MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS Monique Luiza... · Ao meu noivo, Camilo Lima, que além de noivo...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA A SAÚDE

MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS

ESTUDOS QUÍMICOS-COMPUTACIONAIS, FARMACOCINÉTICOS E

TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO

ÁCIDO HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO

HIV-1

NITERÓI

2014



TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO

HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO HIV-1

Orientadora: Prof.ª Dr.ª MONIQUE ARAÚJO DE BRITO

Niterói

2014

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-

CAPS) da Universidade Federal Fluminense,

como requisito parcial para obtenção do Grau

de Mestre. Área de Concentração:

Desenvolvimento de Produtos para Saúde.

FICHA CATALOGRÁFICA

S237 Santos, Monique Luiza Aguiar dos.

Estudos químicos-computacionais, farmacocinéticos e

toxicológicos in silico de derivados azaindóis do ácido hidroxâmico,

inibidores da enzima integrase do HIV-1 / Monique Luiza Aguiar dos

Santos; Orientador: Monique Araújo de Brito. ‒ Niterói, 2014.

115f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal

Fluminense, 2014.

1. Medicamento 2. Síndrome da imunodeficiência adquirida

3. Inibidores de integrase de HIV I. Brito, Monique Araújo de II. Título

CDD 615.1



TOXICOLÓGICOS IN SILICO DE DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO

HIDROXÂMICO, INIBIDORES DA ENZIMA INTEGRASE DO HIV-1

Aprovado em: 26 de fevereiro de 2014.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Monique Araújo de Brito (Orientadora)

Faculdade de Farmácia (UFF)

______________________________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Alessandra Mendonça Teles de Souza

Faculdade de Farmácia (UFRJ)

______________________________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Luiza Rosária Sousa Dias

Faculdade de Farmácia (UFF)

Niterói, 2014

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-

CAPS) da Universidade Federal Fluminense,

como requisito parcial para obtenção do Grau

de Mestre. Área de Concentração:

Desenvolvimento de Produtos para Saúde.

DEDICATÓRIA

A Deus,

“Porque Dele e por Ele, e para Ele, são todas as coisas;...”

(Romanos 11:36)

AGRADECIMENTOS

Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, por seu infinito amor e fidelidade em todos os

momentos, e por tornar possível a conclusão dessa importante etapa da minha vida. Toda

honra e toda a glória seja dada a Ele.

Aos meus pais, Noêmia e Lucivaldo, por todo amor e cuidado, pelo apoio em minhas

escolhas e pela torcida para que eu conquistasse os meus sonhos e objetivos. Mãe você é

minha maior incentivadora. Obrigada por acreditar sempre em mim.

À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Monique Araújo de Brito, por ter me recebido de

braços abertos, pela amizade, confiança e crédito a mim concedidos, e por toda atenção e

disponibilidade.

À Prof.ª Dr.ª Magaly Girão Albuquerque, por sua imensa disposição e vontade de

ajudar, que me auxiliou a dar passos importantes nessa trajetória. Foi uma pessoa essencial

para que esse trabalho pudesse ser realizado.

Ao Prof. Dr. Ricardo Bicca de Alencastro pela agradável convivência e pelo suporte

de infraestrutura.

Ao meu noivo, Camilo Lima, que além de noivo foi professor, orientador, psicólogo,

amigo, companheiro, parceiro e namorado. Pela paciência nos momentos difíceis, e que com

todo carinho e cuidado sempre me incentivou a continuar e persistir, mesmo quando o

cansaço e o desânimo “batiam à porta”.

Aos amigos da Pós-Graduação, em especial à Ana Izabel Bezerra Santos, pela amizade

e companheirismo.

Aos amigos do LabMMol, Thaíssa, André, Eugênio, Daniel e Prof.ª Nadja Paraense

pela amizade e agradável convivência.

À coordenadora do PPG-CAPS, Prof.ª Kátia Lima, e à secretária executiva, Adelina

Iorio, por todo o suporte.

Aos professores do PPG-CAPS, pelos ensinamentos necessários a minha formação.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos

recursos financeiros fornecidos.

À Banca Examinadora pelo aceite e pelas contribuições valiosas para este trabalho.

A todas as pessoas que não citei, mas colaboraram direta ou indiretamente para o

desenvolvimento deste trabalho.

RESUMO

A síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS, acquired

immunodeficiency syndrome) é causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV, human

immunodeficiency virus) que infecta as células do sistema imune, destruindo-as ou causando

prejuízos ao seu funcionamento. Dentre as enzimas do HIV, a integrase é responsável pela

inserção do DNA viral no DNA do hospedeiro. Atualmente, existem apenas três fármacos em

uso clínico pertencentes à classe dos inibidores de integrase: raltegravir (um derivado

pirimidinona carboxamida), elvitegravir (um derivado quinolina) e dolutegravir (um derivado

diazatriciclo carboxamida). Entretanto, diversos casos de resistência a estes fármacos são

descritos na literatura e as mutações da enzima responsáveis por este perfil são conhecidas.

Neste trabalho foram empregados estudos de relação entre a estrutura química e atividade

biológica (SAR) e docking molecular, aplicados a uma série de 68 derivados azaindóis do

ácido hidroxâmico sintetizados e avaliados farmacologicamente como inibidores de integrase

do HIV (PLEWE et al., 2009; TANIS et al., 2010; JOHNSON et al., 2011). Entre os

resultados obtidos, no estudo da relação entre a estrutura química e a atividade biológica foi

observado que a ausência do hidrogênio ligado ao oxigênio da porção ácido hidroxâmico leva

a perda de atividade biológica. E as simulações de docking molecular revelaram que este

oxigênio deve possuir carga parcial -1 para realizar interação iônica com os íons Mg²+

presentes no sítio ativo da enzima integrase que funcionam como cofatores. A complexação

dos derivados azaindóis com estes íons leva a inibição enzimática. Os compostos mais ativos,

1c e 21c, foram os que apresentaram melhor perfil de interação com a enzima.

ABSTRACT

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by the human

immunodeficiency virus (HIV) that infects cells of the immune system, destroying them or

causing damage to its operation. Among all the HIV enzymes, integrase is responsible for the

insertion of viral DNA in the host DNA. Currently, there are only three drugs in clinical use

that belong to the class of integrase inhibitors: raltegravir (a pirimidinone carboxamide

derivative, elvitegravir (a quinoline derivative) and dolutegravir (a diazatricyclo carboxamide

derivative). However, several cases of resistance to drugs of this class are described in the

literature, and the mutations of the enzyme responsible for this profile are known. In this work

were employed studies of structure activity relationship (SAR) and molecular docking,

applied to a series of 68 derivatives of azaindole hydroxamic acid synthesized and

pharmacologically evaluated as HIV-1 Integrase inhibitors (PLEWE et al., 2009; TANIS et

al., 2010; JOHNSON et al., 2011). Among the results obtained in the study of the relationship

between the chemical structure and the biological activity was observed that the absence of

hydrogen bound to oxygen of the hidroxamic acid takes to loss of biological activity. And

molecular docking simulations showed that this oxygen must have partial charge -1 to

perform ionic interaction with Mg²+ ions present in the active site of the integrase enzyme,

which act as cofactors. The complexation of azaindole derivatives with these ions takes to

enzymatic inhibition. The most active compounds, 1c and 21c, were the ones who presented

best profile of interaction with the enzyme.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 20

2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 20

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 21

3.1. HIV E AIDS .................................................................................................. 21

3.1.1. O HIV ........................................................................................................... 21

3.1.2. EPIDEMIOLOGIA ........................................................................................ 23

3.1.3. CICLO DE REPLICAÇÃO DO HIV ............................................................... 25

3.1.4. A ENZIMA HIV-INTEGRASE....................................................................... 27

3.2. INIBIDORES DA HIV-IN .............................................................................. 32

3.2.1. INIBIDORES EM USO CLÍNICO .................................................................. 32

3.2.2. DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO HIDROXÂMICO ............................. 39

3.3. ANÁLISE CONFORMACIONAL E MODELAGEM MOLECULAR ............... 50

3.4. DOCKING MOLECULAR ............................................................................. 52

4. OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 52

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 53

5. METODOLOGIA .......................................................................................... 53

5.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE ................................. 53

5.1.1. CONSTRUÇÃO 3D DOS INIBIDORES, OTIMIZAÇÃO GEOMÉTRICA E

ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS .......................................................... 54

5.1.2. CÁLCULOS DOS DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E

FARMACOCINÉTICOS ............................................................................................. 54

5.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN SILICO

54


5.2.1. PREPARAÇÃO DOS LIGANTES .................................................................. 54

5.2.2. OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO ... 55

5.2.3. MOLEGRO VIRTUAL DOCKER (MVD) ...................................................... 56

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 58

6.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE ................................. 58

6.1.1. ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS ............................................. 58

6.1.2. DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E FARMACOCINÉTICOS .... 60

6.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN SILICO

64


6.2.1. PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO ........................... 70

6.2.2. VALIDAÇÃO DOS PROTOCOLOS DE DOCKING POR RE-DOCKING ........ 74

6.2.3. SIMULAÇÕES DE DOCKING MOLECULAR ............................................... 76

6.3. MODIFICAÇÕES ESTRUTURAIS ................................................................ 93

7. CONCLUSÕES ............................................................................................. 94

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 95

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Morfologia do vírus HIV (Adaptada de PEÇANHA et al., 2002). .......................... 23

Figura 2: Prevalência global do HIV em adultos (15 a 49 anos) em 2011. ............................. 24

Figura 3: Ciclo de replicação do HIV (Adaptada de SOUZA; ALMEIDA, 2003). ................. 26

Figura 4: Representação esquemática dos domínios estruturais da enzima HIV-IN (Adaptada

de ARORA; TCHERTANOV, 2013). ................................................................................... 28

Figura 5: Esquema das etapas de processamento do terminal 3' e de transferência de cadeia do

processo de integração catalisado pela enzima HIV-IN (adaptada de NEAMATI, 2011). ...... 29

Figura 6: Reação de transferência de cadeia. ......................................................................... 30

Figura 7: Esquema da estrutura 3D da PFV-IN (Adaptada de IAVIREPORT, 2014). ............ 32

Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos inibidores da HIV-IN raltegravir (1), dolutegravir

(2) e elvitegravir (3). ............................................................................................................. 33

Figura 9: Estrutura química do RAL, com destaque para os grupos farmacofóricos dos

inibidores da HIV-IN. ........................................................................................................... 35

Figura 10: Estruturas químicas dos componentes do Stribild®:

emtricitabina (4), tenofovir (5)

e cobicistat (6). A estrutura do ELV aparece na Figura 1. ..................................................... 36

Figura 11: Estrutura 3D do domínio catalítico da HIV-IN onde estão destacados os

aminoácidos relacionados à resistência aos fármacos inibidores (em amarelo), os aminoácidos

que fazem parte da tríade catalítica (em vermelho) e os íons Mg²+ (esferas verdes). .............. 38

Figura 12: Tipos de azaindóis. .............................................................................................. 40

Figura 13: Substituição do ácido carboxílico por ácido hidroxâmico. .................................... 40

Figura 14: Perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico. .................................. 41

Figura 15: Estrutura química dos ligantes 1c, 21c, 19a, 24a e 18a. ........................................ 55

Figura 16: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 21c (amarelo), 11c

(verde), 13c (azul) e 12c (vermelho) sobrepostas. ................................................................. 58

Figura 17: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 8a (vermelho), 14a

(amarelo), 22a (laranja), 23a (azul) e 24a (verde) sobrepostas. .............................................. 59

Figura 18: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta) e 19a (verde). ............. 60

Figura 19: Estrutura química dos compostos, 1a, 2a, 16a, 17a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a e 24a,

com valores de IC50 (nM) entre colchetes. ............................................................................. 61

Figura 20: Gráfico de relação linear entre volume, área e peso molecular dos compostos 1a,

2a, 16a, 17a, 19-24a e atividade (pIC50). ............................................................................... 62

Figura 21: Comparação estrutural entre os compostos 19a e 1c. ............................................ 62

Figura 22: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL. ........... 65

Figura 23: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL. ........... 65

Figura 24: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL. ........... 66

Figura 25: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL. .............. 67

Figura 26: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL. ............. 67

Figura 27: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL. .............. 68

Figura 28: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série a e RAL. ................ 69

Figura 29: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série b e RAL. ................ 69

Figura 30: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série c e RAL. ................ 70

Figura 31: Estrutura da PFV-IN (código PDB = 3OYA), com destaque para o sítio ativo onde

está o fármaco RAL. ............................................................................................................. 71

Figura 32: Resultado do alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da HIV-IN e

PFV-IN. ............................................................................................................................... 73

Figura 33: Sobreposição da melhor pose docada (rosa) no ligante do cristal (amarelo). As

esferas verdes representam os íons Mg²+. .............................................................................. 76

Figura 34: Estrutura geral dos dicetoácidos e estruturas químicas do RAL e do composto 1c,

com destaque para os hidrogênios ionizáveis. ....................................................................... 77

Figura 35: Interações do tipo ligação de hidrogênio detectadas para RAL (amarelo). ............ 79

Figura 36: Interações eletrostáticas entre RAL (amarelo) e os íons Mg²+ (verde). .................. 80

Figura 37: Interações hidrofóbicas do tipo π-π detectadas para RAL (amarelo). .................... 81

Figura 38: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 1c nas

simulações de docking molecular. ......................................................................................... 81

Figura 39: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 21c

nas simulações de docking molecular. ................................................................................... 82

Figura 40: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 19a






Figura 43: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 1c. ................ 85

Figura 44: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 19a. .............. 85



Figura 47: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto

1c. ........................................................................................................................................ 87

Figura 48: Interações eletrostáticas e suas respectivas distâncias (em Å) detectadas para o

composto 21c. ...................................................................................................................... 88


19a. ...................................................................................................................................... 88


24a. ...................................................................................................................................... 89

Figura 51: Estrutura tridimensional do composto 18a. .......................................................... 90

Figura 52: Sobreposição de 1c com RAL (amarelo). ............................................................. 90

Figura 53: Sobreposição de 21c com RAL (amarelo). ........................................................... 91

Figura 54: Sobreposição de 19a com RAL (amarelo). ........................................................... 91



Figura 57: Modificações estruturais propostas para o composto 1c. ...................................... 94

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Epidemia de AIDS no Brasil, por região, entre 2001 e 2011. ................................. 25

Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009). ........................................... 42

Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010). ........................................... 45

Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011)......................................... 47

Tabela 5: Valores de MolDock, Re-Rank e Einter das soluções escolhidas para cada composto e

RAL. .................................................................................................................................... 78

Tabela 6: Distâncias das ligações de hidrogênio realizadas pelos derivados azaindóis nas

simulações de docking molecular. ......................................................................................... 84

Tabela 7: Distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π realizadas pelos derivados

azaindóis nas simulações de docking molecular. ................................................................... 87

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Alinhamento de resíduos da PFV-IN com HIV-IN. Os resíduos destacados em

amarelo fazem parte da tríade catalítica, e os destacados em rosa sofreram mutação. ............ 74

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Å Ângstron

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency

Syndrome)

ALH Aceptor de ligação de hidrogênio

cLogP Log do coeficiente de partição calculado

cLogS Log da Solubilidade Calculado

DLH Doador de ligação de hidrogênio

DNA Ácido desoxirribonucleico

DOL Dolutegravir

DST Doença sexualmente transmissível

EHOMO Energia do Orbital Molecular de Mais Alta Energia Ocupado (Highest

Occupied Molecular Orbital)

ELUMO Energia do Orbital Molecular de Mais Baixa Energia Desocupado (Lowest

Unoccupied Molecular Orbital)

ELV Elvitegravir

eV elétrons-Volt

FDA Agência que regulamenta medicamentos nos Estados Unidos (U. S. Food

and Drug Administration)

g/mol Grama por mol

gp Glicoproteico

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus)

HIV-IN Enzima integrase do vírus HIV

HIV-PR Enzima protease do vírus HIV

HIV-TR Enzima transcriptase reversa do vírus HIV

³H Trítio

HOMO Orbital Molecular de Mais Alta Energia Ocupado (Highest Occupied

Molecular Orbital)

IC50 Concentração de Inibição a 50% (Inhibition Concentration at 50%)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LTR Regiões de repetições terminais longas (Long Terminal Repeat)

LUMO Orbital Molecular de Mais Baixa Energia Desocupado (Lowest Unoccupied

Molecular Orbital)

MMFF Merck Molecular Force Field

MPE Mapa de potencial eletrostático

MS Ministério da Saúde

MVD Molegro Virtual Docker

µ Momento dipolo

µM Micro molar

nM Nanomolar

OMS Organização Mundial da Saúde

PDB Banco de Dados de Proteína (Protein Data Bank)

PFV-IN Enzima integrase do Prototipe Foamy Virus

pIC50 Log negativo da concentração de inibição a 50% (Inhibition Concentration

at 50%)

pka Log negativo da constante de acidez (Ka)

PLP Potencial Linear por Partes (Piecewise Linear Potencial)

PM Peso molecular

PSA Área de superfície polar (Polar Surface Area)

R² Coeficiente de determinação

RAL Raltegravir

RMN Ressonância magnética nuclear

RMSD Desvio médio quadrático das posições atômicas

RNA Ácido ribonucleico

RTECS Registro de Efeitos Tóxicos de Substâncias Químicas (Registry of Toxic

Effects of Chemical Substances)

SAR Relação Estrutura-Atividade (Structure Activity Relationship)

SN2 Substituição nucleofílica bimolecular

SPA Ensaio de proximidade de cintilação (Scintillation Proximity Assay)

SUS Sistema Único de Saúde

UNAIDS Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/AIDS

2D Bidimensional

3D Tridimensional

LISTA DE ABREVIATURAS – AMINOÁCIDOS

C Cys Resíduo de cisteína

D Asp Resíduo de ácido aspártico

E Glu Resíduo de ácido glutâmico

H His Resíduo de histidina

I Ile Resíduo de isoleucina

K Lis Resíduo de lisina

L Leu Resíduo de leucina

N Asn Resíduo de asparagina

Q Gln Resíduo de glutamina

R Arg Resíduos de arginina

T Thr Resíduo de treonina

Y Tyr Resíduo de tirosina

20

1. INTRODUÇÃO

O vírus da imunodeficiência humana (em inglês, human immunodeficiency vírus, HIV)

é o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (em inglês, acquired

immunodeficiency syndrome, AIDS) (OMS, 2014). Seu ciclo de replicação é dependente das

enzimas virais transcriptase reversa (HIV-TR), protease (HIV-PR) e integrase (HIV-IN)

(ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012).

A enzima HIV-IN atua em uma etapa importante do ciclo, a integração, catalisando a

incorporação do DNA viral no DNA da célula do hospedeiro (BLANCO; MARTINEZ-

PICADO, 2012).

Atualmente, existem três inibidores da HIV-IN aprovados pela agência que

regulamenta medicamentos nos Estados Unidos (em inglês, U. S. Food and Drug

Administration, FDA): raltegravir (RAL), que foi o primeiro fármaco aprovado em 2007, e

dolutegravir (DOL) em 2013. Já o elvitegravir (ELV) foi aprovado em 2012, apenas em

formulações com os fármacos: emtricitabina, tenofovir e cobicistat (FDA, 2014).

Infelizmente, estudos clínicos relatam o aparecimento de vírus que são resistentes aos

inibidores da HIV-IN disponíveis para uso clínico (CALY et al., 2012; KURITZKES, 2011).

Portanto, é necessário o desenvolvimento de novos inibidores mais potentes e que possam

atuar em vírus resistentes.

Recentemente, Plewe e colaboradores reportaram a síntese e atividade antiviral de

derivados azaindóis do ácido hidroxâmico, que possuem a capacidade de quelar íons

magnésios presentes no sítio catalítico da HIV-IN (PLEWE et al., 2009), sendo esta classe o

objeto de estudo deste trabalho.

2. JUSTIFICATIVA

O tratamento da infecção pelo HIV é feito com a utilização de pelo menos três

antirretrovirais combinados, sendo dois medicamentos de classes diferentes, que poderão ser

combinados em um só comprimido (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). Entretanto,

existem inúmeros relatos de resistência adquirida e de intolerância por parte dos usuários aos

fármacos que compõem esse arsenal de medicamentos (OHRUI, 2011). Nessa perspectiva,

21

novos fármacos são necessários como alternativa e a enzima HIV-IN apresenta-se como alvo

terapêutico promissor.

Dois fatores importantes ratificam as pesquisas com inibidores da HIV-IN: (a) a

ausência de enzimas homólogas celulares em humanos, sugerindo certa especificidade para

essa enzima viral (MELO; BRUNI; FERREIRA, 2006); (b) os relatos de resistência aos

inibidores da HIV-IN em uso clínico (CALY et al., 2012).

Até o momento não há trabalhos científicos na área de modelagem molecular para os

derivados azaindóis do ácido hidroxâmico, objetos de estudo deste trabalho. Sendo assim,

configura-se o ineditismo do estudo de relação estrutura-atividade (Structure-Activity

Relationship, SAR) e docking molecular para estes compostos.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. HIV E AIDS

3.1.1. O HIV

O HIV é capaz de infectar células do sistema imunológico (ou imune), como

macrófagos e linfócitos T CD4+ (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012), destruindo-as ou

incapacitando-as, prejudicando o funcionamento normal deste sistema. Com o progresso da

infecção, o sistema imune torna-se praticamente inoperante e o indivíduo, mais suscetível às

infecções oportunistas (OMS, 2014).

Os alvos do HIV são as células T auxiliares CD4+, os macrófagos e as células

dendríticas (ABBAS et al., 2008). Estas células funcionam como um reservatório que

mantém a infecção viral por um longo período (LAHOUASSA et al., 2012).

O estágio mais avançado da infecção por HIV é a síndrome da imunodeficiência

adquirida (em inglês, acquired immunodeficiency syndrome, AIDS). Para desenvolver a

AIDS, um indivíduo infectado pelo HIV pode levar de 10 a 15 anos; os fármacos antivirais

podem retardar a evolução desse processo (OMS, 2014).

A transmissão do HIV pode ocorrer via relações sexuais sem o uso de preservativos,

da mãe infectada para o filho durante a gestação, o parto ou a amamentação (transmissão

vertical), uso da mesma seringa ou agulha contaminada por mais de uma pessoa, transfusão de

22

sangue contaminado com o HIV e instrumentos perfurantes ou cortantes, não esterilizados

(OMS, 2014).

Até o momento foram identificados dois tipos de HIV chamados HIV-1 e HIV-2. O

HIV-1 é a causa mais frequente da AIDS enquanto que o HIV-2 difere em sua estrutura

genômica e antigenicidade e causa uma síndrome clinicamente semelhante (ABBAS et al.,

2008). O HIV–1 é um retrovírus integrante da família Retroviridae. Retrovírus são vírus que

contém RNA (PEÇANHA et al., 2002) e pertencem ao subgrupo dos lentivírus, que

apresentam a capacidade de causar uma infecção latente de longo prazo nas células e efeitos

citopáticos em curto prazo. Todos os lentivírus são capazes de produzir doenças fatais de

progressão lenta, incluindo síndromes que provocam a degeneração do sistema nervoso

central (ABBAS et al., 2008).

O HIV apresenta forma esférica, com cerca de 10-4

mm de diâmetro, e dois envelopes

glicoproteicos (gp), sendo o maior extracelular (gp120), e o menor inserido na membrana

celular (gp41). Apresenta, também, dois nucleocapsídeos que protegem as duas fitas de RNA

viral e as enzimas virais: HIV-TR, HIV-IN e HIV-PR (ENGELMAN; CHEREPANOV,

2012).

De acordo com o mapa genético do HIV, ele pode ser dividido em três regiões

principais: a região gag, responsável por codificar as proteínas estruturais internas p17

(matriz), p24 (capsídeo), p7 (nucleocapsídeo) e p6; a região pol, responsável pela codificação

da enzimas HIV-PR (p11), HIV-TR (p66/p51) e HIV-IN (p31); e a região env, que codifica as

proteínas do envoltório, gp120 (superfície) e gp41 (transmembrana). Além dessas o genoma

do HIV-1 codifica ainda mais seis proteínas acessórias, sendo duas (tat e rev) relacionadas

com a regulação da expressão gênica (PEÇANHA et al., 2002).

A proteína p17 completa o envelope viral, localizada internamente em relação às

glicoproteínas de superfície (gp120 e gp41) e à membrana lipídica. O capsídeo viral é

envolvido pela proteína gag p24. No interior do capsídeo são encontradas duas cópias do

RNA genômico de fita simples, que supostamente existe na forma de uma ribonucleoproteína

contendo HIV-TR, HIV-IN e a proteína p7 (nucleocapsídeo) de ligação ao RNA. Nessa região

são encontradas ainda as proteínas p6, Vif, Vpr e Nef. A Figura 1 é uma representação da

morfologia do HIV (PEÇANHA et al., 2002).

23

Figura 1: Morfologia do vírus HIV (Adaptada de PEÇANHA et al., 2002).

3.1.2. EPIDEMIOLOGIA

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), desde o começo da epidemia

quase 70 milhões de pessoas foram infectadas com o HIV e cerca de 35 milhões morreram em

decorrência da AIDS no mundo (OMS, 2014). No ano de 2011, 34 milhões de pessoas

estavam vivendo com HIV, 1,7 milhões morreram de doenças relacionadas com a AIDS e

houve 2,5 milhões de novas infecções (OMS, 2014). Nesse mesmo ano a prevalência global

de adultos (15 a 49 anos) com HIV era de 0,8%, sendo a África o continente mais afetado

(Figura 2).

24

Figura 2: Prevalência global do HIV em adultos (15 a 49 anos) em 2011.

Fonte: (OMS, 2014).

A epidemia de AIDS na América Latina tem se mostrado estável. O número de

indivíduos vivendo com HIV em 2011 era de 1,4 milhões, enquanto que em 2001 eram 1,2

milhões. O número de novas infecções diminuiu de 93 mil em 2001 para 83 mil em 2011,

assim como o número de mortes relacionadas a AIDS que em 2001 foram 60 mil e em 2011

54 mil (WHO/UNAIDS, 2014).

No Brasil, estima-se que 630 mil pessoas vivem com o HIV (MORGADO; BASTOS,

2011). Desde o início da epidemia em 1980 até junho de 2012 foram registrados 656.701

casos de AIDS. Em 2011, houve a notificação de 38.776 casos da doença, sendo a taxa de

incidência de AIDS no Brasil de 20,2 casos por 100 mil habitantes (BRASIL, MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2013). Considerando as regiões brasileiras, entre os anos de 2001 e 2011, houve

redução da epidemia apenas no Sudeste, que é a região com o maior número de casos

acumulados (56%) (Tabela 1).

25

Tabela 1: Epidemia de AIDS no Brasil, por região, entre 2001 e 2011.

Taxa de incidência (casos/ 100 mil habitantes)

Região 2001 2011

Sul 27,1 30,9

Sudeste 22,9 21,0

Centro-Oeste 14,3 17,5

Nordeste 7,5 13,9

Norte 9,1 20,8

Fonte: (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).

De acordo com o Ministério da Saúde (BRASIL, MINISTERIO DA SAÚDE, 2013),

houve uma redução significativa dos casos de AIDS no Brasil em crianças menores de cinco

anos, de 846 casos em 2001 para 745 em 2011. Esses dados confirmam a eficácia da política

de redução da transmissão vertical do HIV. Em relação à taxa de mortalidade, esta também

apresentou redução. A taxa de incidência baixou de 6,3 em 2002 para 5,6 a cada 100 mil

pessoas em 2011, representando uma queda de 12% (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2013).

3.1.3. CICLO DE REPLICAÇÃO DO HIV

O ciclo de replicação do HIV é composto por diversas etapas, sendo que, quatro dessas

são dependentes de macromoléculas que são alvos de fármacos em uso clínico (Figura 3).

26

Figura 3: Ciclo de replicação do HIV (Adaptada de SOUZA; ALMEIDA, 2003).

A etapa de fusão corresponde à entrada do vírus na célula através da interação da

glicoproteína viral gp120 com o receptor CD4+, localizado na superfície da célula do

hospedeiro. Essa etapa ocorre com a participação da glicoproteína viral transmembrana gp41

e dos co-receptores quimiocínicos CXCR4 e CCR5 (PINTO; STRUCHINER, 2006).

Após a fusão, há a liberação do conteúdo do capsídeo no meio intracelular, onde

ocorre a etapa de transcrição reversa. Nessa etapa, a enzima viral HIV-TR converte o RNA

viral em DNA (SOUZA; ALMEIDA, 2003), ocorrendo a formação do complexo de pré-

integração, que é transportado para o núcleo.

A etapa de integração corresponde à ação da enzima viral HIV-IN, associada ao

complexo de pré-integração, que promove a intercalação do DNA viral no DNA do

hospedeiro (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012).

O DNA híbrido, resultante da integração, é transcrito em RNA mensageiro, e este é

encaminhado ao citoplasma, onde é traduzido na forma de poliproteínas que são os

precursores das proteínas virais (SOUZA; ALMEIDA, 2003).

27

Após o brotamento das novas partículas virais ocorre a maturação, onde a enzima

HIV-PR promove a hidrólise dos polipeptídeos dando origem aos componentes estruturais

capsídeo, matriz e nucleocapsídeo; e às enzimas HIV-TR, HIV-PR e HIV-IN (ENGELMAN;

CHEREPANOV, 2012).

3.1.4. A ENZIMA HIV-INTEGRASE

A enzima HIV-IN é a responsável pela incorporação do DNA viral no DNA da célula

do hospedeiro. Ela atua em reações altamente específicas, necessárias para o processo de

integração (HAZUDA, 2012).

Ela possui 288 aminoácidos codificados pelo gene pol do HIV-1, sendo composta por

três domínios funcionais: N-terminal, catalítico e C-terminal (NEAMATI, 2011).

O domínio N-terminal é formado pelos aminoácidos 1 até 50 e a sua estrutura

monomérica consiste em quatro hélices-α estabilizadas pelo cátion Zn2+

, coordenado pelos

resíduos His12, His16, Cys40 e Cys43 (NEAMATI, 2011; ARORA; TCHERTANOV, 2013).

Esta região é conhecida como “HHCC zinc-binding motif” e seu papel primário é facilitar a

multimerização da HIV-IN, e de seus contatos extensivos com monômeros de núcleos

catalíticos adjacentes (BLANCO et al., 2011).

O domínio catalítico é constituído pelos aminoácidos 51 até 212, no qual está presente

a tríade catalítica (Asp64, Asp116 e Glu152), além do sítio de ligação do DNA viral

(BLANCO et al., 2011). Estruturalmente, este domínio consiste em uma mistura de seis

hélices-α e cinco folhas-β (ARORA; TCHERTANOV, 2013). Os resíduos que formam o sítio

ativo apresentam grupos carboxilato carregados negativamente coordenados com dois íons

metálicos Mg2+

(NOWOTNY, 2009; ARORA; TCHERTANOV, 2013).

Finalmente, os aminoácidos 213 até 288 formam o domínio C-terminal, que se liga ao

DNA do hospedeiro de forma inespecífica (BLANCO et al., 2011). Um monômero deste

domínio é formado por cinco folhas-β arranjadas de maneira antiparalela, formando uma

espécie de barril (em inglês, “β-barrel”) (NEAMATI, 2011). A Figura 4 é uma representação

esquemática dos três domínios da enzima HIV-IN.

28

Figura 4: Representação esquemática dos domínios estruturais da enzima HIV-IN (Adaptada

de ARORA; TCHERTANOV, 2013).

A HIV-IN catalisa reações de substituição nucleofílica do tipo SN2, com auxílio de

cofatores, que são cátions metálicos divalentes (Mg2+

) (HARE et al., 2010). Inicialmente,

ocorre a hidrólise do grupo fosfato de um ácido nucleico, resultando na formação do produto

3’-OH. Dois íons metálicos auxiliam a reação em diferentes regiões, sendo que um dos íons

auxilia no posicionamento e ativação do nucleófilo, enquanto o outro estabiliza o estado de

transição e o grupo de saída (NOWOTNY, 2009).

A atuação da HIV-IN pode ser dividida em duas etapas: processamento do DNA viral

por clivagem do nucleotídeo do terminal-3’ e transferência de cadeia, quando o DNA viral é

inserido no DNA da célula do hospedeiro (BLANCO; MARTINEZ-PICADO, 2012). O

esquema da Figura 5 é um resumo das duas etapas do processo de integração.

29

Figura 5: Esquema das etapas de processamento do terminal 3' e de transferência de cadeia do

processo de integração catalisado pela enzima HIV-IN (adaptada de NEAMATI, 2011).

30

A integração ocorre, inicialmente, no citoplasma. Após a conversão do RNA viral em

DNA, este passará pelo processamento 3’, sendo esta a primeira reação deste processo. A

HIV-IN reúne sequências específicas dentro de regiões de repetições terminais longas (long

terminal repeat, LTR) em cada região final da fita de DNA viral (HAZUDA, 2012). Ocorre

uma clivagem sítio-específica de dois nucleotídeos de cada extremidade 3’, dando origem a

um DNA processado com o final CA-OH-3’. O grupo hidroxila do terminal 3’-OH será o

nucleófilo que a HIV-IN necessita para a reação de transferência de cadeia, que ocorre após a

entrada do complexo de pré-integração no núcleo (HAZUDA, 2012). Essa reação consiste na

junção das terminações 3’-OH do DNA viral com 5’-fosfato do DNA do hospedeiro, seguida

de etapas de reparação e ligação (Figura 6) (SEO et al., 2011). O processamento inicial faz

com que as fitas se liguem covalentemente (DEEKS et al., 2008). Tanto o processamento 3’,

quanto a transferência de cadeia, dependem de íons metálicos divalentes que funcionam como

cofatores (SEO et al., 2011).

Figura 6: Reação de transferência de cadeia.

31

O processo de integração ocorre no intassomo, que é um complexo núcleo-proteico

composto pela HIV-IN associada ao DNA viral (MAERTENS et al., 2010). Nele estão

presentes dímeros da enzima HIV-IN, nos quais apenas uma subunidade de cada dímero se

liga a uma região final de DNA viral (HARE et al., 2010). O DNA do hospedeiro ou DNA

alvo acomoda-se entre os sítios ativos no interior do intassomo. Este fato provoca uma torção

no DNA do hospedeiro, que permite que os sítios ativos tenham acesso às ligações fosfo-

diéster do DNA alvo (MAERTENS et al., 2010).

Os íons metálicos, que estão coordenados aos resíduos de ácido aspártico e ácido

glutâmico, ativam o nucleófilo 3’-OH e desestabilizam as ligações fosfo-diéster, durante a

transferência de cadeia, facilitando a reação (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012). O

nucleófilo ataca as ligações fosfo-diéster, que estão em fitas opostas do DNA alvo, resultando

numa transesterificação e subsequente fusão das regiões finais 3’ dos DNAs do vírus e do

hospedeiro (HARE et al., 2010b).

A análise da atuação da enzima HIV-IN mostra que ela representa um importante alvo

para a pesquisa e desenvolvimento de novos antirretrovirais, visto que sua principal vantagem

é não apresentar nenhum homólogo celular em humanos, que possibilita o desenvolvimento

de fármacos potencialmente mais específicos (PEÇANHA et al., 2012).

Recentemente, foi elucidada a arquitetura do intassomo da integrase do Prototipe

Foamy Virus (PFV-IN) (Figura 7) (MÉTIFIOT et al., 2013). Ela apresenta a reunião dos três

domínios enzimáticos, dispostos em quatro subunidades num tetrâmero funcional, além de

conter o modo de ligação com DNA, assim como ocorre na HIV-IN (JOHNSON et al., 2012).

No Protein Data Bank (PDB) estão disponíveis estruturas individuais de cada domínio da

HIV-IN, combinações entre catalítico e C-terminal, e entre catalítico e N-terminal. Entretanto

estas não são suficientes para reproduzir a ação enzimática, que é dependente da formação do

intassomo (FERRO et al., 2009).

32

Figura 7: Esquema da estrutura 3D da PFV-IN (Adaptada de IAVIREPORT, 2014).

3.2. INIBIDORES DA HIV-IN

3.2.1. INIBIDORES EM USO CLÍNICO

Os inibidores da HIV-IN são uma nova classe de fármacos anti-HIV, apresentando

baixa toxicidade em relação a outros fármacos, como o efavirenz (inibidor não-nucleosídeo da

HIV-TR), que promove efeitos tóxicos no sistema nervoso central, e aos inibidores da HIV-

PR, que causam reações gastrointestinais indesejadas (CUNKHORN, 2012).

Algumas das razões que fazem dos inibidores da HIV-IN uma classe promissora no

tratamento da infecção por HIV, são: (i) atuação num alvo novo, a HIV-IN, que inibe a etapa

de transferência de cadeia do DNA viral para o DNA do hospedeiro, deslocando o DNA viral

do sítio ativo; (ii) atividade contra cepas de HIV-1 resistentes aos inibidores da HIV-TR e

HIV-PR; (iii) as células de mamíferos não apresentam enzimas integrase, o que torna essa

classe altamente específica contra o vírus e, portanto, de baixa toxicidade (BLANCO;

MARTINEZ-PICADO, 2012).

Desde que esta enzima se tornou um possível alvo terapêutico, vários compostos

apresentaram atividade inibitória in vitro sobre a mesma, porém, poucos passaram para a fase

33

de testes clínicos. Entre eles destaca-se o RAL (1, Figura 8) que foi o primeiro inibidor de

HIV-IN aprovado pelo FDA para o tratamento de HIV/AIDS, em outubro de 2007

(JOHNSON et al., 2011).

Os outros fármacos dessa classe são o ELV (3, Figura 8) e o DOL (2, Figura 8). O

ELV foi aprovado pelo FDA, em 2012, como um dos componentes do Stribild®, composto

também pelos fármacos, emtricitabina, tenofovir e cobicistat (FDA, 2014) Em agosto de

2013, o DOL foi aprovado pelo FDA (FDA, 2014b).

N N

OH

ONH

O

F

CH3

NHCH

3

O

NN

O

CH3

CH3

O

N

N

CH3

OOH

O

O

NH

FF

1 2

N

OH CH3

CH3

OH

OO

O

F

Cl

CH3

3

Figura 8: Estruturas químicas dos fármacos inibidores da HIV-IN raltegravir (1), dolutegravir

(2) e elvitegravir (3).

O fármaco RAL apresenta em sua estrutura um anel central de pirimidinona, e nas

extremidades dois anéis aromáticos (um oxadiazol e um p-fluorofenila). Essas três unidades

aromáticas são unidas por espaçadores amídicos. Ele é comercializado como um sal de

potássio e sua nomenclatura IUPAC é N-[(4-fluorofenil)metil]-1, 6- diidro- 5- hidroxi -1-

metil - 2 - [1 - metil-1-[[ (5-metil-1,3,4 -oxadiazol-2il) carbonil] amino] etil] -6-oxo-4-

pirimidinocarboxamida. Sua fórmula química é C20H20FKN6O5 e seu PM=482,51 g/mol

(BRITO, 2011b).

34

No Brasil, apenas RAL está disponível para uso clínico. Em setembro de 2008, ele foi

indicado pelo Comitê Assessor para Terapia Antirretroviral em Adultos Infectados pelo HIV

para uso no Programa Nacional de DST/AIDS. Desta forma, no início do ano de 2009, o RAL

começou a ser distribuído pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2013b).

De acordo com a Nota Técnica nº 307 de 2008, emitida pelo Ministério da Saúde

(MS), o RAL deve ser utilizado apenas em pacientes que apresentaram quadro de falha

virológica. Além disso, pode ser incluído em esquemas compostos por medicamentos das três

classes de antirretrovirais que fazem parte do coquetel disponível no SUS, que são os

inibidores da HIV-TR e HIV-PR (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013b).

O RAL e os demais fármacos dessa classe inibem, preferencialmente, a transferência

de cadeia de DNA na etapa de integração (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2012), pela

competição com o DNA do hospedeiro (ESPESETH et al., 2000). Os inibidores da HIV-IN

ligam-se no complexo integrase-DNA viral (intassomo) e não possuem a capacidade de se

ligar à enzima na ausência do DNA viral (HARE et al., 2010). Eles complexam os dois íons

metálicos presentes no sítio ativo, reduzindo a atividade enzimática, e também deslocam a

região final 3’-OH do DNA viral, que é o nucleófilo na reação de transferência de cadeia

(HAZUDA, 2012). Além disso, ainda impedem que o DNA do hospedeiro ligue-se ao

intassomo (ESPESETH et al., 2000).

Na Figura 9, utilizando como exemplo o RAL, são destacados os grupos

farmacofóricos dos inibidores da HIV-IN que complexam os íons metálicos do sítio ativo. A

região A é a responsável pela coordenação aos dois íons metálicos (KAWASUJI et al., 2012).

A região B é composta por um fragmento hidrofóbico, derivado de um extensivo estudo de

relação estrutura-atividade (em inglês, Structure-Activity Relationship, SAR) realizado por

diversos grupos de pesquisa, que concluíram que este deve ser um grupo benzila

(KAWASUJI et al., 2012). Este grupo é responsável por melhorar a afinidade e especificidade

do inibidor pelo intassomo (GROBLER et al., 2002). A região C é, comumente, muito

flexível e tolerável a modificações estruturais para otimização da farmacocinética

(KAWASUJI et al., 2012).

35

Figura 9: Estrutura química do RAL, com destaque para os grupos farmacofóricos dos

inibidores da HIV-IN.

A nomenclatura IUPAC do fármaco ELV é ácido 6-[(3-cloro-2-flúor-fenil)metil]-1-

[(2S)-1-hidróxi-3-metil-butan-2-il]-7-metóxi-4-oxo-1,4-diidroquinolina-3-ácido carboxílico.

Sua fórmula química é C23H23ClFNO5 e seu PM é 447,88 g/mol (CHEMICALIZE, 2013).

ELV é um monoceto-ácido que apresenta alta especificidade e eficácia contra a reação

de transferência de cadeia, com um IC50 = 7 nM (QUASHIE et al., 2012).

No ano de 2012, foi aprovado pelo FDA o Stribild®, um medicamento que combina

dois fármacos já utilizados na terapêutica, emtricitabina (4, Figura 10) e tenofovir (5, Figura

10) (ambos inibidores da HIV-TR, aprovados em 2004, e comercializados como Truvada®

) e

mais dois fármacos novos, ELV (3, Figura 8) (um inibidor da HIV-IN) e cobicistat (6, Figura

10) (um inibidor da CYP3A, enzima que metaboliza fármacos anti-HIV, que é utilizado para

prolongar o efeito do ELV) (FDA, 2014). Este medicamento foi desenvolvido para ser

administrado uma vez ao dia, simplificando o tratamento, sendo um benefício para os

pacientes (FDA, 2014).

36

S

OOH

N N

NH2

F

O

N

N

N

N

NH2

O

POH

O

O

CH3

P

OH

OH

O

4 5

S

N

CH3

CH3

N

NH

O

CH3

N

O

NH

O NH

O

O

N

S

6

Figura 10: Estruturas químicas dos componentes do Stribild®:

emtricitabina (4), tenofovir (5)

e cobicistat (6). A estrutura do ELV aparece na Figura 1.

O DOL, (3S,7R)-N-[(2,4-difluoro-fenil)-metil]-11-hidróxi-7-metil-12-oxo-4-oxa-1,8-

diazatriciclo[8.4.0.0{3,8}]tetradeca-10,13-dieno-13-carboxamida, possui fórmula química de

C20H21F2N3O4 e PM de 405,395 g/mol (FDA, 2014b).

Foi observado em ensaios enzimáticos que DOL inibe preferencialmente a reação de

transferência de cadeia, apresentando valor de IC50 = 2,7 nM (DI SANTO, 2014). Demonstrou

eficácia contra clones virais resistentes a RAL e ELV, assim como contra cepas isoladas de

HIV-1 e HIV-2 (DI SANTO, 2014).

Seu tempo de meia-vida plasmática de aproximadamente 14h permite que a

administração de apenas uma dose diária seja suficiente para sua ação farmacológica

(WALMSLEY et al., 2013).

37

Os fármacos inibidores da HIV-IN têm sido desenvolvido com o objetivo de impedir a

sua interação com o DNA do hospedeiro, contudo, nos últimos anos, vários casos de

resistência têm sido descritos (CALY et al., 2012). O desenvolvimento de resistência ao RAL

está relacionado a mutações na HIV-IN, localizadas no domínio catalítico (KURITZKES,

2011). Uma alternativa para minimizar este problema seria o desenvolvimento de inibidores

que impedissem a entrada da HIV-IN no núcleo da célula do hospedeiro (CALY et al., 2012).

Além disso, dados oriundos das avaliações clínicas indicam que as mutações

Y143C(R), Q148H(R)(K) ou N155H na HIV-IN (Figura 11), associadas a mutações

secundárias, podem resultar em resistência ao RAL (KURITZKES, 2011). Os resíduos Q148

e N155 estão localizados estrategicamente no centro do sítio catalítico, próximos aos três

resíduos ácidos presentes neste sítio, e Q148 interage com a região terminal-5’ do DNA viral

(MESPLÈDE et al., 2012). Desta forma, estas mutações (Q148H e N155H) são responsáveis

por provocar mudanças conformacionais no sítio catalítico que levam ao aumento da energia

de ligação dos fármacos inibidores da HIV-IN (MESPLÈDE et al., 2012). Outro ponto de

mutação, Y143, afeta diretamente a ligação do RAL, pois este resíduo interage com o fármaco

via interação do tipo empilhamento de elétrons π (pi-stacking). Esta interação ocorre entre os

anéis aromáticos da tirosina e do RAL (anel 1,3,4-oxadiazol) (MESPLÈDE et al., 2012).

38

Figura 11: Estrutura 3D do domínio catalítico da HIV-IN onde estão destacados os

aminoácidos relacionados à resistência aos fármacos inibidores (em amarelo), os aminoácidos

que fazem parte da tríade catalítica (em vermelho) e os íons Mg²+ (esferas verdes).

Acredita-se que a mutação do resíduo Q148, que é mais frequente, interage com a

adenosina terminal e a citosina pré-terminal da fita de DNA viral, diminuindo a

suscetibilidade aos fármacos inibidores da HIV-IN, e também a atividade da própria enzima

(BLANCO et al., 2011). A segunda mutação mais comum, N155H, interfere diretamente na

ligação da HIV-IN com os íons metálicos, visto que N115 está localizado na base do sítio

ativo e realiza uma interação do tipo ligação hidrogênio com o aminoácido E152 (BLANCO

et al., 2011).

Um estudo clínico realizado por Hatano e colaboradores em 79 pacientes tratados com

inibidores da HIV-IN, 73 usando RAL e 6 com ELV, ratifica que as mutações associadas a

resistência aos inibidores da HIV-IN de maior ocorrência são Q148H/K/R, N155H e

Y143R/H/C. Também foi observado que, entre os 29 indivíduos que apresentaram resistência,

esta apareceu de forma gradual. Outro ponto importante é que mesmo com a redução da

suscetibilidade aos fármacos, todos apresentaram diminuição da capacidade replicativa do

39

vírus. Isto mostra que a terapia com este inibidores pode conferir algum benefício num regime

de tratamento que promove a supressão parcial da replicação viral (HATANO et al., 2010).

Outro dado interessante é que as mutações associadas ao uso do RAL, N155H e

Q148H, podem conferir resistência cruzada para o ELV (KURITZKES, 2011); mas as

mutações E92Q e T66I, observadas com o uso do ELV, não conferem resistência cruzada para

o RAL (BLANCO et al., 2011).

As mutações conhecidas para RAL também foram observadas em ELV tanto em

cultura, quanto em pacientes. Isto impede sua utilização para a maioria dos vírus resistentes à

RAL. Alguns estudos demonstraram que apenas Y143C é suscetível ao ELV (QUASHIE et

al., 2012).

O DOL tem apresentado potente atividade in vitro contra cepas de vírus resistentes ao

RAL (KURITZKES, 2011). Embora nenhum dado sobre o aparecimento de resistência in vivo

tenha sido relatado, alguns experimentos in vitro demonstraram que as mutações L1011,

T124A e S153FY conferem resistência limitada ao DOL (SALADINI et al., 2012).

3.2.2. DERIVADOS AZAINDÓIS DO ÁCIDO HIDROXÂMICO

Os compostos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico foram descritos com

atividade antiviral anti-HIV-1, inicialmente, por Plewe e colaboradores (2009) e,

posteriormente, pelo mesmo grupo de pesquisa em outros dois trabalhos (PLEWE et al.,

2009; TANIS et al., 2010; JOHNSON et al., 2011).

O grupo azaindol é constituído por um indol com nitrogênio no anel benzênico. Podem

também ser chamados de pirrol-piridinas, de acordo com a nomenclatura IUPAC, ou ainda de

azaindenas (HYARIC et al., 2002). Dependendo da posição do nitrogênio, podem assumir

quatro formas diferentes (Figura 12). Podem ser aplicados na preparação de várias substâncias

biologicamente ativas como intermediários, pois muitos dos compostos isolados de

organismos marinhos e de plantas contêm o núcleo indólico e são bioativos (HYARIC et al.,

2002).

40

Figura 12: Tipos de azaindóis.

Conhecendo a capacidade dos ácidos hidroxâmicos de complexar com íons metálicos,

foi realizada a substituição da função ácido carboxílico dos ácidos azaindóis pela função ácido

hidroxâmico. Dessa forma, os compostos originais, capazes de complexar com apenas um íon

metálico, tornaram-se derivados capazes de complexar com dois íons metálicos

simultaneamente, sendo este um possível mecanismo de ação (Figura 13) (PLEWE et al.,

2009). Este fato foi de extrema importância para o desenvolvimento desses compostos, visto

que o sítio ativo da HIV-IN possui dois íons metálicos.

N

O

O

Mg2+

N N

O

NH

Mg2+

OMg

2+

N

Figura 13: Substituição do ácido carboxílico por ácido hidroxâmico.

A gênese da série teve início com a triagem de oito ácidos carboxílicos azaindóis,

empregando um ensaio enzimático chamado Integrase Strand-Transfer Scintillation

Proximity Assay (SPA), que utiliza uma pequena esfera como superfície sólida (SPA bead).

41

Esta esfera tem a capacidade de emitir luz quando moléculas radioativadas estão ligadas na

sua superfície (GROBLER et al., 2009). O método consiste, primeiramente, na incubação da

HIV-IN com o DNA viral, chamado de DNA doador, ocorrendo a formação do complexo

HIV-IN-DNA viral que é aderido à superfície da esfera. Em seguida, adiciona-se o DNA do

hospedeiro, chamado de DNA alvo, que recebe um pré-tratamento com um isótopo, podendo

ser o trítio (³H). O DNA alvo tritiado é adicionado à mistura reacional e incubado novamente.

A atividade enzimática é quantificada por um programa que detecta a emissão de luz. A

avaliação dos ácidos hidroxâmicos por este método revelou que 65 compostos apresentaram

IC50 entre 2,9 nM e 23 µM, e apenas 3 foram inativos (PLEWE et al., 2009; TANIS et al.,

2010; JOHNSON et al., 2011).

O perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico está descrito na Figura

14. Os compostos foram numerados e agrupados em séries de acordo com o artigo em que

foram publicados: série a (1a a 24a) - Plewe e colaboradores (2009) (Tabela 2); série b (1b a

16b) - Tanis e colaboradores (2010) (Tabela 3); série c (1c a 28c) - Johnson e colaboradores

(2011) (Tabela 4).

NN

N

O

R2

OR1

Ar

R3

Figura 14: Perfil geral dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.

42

“(continua)”

Tabela 2: Compostos da série a - Plewe e colaboradores (2009).

NN

N

O

R2

OR1

Ar

# N

O

R2

OR1

Ar

IC50 (nM)

1a N

O

H

OH

FF 84

2a N

O

H

OH

F 137

3a N

O

H

OH

Cl

F

102

4a N

O

H

OH

Cl

F

F

131

5a N

O

H

OH

Cl

Cl

442

6a N

O

H

OH

S

Cl

387

7a N

O

H

OH

N

779

8a N

O

H

OH

N

OH

5730

9a N

O

H

OH

F CN

812

43

“(continuação)”


# N

O

R2

OR1

Ar

IC50 (nM)

10a N

O

H

OH

CN

1620

11a N

O

H

OH

NC

>10000

12a N

O

H

OH

F

NH2

O

1300

13a N

O

H

OH

F

NH2

O

608

14a N

O

H

OH

NH2

O

1720

15a N

O

H

OH

O

NH2

>10000

16a N

O

CH3

OH

FF 250

17a N

O

H

OCH

3

FF

356

18a N

O

CH3

OCH

3

FF >50000

19a N

O

CH3

OH

F 250

20a

N

O

OH

CH3

F

618

44

“(conclusão)”


# N

O

R2

OR1

Ar

IC50 (nM)

21a

N

O

OH

OH F

804

22a N

O

OH

CH3

CH3 CH

3 F

1700

23a N

O

OH

CH3

CH3 F

8000

24a

N

O

OH

F

23000

45

“(continua)”

Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010).

NN

N

O

CH3

OH

R3

F

# R3

IC50 (nM)

1b N

OH

1421

2b N

N

CH3

534

3b N

NH

O

388

4b N

CONH2

466

5b N

CONH2

558

6b

OH

145

7b O

OCH

3

382

8b O

O

313

9b

OCH

3

242

46

“(conclusão)”

Tabela 3: Compostos da série b - Tanis e colaboradores (2010).

# R3

IC50 (nM)

10b O

OCH3

308

11b NH

O

N

O

503

12b N

O

OH

319

13b NH

O

CH3

CH3

251

14b N

O

559

15b

OH

340

16b

O

OCH

3

552

47

“(continua)”

Tabela 4: Compostos da série c - Johnson e colaboradores (2011).

NN

Ar

R3 N

O

OH

# R3

Ar

IC50 (nM)

1c H

F 2,9

2c H

NF

32

3c H

NF

F

18

4c H

F CN 50

5c H

F

Cl

CN

17

6c N

CH3CH

3

F 81

7c NCH

3

OH

F

15

8c N

F

15

9c NCH

3

OCH

3

F

26

10c

N

CH3

F 35

48

“(continuação)”


# R3

Ar

IC50 (nM)

11c N

F F

F

11

12c O

N

F

12

13c O

N

F

11

14c O

O

F

14

15c O

O

CH3CH

3

F 17

16c

O

N

F 14

17c O

F

F

16

18c

OH

O

F

13

19c N

O

F

13

49

“(conclusão)”


# R3

Ar

IC50 (nM)

20c

N

CH3

CH3

O

F

14

21c

CH3

CH3

OH

F 8,8

22c

O

O

F

14

23c

F

F

F

F

13

24c S

N

O

O

O

F

43

25c

S

NCH

3

O

O

O

CH3

F

66

26c S

NCH

3

O

O

CH3

F 13

27c S

N

O

O

F

22

28c

S

N

O

O

CH3

F

36

50

3.3. ANÁLISE CONFORMACIONAL E MODELAGEM MOLECULAR

Ae análise conformacional consiste em explorar os arranjos espaciais (conformações)

energeticamente favoráveis de uma molécula. Nesta análise pode-se utilizar mecânica

molecular, dinâmica molecular, cálculos químico-quânticos ou análises de dados estruturais

determinados experimentalmente por métodos como RMN e cristalografia por difração de

raios-X (SANT’ANNA, 2002; IUPAC, 1997).

O objetivo de uma busca conformacional é identificar as conformações preferenciais

de uma molécula, que irão determinar o seu comportamento. Estas conformações estão

localizadas em pontos mínimos de energia, encontrados através de métodos de minimização

de energia. Estes métodos localizam o mínimo de energia mais próximo à energia da estrutura

de partida (LEACH, 2001).

Ao realizar uma análise conformacional, o ideal seria identificar todas as

conformações de menor energia, combinando sistematicamente todos os ângulos de torção

relevantes da molécula. Esta técnica é chamada pesquisa de grade (grid search) ou análise

conformacional sistemática. Entretanto, um número excessivo de conformações podem ser

geradas em função do número de rotações livres existentes na molécula, o que limita esta

metodologia. O número de confôrmeros a ser analisado equivale a (360°/θ)n, onde θ é o

incremento (em graus) usado no processo de varredura de cada ângulo de torção e n é o

número de rotações livres avaliadas. Quanto menor for o incremento e quanto maior for o

número de rotações livres, maior será o número de conformações geradas, mas, na prática,

apenas alguns confôrmeros são importantes (LEACH, 2001).

O método de Monte Carlo também pode ser usado para explorar o espaço

conformacional (SANT’ANNA, C. M. R., 2002; IUPAC, 1997). Ele utiliza um gerador

numérico randômico, que seleciona várias conformações a fim de obter uma descrição

estatística do sistema (YOUNG, 2009).

O método de mecânica molecular envolve o cálculo das geometrias e energias

conformacionais de moléculas usando uma combinação de campos de força empíricos. O

cálculo das características geométricas e de energia de entidades moleculares é baseado em

funções de potencial empírico, cuja forma é tomada da mecânica clássica. (SANT’ANNA, C.

M. R., 2002; IUPAC, 1997).

51

A equação de Schrödinger é uma das aproximações utilizadas na mecânica quântica.

Entretanto, cálculos de mecânica quântica consomem muito tempo, principalmente quando

utilizados para espécies bioquímicas, porque levam em consideração todos os elétrons da

molécula, que são descritos por múltiplas funções de base. A mecânica molecular é uma

técnica computacionalmente mais simples que utiliza formulações algébricas em vez de

equações diferenciais, utilizadas na mecânica quântica (YOUNG, 2009).

O método de mecânica quântica ab initio usa equações exatas, sem aproximações, que

envolve a população eletrônica total da molécula, podendo ser aplicado a moléculas

relativamente pequenas e, por ser mais exato requer grande capacidade de memória e tempo

de cálculo do computador (LEACH, 2001).

Esse modelo emprega um conjunto de funções de bases nos cálculos. Uma função de

base mínima conteria exatamente o número de funções necessárias para acomodar todos os

orbitais preenchidos de um átomo. Na prática, uma base mínima inclui todos os orbitais

atômicos em uma camada (LEACH, 2001).

As bases mínimas são conhecidas por apresentarem diversas deficiências. Um

problema em particular ocorre com compostos contendo átomos do final do período, como

por exemplo, oxigênio e flúor. Estes átomos são descritos utilizando-se o mesmo número de

funções de base para os átomos do início do período, apesar de possuírem mais elétrons. O

simples aumento do número de funções não necessariamente soluciona o problema ou

aprimora o modelo. A solução mais comum deste problema é a introdução de uma base com

função de polarização. Funções de polarização possuem um número quântico angular mais

elevado, e assim correspondem à adição de orbitais p para átomos de hidrogênio e d para os

demais átomos (LEACH, 2001). O uso de bases contendo funções de polarização é indicado

por um asterisco (*). Assim, 6-31G* refere-se à base 6-31G com funções de polarização para

átomos pesados (isto é, não hidrogênio). Dois asteriscos (e. g., 6-31G**) indicam a aplicação

de funções de polarização (isto é, orbital p) para os átomos de hidrogênio e hélio. A base 6-

31G** é particularmente útil onde ocorrem ligações hidrogênio. Funções de base com

polarização parcial também foram desenvolvidas, por exemplo, 3-21G* que é a mesma base

mínima 3.21G com funções de polarização parcial (LEACH, 2001).

52

3.4. DOCKING MOLECULAR

A técnica conhecida como docking molecular simula o “encaixe” ou o “ajuste” de um

ligante numa macromolécula (e.g., proteína). Esta simulação pode ser feita de modo

automático com o uso de programas computacionais específicos como AutoDock, eHiTS,

Glide, GOLD, Molegro Virtual Docker. Em resumo, a técnica consiste em identificar

possíveis modos de ligação entre um ligante e uma proteína e estimar as respectivas energias

de interação. As diversas soluções (poses) encontradas correspondem a diferentes

conformações e orientações do ligante dentro de cavidades na proteína que equivalem a

possíveis sítios de ligação. As soluções com menores valores de energia de interação são

classificadas como as melhores soluções (KITCHEN et al., 2004).

Durante o processo de reconhecimento molecular, o ligante e a macromolécula

receptora sofrem mudanças conformacionais (MAGALHÃES et al., 2007). A consideração da

flexibilidade molecular da macromolécula e do ligante implica no tratamento de um número

muito elevado de graus de liberdade por parte dos algoritmos de docking. Além disso, o

reconhecimento molecular é um processo dinâmico e muito complexo, envolvendo um grande

número de interações intermoleculares entre o ligante, a macromolécula receptora e o

solvente. Devido à sua complexidade, os programas de docking trabalham com dois tipos de

funções: função de busca e função de pontuação. A função de busca realiza a predição da

conformação e orientação do ligante em relação ao sítio de ligação da macromolécula

receptora; e a função de pontuação discrimina corretamente o modo de interação de um

ligante em seu sítio de ligação e/ou determina, entre dois ou mais ligantes, aquele com maior

afinidade de interação para uma ou mais macromoléculas (LEACH, 2001; MAGALHÃES et

al., 2007).

4. OBJETIVO GERAL

Este trabalho tem como finalidade propor novos compostos derivados azaindóis do

ácido hidroxâmico, através de estudos: da relação estrutura-atividade a partir de descritores

calculados por mecânica quântica; das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas

calculadas in silico; e do modo de ligação entre os derivados e a proteína por docking

molecular.

53

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudo dos perfis conformacionais e das conformações mais estáveis de cada inibidor;

Determinação dos seguintes descritores para a relação estrutura-atividade:

Mapa de potencial eletrostático (MPE),

Valores e mapas dos orbitais de fronteira de mais alta energia ocupado (em

inglês, Highest Occupied Molecular Orbital, HOMO) e de mais baixa energia

desocupado (em inglês, Lowest Unoccupied Molecular Orbital, LUMO),

Magnitude e direção do momento dipolo (µ),

Volume,

Área,

Solubilidade (clogS),

Área de superfície polar (em inglês, Polar surface area, PSA),

Parâmetros da “Regra dos Cinco” de Lipinski,

Peso molecular (PM),

Lipofilicidade (clogP),

Número de grupos aceptores e doadores de ligação hidrogênio;

Estudo farmacocinético in silico e perfis de Druglikeness e Drug-score;

Estudo toxicológico in silico com avaliação dos riscos mutagênico, tumorigênico,

irritante e efeito sobre o sistema reprodutor;

Docking molecular.

5. METODOLOGIA

5.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE

O estudo de Relação Estrutura-Atividade (em inglês, Structure Activity Relationship,

SAR) foi realizado com os valores dos descritores que foram obtidos através da modelagem

molecular e de parâmetros farmacocinéticos, com as atividades biológicas (pIC50) dos

compostos, a fim de averiguar se havia ou não relação direta dos mesmos com a atividade, e

com quais descritores esta relação era mais próxima. Os descritores que mantinham relação

direta com a atividade podiam ser usados como guia na proposição de outros derivados da

mesma classe.

54

5.1.1. CONSTRUÇÃO 3D DOS INIBIDORES, OTIMIZAÇÃO GEOMÉTRICA E

ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS

As estruturas tridimensionais (3D) dos inibidores foram construídas e otimizadas no

programa Spartan’10 (Wavefunction, Inc.), utilizando o método de mecânica molecular com o

campo de força MMFF. Após esta etapa, cada estrutura foi submetida à análise

conformacional pelo método de Monte Carlo. Em seguida, os confôrmeros de menor energia

foram otimizados pelo método ab initio Hartree-Fock 6-31G*.

5.1.2. CÁLCULOS DOS DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E

FARMACOCINÉTICOS

Após os cálculos, com auxílio do programa Spartan’10, foram obtidos os valores dos

descritores estéricos: volume, área e área de superfície polar (PSA); e eletrônicos: mapas de

potencial eletrostático (MPE), mapas e valores dos orbitais de fronteira de mais alta energia

ocupado (HOMO) e de mais baixa energia desocupado (LUMO), e momento dipolo (µ);

Os descritores farmacocinéticos: peso molecular (PM), lipofilicidade (cLogP),

solubilidade (cLogS) e número de aceptores (ALH) e doadores (DLH) de ligação de

hidrogênio foram obtidos no servidor Osiris® Property Explorer (SANDER et al., 2009;

Actelion Pharmaceutical Ltd.) e programa no Spartan’10.

5.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN

SILICO

Os perfis farmacocinéticos: druglikeness (semelhança com fármacos) e drug-score

(índice de aproximação para se tornar um potencial candidato a fármaco); e toxicológicos:

potenciais riscos mutagênico, tumorigênico, irritante e efeito sobre o sistema reprodutor, foram

obtidos no servidor Osiris® Property Explorer (SANDER et al., 2009; Actelion

Pharmaceutical Ltd.). Os valores encontrados foram comparados com o fármaco RAL.


5.2.1. PREPARAÇÃO DOS LIGANTES

As estruturas 3D dos compostos em estudo foram preparadas conforme descrito

anteriormente para o estudo da relação estrutura-atividade, salvas no formato mol2 e

55

utilizadas como estruturas de partida para o docking. A estrutura 3D do RAL foi extraída do

complexo com PFV-IN, para o procedimento de re-docking.

Entre os compostos em estudo, cinco foram avaliados no docking molecular. Os

escolhidos foram: 1c, o mais ativo da série; 19a, análogo estrutural de 1c com diferença de

atividade significativa; 21c, segundo mais ativo, substituído na posição R3; 24a, o menos

ativo da série; e 18a, inativo. Suas estruturas 2D estão representadas na Figura 15.

1c

IC50 = 2,9 nM 21c

IC50 = 8,8 nM

19a

IC50 = 250 nM 24a

IC50 = 23000 nM

18a

IC50 = >50000 nM

Figura 15: Estrutura química dos ligantes 1c, 21c, 19a, 24a e 18a.

5.2.2. OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO

A estrutura cristalográfica do intassomo da PFV-IN foi extraída do PBD, onde está

depositada sob o código 3OYA (HARE et al., 2010b).

NN

F

N

O

OH

NN

F

N

O

OH

CH3

OH

CH3

NN

F

N

O

CH3

OH

NN

F

N

O

OH

NN

F

N

O

CH3

F

OCH

3

56

Para garantir que os resíduos localizados próximos ao ligante RAL fossem

semelhantes aos encontrados na HIV-IN, foi feito um alinhamento das sequências primárias

dos sítios catalíticos das duas enzimas, com auxílio do servidor T-Coffee (NOTREDAME et

al., 2000). Os resíduos posicionados numa distância de até 5 Å a partir do RAL incompatíveis

com HIV-IN foram mutados. A pesquisa foi executada no programa Discovery Studio

Visualizer (Accelrys, Inc.), e as mutações no programa Molegro Virtual Docker (MVD),

seguidas de minimização de energia dos respectivos resíduos, através da busca do melhor

ângulo diedro. No MVD, a minimização de energia é feita através de um campo de força que

utiliza o potencial linear por partes (em inglês, Piecewise Linear Potencial, PLP) para

interações do tipo estéricas e ligações hidrogênio, e o potencial de Coulomb para forças

eletrostáticas. Apenas ângulos de torção e cadeias laterais são modificadas durante a

minimização, todas as outras propriedades (como comprimentos de ligação e posições dos

átomos) são mantidas fixas.

5.2.3. MOLEGRO VIRTUAL DOCKER (MVD)

O Molegro Virtual Docker (MVD) ou MolDock é baseado num método de busca

heurístico, que combina algoritmos de evolução diferencial e de predição de cavidade. Foi

utilizada a licença teste, que é válida por 30 dias (MOLEGRO, 2013). Este programa foi

escolhido devido à facilidade de uso e interface amigável.

Os tipos de átomos e as ordens de ligação foram corrigidos para as estruturas dos

ligantes e da proteína, usando um módulo de preparação automatizado do MVD. Para cada

complexo, átomos de hidrogênio foram adicionados e as cargas atômicas parciais padrões do

MVD foram assinaladas. As ligações rotacionáveis dos ligantes foram mantidas flexíveis e a

enzima foi tratada como um corpo rígido. Durante os experimentos de docking, foram

mantidas apenas quatro moléculas de água que coordenam com os íons Mg²+.

Potenciais sítios de ligação (cavidades) foram detectados usando o algoritmo de

predição de cavidade baseado em grid. O tamanho da população, o número máximo de

interações, o fator de escalonamento e a probabilidade de crossover foram ajustados para 50,

1500, 0,50, e 0,90, respectivamente. Para cada complexo, foram executadas 50 corridas

independentes com o algoritmo MolDock SE, com cada corrida retornando um número

máximo de 15 soluções (poses) para os ligantes em estudo. No re-docking cada corrida

retornou uma única solução.

57

A região de ancoramento dos inibidores foi restrita a uma esfera de 10 Å de raio,

centrada nas coordenadas x = -38,35; y = 30,89 e z = -20,79, que é a região de ligação do

substrato.

A metodologia de docking molecular foi validada com cálculos de re-docking do RAL

presente no intassomo da PFV-IN depositada no PDB. Essa mesma metodologia foi aplicada

para a enzima mutada. O procedimento de re-docking consiste em retirar o ligante do

complexo enzimático e realizar o docking, com o intuito de avaliar se a conformação foi

reproduzida (LEACH, 2001). O re-docking é analisado em termos do desvio médio

quadrático das posições atômicas (RMSD), entre a estrutura do ligante encontrada pelo

programa e a obtida experimentalmente. Valores de RMSD menores de 2.0 Å são um

indicativo de que as soluções (poses) encontradas foram corretamente preditas (LEACH,

2001).

Neste trabalho foram utilizadas duas funções de pontuação: (a) a pontuação MolDock,

que usa um potencial linear por partes (em inglês, piecewise linear potential, PLP), que

considera o somatório das energias de interação intra (auto interação) e inter (ligante-proteína)

molecular (GEHLHAAR et al., 1995); (b) função de pontuação Re-Rank, que reclassifica as

melhores soluções de docking (poses), aumentando a eficácia do resultado.

A função de pontuação Re-Rank identifica as soluções mais promissoras entre as

obtidas pela função de pontuação MolDock, considerando o potencial a 12-6 de Lennard-

Jones e o termo de torção sp2-sp2 (MOLEGRO, 2011).

De acordo com Thomsen e Christensen (2006), a utilização da pontuação MolDock,

seguida por um procedimento de reclassificação, é um esquema adequado para a

identificação dos melhores modos de ligação, no lugar de esquemas de pontuação mais

avançados (THOMSEN; CHRISTENSEN, 2006).

As melhores soluções dos complexos obtidos por docking foram analisadas de acordo

com as interações intermoleculares (enzima-ligante), como ligação de hidrogênio,

eletrostáticas, van der Waals, hidrofóbicas e π-π stacking, empregando o programa MVD.

58

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE

6.1.1. ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS

Após a análise conformacional e otimização das conformações de menor energia pelo

método ab initio, foi feita uma comparação entre os confôrmeros mais estáveis de cada

composto.

Entre os compostos mais ativos, 1c, 21c, 11c, 13c e 12c, observa-se que suas

conformações se coincidem no núcleo azaindol e nos radicais R1 e R2, havendo alguns

desvios nos radicais Ar e R3. A Figura 16 mostra a sobreposição desses compostos.

Figura 16: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 21c (amarelo), 11c

(verde), 13c (azul) e 12c (vermelho) sobrepostas.

Ao sobrepor a conformação mais estável de 1c com as dos compostos menos ativos,

8a, 14a, 22a, 23a e 24a, observa-se que eles diferem de 1c por possuírem substituintes

volumosos em R2, fato que pode estar intimamente relacionado com a atividade. A Figura 17

mostra essa sobreposição.

59

Figura 17: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta), 8a (vermelho), 14a

(amarelo), 22a (laranja), 23a (azul) e 24a (verde) sobrepostas.

Ao analisar as conformações mais estáveis dos compostos 1c e 19a, que diferem

apenas no radical R2, observa-se que este radical ocupa posições diferentes no espaço nos

dois compostos. Esta pode ser uma possível explicação para grande diferença entre as

atividades, onde 1c possui IC50 = 2,9 nM, e 19a IC50 = 250 nM. Essas conformações estão

representadas na Figura 18.

60

Figura 18: Conformações mais estáveis dos compostos 1c (magenta) e 19a (verde).

Tanto na sobreposição dos compostos mais ativos quanto na dos menos ativos, foram

observadas variações nas posições espaciais ocupadas pelos radicais R1, R2, R3 e Ar. No caso

dos mais ativos, apesar de possuírem o mesmo radical Ar, observa-se que suas posições não

seguem um padrão. Provavelmente, isto ocorre em decorrência da variabilidade estrutural dos

radicais R3.

6.1.2. DESCRITORES ESTÉRICOS, ELETRÔNICOS E FARMACOCINÉTICOS

Primeiramente foi realizada uma investigação da existência de linearidade entre cada

descritor e a atividade biológica, pela análise da regressão linear e avaliação do coeficiente de

determinação (R²). Para a confecção dos gráficos, os valores de IC50 foram convertidos em

pIC50 (-logIC50). Foi admitida a existência de relação linear para valores de R² iguais ou

maiores que 0,7. A fim de facilitar a análise, os compostos foram agrupados de acordo com

sua semelhança estrutural e variação de um mesmo radical (R1, R2, R3 ou Ar). Os compostos

inativos 11a, 15a e 18a não foram incluídos nessa análise.

Para os descritores estéricos volume e área, e o descritor farmacocinético peso

molecular foi encontrada relação linear com a atividade (pIC50) nos compostos 1a, 2a, 16a,

17a, 19-24a (Figura 19), que apresentam grupos Ar e R3 semelhantes e variação em R1 e

61

R2.9 Esses descritores traduzem a relação direta dos substituintes dos radicais R1 e R2 com a

atividade. Foi observado que quanto menor o volume, área e peso molecular maior a

atividade. O gráfico de relação linear e os valores de R² encontrados para cada descritor estão

representados na Figura 20.

Figura 19: Estrutura química dos compostos, 1a, 2a, 16a, 17a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a e 24a,

com valores de IC50 (nM) entre colchetes.

62

Figura 20: Gráfico de relação linear entre volume, área e peso molecular dos compostos 1a,

2a, 16a, 17a, 19-24a e atividade (pIC50).

Nos compostos 1a, 2a, 16a, 17a, 19-24a, analisando estrutura química e dos

respectivos valores de pIC50 mostra que é mais prejudicial adicionar um radical metil em R1

do que em R2, uma vez que o composto 17a apresenta pIC50 menor que 16a. Já o radical R2

deve ser pouco volumoso, pois na série 2a, 19-24a foi observado que seu volume é

inversamente proporcional à atividade.

O composto mais ativo de toda a série, 1c é análogo estrutural de 19a (Figura 21). A

única diferença entre eles está no radical R2, que em 1c é um radical etil ligado ao núcleo

azaindol, formando um anel de seis membros. A formação desse anel levou a um aumento

significativo da atividade, que não é explicado pelos descritores estéricos. Uma possível

explicação seria uma melhor interação com o alvo devido ao aumento da rigidez. Os

descritores estéricos de todos os compostos estudados estão disponíveis no Apêndice A.

Figura 21: Comparação estrutural entre os compostos 19a e 1c.

63

Após o cálculo das propriedades eletrônicas momento dipolo (µ), energias dos orbitais

HOMO (EHOMO) e LUMO (ELUMO) foi constatado que não há relação linear entre os valores

desses descritores e a atividade (pIC50).

Foi observado que houve pouca variação entre os valores de EHOMO, estando todos

compreendidos numa faixa entre -8,03 eV (composto 16b) e -8,91eV (composto 28c). A

variância calculada para esta propriedade foi de 0,0364. O composto mais ativo, 1c,

apresentou EHOMO = -8,48 eV, muito próximo da média que foi -8,47 eV.

Os valores de ELUMO também pouco variaram estando numa faixa entre 1,62 eV

(composto 9a) e 3,05eV (composto 16b). O compostos mais ativo, 1c, apresentou ELUMO =

2,84 eV, próximo ao valor médio de 2,68 eV. Os valores das propriedades eletrônicas obtidas

para todos os compostos estão disponíveis no Apêndice B.

A análise dos mapas de potencial eletrostático molecular (Apêndice D) e coeficientes

de distribuição dos orbitais de fronteira HOMO (Apêndice E) e LUMO (Apêndice F) dos

derivados azaindóis mostrou uma densidade eletrônica semelhante para todos os compostos.

Logo, a atividade biológica não pode ser explicada através de tais mapas.

Após o cálculo e análise dos descritores farmacocinéticos P. M., clogP, clogS, ALH e

DLH não foi observada relação linear direta com a atividade (pIC50).

Os valores de solubilidade foram obtidos no servidor Osiris Property Explorer, que

fornece uma estimativa da solubilidade em clogS que é o logaritmo na base 10 da solubilidade

medida em mol por litro. De acordo com o Banco de Dados do servidor 80% dos fármacos

disponíveis no mercado apresentam clogS maior que -4. Entre todos os compostos analisados

nenhum apresentou clogS menor ou igual a -4 (Apêndice C).

Comparando os cinco compostos mais ativos, 1c, 21c, 11c, 13c e 12c com os cinco

compostos menos ativos, 22a, 14a, 8a, 23a e 24a observa-se que os valores de clogP dos mais

ativos encontram-se numa faixa acima de 2,0 e abaixo de 3,0, enquanto que os menos ativos

apresentam clogP abaixo de 1,0 e acima de 3,0. Pode-se supor que a lipofilicidade numa faixa

entre 2,0 e 3,0 seja preferencial para o desempenho destes inibidores.

64

Todos os compostos analisados obedecem à Regra dos Cinco de Lipinski (LIPINSKI,

2004) (Apêndice C) que estabelece parâmetros para que um fármaco tenha boa absorção por

via oral. São eles:

Peso molecular menor do que 500 daltons;

cLogP menor do que 5;

Máximo de cinco grupos doadores de ligação hidrogênio;

Máximo de dez grupos aceptores de ligação hidrogênio.

6.1.3. ESTUDO DOS PERFIS FARMACOCINÉTICO E TOXICOLÓGICO IN

SILICO

Os estudos de farmacocinética e toxicologia in silico têm sido bastante utilizados e

auxiliam no processo de descoberta de novas entidades químicas (MAGALHÃES, 2013;

BRITO, 2010; PASSAMANI, 2009; AFONSO, 2008; MAGALHÃES, 2008; LAGORCE et

al., 2008; SELICK; BERESFORD; TARBIT, 2002).

No servidor Osiris® Property Explorer, o perfil farmacocinético é determinado pelo

parâmetro druglikeness (semelhança com fármacos), que é baseado nos fragmentos de 3300

fármacos comerciais e 15000 substâncias químicas disponíveis comercialmente.

De acordo com cálculos baseados nessa lista, cerca de 80% dos fármacos

apresentaram valores de druglikeness positivos, enquanto que os produtos químicos

apresentaram valores negativos. Portanto, para um candidato a fármaco, é desejável que ele

possua valores de druglikeness positivos, o que significa que ele possui fragmentos

semelhantes aos fármacos disponíveis no mercado (Osiris®

Property Explorer, SANDER et

al., 2009; Actelion Pharmaceutical Ltd.; BRITO, 2010).

Nas Figuras 22, 23 e 24 estão os gráficos do perfil de druglikeness dos cinco

compostos mais ativos de cada série dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.

65

Figura 22: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL.

Figura 23: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL.

Série a

66

Figura 24: Perfil de druglikeness dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL.

O melhor perfil de druglikeness foi observado para a série c, onde estão os dois

compostos mais ativos, 1c e 21c, que apresentaram valores positivos. Os compostos 7c, 9c,

10c e 25c foram os que mais se aproximaram de RAL, e apresentam IC50 < 100 nM, estando

entre os compostos com melhor atividade biológica. Na série b, o destaque é o composto 2b,

único que apresentou druglikeness maior que RAL. Infelizmente, 2b não está entre os

compostos com melhor atividade biológica, com IC50 = 534 nM. Na série a, foram observados

os piores perfis de druglikeness. Mais da metade com valores negativos. Fazem parte desta

série os cinco compostos de menor atividade, 22a, 14a, 8a, 23a e 24a, além dos inativos 11a,

15a e 18a.

O parâmetro drug-score (índice de aproximação para se tornar um potencial candidato

a fármaco), combina os valores obtidos de druglikeness, cLogP (lipofilicidade), logS

(solubilidade), peso molecular e riscos de toxicidade em um único valor de modo a avaliar se

o composto tem potencial para se tornar um fármaco. Este parâmetro permite julgar de uma

forma mais completa o potencial de um fármaco. Valores de drug-score próximos de 1

garantem uma probabilidade teórica de sucesso (Osiris® Property Explorer, SANDER et al.,

2009; Actelion Pharmaceutical Ltd.; BRITO, 2010).

67

Nas Figuras 25, 26 e 27 estão os gráficos do perfil de drug-score dos cinco compostos

mais ativos de cada série dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.

Figura 25: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série a e RAL.

Figura 26: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série b e RAL.

68

Figura 27: Perfil de drug-score dos cindo compostos mais ativos da série c e RAL.

A série c foi a que apresentou o melhor perfil de drug-score. Mais da metade dos

compostos com valores acima de 0,5 (metade de 1 – valor ideal), entre eles 1c o mais ativo. A

série b apresentou o pior perfil, e nenhum composto alcançou pontuação igual ou maior que

0,5. Na série a, os compostos 24a e 8a foram alguns dos poucos que alcançaram pontuação

igual ou maior que 0,5. Infelizmente, estão entre os cinco compostos com menor atividade

biológica.

Os perfis toxicológicos foram avaliados quanto aos potenciais riscos mutagênicos,

tumorigênico, irritante e efeito sobre o sistema reprodutor. A análise in silico foi feita no

servidor Osiris® Property Explorer (Actelion Pharmaceuticals Ltd.), que identifica fragmentos

estruturais pré-computados de compostos reconhecidamente tóxicos do banco de dados

RTECS® (Registry of Toxic Effects of Chemical Substances). O fragmento é considerado

tóxico se ele estiver na lista do RTECS e não estiver (ou estiver raramente) no banco de dados

dos fármacos comerciais (BRITO, 2010).

Nas Figuras 28, 29 e 30 estão o risco de toxicidade in silico encontrados para os cinco

compostos mais ativos de cada série.

69

Figura 28: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série a e RAL.

Figura 29: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série b e RAL.

70

Figura 30: Perfil toxicológico dos cinco compostos mais ativos da série c e RAL.

Houve redução do risco mutagênico de alto, em compostos da série a e b, para

moderado, nos compostos da série c. A principal diferença estrutural entre eles é a formação

de um ciclo entre o radical R2 e o núcleo azaindol. Este aumento da restrição conformacional

é, provavelmente, responsável por essa diferença.


6.2.1. PREPARAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DA ENZIMA ALVO

Para as simulações de docking molecular foi utilizada a estrutura do cristal do

intassomo da PFV-IN (código PDB = 3OYA) (Figura 31), composta pela enzima complexada

com seu respectivo DNA viral, tendo como ligante o fármaco de referência RAL. De acordo

com Johnson e colaboradores (2012), esta estrutura reproduz o modo de ligação com DNA

viral, assim como ocorre na HIV-IN (JOHNSON et al., 2012).

71

Figura 31: Estrutura da PFV-IN (código PDB = 3OYA), com destaque para o sítio ativo onde

está o fármaco RAL.

Foi feito alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da PFV-IN (Uniprot

ID P14350) e da HIV-IN (Uniprot ID P12497), no servidor T-COFFEE, obtendo-se um score

igual a 94.

O programa T-COFFEE usa uma biblioteca primária de alinhamentos locais e globais

de pares de sequências, gerados pelos programas LALIGN (HUANG; MILLER, 1991) e

CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994), respectivamente. Em seguida,

numa etapa de otimização, é selecionado o alinhamento múltiplo mais ajustado aos

alinhamentos de pares de sequência da biblioteca primária, usando o método progressivo,

semelhante ao utilizado no CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994). Este

procedimento fornece um alinhamento múltipo global com menos tendência a erros

relacionados ao desalinhamento das sequências primárias de entrada.

A análise do alinhamento foi feita pelo programa Core, que avalia a qualidade do

pareamento múltiplo das sequências primárias pontuando o alinhamento múltiplo (POIROT,

O'TOOLE E NOTREDAME, 2003). Este programa utiliza uma escala de cores que varia do

azul ao vermelho para avaliar a qualidade do alinhamento. As regiões pareadas com alto grau

72

de identidade são destacadas em cor vermelha, enquanto aquelas com baixo grau de

identidade são destacadas nas cores azul e verde (Figura 32). A similaridade entre PFV-IN e

HIV-IN é limitada ao sítio ativo, uma vez que PFV-IN possui grau de identidade menor que

20% com HIV-IN, e uma extensão do domínio N-terminal não encontrada na HIV-IN (YIN;

CRAIGIE, 2010). Entretanto, os três domínios encontrados no intassomo da PFV-IN tem

essencialmente a mesma estrutura encontrada nos domínios individuais da HIV-IN. Portanto,

a estrutura do intassomo da PFV-IN representa um modelo confiável do intassomo da HIV-IN

(YIN; CRAIGIE, 2010).

73

T-COFFEE, Version_9.03.r1318 (2012-07-12 19:05:45 - Revision 1318 - Build 366)

Cedric Notredame

CPU TIME:0 sec.

SCORE=94

*

BAD AVG GOOD

*

sp|P14350|868-1 : 93

sp|P12497|1201- : 94

cons : 94

sp|P14350|868-1 1 RPQKPFDKFFIDYIGPLPP--SQGYLYVLVVVD 31

sp|P12497|1201- 1 VDCSPGI-WQL------DCTHLEG-KVILVAVH 25

cons 1 .* : : :* :**.*. 33

sp|P14350|868-1 32 GMTGFTWLYPTKAPSTSATVKSLNVLTSIAIPK 64

sp|P12497|1201- 26 VASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVK 58

cons 34 :*: * : . *. * *:. * 66

sp|P14350|868-1 65 VIHSDQGAAFTSSTFAEWAKERGIHLEFSTPYH 97

sp|P12497|1201- 59 TVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYN 91

cons 67 .:*:*:*: ***:*. . **: **. **: 99

sp|P14350|868-1 98 PQSGSKVERKNSDIKRLLTKLLVGRPTKWYDLL 130

sp|P12497|1201- 92 PQSQGVIESMNKELKKIIGQVR----DQAEHLK 120

cons 100 *** . :* *.::*::: :: : .* 132

sp|P14350|868-1 131 PVVQLALN----NTYSPVLKYTPHQLLFGID 157

sp|P12497|1201- 121 TAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDII 151

cons 133 ..**:*: : . : *:. : :..* 163

Na estrutura da PFV-IN assumindo o ligante RAL como referência, foi feita uma

pesquisa dos resíduos localizados num raio de até 5 Å, e comparados com HIV-IN, como

representado no Quadro 1.

Figura 32: Resultado do alinhamento da sequência primária dos sítios catalíticos da HIV-IN e

PFV-IN.

74

Quadro 1: Alinhamento de resíduos da PFV-IN com HIV-IN. Os resíduos destacados em

amarelo fazem parte da tríade catalítica, e os destacados em rosa sofreram mutação.

Resíduo – sequência primária

PFV-IN HIV-IN

Asp116 Asp64 (tríade catalítica)

Asp128 -

Tyr129 -

Asp185 Asp116 (tríade catalítica)

Gln186 Asn117

Pro211 Pro142

Tyr212 Tyr143

His213 Asn144

Pro214 Pro145

Gln215 Gln146

Glu221 Glu152 (tríade catalítica)

Os resíduos Gln186 e His213 foram ambos mutados para o resíduo Asn (asparagina),

no MVD, seguidos de etapas de minimização de energia. É importante ressaltar que os

aminoácidos mutados não estão próximos aos íons Mg²+.

6.2.2. VALIDAÇÃO DOS PROTOCOLOS DE DOCKING POR RE-DOCKING

Antes da realização do docking dos compostos em estudo em seu respectivo alvo, o

protocolo foi validado. Nessa validação o próprio ligante da estrutura cristalina de um

complexo ligante-proteína é submetido ao processo de docking molecular para tentar

reproduzir o modo de ligação original. A enzima foi considerada como um corpo rígido.

Em geral, a confiabilidade dos resultados de docking depende da similaridade entre o

modo de ligação experimental e a solução de menor energia. Um valor de RMSD ≤ 2,0 Å é

amplamente aceito como a distinção entre o sucesso e o fracasso em reproduzir um modo de

ligação conhecido (YUSUF et al., 2008). No re-docking, foi aceito como metodologia

validada, todo resultado que apresentou valor de RMSD ≤ 2,0 Å.

A validação do protocolo de docking foi realizada com as estruturas da PFV-IN

mutada e não mutada. Dessa forma, foi possível observar quaisquer modificações na enzima

decorrentes da mutação.

Além disso, foi testada a influência das moléculas de água na simulação de docking.

Um total de seis corridas foram efetuadas, três para a enzima mutada e três para a não mutada,

75

em ambientes distintos: presença de todas as moléculas de água, ausência de moléculas de

água e com apenas quatro moléculas de água que coordenam com os íons Mg2+

. Para essas

diferentes situações foram obtidas soluções com RMSD abaixo de 2,0 Å. Logo, a mutação

não prejudicou a interação do ligante com a enzima, assim como a presença ou ausência de

moléculas de água.

De acordo com Johnson e colaboradores (2012), a manutenção das moléculas de água

localizadas próxima ao sítio ativo é importante, pois elas fazem contato direto com os

inibidores ou íons Mg²+ (JOHNSON et al., 2012). A partir dessas informações optou-se pela

realização do docking na presença das moléculas de água que coordenam com os íons Mg²+,

pois elas podem ser importantes na manutenção da conformação ativa da enzima.

No re-docking com a enzima mutada e na presença das moléculas de água que

coordenam com os íons Mg²+, a melhor solução encontrada apresentou RMSD = 0,379 Å, e o

melhor valor de Re-Rank, -135,315.

Foi realizada a sobreposição da melhor pose docada na conformação correspondente

do ligante do cristal, como pode ser visto na Figura 33. Observa-se um bom encaixe das duas

estruturas.

76

Figura 33: Sobreposição da melhor pose docada (rosa) no ligante do cristal (amarelo). As

esferas verdes representam os íons Mg²+.

6.2.3. SIMULAÇÕES DE DOCKING MOLECULAR

Os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico foram desenvolvidos com o intuito de

exercerem atividade de inibição da enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons

Mg²+ presentes no sítio ativo, que funcionam como cofatores (PLEWE et al., 2009). Neste

estudo foram avaliadas as interações entre os complexos ligante-proteína dos seguintes

derivados: o mais ativo (1c), o segundo mais ativo (21c), um análogo estrutural do mais ativo

(19a), o menos ativo (24a) e um inativo (18a).

Foi atribuída a RAL e aos ligantes estudados, exceto 18a, carga parcial -1 para o

átomo de oxigênio da hidroxila da função ácido hidroxâmico, e para o átomo de oxigênio da

hidroxila ligada ao anel pirimidinona no caso do RAL. RAL possui pka = 2,13, e os

compostos possuem pka entre 8,2 e 8,6, logo há uma fração ionizada em pH = 7,2, no qual foi

realizado o ensaio de atividade enzimática (PLEWE et al., 2009; CHEMICALIZE, 2014).

Não foram observadas interações de RAL e dos derivados azaindóis com os íons Mg²+

em simulações de docking realizadas com tais compostos não ionizados. Sabe-se que os

dicetoácidos, primeiros compostos inibidores da HIV-IN descobertos, apresentam entre seus

grupos farmacofóricos um carboxilato que pode ser substituído por um bioisóstero

(ROGOLINO et al., 2012). De Luca e colaboradores (2011), consideraram a porção ácido

77

carboxílico como carboxilato em seus estudos de docking com dicetoácidos. Logo, há

influência do estado de ionização na interação com os íons Mg²+, sendo fundamental a

presença de hidrogênios ionizáveis em compostos inibidores da HIV-IN, como observado na

Figura 34.

Figura 34: Estrutura geral dos dicetoácidos e estruturas químicas do RAL e do composto 1c,

com destaque para os hidrogênios ionizáveis.

Para cada ligante foi gerado um grupo (cluster) com 15 soluções (poses). A melhor

solução foi escolhida levando em consideração o menor valor possível de Re-Rank e

sobreposição com RAL.

A função de pontuação Re-Rank foi utilizada porque a melhor solução obtida na

validação do protocolo de docking foi a que apresentou menor valor de RMSD e melhor Re-

Rank. O Re-Rank é uma função de pontuação que leva em conta um termo de torção sp2-sp

2 e

o potencial 12-6 de Lennard-Jones, que é utilizado para interações estéricas; para interações

eletrostáticas é utilizado o potencial de Coulomb. Ele identifica a mais promissora solução das

soluções obtidas pelo algoritmo de docking (MOLEGRO, 2011).

78

A Tabela 5 é um resumo das propriedades das melhores soluções escolhidas para cada

composto e RAL.

Tabela 5: Valores de MolDock, Re-Rank e Einter das soluções escolhidas para cada composto e

RAL.

Composto MolDock Score Re-Rank Score Einter (Kcal/mol)

RAL -210,93 -135,315 -218,286

1c -152,61 -97,70 -160,765

21c -183,58 -121,46 -184,873

19a -159,16 -100,43 -168,813

24a -187,86 -120,99 -203,29

18a -140,69 -92,6026 -164,528

Após a escolha da melhor solução obtida para cada composto, foi feita uma análise da

conformação e do modo de interação de cada ligante com a enzima, em comparação com

RAL, fármaco de referência.

O fármaco de referência RAL apresentou 10 interações do tipo ligação de hidrogênio:

i) Asp185-OD1 e RAL-O5 (distância O---O = 2,83 Å); ii) Tyr212-OH e RAL-O1 (distância

O---O = 2,19 Å); iii) Glu221-OE2 e RAL-O3 (distância O---O = 2,92 Å) iv) RAL-O4 e

Asp128-OD1 (distância O---O = 3,13 Å) v) RAL-O4 e Asp128-OD2 (distância O---O = 3,01

Å) vi) RAL-O4 e Glu221-OE2 (distância O---O = 2,96 Å) vii) RAL-O4 e H2O456-O1

(distância O---O = 3,18 Å) viii) RAL-O4 e H2O534-O1 (distância O---O = 2,97 Å) ix)

H2O401-O1 e RAL-O5 (distância O---O = 3,02 Å) x) H2O534-O1 e RAL-O5 (distância O---O

= 2,51 Å). Na Figura 35, estão representadas essas interações.

79

Figura 35: Interações do tipo ligação de hidrogênio detectadas para RAL (amarelo).

Obs.: As duas esferas verdes representam os íons Mg²+ e as pequenas esferas vermelhas são

moléculas de água.

Além das ligações de hidrogênio, foram detectadas interações do tipo eletrostáticas

entre o oxigênio ionizado do RAL e os dois íons Mg²+, que funcionam como cofatores

(distâncias O4---Mg1 = 2,031 Å e O4---Mg2 = 2,257 Å) (Figura 36). Essa interação é uma

das mais importantes para a atividade antiviral, uma vez que a inibição enzimática dos

fármacos dessa classe é caracterizada pela complexação com os dois íons Mg²+ presentes no

sítio ativo (HAZUDA, 2012).

80

Figura 36: Interações eletrostáticas entre RAL (amarelo) e os íons Mg²+ (verde).

Ainda foram observadas quatro interações hidrofóbicas do tipo π-π para RAL (Figura

37): i) entre o anel oxadiazol e o anel imidazol da base nitrogenada adenina (distância = 4,62

Å) ii) entre o anel oxadiazol e o anel pirimidina da base nitrogenada adenina (distância = 4,30

Å) iii) entre o radical p-fluorofenil e a base nitrogenada citosina (distância = 3,64 Å) iv) entre

o anel pirimidinona e o fenol de Tyr212 (distância = 3,65 Å).

81

Figura 37: Interações hidrofóbicas do tipo π-π detectadas para RAL (amarelo).

Foram observadas interações intermoleculares do tipo ligação de hidrogênio para os

derivados azaindóis, como representado nas Figuras 38, 39, 40, 41 e 42.

Figura 38: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 1c nas

simulações de docking molecular.

82

Figura 39: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 21c

nas simulações de docking molecular.



83





84

As distâncias das ligações de hidrogênio detectadas para os cinco derivados azaindóis

avaliados estão listadas na Tabela 6.

Tabela 6: Distâncias das ligações de hidrogênio realizadas pelos derivados azaindóis nas

simulações de docking molecular.

Ligação de hidrogênio

Composto Participantes Distância

1c

1c-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,37 Å

1c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,02 Å

1c-O2 e DNA-N O---N = 3,10 Å

21c

21c-O2 e DNA-N2 O---N = 2,94 Å

21c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,12 Å

21c-O3 e Tyr212-O O---O = 1,73 Å

19a

19a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,60 Å

19a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,50 Å

19a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 3,08 Å

24a

24a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,68 Å

24a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,81 Å

24a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 2,83 Å

18a 18a-N1 e H2O456-O1 O---N = 2,72 Å

18a-O2 e Asn213-N N---O = 2,21 Å

Interações do tipo sigma-π foram observadas apenas para o composto 1c, entre o

radical p-fluorofenil e o resíduo Pro214 (distância = 2,48 Å). O composto 21c não apresentou

interações do tipo π-π. Nas Figuras 43, 44, 45 e 46 estão as interações observadas para os

demais compostos.

85

Figura 43: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 1c.

Figura 44: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 19a.

86



As distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π detectadas para os cinco

derivados azaindóis avaliados estão listadas na Tabela 7.

87

Tabela 7: Distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π realizadas pelos derivados

azaindóis nas simulações de docking molecular.

Interação

π-π

Composto Participantes Distância

1c

Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 4,82 Å

Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,18 Å

Radical p-fluorofenil e citosina 3,51 Å

21c Não apresentou interações do tipo π-π.

19a



Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,46 Å


24a



Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,55 Å


18a Radical p-fluorofenil e citosina 4,80 Å

O oxigênio ionizado (O2) dos compostos 1c, 21c, 19a e 24a realizou interação

eletrostática com pelo menos um dos íons Mg²+

e resíduos da tríade catalítica. Essas

interações estão representadas nas Figuras 47, 48, 49 e 50.


1c.

88

Figura 48: Interações eletrostáticas e suas respectivas distâncias (em Å) detectadas para o

composto 21c.


19a.

89


24a.

De acordo com Plewe e colaboradores os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico

inibem a enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons Mg²+ presentes no sítio

ativo (PLEWE et al., 2009). Entre os compostos analisados, apenas 21c apresentou interação

com ambos os íons. Foi observado que seu oxigênio ionizado (O2) encontra-se sobreposto ao

do RAL, e posicionado entre os dois íons Mg²+ (Figura 48). Nos demais compostos esta

sobreposição não foi detectada, inclusive no mais ativo, 1c, onde foi observada interação com

apenas um íon Mg²+.

Na estrutura química do composto 18a não há oxigênios ionizáveis (Figura 51). Os

radicais R1 e R2 são grupos metila. Logo, não houve interação com os íons Mg²+, o que

explica sua ausência de atividade biológica. Além disso, encontra-se distante do DNA,

realizando apenas uma interação do tipo π (distância = 4,80 Å), maior que a observada para os

compostos 1c, 19a e 24a (distância = 3,51 Å, 3,52 Å e 3,52 Å, respectivamente).

90

Figura 51: Estrutura tridimensional do composto 18a.

Ao comparar a conformação dos compostos estudados com RAL, apenas 21c

apresenta conformação diferente. Nos demais houve sobreposição com RAL, como pode ser

observado nas Figuras 52, 53, 54, 55 e 56.

Figura 52: Sobreposição de 1c com RAL (amarelo).

91

Figura 53: Sobreposição de 21c com RAL (amarelo).

Figura 54: Sobreposição de 19a com RAL (amarelo).

92



Pode-se observar que 1c, 19a e 24a estão posicionados na cavidade de forma

semelhante, com sobreposição entre os radicais p-fluorofenil do RAL e dos respectivos

compostos. Isto fez com que houvesse interação de O2 com apenas um dos íons Mg2+

. Em

21c, a presença de substituintes na posição R3 fez com que ele se posicionasse de modo

diferente dos demais, permitindo que O2 interagisse com ambos os íons Mg²+, semelhante ao

que ocorre com RAL.

93

O número de interações feitas por 21c e 1c pode explicar o fato de 21c ser

ligeiramente menos ativo que 1c, apesar de sua interação com ambos os íons Mg²+. Foram

detectadas três interações do tipo ligação de hidrogênio para ambos, mas 1c apresenta quatro

interações do tipo π, e 21c nenhuma. A conformação adotada por 1c na cavidade permitiu

uma melhor interação com a proteína-alvo, o que não ocorreu com 21c. É importante ressaltar

que RAL realiza interações do tipo π-π com a proteína-alvo nos mesmos locais que 1c.

Foi observado que 19a e 24a apresentaram perfis de interação semelhantes. A

flexibilidade do radical R2 parece dificultar a aproximação entre estes compostos e o DNA,

pois as distâncias interatômicas das interações π são maiores que as observadas para o

composto 1c. Ainda em relação às interações não foram observadas diferenças significativas

devido à diferença de volume do radical R2 em 19a e 24a.

6.3. MODIFICAÇÕES ESTRUTURAIS

Entre os compostos estudados, 1c poderia ser escolhido como composto protótipo.

Mas, foi observado durante as simulações de docking molecular que, ele interage com apenas

um íon Mg²+. Diante disso, podem ser propostas modificações estruturais para 1c (Figura 57).

A nova posição da função ácido hidroxâmico acarretaria na interação com ambos os íons

Mg²+.

94

Figura 57: Modificações estruturais propostas para o composto 1c.

7. CONCLUSÕES

Não foi observada relação direta com a atividade para os descritores calculados. O

melhor perfil farmacocinético e toxicológico foi apresentado pela série c. A principal

característica que a difere das demais é o radical R2 cíclico. Além de melhorar os valores de

druglikeness e drug-score, houve redução do risco mutagênico.

Considerando a estrutura geral dos derivados azaindóis, os substituintes em R1, R2,

R3 e Ar possuem relação com atividade apresentada. Pode-se sugerir que a presença de um

átomo de hidrogênio em R1 torna o composto ionizado, de maneira que haja complexação

entre o oxigênio carregado e os íons Mg2+

. Por outro lado, o radical R2 pode ser um grupo etil

para que forme um ciclo com o núcleo azaindol, pois essa ciclização melhorou o perfil

toxicológico e a atividade biológica da série, como citado anteriormente. A restrição

conformacional melhorou o acesso dos derivados ao sítio ativo enzimático. O radical Ar deve

ser o grupo p-fluorofenila, que semelhante ao RAL, faz interação com o DNA do tipo π-π, o

que favorece a manutenção da conformação ativa dos derivados azaindóis. E o radical R3

representa uma posição importante para a proposição de novos derivados. No docking

molecular o composto 21c adotou conformação diferente dos demais devido a este radical.

95

Com isso, seu oxigênio ionizado ficou entre os dois íons Mg²+. Apesar disso, apresentou

número menor de interações intermoleculares que 1c, o mais ativo.

É importante ressaltar que as modificações estruturais propostas, estão baseadas em

simulações de docking molecular realizadas com um modelo da enzima HIV-IN construído a

partir de mutações de aminoácidos do sítio catalítico da PFV-IN. Futuramente, pretende-se

construir um modelo da HIV-IN por modelagem comparativa, e com este modelo, avaliar os

derivados azaindóis do ácido hidroxâmico com técnicas de docking e dinâmica molecular.

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104

APÊNDICE A - Descritores estéricos dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.

# Volume (Å³) Área (Å²) PSA (Å²) IC50 (nM) # Volume (Å³) Área (Å²) PSA (Å²) IC50 (nM)

1a 275,88 296,09 55,271 84 11b 446,94 472,46 76,745 503

2a 271,36 291,33 55,063 137 12b 413,54 432,04 69,372 319

3a 284,93 306,02 55,243 102 13b 381,95 409,82 63,785 251

4a 289,17 308,64 55,265 131 14b 432,26 456,08 50,453 559

5a 293,53 313,17 55,052 442 15b 356,16 382,23 60,655 340

6a 267,99 289,93 55,072 387 16b 422,68 455,45 54,695 552

7a 260,53 280,36 61,851 779 1c 296,38 309,91 43,599 2,9

8a 285,37 303,47 80,231 5730 2c 290,07 305,81 50,511 32

9a 290,48 309,62 70,428 812 3c 331,32 335,44 50,537 18

10a 286,37 306,46 70,172 1620 4c 318,73 331,20 60,24 50

11a 286,33 306,16 70,172 >10000 5c 332,16 344,95 60,243 17

12a 301,54 321,64 91,680 1300 6c 363,64 380,73 45,755 81

13a 301,41 322,62 90,834 608 7c 389,06 407,44 64,465 15

14a 297,53 319,95 92,849 1720 8c 405,41 418,60 45,759 15

15a 297,52 319,81 92,915 >10000 9c 409,21 431,45 52,814 26

16a 295,88 316,22 40,964 250 10c 411,07 428,61 46,031 35

17a 297,00 320,51 41,525 356 11c 398,21 415,01 46,023 11

18a 316,68 339,10 28,005 >50000 12c 436,91 453,27 56,914 12

19a 291,08 310,25 40,666 250 13c 419,16 434,59 57,533 11

20a 327,85 350,55 40,087 618 14c 428,69 444,21 57,421 14

21a 334,31 353,66 54,409 804 15c 423,85 448,62 55,17 17

22a 345,38 364,82 37,725 1700 16c 455,42 473,88 57,004 14

23a 328,01 350,09 39,316 8000 17c 429,71 441,67 50,037 16

24a 374,68 391,02 40,003 23000 18c 360,24 376,65 77,017 13

1b 391,50 415,44 62,267 1421 19c 433,19 449,33 53,797 13

2b 417,71 441,47 46,462 534 20c 420,88 436,17 57,151 14

3b 400,04 415,21 68,721 388 21c 394,31 412,23 62,294 8,8

4b 417,49 438,26 79,840 466 22c 447,38 465,67 57,403 14

5b 417,49 438,26 79,840 558 23c 364,24 382,54 43,763 13

6b 319,62 343,17 60,637 145 24c 410,90 426,23 83,896 43

7b 386,20 418,44 55,587 382 25c 424,50 448,04 81,381 66

8b 409,48 432,16 55,103 313 26c 378,31 396,78 76,326 13

9b 339,86 364,87 48,267 242 27c 403,68 420,11 75,879 22

10b 404,44 434,20 55,121 308 28c 438,33 455,23 76,798 36

105

APÊNDICE B - Descritores eletrônicos dos derivados azaindóis do ácido hidroxâmico.

#

µ (Debye) EHOMO (eV) ELUMO (eV) IC50 (nM)

#

µ (Debye) EHOMO (eV) ELUMO (eV) IC50 (nM)

1a 8,18 -8,55 2,78 84 11b 8,90 -8,56 2,65 503

2a 7,66 -8,57 2,79 137 12b 6,46 -8,76 2,52 319

3a 8,84 -8,58 2,6 102 13b 9,34 -8,6 2,65 251

4a 7,63 -8,55 2,47 131 14b 6,13 -8,18 2,9 559

5a 5,89 -8,73 2,64 442 15b 5,55 -8,38 2,79 340

6a 6,89 -8,68 2,69 387 16b 7,65 -8,03 3,05 552

7a 7,54 -8,58 2,79 779 1c 8,38 -8,48 2,84 2,9

8a 8,32 -8,4 2,92 5730 2c 9,21 -8,45 2,62 32

9a 5,54 -8,69 1,62 812 3c 8,73 -8,41 2,34 18

10a 9,09 -8,71 2,03 1620 4c 4,62 -8,59 1,66 50

11a 7,89 -8,77 2,03 >10000 5c 3,35 -8,66 1,37 17

12a 8,5 -8,45 2,25 1300 6c 8,42 -8,31 2,93 81

13a 7,5 -8,62 2,2 608 7c 9,67 -8,41 2,83 15

14a 6,08 -8,58 2,42 1720 8c 8,32 -8,29 2,93 15

15a 5,16 -8,65 2,44 >10000 9c 7,39 -8,33 2,9 26

16a 6,83 -8,44 2,87 250 10c 8,36 -8,28 2,94 35

17a 7,1 -8,43 2,87 356 11c 8,15 -8,43 2,79 11

18a 5,63 -8,27 2,96 >50000 12c 7,35 -8,33 2,96 12

19a 7,29 -8,48 2,87 250 13c 7,7 -8,3 2,75 11

20a 7,17 -8,48 2,87 618 14c 8,81 -8,49 2,77 14

21a 7,21 -8,66 2,63 804 15c 8,54 -8,18 2,96 17

22a 6,11 -8,42 2,93 1700 16c 7,97 -8,49 2,78 14

23a 6,34 -8,44 2,9 8000 17c 7,71 -8,27 2,91 16

24a 7,13 -8,49 2,85 23000 18c 6,81 -8,33 2,81 13

1b 3,51 -8,31 2,84 1421 19c 8,57 -8,21 2,85 13

2b 6,42 -8,23 2,93 534 20c 10,83 -8,14 2,9 14

3b 2,76 -8,45 2,72 388 21c 9,89 -8,16 3,01 8,8

4b 4,93 -8,44 2,82 466 22c 6,41 -8,26 2,87 14

5b 4,93 -8,44 2,81 558 23c 7,06 -8,51 2,67 13

6b 5,10 -8,4 2,78 145 24c 9,72 -8,86 2,41 43

7b 5,85 -8,34 2,82 382 25c 10,77 -8,79 2,54 66

8b 4,20 -8,34 2,84 313 26c 10,55 -8,81 2,48 13

9b 5,02 -8,35 2,81 242 27c 11,3 -8,74 2,53 22

10b 6,70 -8,2 2,97 308 28c 6,16 -8,91 2,41 36

106

APÊNDICE C - Descritores farmacocinéticos dos derivados azaindóis do ácido

hidroxâmico.

# P.M.

(uma) clogS clogP ALH DLH

IC50

(nM) #

P.M.

(uma) logS clogP HBA HBD

IC50

(nM)

1a 303,268 -2,74 2,38 5 2 84 11b 455,49 -1,42 0,89 9 2 503

2a 285,278 -2,43 2,22 5 2 137 12b 426,448 -2,12 1,3 8 2 319

3a 319,273 -3,16 2,78 5 2 102 13b 384,411 -2,6 1,94 7 2 251

4a 337,713 -3,47 2,94 5 2 131 14b 426,492 -1,88 2,39 7 1 559

5a 336,178 -3,58 3,18 5 2 442 15b 357,385 -2,19 2,27 6 2 340

6a 307,761 -2,86 0,96 6 2 387 16b 415,465 -2,24 2,47 7 1 552

7a 268,276 -1,34 1,41 6 2 779 1c 311,316 -2,27 2,44 5 1 2,9

8a 298,302 -1,22 0,52 7 3 5730 2c 312,304 -1,5 1,17 6 1 32

9a 310,288 -3,2 2,25 6 2 812 3c 330,290 -1,81 1,33 6 1 18

10a 292,298 -2,88 2,1 6 2 1620 4c 336,326 -3,04 2,47 6 1 50

11a 292,298 -2,88 2,1 6 2 >10000 5c 370,771 -3,78 3,03 6 1 17

12a 328,303 -2,51 1,13 7 3 1300 6c 368,412 -1,78 2,07 6 1 81

13a 328,303 -2,51 1,13 7 3 608 7c 398,438 -1,58 1,55 7 2 15

14a 310,313 -2,2 0,97 7 3 1720 8c 408,477 -2,74 2,8 6 1 15

15a 310,313 -2,2 0,97 7 3 >10000 9c 412,465 -1,7 1,91 7 1 26

16a 317,295 -2,23 2,62 5 1 250 10c 408,477 -2,6 2,79 6 1 35

17a 317,295 -2,74 2,74 5 1 356 11c 430,430 -2,92 2,53 6 1 11

18a 331,322 -2,24 2,98 5 0 >50000 12c 446,482 -2,94 2,67 7 1 12

19a 299,305 -1,92 2,46 5 1 250 13c 432,455 -2,83 2,38 7 1 11

20a 327,359 -2,49 3,28 5 1 618 14c 439,487 -3,02 2,2 7 1 14

21a 343,358 -1,98 2,22 6 2 804 15c 427,476 -2,88 2,41 7 1 17

22a 341,386 -2,71 3,33 5 1 1700 16c 460,509 -3,22 2,95 7 1 14

23a 327,359 -2,6 3,11 5 1 8000 17c 449,457 -3,92 3,8 6 1 16

24a 375,403 -3,24 4,19 5 1 23000 18c 383,379 -2,52 2,04 6 2 13

1b 398,438 -1,72 1,59 7 2 1421 19c 438,503 -2,23 2,36 7 1 13

2b 411,481 -1 1,84 7 1 534 20c 424,476 -2,45 2,03 7 1 14

3b 411,437 -1,35 0,7 8 2 388 21c 397,450 -3,02 2,78 6 2 8,8

4b 425,464 -2,05 1,17 8 2 466 22c 453,514 -3,35 2,75 7 1 14

5b 425,464 -2,05 1,17 8 2 558 23c 407,367 -3,78 3,74 5 1 13

6b 329,331 -1,8 1,57 6 2 145 24c 460,486 -1,48 0,32 10 1 43

7b 387,411 -1,85 1,78 7 1 382 25c 462,502 -1,33 0,57 10 1 66

8b 413,449 -2,62 2,07 7 1 313 26c 418,449 -1,41 0,72 9 1 13

9b 343,358 -1,93 1,93 6 1 242 27c 444,487 -2,09 1,04 9 1 22

10b 401,438 -2,15 2,12 7 1 308 28c 472,541 -2,52 1,78 9 1 36

107

APÊNDICE D – Mapas de potencial eletrostático (MPE) dos derivados azaindóis do

ácido hidroxâmico.

108



109



110

APÊNDICE E – Mapas dos orbitais de fronteira HOMO dos derivados azaindóis do


111



112



113

APÊNDICE F – Mapas dos orbitais de fronteira LUMO dos derivados azaindóis do


114



115



MONIQUE LUIZA AGUIAR DOS SANTOS Monique Luiza... · Ao meu noivo, Camilo Lima, que além de noivo...

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