuperação. Além disso, o estresse cirúrgico, por si,

induz ao aumento desse marcador. A troponina também pode sofrer alterações em

quadros como angina instável e IAM sem elevação de ST, mas nestes casos, essas

alterações são preditivas. Mesmo lesões não-isquêmicas induzem à elevação de

troponina relacionada à pior prognóstico. A classificação IIIB de Braunwald para angina

Instável pode com isso, ser subdividida em IIIB com ou sem troponina positiva. Há

duas formas de troponinas: a I que se liga à C, formando o complexo TIC e a T. Pode

haver redução dos níveis dessas proteínas na presença de ácido

etilenodiaminotetracético (EDTA) e de heparina. Outra limitação é o perfil metabólico

com demora de três horas para elevação a partir dos sintomas. Apesar disso, as

troponinas fornecem informação prognóstica superior à história clínica, ECG e

ergometria no momento da alta hospitalar. A confirmação definitiva de lesão

irreversível dos miócitos poderia vir com o uso de anticorpos anti-troponina I marcados

com radioisótopos que, ao ligarem-se às troponinas remanescentes nas miofibrilas,

indicariam dano inequívoco do miócito. Essa possibilidade depende de mais e maiores

estudos (Ramos, 2001). Outros marcadores conhecidos, porém menos específicos são a

mioglobulina e a desidrogenase lática.

A apoptose tem seus próprios marcadores como já discutimos e a possibilidade

de haver essa forma de morte celular nas SCA, traz condições para o uso desses

marcadores na avaliação prognóstica de pacientes isquêmicos. A anexina, um marcador

que se liga ao cálcio e tem afinidade pela fosfatidilserina, acaba por marcar o processo

final de apoptose, quando a célula externaliza seu fosfolipídio com carga negativa

(Matsuda et al., 2003). O Fas solúvel e o TNF são agentes desencadeadores da via

extríseca da apoptose e podem ser marcadores inespecíficos de morte celular

programada (Lewin, 2000). Além do TNF, outras citocinas como as interleucinas (1, 2 e

6) e interferon-gama estão envolvidas na reação ao evento isquêmico com produção de

óxido nítrico, sendo potentes marcadores de remodelamento e IC secundária (Cuoco et

al., 2003). A dosagem de antiapoptóticos também poderia ter essas funções. O HSP-70,

20

um protetor tecidual, poderia ser um indicador indireto de lesões, especialmente as de

isquemia-reperfusão (Zhou et al., 2001).

Outros marcadores de evolução têm sido aventados. Nas SCA, além dos fatores

de risco clássicos estabelecidos, marcadores como a função renal e a proteína C sérica

ultra-sensível evidenciaram forte potencial de predição. Dois estudos recentes

mostraram a associação do peptídeo natriurético ventricular (BNP) com achados em

pacientes isquêmicos. A reação desse marcador à IC já é bem conhecida e ocorre

quando o ventrículo é submetido a uma sobrecarga de pressão ou de volume, induzindo

à vasodilatação, natriurese, inibição do sistema renina-angiotensina e redução da

apoptose. Recentemente observou-se que o BNP correlacionou-se com a mortalidade e

o risco de desenvolver IC ou IAM precocemente em pacientes com SCA. Na

comparação com a CKMB massa e a troponina, a adição do BNP reforça a sensibilidade

ao diagnóstico e o valor prognóstico em pacientes com IAM sem supra de ST, conforme

recente revisão publicada (Mesquita & Villacorta Jr., 2006). Já outra análise, desta vez

original, correlacionou três marcadores: a proteína C, a fração N-terminal do BNP e o

fibrinogênio com os achados de cinecoronariografia. Concluíram os autores que, em

portadores de SCA sem supra de ST, a dosagem sérica da fração inativa de BNP,

proteína C e fibrinogênio nas dez primeiras horas de internação se correlacionou com os

achados angiográficos (Magalhães et al., 2006).

Uma pesquisa usando meramente o leucograma de 142 pacientes com doença

arterial coronariana (DAC): 57 estáveis e 85 com IAM, detectada por angiografia

comparada com um grupo de 90 controles, mostrou que a monocitose, um dos mais

importantes componentes do processo inflamatório na placa aterosclerótica, foi uma

variável independente para DAC e seu prognóstico ao indicar que a leucocitose era

maior nos indivíduos isquêmicos. A monocitose foi ainda maior nos infartados,

marcando de forma independente o risco para DAC e IAM (Afiune Neto et al., 2006).

A contagem total de leucócitos à admissão de pacientes com SCA foi preditiva de

mortalidade e evolução para IC e era maior nos pacientes com SCA com elevação de ST

do que naqueles com angina e nos controles (Furman et al., 2004).

A função plaquetária medida com o analisador de função plaquetária mostrou

elevação do tempo de interação do colágeno-difosfato de adenosina em pacientes com

maior dano miocárdico medido pelos níveis de CKMB e troponina na SCA, sugerindo

que a função plaquetária ajuda na estratificação de risco em pacientes com IAM

(Frossar et al., 2004).

21

A adiponectina, um peptídeo a pouco descoberto derivado do adipócito, está

envolvida na regulação da sensibilidade à insulina e da oxidação do lipídio e

consequentemente, poderia envolver-se no desenvolvimento de DAC. Um estudo

confirmou que as concentrações elevadas de adiponectina no plasma se associavam a

um menor risco de IAM (Pischon et al., 2004).

Anticorpos antibeta2-glicoproteína I e anticardiolipina foram detectados por

imunoensaio em pacientes com IAM. A freqüência do segundo não diferiu dos

controles, porém o primeiro foi mais freqüente, sugerindo que seja um fator de risco

independente, o que pode representar um elo entre autoimunidade e aterosclerose

(Ranzolin et al., 2004). Marcadores inflamatórios também estão envolvidos nas SCA

como já discutimos. A IL-1 (D’Ambrósio et al., 2004) e a IL-18 (Blankenberg et al.,

2003) marcaram precocemente o IAM (IL-1) ou associaram-se à vulnerabilidade das

placas (IL-18).

O arsenal de métodos para diagnóstico e prognóstico tem servido para permitir

abordagens terapêuticas e preventivas na cardiopatia isquêmica. Métodos como as

dosagens de S-100 e troponina, discutidos previamente, foram eficazes como

marcadores nas SCA e também no pós-operatório de CRM, que é alvo do nosso tema.

No entanto, os achados ainda são contraditórios quando se analisa individualmente cada

um desses biomarcadores; e apenas associando-se vários desses – o que torna a

avaliação menos factível e mais custosa – temos dados de predição altamente

confiáveis.

Pesquisas recentes com DNA plasmático têm mostrado o potencial desse

biomarcador em diversas situações de estresse ou disfunção tecidual. A análise

quantitativa do DNA circulante requer o uso de PCR para obtenção de cópias da

molécula-alvo. No entanto, é preciso enfatizar que no plasma estão presentes diferentes

concentrações de DNA mitocondrial, dependendo da quantificação de sua forma livre

ou então, ligada a partículas (Chiu et al., 2003).

A PCR consiste em sintetizar in vivo cópias de DNA partindo de uma seqüência-

alvo. Para que ocorra a hibridização, utiliza-se um ou mais primers (oligonucleotídeos)

complementares ao gene de interesse. A síntese das cópias é obtida por polimerização

utilizando-se a DNA polimerase. Pode-se repetir esse processo diversas vezes. Cada

ciclo consistirá na repetição das três etapas: desnaturação, anelamento (hibridização) e

polimerização (Andrade, 2003).

22

Algumas variações da técnica que utiliza PCR podem ser aplicadas em situações

específicas. A transcrição reversa (RT) associada à PCR (RT-PCR), por exemplo, é uma

técnica utilizada para síntese de DNA complementar a partir de fitas de RNA,

possibilitando a amplificação de alvos deste ácido nucléico, assim como a detecção de

vírus e transcritos de RNA de genes que codificam para características de interesse

(Lunge et al., 2003). Outras variações são a Nested PCR, PCR Multiplex e Taqman

PCR.

Por fim, a PCR é uma técnica relativamente fácil, que parte de um DNA molde

contendo a seqüência a ser amplificada. Não é necessária a clonagem porque os

iniciadores definem a área de interesse. A desnaturação se dá com a temperatura por

volta dos 95˚C por 5 minutos para promover a separação das fitas de DNA. O

anelamento, quando ocorre a ligação dos iniciadores, é alcançado ao baixarmos a

temperatura de acordo com a composição dos iniciadores e, por fim, eleva-se a

temperatura para cerca de 72˚C por 2 minutos para que ocorra a polimerização. Esse

processo pode ser repetido diversas vezes e, ao final, teremos a amplificação da região-

alvo do DNA molde (Villa & Medeiros, 1995).

Considerando que a cardiopatia isquêmica está entre as etiologias mais

importantes para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, a busca por marcadores

de evolução para pacientes candidatos à revascularização, ou mesmo já submetidos a tal

procedimento, passa a ter mais atenção. Diversas metodologias moleculares, passando

ou não pela PCR, têm contribuído para a análise de fatores de risco para essa forma de

cardiopatia. O DNA plasmático se mostrou eficaz no diagnóstico preciso de um dos

fatores de risco mais poderosos para o desenvolvimento de doença coronariana precoce.

A hipercolesterolemia familiar é uma desordem do metabolismo de lipídios causado por

mutações do gene do receptor de LDL. A avaliação dessa mutação por eletroforese de

DNA foi extremamente útil na detecção dessas mutações (Nissen et al., 1995).

Em relação ao grupo que sofre IAM ao peri-operatório, sugere-se que o próprio

evento libere DNA. Se por um lado isto poderia induzir a um viés, por outro seria um

meio auxiliar no diagnóstico, considerando que as manifestações clínicas são

mascaradas e a instabilidade hemodinâmica e as arritmias ventriculares são

apresentações mais comuns. Assim, encontramos fundamentos para acreditar que a

liberação daquela molécula se relacione com o grau de morbidade da cardiopatia

isquêmica e com a evolução clínica do paciente revascularizado.

23

JUSTIFICATIVA

Pacientes submetidos à CRM em nosso meio têm à disposição uma série de

métodos para avaliar um período crítico para a morbimortalidade, que é o pós-

operatório nas unidades de recuperação. Nenhum desses métodos, no entanto, é capaz

de isoladamente relacionarem-se com a evolução de modo altamente preditivo. Em

nosso estudo, avaliamos a hipótese de um novo marcador acrescentar potencial

preditivo aos marcadores tradicionais.

O DNA plasmático livre seria um potencial marcador, especialmente para

pacientes de risco, como aqueles com comprometimento trivascular, angina instável,

baixa fração de ejeção, submetidos à CEC prolongada e endarterectomizados.

Indivíduos com IAM recente poderiam contaminar os achados, mas a grande maioria

dos pacientes poderiam se beneficiar desse método relativamente simples e barato se as

coletas fossem organizadas dentro da rotina do laboratório. Considerando o objetivo de

avaliar a predição de evolução de morbidades no pós-operatório, a conexão com as

rotinas torna-se mais fácil já que, nesses casos, as coletas são diárias e o interesse para a

pesquisa de DNA restringe-se ao plasma, dispensando o sangue para as análises

hematológicas e bioquímicas. As pesquisas moleculares requerem laboratório

específico, o que tem se tornado uma realidade cada vez mais presente nos centros de

referência.

A dosagem do DNA plasmático, assim, se aplica neste estudo com o fim de

relacionar sua concentração e as diferentes situações peri-operatórias, desde pacientes

com diferentes estratificações nos seus riscos, até variáveis técnicas, como o tempo de

CEC e o tipo de cardioplegia usada. O protocolo foi desenhado de forma a permitir tais

comparações, inclusive usando um possível viés (IAM) como um evento a mais de

morbidade detectada no pós-operatório.

Por fim, uma metodologia molecular poderia de forma inédita demonstrar seu

valor prognóstico e até mesmo diagnóstico quando aplicada a pacientes candidatos á

CRM. Quadros de estresse teciduais equivalentes a esse, como discutidos previamente

(AVE, trauma, etc.), mostraram que esse potencial é uma realidade.

24

OBJETIVOS

Em nosso estudo, procuramos analisar o papel do DNA livre no plasma como

preditor de complicações na pré e pós-cirurgia de revascularização miocárdica, traçando

uma curva para os desfechos moleculares e buscando uma analogia com os desfechos

clínicos e bioquímicos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I – Caracterizar a amostra de indivíduos estudada, utilizando-se para tanto,

variáveis demográficas, clínicas e de exames complementares.

II – Estabelecer os níveis de DNA plasmático livre no pré e pós-operatório de

CRM.

III – Correlacionar as concentrações de DNA plasmático com os seguintes

achados: concentração sérica de CKMB, tempo de CEC, tempo para alta da UTI,

sintomatologia, tempo de extubação e relação entre número de vasos comprometidos e

revascularizados.

25

MATERIAL E MÉTODOS

Como vimos, nenhum método é definitivo na análise da evolução no pós-

operatório intra-hospitalar de CRM. O DNA plasmático, por ser liberado em situações

de injúria tecidual, poderia relacionar-se ao grau dessa injúria, como estudos prévios

confirmaram em pacientes com AVE e traumatizados, conferindo lógica a nossa

hipótese.

1. Aprovação Ética: O presente estudo obteve aprovação dos Comitês de Ética em

Pesquisa das duas instituições envolvidas: Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) e

Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia (IC-FUC).

2. Delineamento: Estudo de coorte onde foram recrutados 25 pacientes voluntários com

diagnóstico de cardiopatia isquêmica e indicação de CRM eletiva selecionados

longitudinalmente. Estes pacientes informaram seu consentimento após cumprirem a

rotina da triagem do serviço de pré-operatório do Instituto de Cardiologia de Porto

Alegre. Aqueles que não foram encaminhados pelo médico assistente e foram acionados

pelo pronto atendimento por apresentarem quadro de urgência ou emergência cirúrgica

foram excluídos do estudo, já que o protocolo requeria prévia dosagem consentida do

DNA plasmático. Após o procedimento de revascularização, que não excluía

substituição ou plastia valvares, os pacientes eram encaminhados à unidade de

recuperação. Vinte e cinco pacientes completaram as 3 amostras previstas, sendo uma

no pré-operatório e duas no pós-operatório (uma na chegada à recuperação e outra no

dia da alta dessa unidade). Um grupo controle com 6 pacientes hígidos teve apenas o

nível de DNA plasmático observado em condições basais para comparar com a primeira

amostra dos candidatos á CRM.

3. Amostra: O tamanho relativamente pequeno da amostra deve-se ao caráter

experimental da avaliação da capacidade preditiva de um marcador que, na hipótese de

demonstrar ter potencial diagnóstico e prognóstico, aí sim, poderia ser usado em estudos

com amostras maiores a fim de revalidar os achados.

3.1.Critérios de Inclusão: Foram incluídos nesse estudo homens e mulheres com

diagnóstico confirmado de cardiopatia isquêmica, desde que portassem patologia com

indicação consensual de revascularização cirúrgica e prévio estudo coronariográfico. A

forma de apresentação da cardiopatia isquêmica, a fim de comparar as diferentes

manifestações clínicas com as dosagens moleculares de DNA, foi bastante permissiva,

podendo o paciente apresentar qualquer uma das formas (aguda, crônica ou silenciosa),

26

com ou sem insuficiência cardíaca manifesta. Aqueles que, no mesmo tempo, tinham

indicação de troca ou plastia de válvulas também foram mantidos na pesquisa por

supostamente potencializarem os achados.

3.1.1. Grupo Controle: Um grupo controle de 6 homens hígidos, com dosagem de

DNA plasmático em condições basais semelhantes à amostra pré-operatória dos

pacientes candidatos à CRM, a não ser pela maior prevalência de fatores de risco neste

grupo, serviu de comparação entre as duas amostras, a fim de avaliar a fidedignidade

dos níveis basais do DNA, que são o ponto de partida da curva a ser traçada daquele

marcador.

3.2.Critérios de Exclusão: Os pacientes menores de 18 anos e os maiores de 70 anos

não foram incluídos. Além disso, a fim de evitarmos a indução de viés por aumento da

dosagem plasmática de DNA livre não relacionado à CRM, foram excluídos pacientes

com IAM e AVE nas últimas 8 semanas e qualquer cirurgia de grande porte no mesmo

período. Como citado anteriormente, CRM de urgência não pôde ser incluída pela

impossibilidade de acionar-se o aparato de inclusão no protocolo. Por tratar-se de um

grupo importante para reforçar os achados do desfecho proposto, um futuro estudo

poderia incluí-lo, desde que uma equipe mantivesse um sobreaviso de prontidão. No

entanto, a exclusão desse grupo não gera falsos-positivos, validando a nossa hipótese.

3.3. Caracterização da Amostra: A obtenção dos dados demográficos, registrados no

protocolo, levou em consideração, no pré-operatório, idade, cor, gênero e procedência.

Entre os dados clínicos, foram avaliados sintomas, escores de gravidade, sinais de

insuficiência cardíaca e condições hemodinâmicas, sinais vitais, fatores de risco e

patologias associadas. O ECG, a coronariografia e o hemograma complementaram os

dados nessa fase.

O registro da evolução clínica com os dados do pós-operatório (momento da

retirada da pinça aórtica, extubação e alta da UTI), do tempo de CEC, do número de

enxertos e da dosagem de CKMB, um marcador tradicional de dano miocárdico foi feito

a fim de estabelecer possíveis correlações com as concentrações plasmáticas do DNA

extraído.

4. Materiais e procedimentos:

4.1. Coleta de Sangue: Vinte e cinco dos trinta pacientes selecionados inicialmente

completaram as 3 amostras. Foram coletados de cada paciente 5ml de sangue venoso

periférico em cada uma das 3 amostras, em concordância com as rotinas do hospital.

Após ser centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos, o plasma, separadamente, foi

27

armazenado a -20 graus Celsius até o momento dos ensaios moleculares, que foram

realizados no Laboratório de Diagnóstico Genético e Molecular da Universidade

Luterana do Brasil. Essas amostras foram colhidas em três etapas: pré-operatório, pós-

operatório imediato e no dia da alta da unidade de recuperação. O material foi coletado

e armazenado em tubos com EDTA e seriado conforme o esquema descrito.

4.2.Extração de DNA: O DNA foi extraído do plasma seguindo o protocolo

desenvolvido por Boom et al (1990) que prevê a lise de 100uL de cada amostra de

plasma em 900 uL de um tampão GuSCN. Após sofrer lise o DNA foi ligado a

partículas de sílica e posteriormente lavado com vários solventes em etapas

consecutivas. A seguir, foi secado e liberado das partículas de sílica em 50 uL de

tampão.

4.3. PCR: O DNA plasmático foi medido por PCR quantitativa em tempo real usando a

PE Applied Biosystems 7000 Sequence Detector. A amplificação foi baseada no ensaio

5` nuclease (Taqman). A PCR em tempo real utiliza um termociclador combinado a um

fluorímetro capaz de monitorar a amplificação a cada ciclo, detectando diretamente o

produto amplificado (amplicon). A quantificação da seqüência alvo se dá ao

detectarmos em que ciclo esta seqüência será detectada. Quanto mais precoce, maior

será a concentração de DNA (Heid et al, 2002).

Assim, o DNA foi medido por ensaio de PCR em tempo real para o gene da

beta-globina, que está presente no núcleo de cada célula do corpo e é capaz de

determinar o DNA genômico equivalente a partir de uma única célula, consistindo na

amplificação dos ´´primers`` beta-globina-354F (5`- GTG CAC CTG ACT CCT GAG

A-3`), BETA-GLOBINA-455R (5`CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3`), e uma

sonda duplamente marcada para a beta-globina-402T [5`-(FAM)AAG GTG AAC GTG

GAT GAA GTT GGT GG (TAMRA)-3`](Lo et al., 1998).

5. Desfechos: Os desfechos primários medidos foram as relações da concentração do

DNA plasmático com os valores de CKMB, os tempos para extubação, alta da UTI, de

CEC, e os sintomas no período de recuperação. Outros desfechos medidos foram o

número de vasos ou ramos comprometidos (C), o número de vasos ou ramos

reperfundidos (R) e a relação entre eles. Se C/R > 1 - pressupondo que quanto maior

esse valor, pior o índice de revascularização - e valores altos de C e R se associam a

níveis elevados de DNA livre, estes seriam então, achados capazes de refletir a razão do

aumento do ácido nucléico plasmático; uma variável clínico-cirúrgica específica para

este marcador e este estudo.

28

6. Análise Estatística: Feita análise não paramétrica dos dados, utilizando os testes de

Kruskal Wallis para comparar os valores médios dos grupos. Correlação de Spearman e

Regressão Múltipla foram feitas para comparar concentração do DNA plasmático com

os seguintes achados: concentração sérica de CKMB, tempo de CEC, tempo para alta da

UTI, sintomatologia e tempo de extubação. Os possíveis vícios são inerentes às

variáveis peri-operatórias capazes de gerar vieses de confusão; já os vícios de seleção,

aferição e acaso puderam ser amenizados, considerando-se a metodologia empregada,

apesar de terem sido excluídos da seleção os pacientes admitidos para CRM de

urgência, o que, no entanto, geraria apenas um déficit no desfecho e, justamente por esta

razão, reforçaria nossos achados.

29

RESULTADOS

Dos 25 pacientes, 16 eram do gênero masculino e a idade média foi de 58,92

com mediana de 62 anos (44 a 67 anos). Todos apresentavam algum dos tradicionais

Fatores de Rico (FR). Um paciente masculino de 54 anos, tabagista pesado, apresentava

apenas esse FR além do gênero e era fortemente sintomático. Seis pacientes (24%) eram

assintomáticos e desses, a metade (3 pacientes), era de diabéticos. A seguir, os FR mais

encontrados foram o sobrepeso em 19 pacientes (76%), sendo que 11 (44%)

apresentavam IMC acima de 30, história familiar e tabagismo em 18 (72%), hipertensão

arterial sistêmica em 17 (68%), dislipidemia em 16 (64%), diabetes em 10 (40%) e

ainda, 9 pacientes (36%) relataram uma vida estressante ou tratamento para depressão e

6 (24%) relataram estilo de vida sedentário. Muitos desses fatores se sobrepuseram no

mesmo paciente. A sobreposição mais prevalente foi entre dislipidemia e sobrepeso e

entre hipertensão e sobrepeso. A história familiar e o tabagismo, por incidirem na

maioria dos pacientes, também acabaram por apresentar elevada associação com os

demais fatores de risco. Além disso, a maioria dos diabéticos era hipertensa, obesa e

dislipidêmica, resultando em achados concordantes com a literatura. A avaliação do

risco cardiovascular em 10 anos utilizando o sistema de Framingham mostrou uma

pontuação média no grupo feminino de 11% e no grupo masculino de 14%. Além

desses dados, o pré-operatório avaliou rotineiramente os valores de hematócrito e a

hemoglobina, sendo que somente 2 pacientes apresentaram anemia com valores de

30/10 e 29/10, respectivamente. Não ocorreram perdas significativas no pós-operatório

imediato (tabela 1: ver na página seguinte).

30

TABELA 1: CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO AMOSTRADA SEGUNDO

SEUS FATORES DE RISCO (FR):

Pac\Fr Gênero Idade Dislip. Tabag. DM HAS IMC HF Sint.

01 Masc 55 - + - - < 25 + + 02 Masc 58 + + - - = 30 + + 03 Masc 63 - - - + > 30 - + 04 Fem 67 + + - + < 25 - + 05 Fem 62 + - + + > 30 + + 06 Masc 58 + + - + > 30 - + 07 Fem 53 + - - + > 30 + - 08 Masc 66 - + - + < 25 + + 09 Fem 44 + + + + = 25 + + 10 Masc 66 + - + + > 25 + + 11 Masc 54 - + - - > 25 - - 12 Masc 63 + + + + > 25 + - 13 Fem 67 + + + + > 30 + + 14 Masc 49 - - - + > 30 + + 15 Masc 45 + + - + > 30 + + 16 Masc 67 + + + + > 25 + - 17 Masc 52 - + + + = 30 - + 18 Fem 47 - + + + > 30 + + 19 Masc 58 + + - + < 25 + + 20 Masc 53 - + - - = 25 + + 21 Fem 64 + + + - > 25 - + 22 Masc 65 + + + - > 25 - - 23 Masc 66 - - - - > 30 + + 24 Fem 66 + - - + < 25 + - 25 Fem 65 + + - - >25 + +

- A dislipidemia foi considerada quando os valores de colesterol ou triglicérides

ultrapassavam 200 mg/dl.

- O tabagismo foi considerado naqueles com hábito ativo, mesmo nos que

referiram suspensão, desde que dentro dos últimos 6 meses.

- O diabetes não foi diferenciado entre os que usavam ou não insulina. Todos os

diabéticos da amostra eram do tipo II.

- A hipertensão foi considerada somente naqueles com prévio diagnóstico

médico, independentemente do uso de medicação.

- A história familiar foi considerada positiva quando o paciente descendeu de pai

e/ou mãe cardiopatas, ou possuía tios e/ou irmãos com a patologia antes dos 60 anos.

- Os sintomas considerados foram a dor torácica (típica ou atípica), dispnéia,

cansaço aos esforços ou outros sintomas de disfunção miocárdica.

31

Seis pacientes serviram de grupo controle para as primeiras amostras dos

pacientes submetidos à CRM. Todos os pacientes do controle eram do gênero masculino

com idade mediana de 32 anos (mínima de 24 e máxima de 40 anos).

O valor médio de coronárias ou ramos coronarianos comprometidos foi de 3,8,

com mediana de 3 (2 a 5 ramos) e de enxertos (de mamárias, safenas, seqüenciais ou

outras) foi de 2,56 em média e mediana de 2 (2 a 5 enxertos). Já a relação de vasos

comprometidos sobre os revascularizados foi de 1,48, sendo que 13 pacientes (52%)

tiveram essa razão maior do que um. Nove pacientes (36%) tiveram 4 ou 5 ramos

comprometidos e somente um deles com índice de revascularização igual a um.

Curiosamente, um paciente com 3 ramos comprometidos, recebeu 4 pontes ou

seqüenciais, obtendo índice de C/R<1. Em relação aos achados eletrocardiográficos,

houve grande variabilidade. Um paciente chegou a apresentar ECG normal. Justamente

neste caso a complexidade das lesões coronarianas era branda com 2 coronárias

comprometidas, sendo que as 2 foram revascularizadas (relação C/R=1) e baixo valor de

DNA livre, assim como de sua variação de pré para o pós-operatório (desfecho

secundário). Todos os outros pacientes apresentavam alguma alteração ao ECG. Dez

pacientes (40%) tinham indício de necrose, sugerindo IAM prévio. Outras alterações

comuns foram isquemia em uma ou mais paredes em 16 pacientes (64%), alterações

secundárias, sugerindo sobrecarga de ventrículo esquerdo em 7 pacientes (28%) e

bloqueio de ramo em 3 pacientes (12%). Os achados a seguir foram os parâmetros para

o desfecho primário. O tempo médio de retirada do pinçamento aórtico foi de 61,72 ±

22,4 minutos. Um único paciente - com aumento significativo do DNA plasmático do

pré para o pós-operatório – teve a retirada acima dos 100 minutos. O tempo médio de

circulação extra-corpórea foi de 84,20 ± 23 minutos, mas 2 pacientes chegaram a 2

horas de CEC, com reflexo na curva do DNA. A extubação deu-se, em média em 1,64

dias com mediana de 1 dia (1 a 14 dias), porém 21 pacientes foram extubados no

primeiro dia, 3 no segundo e um no décimo quarto dia, associando-se com elevação

significativa na curva do DNA. A alta da UTI foi possível em média em 7,44 dias com

mediana de 3 dias (3 a 14 dias). A maioria (64%) obteve alta no terceiro dia, cinco

pacientes (20%), no quarto dia, dois no quinto, um no sexto e um no décimo quarto,

quando este foi extubado. Os 4 pacientes com alta após 4 dias de UTI tiveram a

dosagem do DNA no quarto dia e não na alta, a fim de que os achados moleculares

refletissem as complicações. Justamente esses pacientes tiveram maior aumento na

curva de DNA. Por fim, o nível de CKMB pós-operatória, cujo kit previa normalidade

32

até 10 UI/1, teve, como média, 15,85 UI/1. Somente 5 pacientes tiveram níveis de até

10 UI/1. Portanto, 80% da amostra estava com valores alterados, sem qualquer

correlação com a curva de DNA. Nos demais dados para desfecho primário também não

houve correlação, a menos que partíssemos de um ponto de corte mais alto, como vimos

acima, reduzindo muito a amostragem e comprometendo a análise, como discutiremos

adiante (tabela 2).

Abreviaturas da tabela:

- P\D: pacientes na ordem de 1 a 25 \ desfechos no plano horizontal.

- ECG (eletrocardiografia): definidos como isquêmicos (I); com necrose (N); BRD ou

BRE (bloqueios de ramo direito ou esquerdo); SCE (sobrecarga de cavidades esquerdas)

e DLN (dentro dos limites da normalidade).

- Cine (coronariografia): número de vasos (coronárias e/ou ramos) com estenose.

- Ht/Hb: hematócrito/hemoglobina.

- CEC: (circulação extra-corpórea): definido o tempo de assistência do método.

- Pinça: tempo para retirada da pinça aórtica.

- Enx: definido como o dia de retirada da assistência ventilatória.

- Alta da UTI: definido como o dia de alta para o quarto.

- CKMB: Enzima de necrose dosada na última coleta antes da alta da UTI. Kit (Roche)

até 10 (normal).

- DNA: desfecho primário com dosagem nos 3 momentos definidos no projeto.

- Rel. C/R: razão entre o número de ramos comprometidos e os enxertos.

Em todos esses pacientes citados na tabela 2 (na página seguinte), foi usada a

cardioplegia com cristalóide gelado.

33

TABELA 2: DESFECHO PRIMÁRIO DIANTE DAS DEMAIS VARIÁVEIS

D

P

ECG Cine

num

Ht/Hb CEC

tempo

Pinça

retir.

Enx.

núm.

Ext.

dia

Alta

UTI

CKMB

pósop

DNA

préop

DNA

pós 1

DNA

pós 2

REL.

C/R

01 BRD 02 44/14 90m. 77m. 01/V 01 03 30 2838 6034 68107 2,0

02 BRD 03 41/13 105m. 55m. 04 01 03 15 5063 1586 1295 0,75

03 I/SCE 02 43/14 50m. 40m. 02 14 14 11 1488 117965 3577 1,0

04 I/SCE 05 42/14 89m. 77m. 04 01 03 17 <500 952907 1471 1,25

05 SCE 04 42/13 98m. 59m. 03 01 03 12 5768 2972 13910 1,33

06 I 02 40/13 55m. 38m. 02 01 03 10 974 204344 2210 1,0

07 I 03 43/13 78m. 56m. 03 01 03 08 <500 19472 1471 1,0

08 I/N 03 43/15 57m. 25m. 02 01 03 08 861 8295 15764 1,5

09 I 03 30/10 85m. 58m. 02 01 04 14 <500 5411 <500 1,5

10 N 03 29/10 108m. 92m. 03 02 03 12 <500 27669 24892 1,0

11 I/N 03 45/14 95m. 78m. 02 01 04 20 <500 15560 2353 1,5

12 SCE 04 40/13 87m. 49m. 03 01 04 18 <500 8056 156961 1,3

13 I 02 36/11 58m. 34m. 02 01 04 07 716 6138 <500 1,0

14 DLN 02 44/15 51m. 42m. 02 01 03 13 <500 <500 838 1,0

15 I/N 04 49/37 120m. 102m. 02 01 03 13 579 1518 1462 2,0

16 I/N 03 39/12 120m. 92m. 03/V 01 05 22 4551 12993 10374 1,0

17 I 02 42/14 59m. 39m. 02 01 03 09 1448 2968 5724 1,0

18 N/SCE 04 32/11 56m. 37m. 03 01 04 16 648 <500 7952 1,3

19 N/SCE 04 38/12 93m. 76m. 04 01 05 21 <500 14654 Nr 1,0

20 I/N 05 41/13 106m. 90m. 04 02 03 19 <500 540 868 1,25

21 I/BRD 04 41/12 112m. 92m. 03 01 03 20 549 <500 714 1,33

22 N 04 35/11 107m. 74m. 02 01 03 14 2218 3527 1062 2,0

23 I/SCE 03 41/13 92m. 75m. 03 01 06 13 <500 64330 <500 1,0

24 I/N 01 41/13 55m. 38m. 01 02 03 21 <500 22061 3811 1,0

25 I 03 41/13 79m. 48m. 02 01 03 19 <500 7791 4452 2,0

34

As concentrações plasmáticas de DNA livre foram determinadas em todos os

indivíduos incluídos no estudo, conforme metodologia descrita previamente. A terceira

dosagem foi a que variou em função da variação do dia da alta do paciente (dia da

terceira coleta) – média de 7,44 dias. Os níveis de DNA observados no grupo controle e

na amostra pré-operatória dos cardiopatas foram de 1889 ± 760 e 1347 ± 310

kilogenomes-equivalents/L (média), respectivamente, não sendo observadas diferenças

significativas entre esses grupos (p>0,05) (figura 1). Todavia, no grupo de cardiopatas,

houve aumento significativo de DNA plasmático livre no pós-operatório imediato e no

dia alta da UTI: 52975 ± 36836 e 15843 ± 6919 kilogenomes-equivalents/L (média),

respectivamente em relação aos níveis pré-operatórios (p<0,001) (figura 1). Foi ainda

observada correlação entre níveis mais altos do marcador em estudo com o índice de

reperfusão proposto pela relação C/R, independentemente do número de vasos

comprometidos. Quando a relação foi maior do que 1 a curva do DNA alterava

significativamente (rho = - 0,447, C.I.= - 0,7219 a - 0,050; p = 0,025) (figura 2).

Contudo, não houve correlação significativa entre os níveis do DNA plasmático livre e

o tempo para alta da UTI, o tempo de CEC, o tempo para extubação, a concentração

sérica da CKMB e a presença de sintomas.

As figuras 1 e 2 (nas páginas seguintes) mostram respectivamente, os valores

significativamente alterados do DNA no pós-operatório em relação aos níveis basais e a

relação entre a cobertura por enxerto vascular – parcial ou total – dos ramos

comprometidos (proposto pela fórmula C/R) e os achados moleculares.

35

controle pre pos1 pos20

20

40

60

80

100

(Tho

usan

ds)

DN

A p

lasm

atic

o

* ^

Figura 1. Concentrações de DNA plasmático livre em indivíduos hígidos e submetidos à CRM. O grupo controle, constituído de indivíduos hígidos, apresentou concentração média de DNA plasmático livre de 1889 ± 760 kilogenomes-equivalents/L. No grupo de indivíduos submetidos à CRM, a concentração média pré-operatória (pré) foi de 1347 ± 310 e pós-operatória foi de 52975 ± 36836 e 15843 ± 6919 kilogenomes-equivalents/L, no pós-operatório imediato (pós 1) e na alta da UTI (pós 2), respectivamente. Os valores estão representados em média ± E.P. * Significativamente diferente dos grupos pós 1 e pós 2 � Significativamente diferente dos grupos pós 1 e pós 2

36

Figura 2. Níveis de DNA plasmático livre no pós-operatório imediato (amostra pós-operatória 1) nos grupos de indivíduos com relação de número de vasos comprometidos / número de vasos reperfundidos (C / R) > 1 e </= 1. A concentração média de DNA plasmático livre detectada foi de 72513 ± 67732 no grupo com C / R > 1 e 28016 ± 10345 kilogenomes-equivalents/L no grupo com C / R </= 1. Os valores estão representados em média ± E.P. Houve correlação entre níveis mais altos de DNA plasmático livre no pós-operatório imediato e menor número de vasos reperfundidos (C / R > 1) (rho= -0,447, C.I. -0,7219 a -0,050; p=0,025).

>1 </=1 C / R

0

30

60

90

120

150

(Tho

usan

ds)

DN

A p

lasm

atic

o

37

DISCUSSÃO

O presente estudo teve como objetivo investigar o papel do DNA plasmático

livre como marcador de dano e, consequentemente, de evolução na recuperação de

CRM (período de chegada até a alta da unidade fechada). Os níveis de DNA livre

aumentaram de modo significativo após a cirurgia. A relação entre esta curva e a

morbidade, especialmente os níveis de CKMB, ficaram aquém do esperado. Nossos

resultados, no entanto, mostraram uma forte relação com o índice de reperfusão

proposto pela razão entre ramos comprometidos e revascularizados (C/R). A idéia de

relacionar esses achados se baseia no fato de que algumas áreas do miocárdio podem e

comumente são subestimadas. Zonas julgadas como inviáveis pelos métodos

diagnósticos convencionais e, por essa razão, muitas vezes desconsideradas no

momento de indicar qualquer procedimento de revascularização, são, na verdade,

regiões com alguma atividade metabólica, e métodos cada vez menos raros em nosso

meio, ainda que com elevado custo como a Tomografia por Emissão de Pósitrons

(TEP), nos mostram claramente o potencial e, portanto, a viabilidade dessas regiões.

Assim, se pudéssemos incrementar as possibilidades de revascularização, a partir de

dados otimizados de viabilidade, poderíamos também reduzir a morbidade. Essa

hipótese se confirmou através dos nossos achados, já que os pacientes com a relação

C/R = ou <1 tiveram melhor evolução pós-cirúrgica.

A tentativa de associar a curva de DNA com as variáveis peri-operatórias

dispostas na tabela 2, não mostrou correlação significativa. Contudo, se partirmos de um

ponto de corte mais estreito a fim de buscar os pacientes com maiores indícios de dano

tecidual, observamos alguns desfechos interessantes. Em relação à CEC, se analisarmos

os 2 pacientes que alcançaram 2 horas com este suporte, notamos aumento significativo

nos níveis plasmáticos do DNA livre do pré para o pós imediato, principalmente

naquele que apresentou um nível maior de CKMB na recuperação. Ao avaliarmos o

pinçamento aórtico, observamos que o único paciente submetido a um período superior

a 100 minutos desse procedimento, também triplicou os níveis pós-operatórios de DNA

livre. Da mesma forma, os 4 pacientes que obtiveram alta da recuperação após 4 dias

nessa unidade, também tiveram aumento importante de seus níveis de DNA (um

paciente no décimo quarto dia, outro no sexto e dois no quinto dia), sendo que tiveram

suas terceiras coletas no quarto dia em vez da alta a fim de evitar um possível viés. Já os

38

níveis da CKMB, mesmo com ponto de corte mais alto, e a sintomatologia não se

relacionaram com os desfechos moleculares.

Obviamente, a amostragem, por tornar-se muito reduzida nessas condições, não

pode ser validada para esse estudo, mas de certa forma dá subsídios para investigações

com desenhos e números mais amplos. Trabalhos utilizando essa molécula com

metodologia laboratorial similar, mas em outras condições de dano celular como no

AVE, evidenciaram grande potencial prognóstico (Rainer et al., 2003). A severidade da

evolução de pacientes com trauma também se relacionou com os achados moleculares

em outro estudo (Lam et al., 2003). A diferença entre esses ensaios e o nosso se deu

principalmente no período de observação e o uso de escalas de gravidade que

permitiram observações mais pontuais. As amostras também não foram muito grandes e

as dosagens observadas nos níveis basais e no ápice do dano foram similares nos 3

estudos. Conseqüentemente, o resultado da variação do DNA livre (curva) também não

apresentou maiores discrepâncias, mostrando forte aumento dos níveis séricos nas 3

pesquisas. O tamanho relativamente pequeno da amostra deve-se ao caráter

experimental da avaliação da capacidade preditiva do marcador.

Outros trabalhos relacionaram fragmentos de DNA com câncer (Fackelmayer et

al., 2001) e liberação de DNA fetal, permitindo a análise dessa molécula, no plasma

materno (Lo et al., 1998).

Entre os possíveis vícios desse trabalho, devemos considerar que estamos

sujeitos a algum viés de confusão inerente às variáveis peri-operatórias já que, ao

excluirmos justamente os pacientes com indicação emergencial de CRM podemos estar

eliminando um potencial grupo capaz de incrementar os achados sobre o desfecho

primário. No entanto como esse viés induziria a um falso negativo e não a um falso

positivo, consideramos previamente, que o marcador proposto mostrando algum poder

preditivo, este poderia ser revalidado em desenhos mais inclusivos, pois o desfecho

seria reforçado pela presença daquele grupo, validando nossa hipótese. Apesar de o

DNA mitocondrial ser um potencial indutor de viés de confusão por estar presente no

plasma na forma livre e associada a partículas (Chiu et al., 2003), em nosso estudo esse

risco foi reduzido pelo desenho, que incluiu uma amostra pré e duas pós-operatórias. O

acaso pode ser desconsiderado devido à metodologia utilizada. Em relação ao grupo que

sofre IAM no peri-operatório, sugere-se que o próprio evento libere DNA. Se, por um

lado, isto poderia induzir a um viés, por outro, seria um meio auxiliar no diagnóstico,

considerando que as manifestações clínicas são mascaradas e a instabilidade

39

hemodinâmica e as arritmias ventriculares são as apresentações mais comuns das SCA

nesse período (Figueiredo, 2005).

Consideramos que as causas de liberação da molécula de DNA no plasma

ocorrem por mais de uma razão, sendo que os fenômenos apoptóticos e necróticos são

os predominantes por fazerem parte da fisiopatologia das SCA (Cuoco et al., 2003).

Esse processo, em parte e principalmente o que envolve a apoptose pode ser revertido

ou ´´abortado``, o que explica parcialmente o retorno do DNA livre no plasma para

níveis basais ou próximo disso, no seguimento de médio prazo.

A grande freqüência de dano neurológico em CRM é amplamente citada na

literatura como já mencionamos anteriormente. Neste estudo, porém, não utilizamos

nenhum parâmetro de investigação desse tipo de dano. A possibilidade de o DNA estar

aumentado por suposta complicação neurológica, ainda que clinicamente não tenha sido

observada, poderia contaminar os nossos desfechos, já que trata-se de um fenômeno de

alta incidência em situações de injúria tecidual (Regner et al., 2001). Por outro lado,

como nosso objetivo foi avaliar o poder prognóstico e diagnóstico do DNA plasmático,

as origens da morbidade não gerariam falso-positivos.

Concluímos que o DNA livre no plasma, apesar de não configurar-se como um

marcador definitivo, sem dúvida acrescentou dados importantes na avaliação da

evolução pós-operatória. Outro grande benefício foi a observação de que pacientes com

reduzido nível de abordagem cirúrgica, do ponto de vista de cobertura maior das regiões

isquêmicas, estarão sujeitos a um maior dano celular medido pelo DNA plasmático.

Com isso, espera-se considerar a maior cobertura possível a fim de evitar-se tal dano. A

relação C/R, neste experimento, só foi considerada como objetivo secundário por não

ter sido ainda amplamente analisada na literatura. A partir dos nossos achados, a busca

por confirmação das evidências observadas nesse estudo poderá contribuir para

revalidar nossas conclusões.

40

PERSPECTIVAS

Em função dos argumentos ressaltados em nossa conclusão, consideramos que

há forte justificativa para que novos experimentos confirmem nossos desfechos e

incluam desfechos mais tardios, como o dano neurológico avaliado pela proteína S 100,

por exemplo, e cardiovascular, utilizando marcadores de necrose e apoptose. Devemos

ainda, considerar que a busca por uma melhor relação C/R (a mais próxima de 1

possível) poderá reduzir a morbidade pós-operatória, como pudemos detectar através da

dosagem do DNA livre. Já sabemos que as áreas vistas como inviáveis podem estar mal

estimadas e que métodos nucleares mais complexos (atividade metabólica por TEP)

podem ampliar a zona de viabilidade e assim fornecer fundamentos para uma

abordagem mais completa, seja através da CRM, da angioplastia, do uso da terapia

celular (angiogênese e/ou regeneração), do uso da terapia gênica e da associação entre

esses métodos. A nosso ver e baseado em nossos resultados, não há razão para que não

busquemos esta otimização e a confirmação de seus benefícios.

41

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