1. Tcnicas Especiais:1- Radioautografia:A radioautografia uma tcnica em que possvel a localizao desubstncias radioativas nos tecidos, esta baseia-se no efeito das radiaessobre as emulses fotogrficas. Nesta tcnica cristais microscpicos debrometo de prata, contidos na emulso fotogrfica, agem comomicrodetectores da radioatividade; esses cristais atingidos pela radiao edepois de revelados transformam-se em gros de prata metlica (aparecendonegros ao microscpio), caracterizando a presena de radioatividade nasestruturas que com este esto em contato.Uma radioautografia obtida da seguinte maneira: um corte de rgo, como istopo radioativo previamente injetado no animal, posto em contato comuma pelcula de emulso fotogrfica. Logo aps, um certo tempo, a pelcula revelada e os pontos negros que nesta aparecerem vo corresponder aos locaisdo rgo que contm o istopo. Como a quantidade de gros de prata relativa radioatividade presente, a radioautografia, permite que essaradioatividade tambm possa ser medida.Essa tcnica tambm foi adaptada para o uso em microscpios eletrnicos,onde a emulso colocada sobre os cortes finos de material embebido emresinas sintticas; mas devido ao seu grande poder de aumento os gros deprata em sua maioria no aparecem globosos, mas como filamentosenovelados.Esse mtodo tem sido largamente utilizado para o estudo de importantesfenmenos biolgicos como pr exemplos a sntese de protenas e ometabolismo de D.N.A . Ento pr definio de radioautografia obtemos que: o uso combinado demolculas radioativas e suspenses de brometo de prata em gelatina abase de sua tcnica.1

2. ILUSRAES:2- Centrifugao fracionada:Denomina-se centrifugao fracionada o processo fsico que aplica a2 3. fora centrfuga para separar organelas celulares, de acordo com o coeficientede sedimentao de cada uma. Este depende do tamanho, forma e densidadeda partcula e tambm da viscosidade e densidade do meio. Fases da tcnica: De incio remove-se o rgo em estudo de um animal recm- sacrificado, esse rgo deve ser picados em pedaos muito pequenos e colocados em soluo apropriada, como pr exemplo sacarose e resinas plsticas solveis e inertes de diferentes composies podem ser utilizadas para constiturem uns meios de viscosidades e densidades diversas. Logo em seguida, os fragmentos de rgo em suspenso so colocados em um cilindro de vidro onde dento gira em grande velocidade um mbolo ligado a um motor eltrico, esse equipamento denominado homogeneizador. Os fragmentos dos tecidos so atritados acabam liberando as organelas. Encerrado este processo deixa-se a suspenso em repouso pr alguns minutos para que as clulas que ficaram intactas e as fibras do tecido conjuntivo possam se sedimentarem. Ento inicia-se a centrifugao do sobrenadante com rotaes cada vez maiores, sendo assim as organelas mais densas se sedimentam primeiro, e cada vez que o sobrenadante submetido a foras centrfugas cada vez maiores obtem-se a separao dos diversos componentes celulares. Um aperfeioamento deste tipo de centrifugao a centrifugao contragradiente. O gradiente consiste em uma soluo cuja concentrao mxima no fundo do tubo e mnima na superfcie, apresentando um aumento gradual da concentrao de cima para baixo. Sobre o gradiente homogeneizado celular e se faz a centrifugao. As partculas migram em direo centrfuga e param onde ocorre um equilbrio entre a ao da fora centrfuga e a tendncia de flutuao da partcula. Essa tcnica permite a obteno de fraes mais puras. OBS.: todas as etapas de ambas as tcnicas so realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas enzimticos funcionem o que lesaria as organelas durante sua separao.Ilustraes:3 4. 3- Imunocitoqumica: 4 5. Essa tcnica tem como base o seguinte fato: quando uma macromolculaestranha (antgeno), introduzida em um organismo, este reage produzindouma protena denominada anticorpo; que pr sua vez combinaespecificamente com o antgeno. Nesta tcnica podem ser utilizadosmarcadores acoplados a anticorpos, sem que este perca a capacidade de secombinar com o antgeno, para isso a tcnica imunocitoqumica se divide emdois tipos: direta e indireta.So 3 os mtodos mais usados para marcar os anticorpos: Conjuno com composto fluorescente: esta tcnica possvel devido aidentificao do anticorpo e do antgeno a que ele se liga, pelo empregomicroscpio de fluorescncia. Conjuno com uma enzima: neste caso o anticorpo localizado pr meiode tcnicas histoqumicas usualmente empregadas para enzimas. A maisutilizada a peroxidase que pode ser visualizada tanto no microscpioptico como o eletrnico. Conjuno com uma substncia que no se deixa atravessar pela luz e quedispersa eltrons: o mais utilizado o ouro pois suas partculas podem servistas tanto no microscpio ptico como no eletrnico.Tcnica direta:Supondo-se de um determinado rgo de um certo animal possa se extraire purificar quimicamente uma protena, que ser chamada de X (antgeno),deseja-se ento saber em que clula ou estrutura do rgo que ela estalocalizada, pois esta foi retirada de um rgo inteiro. Injetando-se a protena Xnum coelho, este formara um anticorpo com propriedade de se combinarsomente com ela. logo aps um determinado tempo, do sangue do coelho,pode se extrair e purificar o anticorpo contra a protena X. Este anticorpo podeser ligado a um composto fluorescente podendo assim ser identificado aomicroscpio.Ento mergulhando-se um corte do mesmo rgo do qual se obteve aprotena X numa soluo que contenha o anticorpo marcado, haver umacombinao dos dois e os componentes teciduais que contem a protena Xsero visveis.Tcnica indireta: 5 6. Esta tcnica realizada pr etapas: 1o etapa: faz-se a imerso do corte histolgico em soluo com anticorpono marcado, obtido do sangue de um animal no qual foi injetado umantgeno que deseja-se determinar a localizao, o anticorpo fixa-se aoantgeno que no pode ser observado ao microscpio pois o anticorpo noesta marcado. 2o etapa: emerge-se o preparado em uma soluo com antianticorpo(antigamaglobulina), este antianticorpo marcado fixa-se ao anticorpo que jesta ligado ao antgeno revelando sua localizao.Os mtodos de imunocitoqumica tem sido aperfeioados para que se obtenhauma localizao cada vez mais precisa das macromolculas pesquisadas, umdesses mtodos aperfeioados o do ouro-protena A que tem contribudomuito para as pesquisas em biologia celular. 6 7. Microscpio de Fase:O estudo microscpio de tecidos vivos muito difcil, sendo que seuscomponentes na maioria so incolores e transparentes. Pr isso que utilizadoo microscpio de contraste de fase, pois este permite o estudo de muitosdetalhes celulares in vivo . a velocidade com que a luz atravessa um corpo e ondice de refrao deste dependem da quantidade de matria presente(densidade), ento quanto maior a densidade menor ser a velocidade da luzno interior desse corpo e menor tambm o ndice de refrao.Como as diversas estruturas celulares tem ndices de refrao diferente,causam atrasos diferentes nas ondas luminosas que as atravessam, dandoorigem a diferenas de fase entre as ondas luminosas emergentes que nopodem ser visveis. No microscpio de fase existem dispositivos especiais quetransformam essas diferenas de fase em diferenas de amplitude prconseqncia diferena na intensidade luminosa, a qual a retina sensvel.Microscpio de Polarizao:A luz, ao atravessar um filtro polaride, torna-se polarizada, ou seja, passaa vibrar em uma nica direo. Com o segundo filtro colocado nomicroscpio, acima do primeiro e com seu eixo perpendicular, a luz noatravessa o conjunto. O primeiro filtro chamado de polarizador e colocadono condensador, j o segundo filtro colocado entre a objetiva e a ocular e denominado analisador.Quando entre os dois filtros existem estruturas contendo molculasorientadas (Ex.: celulose, colgeno ...), essas estruturas apareceram brilhantescontra um fundo escuro, isto ocorre porque as molculas orientadas soanisotrpicas e modificam o eixo de luz recebida do polarizador.Microscpio de Fluorescncia: Diz-se substncias fluorescentes, quando algumas substncias soexcitadas pr determinados comprimentos de onda, onde estas absorvemenergia e emitem luz de maior comprimento de onda. Nos microscpiosutilizam luz com fonte ultravioleta, onde as substncias fluorescente aparecemcomo estruturas brilhantes contra um fundo escuro, aps a lente objetiva socolocados filtros que permitem a passagem da luz ultravioleta, mas eliminam apassagem da radiao para proteger os olhos do observador. Vrios corantes que so fluorescente, e que tenham afinidade pr certoscomponentes celulares, so utilizados para sua identificao; como exemplo oalaranjado-de-acridina, que se liga ao D.N.A e ao R.N.A . Atualmente este tipo de microscopia tem sido muito utilizado para 7 8. localizar sondas fluorescentes, que so substancias diversas capazes de reagircom quantidades mnimas de determinadas molculas intracelulares. Alocalizao da sonda, pr sua fluorescncia, indica a presena da molculacelular procurada.Microscpio Eletrnico:Tambm chamado de transmisso, possui uma alta resoluo eapresentao de imagens com grande riqueza em detalhes. Os eltrons soproduzidos graas ao aquecimento no vcuo de um filamento, o catdio, queno emite eltrons. Essas partculas so aceleradas devido a diferena depotencial de 60 a 100 KV que existe entre o filamento e o andio (placaperfurada que forma um feixe de eltrons).Esse feixe transmitido pr lentes eletromagnticas, parecida com a luzdo microscpio ptico. O condensador focaliza o feixe de eltrons no plano doobjeto, e a objetiva forma uma imagem desse objeto, essa imagem ainda ampliada pr lentes projetoras e a imagem final ds-se sobre uma telafluorescente ou um filme fotogrfico.Devido os eltrons serem facilmente desviados pelo objeto, so realizadoscortes muito finos de tecidos que so realizados em ultramicrtomos comnavalhas de vidro ou diamante.Microscpio Eletrnico de varredura:Tambm denominado de scanning electron microscope, nesse tipo demicroscpio colocado entre a lente eletromagntica e o objeto uma bobinade varredura que provoca um desvio do feixe de eltrons, de tal modo que omesmo vai incidir ponto pr ponto sobre o objeto em uma seqnciadeterminada. O objeto pr sua vez no se deixa atravessar pelo feixeeletrnico, devido a sua espessura e a evaporao de metal pesado sobre a suasuperfcie.De tal modo que o feixe de eltrons que incide sobre o objeto (feixeprimrio) sofre reflexes originando eltrons secundrios que so capturadospr detectores especiais que geram um sinal eltrico, transferindo para ummonitor de vdeo.8 9. Comparao Entre o Microscpio ptico Com oMicroscpio EletrnicoAs principais diferenas entre o microscpio eletrnico com ptico o poderde resoluo, o limite de resoluo dos melhores microscpios pticos de0,2m, ento o que determina a riqueza de detalhes fornecido pr um sistemaptico o seu limite de resoluo e no o seu poder de aumento. J omicroscpio eletrnico possui um sistema de resoluo muito maior que de0,0001m mostrando uma riqueza de detalhes surpreendentemente maior quea do microscpio ptico.Bibliografias consultadas: Junqueira e Carneiro, Histologia Bsica, 9o edio, editora GuanabaraKoogan. Junqueira e Carneiro, biologia molecular e celular. Texto gentilmente cedido pelo prprio autor (maloureiro@sti.com.br) www.sti.com.br 9