Msc J.Gabriel Roderjan Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009.
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Msc J.Gabriel Roderjan
Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009
Plano de TrabalhoPROGRAMA TEÓRICO:
1. Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários2. Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática;3. Aplicação clínica das enzimas;4. Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos5. Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática6. Introdução aos processos fermentativos7. Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas 8. Seminários: Fermentação acética: vinagres 9. Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos10. Seminários: Fermentação láctica: vegetais11. Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados12. Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados13. Seminários: Processos biotecnológicos
Aula teórica Apresentação dos
tópicos Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Perguntas
Plano de TrabalhoPROGRAMA PRÁTICO:
1. Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos
2. Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores
3. Imobilização de enzimas4. Purificação de enzimas5. Preparação para fermentação láctica do leite6. Fermentação láctica: leite7. Preparação para produção de cerveja 8. Fermentação alcoólica: cervejas
Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Tutorial Formulação de protocolos de
procedimento; Formulação do plano de ação; Check-list; Documentação e legislação Procedimento operacional padrão Resultados e modificações
AVALIAÇÕES AULAS PRÁTICAS
Avaliação de desempenho nas aulas práticas Trabalhos em sala de aula Valor 2,0 PROVAS
1ª prova 1° bimestre - 09/09/2009 - valor 8,0 2ª prova 1°bimestre - 07/10/2009 - valor 8,0 3ª prova 2°bimestre - 04/11/2009 - valor 5,0 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/2009 - valor 10,0 Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas SEMINÁRIOS Trabalho impresso Apresentação Valor 5,0
BibliografiaLEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
xxviii, 1202 p. ISBN 85-7378-166-1 (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, 2006. 1 v. (várias paginações) ISBN 78-85-363-0679-7 BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia,
1980. 233 p. ISBN 84-200-0437-5 LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c1975. 285 p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E.
Blücher, 1983. 227 p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, 1993. 413 p. ISBN 84-
200-0743-9 BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 1975. 300 p.
(Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005.
xv, 434 p. ISBN 85-99011-01-04 (enc.)
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, 1991. 444 p. ISBN 84-200-0705-6
http://www.bireme.br/php/index.phpwww.anvisa.gov.br/www.fda.govwww.biotecnologia.com.br/www.atcc.org/www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme
Modelo de relatório de seminárioSUMÁRIO1. Introdução2. Aplicação3. Método (como se utiliza e quais vias
bioquímicas envolvidas)4. Organograma (seqüência de eventos)5. Legislação e Controle de qualidade6. Referências7. Anexos
Aspectos gerais
Vida= fn(matéria x energia)
Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas;
Reações químicas Estabilidade Conversão da matéria em energia e da
energia em matéria Fonte principal: Sol Meio: água
Reações químicas A + B ↔ AB AOH + HB ↔ AB +H2O
Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação
S PReação:
Keq = [P]/[S]
G = - RT ln KeqReações com G’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos
S P Reação = colisão de moléculas
em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)
Facilitadores de reação Catálise = alteração na velocidade da
reaçãoWilliam P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975
Redução na energia de ativação (ΔG); Sem um catalisador : A + B ↔ AB em 20 minutos e X de ΔG Com um catalisador : A + B ↔ AB em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG
Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG
A velocidade de uma reação e a energia de ativação
a) Reação de 1ª ordem:
b) Reação de 2ª ordem:
V = k [S]
V = k [S1][S2]
k M-1 S-1
Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação
(uni molecular)
(bi molecular)
A lei de velocidade
Vantagem da catálise Reação com vários passos: velocidade é
determinada pelo passo com a mais alta ∆G++
Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas.
Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;
Quem faz a catálise? Catalisador = qualquer molécula que
facilite a reação.
Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação.
○ Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida;
○ A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação;
○ A reação tem mais do que um passo.
E + S ES EP E + P
Tipo de catálise
Biomoléculas e a catálise
○Carboidratos○Lipídeos○Proteínas
Proteínas funcionais
Seqüência amino acídica é quase infinita Combinação de 20 aminoácidos sem limite
de número e repetições Formação estrutural multivariável Adaptação a vários estados e ambientes
Enzimas = Proteínas funcionais
Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.
As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.
O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima.
O que há de especializado na função da enzima? Alto grau de especificidade pelo substrato;
Aceleram as reações;
Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto;
São as principais responsáveis para cada processo bioquímico:
catabolismo e Anabolismo
O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas? Estrutura especializada voltada ao
substrato A forma complementar, carga e
características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.
Catálise enzimática
O Ajuste Induzido
Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.
A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição
História da EnzimologiaPasteur declarou que "a fermentação alcoólica é
um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação".
Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878;
Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar - 1897
Histórico Sumner provou que as enzimas
eram proteínas através da cristalização da urease – 1926;
John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930.
Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.
Especificidade Eficiência Ação da enzima no substrato é
dependente de:○ Presença de substrato em concentração
adequada;○ pH○ Temperatura○ Concentração de produto;○ Cofatores○ Meio (sólido ou líquido)
Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima
Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima
COFATORES necessários para o funcionamento da enzima
Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa)
Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima
As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.
Cofatores inorgânicos: íons
A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato
Quimiotripsina
Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato
O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise
Coenzimas
ATP + GLICOSE ADP + GLICOSE-6-FOSFATONome comum da enzima: Hexoquinase
Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferaseClassificação: E.C.2.7.1.1
ATP:Glicose fosfotransferaseE.C.2.7.1.1
[EC number]: número de comissão da enzima
2 transferase7 sub-classe: fosfotransferase1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.
Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.
Nomenclatura das enzimasATP:Glicose fosfotransferase
E.C.2.7.1.1[EC number]: número de comissão da enzima
2 transferase7 sub-classe: fosfotransferase1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.
Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.
Cinética enzimática
Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação
Enzimática
Equação de Michaelis-Menten
[E] = constante e limitante
Quando [S] tende a zero(reação de 1ª ordem)
Quando [S] tende para infinito(reação de ordem zero)
Constante de Michaelis-Menten (Km)É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
k1 k2
Modelo Cinético: E + S ES E + P k-1 K-2
Aproximações:
1. Admitindo-se a reação em seu início: k1 k2
E + S ES E + P k-1
2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por:
Vo = k2 [ES] (eq. 1)
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato
Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí:
[EL] = [ET] - [ES]
4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd)
Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2)
Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos:
[ET] [S] [ES] = (eq. 4)
[S] + Km
onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten)
Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S]Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km
O gráfico de 1/vo x 1/[S]
A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk
Modo mais correto de se determinar Vmax e Km
O significado de Km e a afinidade enzimática
Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES
Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante
kcat = k3 e [EP] ~[Et]
Passo limitante
kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato
Para [S] << Km
A Relação kcat/Km
Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica
Reações com Dois ou Mais Substratos
(Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)
Cinética envolvendo um complexo ternário
Cinética de dupla troca ou pingue-pongue
Inibição Reversível
KI é a constante de dissociação do complexo EI
a) Inibição Competitiva
Cinética de uma Inibição Competitiva
KI é a constante de dissociação do complexo EI
EI E + I
Não altera a velocidade máxima da reação, porém aumenta a constante de Michaelis-Menten ou seja:
V’max = VmaxK’m > Km
Inibidor Competitivo
Inibição competitiva pode ser revertida por aumentos na concentração do substrato
Admitindo-se que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato
b) Inibição não-competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
Cinética de uma Inibição não -competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
ESI ES + I
Diminui a velocidade máxima da reação e a constante de Michaelis-Menten ambos por um mesmo valor ’)
V’max < VmaxK’m < Km
Inibidor não-competitivo
Note que independentemente do valor de ’ o coeficiente angular da reta 1/Vo x 1/[S] será sempre o mesmo, daí as retas serem paralelas
Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva
c) Inibição Mista
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
Inibição não competitiva
[I]
1/[S]
1/vo
Sem inibidor
= ’Inibição Mista
(Vmax/ [S[Vo = Km + [S]
- 1/Km
Inibição Não Competitiva MISTA
Não altera a constante de Michaelis-Menten, porém diminui a velocidade máxima da reação
V’max < Vmax
K’m = Km
Admitindo que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor não afeta a afinidade da enzima pelo substrato
Numa inibição mista Vmax diminui e Km aumenta
Inibição da quimotripsina com o diisopropilfluorofosfato (DIFP), leva à conclusão que a Ser195 é um resíduo chave na catálise
Inibição Irreversível
Inibidores irreversíveis são importantes ferramentas no estudo do mecanismo de uma reação enzimática
Inibidores Suicidas: classe de inibidores irreversíveis pouco reativos, mas que no centro ativo da enzima são modificados e reagem irreversivelmente com a enzima inativando-a. São substâncias utilizadas na industria farmacêutica como remédios ou drogas de poucos efeitos colaterais
Efeito do pH na Atividade Enzimática
Os grupos laterais dos aminoácidos podem se encontrar com carga positiva, negativa ou neutra, dependendo do pH
Efeito da Temperatura na Atividade Enzimática
10 20 30 40 50 60 70Temperatura (°C)
Vo
A atividade aumenta com a temperatura até o ponto onde a enzima não se desnatura
Efeito da Concentração de Enzima na Atividade Enzimática
Concentração de Enzima (mM)
Vo
(mmol/s) [S] em excesso
Se o substrato não estiver em excesso, a velocidade da reação atinge um valor máximo e permanece constante
As Enzimas Reguladoras
Enzimas que têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais
Enzimas Alostéricas: são reguladas por ligações não covalentes
1º Tipo:
A Aspartato Transcarbamilase
R
R (2 cadeias)
R
Inibição por Retroalimentação ou Feedback da Conversão de L-Treonina em L-Isoleucina
E1 é a enzima desidratase da L-treonina, que é inibida de forma alostérica por L-isoleucina
Cinética Sigmoidal das Enzimas Alostéricas
O substrato é um modulador positivo
Com um modulador positivo e um ne-gativo, sem alterar Vmax
Com um modulador negativo que não altera K0,5
Algumas Enzimas Reguladoras Sofrem Modificações Covalentes
Regulação Covalente da Fosforilase do Glicogênio
Regulação alostérica por AMP (secundária)
Ser-P
Ser-P
AMP
AMP
glicose
Piridoxal-P
Piridoxal-P
glicose
Regulação enzimática por clivagem proteolítica
Ativação do zimogênio por clivagem proteolítica
Estrutura da quimiotripsina