Isolamento Viral em Cultivo Celular
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Isolamento Viral em Cultivo Celular Adriana Candido Rodrigues
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Isolamento Viral em Cultivo Celular
Adriana Candido Rodrigues
Sistemas Celulares
Célula viva para replicação
Vírus: Parasitas intracelulares obrigatórios
Animais de Laboratório
Ovos Embrionados
Cultura de Células
Importância
Animais
Vantagens:
Simples
Confiável
Sensível
Desvantagens:
Tempo
Espaço
Custo
Cultura Celular
Vantagens:
Espaço
Custo
Ética
Desvantagem:
Menor sensibilidade
A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório.
Rapidez no Diagnóstico
Viável economicamente.
É um método sensível, tendo a capacidade de detectar pequenas concentrações do vírus.
Utilidade da cultura celular
Diagnóstico e IsolamentoProdução de vacinasBiologia molecular do vírus, mecanismo de infecção e patogeniaIsolar grande numero de vírusProdução de antígenos viraisRealizar testes de neutralizaçãoDeterminação de concentrações virais
N2A Neuroblastoma MurinoOrigem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC)
BHK-21 Rim de Camundongo Recém NascidoOrigem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC)
Fonte :Instituto Pasteur
Vantagens da Célula
• Universalidade• Sensibilidade• Custo• Espaço Físico• Caráter Ético• Simplicidade
Desvantagens da Célula
• Contaminação• Toxidade
1913
Levaditi - primeira descrição.
1956
Vieuchange et al. Relatou a
sensibilidade de culturas celulares
primárias de células de rim de camundongo à
infecção pelo vírus da raiva .
Dois anos mais tarde, Kissling descreveu a
passagem seriada de vírus de campo
e de cultivo em células primarias
de rim de hamster
Por volta de 1963, Kissling e
Reesedemonstraram o
potencial da utilização do
crescimento viral desta maneira
para preparação de uma vacina.
1975
Larghi et al. - BHK-21 desenvolveram o primeiro
isolamento do vírus rábico de rua em células BHK-21 (baby hamster
kidney) tendo em vista o seu uso na rotina
diagnóstica (CAMPBELL; CHARLTON,
1988).Segundo este experimento: cultura celular apresentou >
sensibilidade.
1977
Smith et al. CER (embrião de
galinha). Um ano depois utiliza
N2A (neuroblastomade camundongo)
CongelamentoDescongelamentoManutenção
Fonte: Instituto Pasteur
A manutenção das células é realizada em dois repiques por semana, efetuados
durante sua viabilidade e crescimento.
Fonte: Instituto Pasteur
Estas células, após crescimento, serão utilizadas na técnica do isolamento viral.
Fonte: Instituto Pasteur
Fonte: Google
Obtenção do número de células desejável:5 x 105 células/mL
Contagem Celular
N° de células /mL = n° total de células X 10.000 X fator de diluição n° de quadrantes
N° de células encontrado = Volume FinalN°de células /mL da suspensão original
Total de células dos 4 quadrantes x 10.000* x 10**4
* Fator de conversão da câmara de Neubauer**Volume total de meio usadas na suspensão de células.
Ex.: 196 x 104 x 10 = 490 x 104 = 49 x 105
4Células/mL
49 x 105 _________________ Volume final5 x 105 _________________ 1 mL
Volume final= 9,8 mL
Inóculo:
Uma suspensão a 20% (peso/volume) foi preparada a partir de fragmentos do Sistema
Nervoso Central
Fonte: Instituto Pasteur
Armazenamento das amostras em freezer
Fonte: Instituto Pasteur
Após preparar Cabine de Segurança Biológica, homogeneizar a amostra.
Manipular no gelo.
Fonte: Instituto Pasteur
Meio de cultura: para 10 mL de meio acrescentar 30 μL de antibiótico e 30 μL de
aminoácidos essenciais
Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 40μL da amostra em cada orifício da placa, em triplicata.
Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 160 μL de meio de cultura, homogeneizar.
Fonte:Instituto Pasteur
Adicionar 100 μL de suspensão de células, (contendo 5 x 105 células/mL ).
Fonte: Instituto Pasteur
Incubar a 37°C em Câmara Úmida de CO2 a 5% de 72 a 96 horas
Fonte :Instituto Pasteur
Como as células não sofrem efeito citopático, será
preciso evidenciar o vírus através da
Imunofluorescência Direta (IFD).Remover o
sobrenadante com uma bomba de
sucção. Fonte :Instituto Pasteur
Adicionar 200 μL de Acetona a 80% e incubar por 15 minutos em banho de gelo.
Fonte: Instituto Pasteur
Após, desprezar Acetona e
secar a placa.
Fonte: Instituto Pasteur
Acrescentar 40 μL do conjugado antirrábico , previamente titulado, por
orifício, e incubar a 37º C por 60 minutos.
Fonte: Instituto Pasteur
Enxaguar a placa por imersão, 3
vezes em solução salina tamponada, pH 7,4, e 3 vezes
em água destilada. Secar a placa.
Fonte: Instituto Pasteur
Adicionar 50μL de glicerina tamponada (pH 8.5) em cada orifício
Fonte: Instituto Pasteur
Fonte: Instituto Pasteur
A leitura será realizada em cada orifício e, sendo observada pelo
menos uma célula infectada, será
considerada positiva.Orifícios sem células
infectadas serão considerados
negativos.
Positivo Negativo
