MicrobiologiaTeórica 32

2º Ano2011/2012

Sumário

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Capítulo XXX. A microbiologia como pilar das ciências biomédicas

Expectativas dos alunos. Análise de resposta à pergunta para que serve a microbiologia em Ciências Biomédicas? Exemplos das análises clínicas Exemplos da Indústria Farmacêutica

Controlo de Qualidade Produção de medicamentos por microrganismos

Exemplos da Indústria Agroalimentar Investigação em Ciências Biomédicas

Microbiologia e diagnóstico Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de terapêutica Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas e terapêuticas

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Microbiologia e análises clínicas Microbiologia e Parasitologia Médicas

São função exclusiva dos biomédicos nalguns países com UK.

O Cientista Biomédico tem de ser capaz de: Fazer diagnóstico microbiológico de amostras médicas.

Por cultura Por coloração Por testes bioquímicos Por testes moleculares

Fazer o diagnóstico da imunidade serológica Análise de anticorpos ou antigénios presentes no soro

dos pacientes

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Microbiologia e Indústria Agroalimentar Controlo de qualidade microbiológicas:

Matérias primas Processos Produtos finais

Monitorização de fermentadores ou bioreactores onde existe a produção de alimentos ou aditivos por bactérias: Produção de proteínas recombinantes ou nativas Isolamento e purificação desses produtos

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Microbiologia Investigação em Ciências Biomédicas Microbiologia e diagnóstico

Desenvolvimento e aprefeiçoamento de novas formas de diagnóstico

Microbiologia e desenvolvimento de novas formas de terapêutica Utilização dos microrganismos em novas formas

de terapêutica ou produção de conhecimento que leve ao desenvolvimento de novas formas terapêuticas

Microbiologia e conhecimento de novas vias etiológicas Associação de agentes microbianos a patologias

e/ou caracterização de novoas agentes etiológicos de patologias infecciosas. 3-01-20125 T32-34 MJC

Microbiologia Investigação em Ciências Biomédicas Técnicas que é necessário o cientista

biomédico dominar: Cultura de células microbianas Observação ao microscópio de lâminas preparadas

e preparação de lâminas para observação ao microscópio.

Identificação de microrganismos pelas várias técnicas Bioquímicas Moleculares

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Bibliografia

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Sumário

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Capítulo XXX. Exemplos das análises clinicas Análise de um artigo que faz o teste de um método de diagnóstico

microbiológico da doença periodontal A pergunta Os métodos utilizados Os resultados As conclusões.

Em que passos deverá intervir o Biomédico?

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Diagnóstico Microbiológico da Doença Periodontal

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É possível? É útil? Está disponível?

Que métodos de investigação? Que testes?

Artigo ”Comparison between polymerase chain reaction-based and checkerboard DNA hybridization techniques for microbial assessment

of subgingival plaque samples.”

Que técnicas existem para detectar/quantificar MO periodontopatogénicos? Cultura Teste BANA

Benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA) test (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, e Bacteroides forsythus)

Observação directa

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Que técnicas existem para detectar/quantificar MO periodontopatogénicos? Métodos moleculares

PCR RT-PCR DNA-DNA hibridization

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Qual o objectivo da investigação presente?

Compara os resultados obtidos por dois métodos moleculares. PCR e aplicação dos testes Micro-Ident

Hibridação DNA-DNA (sem PCR)

Para as mesmas amostras de pacientes saudáveis e de pacientes com periodontite.

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Caracterização da população estudada. Todos com mais de 20 anos Saudáveis sem ser a periodontite Sem tratamento periodontal ou antibiótico

sistémicos há pelo menos 3 meses 25 pessoas

Grupo com patologia periodontal Pelo menos 24 dentes Sem locais com PD acima de 4 mm

Grupo saudáveis Com pelo menos 20 dentes Mais de 5% de dentes com PD acima de 4mm

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Como foi feita a avaliação microbiológica?

Tiradas amostras de 6 locais nos doentes com periodontite: 2 em bolsas com menos de 4mm 2 em bolsas com 4-6 mm 2 em bolsas com mais de 6 mm Paper points for the Micro ID test Cureta para DNA-DNA

Nas amostras para o Microident (Fotos slide 2): Extração de DNA PCR hibridização com membrana com 13

sondas específicas. Verificação do sinal e classificação por comparação com

escala em 0,5 ate 3 de abundância Nas amostras de DNA-DNA hibridization (Fotos slide 6)

Extração de DNA hibridização com os chips de DNA

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Teste MicroIDent

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Este é o resultado que o médico dentista recebe como relatório não o resultado laboratórial.No laboratório o resultado é lido por hibridização com uma membrana de nitrocelulose.

DNA-DNA Checker Board

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Quais os resultados da investigação?

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Quais os resultados da investigação? Ambos os métodos têm “perfis” diferentes para

indivíduos com doença periodontal e sem. Num há 11 espécies com diferenças significativas

estatisticamente entre saúde e doença. Noutro há 10 espécies estatisticamente diferentes

entre saúde e doença.

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Quais os resultados da investigação?

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Quais os resultados da investigação? Há alguma concordância na especificidade e na

sensibilidade dos testes

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Quais os resultados da investigação?

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Quais os resultados da investigação? Para a maioria das espécies é indiferente usar um

ou outro teste que os resultados estatisticamente não diferem mesmo quando se consideram as quantificações.

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Conclusões gerais

Para algumas das espécies os resultados são muito semelhantes.

Para outras há maiores diferenças O facto de para os agentes mais associados à

periodontite os resultados serem muito semelhantes leva a supor que os dois tipos de teste podem ser usados alternativamente.

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Sumário

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Capítulo XXX. Exemplos das análises clinicas. Procedimentos normais num consultório de

Análises clínicas Análise de uma amostra de urina

Análise preliminar Cultivo Antibiograma

Análise serológica de marcadores da hepatite Testes serológicos

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Num laboratório de análises clínicas... Cultivo de bactérias e fungos em placas Exame directo de amostas de esfregações, urina

ou fezes. Preparação, fixação, coloração e exame de

lâminas de sputum, esfregações, fezes, fluído encefalo raquidiano e organismos de cultura. As colorações incluem coloração de gram mas também outras colorações específicas para algumas amostras.

Inoculação e leitura de testes bioquímicos para identificação de Microrganismos

Determinação de sensibilidade a antibióticos por antibiogramas.

Testes serológios para fetecção de antigénios ou anticorpos.

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Análise microbiológica de uma amostra de urina Análise preliminar:

Tiras de detecção de: Leucócitos Proteínas Glicémia

Permitem a despistagem rápida de infecção urinária.

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http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/near-patient-testing/combur/

Análise microbiológica de uma amostra de urina Análise cultural:

Análise de crescimento, quantificação. Esta é feita pois a inoculação é feita usando um volume

determinado de urina 0.01 ou 0.001ml. A cultura é feita em agar de sangue, MacConkey ou

Colistin-nalidixic ácid Agar (CNA). Antibiograma

Em meio Mueller-Hinton é feita a cultura dos isolados onde são testados alguns antibióticos passíveis de ser utilizados.

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http://www.youtube.com/watch?v=FOimwWEV6vU&feature=player_embedded

Análise serológica de marcadores de HBV Marcadores:

HBSag (Antigénio de superfícies de vírus da hepatite B)

HB anti-core (anticoprpo para o antigénio core do vírus da hepatite B).

HBeAg (Antigénio e do vírus da hepatite B) Anti-HBe (anticorpo contra o antigénio e do vírus).

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Procedimento para detecção de antigénios

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Em todos os testes de ELISA há: Replicados da amostra Um contolo positivo em que há uma

concentração conhecida do antigénio a detectar.

Um contolo negativo em que não há o antigénio a detectar.

A leitura é feita por espectofotometria que mede a intensidade da cor gerada da reação da enzima com o substratos presentes.

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Sumário

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Capítulo XXX. Risco associado ao trabalho em laboratórios

de análises clínicas. Risco biológico Risco quimico Risco físico Risco eléctrico Risco ambiental

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Risco Biológico

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Todas as amostras são potencialmente perigosas! Usar o equipamento de segurança pessoal

adequado: Luvas Batas Óculos quando necessário

Respeitar as normas de segurança dos níveis de risco biológico:

Nível 1 Nível 2 Nível 3 Nível 4

Todos os níveis pressupõem a adopção das medidas do nível anterior.

Nível 1 Nível 1: Bactérias e vírus  Bacillus subtilis, 

canine hepatitis, Escherichia coli, varicella (chicken pox),e algumas culturas celulares não infecciosas.

Na manipulação deste material pode apenas usar-se luvas.

A descontaminação deste nível é feita por lavagem das mãos e descontaminação por autoclavagem de todo o material contaminado.

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Nível 2 Bactérias e vírus que causam doenças pouco

graves em humanos ou que dificilmente podem ser contraídos por aerossois.

Hepatitis A, B, e C, influenza A, Lyme disease, salmonella, papeira, rubeola, febre de Dengue e HIV.

Têm de ser usadas câmaras de segurança biológica nível 2.

Acesso limitado ao laboratório Avisos de perigo biológico Descontaminação de todo o material antes de

ser deitado no lixo.3-01-2012T32-34 MJC 37

Nível 3  Bactérias e vírus que podem causar

patologias fatais em humanos mas para as quais há vacinas e outros tratamentos.

 anthrax, West Nile virus,encefalite equina Venezuelana , SARS, variola , tuberculose, tifo, Febre Rift Valley fever, Febre Rocky Mountain spotted fever, Febre amarela e malaria.

Trabalho obrigatório em câmaras de segurança biológica 3

Acesso controlado ao laboratório Descontaminação da roupa antes de lavar. Descontaminação de todo o equipamento3-01-2012T32-34 MJC 38

Nível 4 Víruses e bactérias que causam patologias

severas e fatais em humanos para as quais não há tratamentos nem vacinas disponíveis.

Febres hemorrágicas Trabalho não autorizado na maior parte dos

laboratórios. Controlo de entrada e saída de todas as

pessoas e materiais.

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Risco Químico Algumas das substâncias usadas para

preparar as amostras têm vários riscos associados.

É preciso saber a sinalética e respeitar as normas de segurança de cada substância

Não cheirar Não pipetar com a boca Ter cuidados especiais com a chama Cuidados com o contacto com a pela de

substâncias carcinogénicas

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Risco Eléctrico Além das precauções normais de senso

comum ... Necessário asseurar que os equipamentos são

mantidos em condições ao longo dos anos.

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Risco Físico Cuidado esqpecial com a arrumação do

laboratório Evitar gavetas e portas dos armários abertas Evitar caixas ou obstáculos no chão que

possam promover quedas. Cuidado com a abertura brusca de portas

especialmente as que abrem para os dois lados!

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Risco Ambiental Cuidados na separação dos lixos Eliminação responsável de substâncias como

mercúrio, chu,bo ou outras susbtâncias químicas nocivas para o ambiente

Manutenção do ar do laboratório com qualidade Monitorização da qualidade do ar Manutenção dos filtros e condutas de ar

condicionado.

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Recursos

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http://www.cdc.gov/niosh/topics/healthcare/#c

Capítulo 5. Secção 5.4 Capítulo 6. Secção 6.5