CULTIVO E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DESTINADAS À TRANSFERÊNCIA NUCLEAR EM BOVINOS

Revisão de Literatura

Paula de Oliveira Waeny Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato

BRASÍLIA - DF

DEZEMBRO / 2016

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

ii

CULTIVO E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DESTINADAS À TRANSFERÊNCIA NUCLEAR EM BOVINOS

Revisão de Literatura

Trabalho de conclusão de curso de

graduação em Medicina Veterinária

apresentado junto à Faculdade de Agronomia

e Medicina Veterinária da Universidade de

Brasília

Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato

BRASÍLIA - DF

DEZEMBRO / 2016

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Cessão de Direitos

Autor: Paula de Oliveira Waeny

Título: Cultivo e isolamento de células destinadas à transferência nuclear em

bovinos: revisão de literatura.

Ano: 2016

É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta

monografia e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos

acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e

nenhuma parte desta monografia pode ser reproduzida sem a autorização por

escrito do autor.

_______________________________

Paula de Oliveira Waeny

Waeny,PauladeOliveira

Cultivo e isolamento de células destinadas à transferência nuclear embovinos:revisãodeliteratura./PauladeOliveiraWaeny;orientaçãodeIvoPivato.–Brasília,2016.

35p.:il.

Trabalho de conclusão de curso de graduação – Universidade deBrasília/FaculdadedeAgronomiaeMedicinaVeterinária,2016.

iv

v

À mulher da minha vida: minha mãe, que é a minha inspiração e melhor amiga. E aos três homens da minha vida: meu pai, meu irmão e meu namorado, que sempre me protegem e me alegram.

vi

AGRADECIMENTOS

À Universidade de Brasília e meus Professores, por me oferecerem

oportunidades de aprendizado, crescimento pessoal e profissional.

Ao meu querido Orientador Prof. Dr. Ivo Pivato por ter me ensinado a beleza

e o encanto da Reprodução Animal, pela paciência e vontade de ensinar, pelas

conversas dentro e fora de sala de aula, pelos conselhos e pelas oportunidades extracurriculares de aprendizado.

À minha família, em especial minha mãe Sueli, meu pai José Carlos, meu

irmão Matheus e minha cunhada Karina, que sempre me apoiaram nos estudos,

estiveram presentes quando eu precisei e foram meus maiores exemplos.

Ao meu namorado, melhor amigo e companheiro de todas as horas, Hannes,

pelo amor, carinho, atenção e paciência. Por ter me ensinado Alemão, me apoiado

em todas as decisões e ser essencial em minha vida. Danke an meinen Freund und

Wegbegleiter Hannes für die Liebe, Fürsorge, Aufmerksamkeit und Geduld. Danke,

dass ich durch ihn Deutsch lernen konnte und auch dafür, dass er mich in allen

Entscheidungen unterstützt hat, er ist für mein Leben essentiell.

À Geneal, por ter colocado pessoas maravilhosas no meu círculo

profissional. Ao meu supervisor, Med. Vet. Henrique Bayão, pelos ensinamentos,

cobranças e piadas. Aos funcionários da Fazenda Santa Elza, por sempre me

ajudar e me fazer rir. À equipe do Laboratório, pela paciência e por sempre

responder minhas perguntas e, em especial, ao Tom, pela ajuda indispensável, pela

companhia agradável e pelas conversas engraçadas. Ao Rodolfo, pela boa vontade e disposição para voltar a Brasília comigo.

A todos os meus amigos, que me proporcionaram momentos de muita

alegria, me ajudaram e fazem a minha vida valer mais a pena. Dentre eles, Anita,

Gabi, Marina, Natália, Fernanda, Silvia, Mariana, Camila, Fabiane, Jacqueline,

Camilinha, Lorena, Júlia, Raisa, Estéfany, Guilherme, Oberdan e Albert.

Aos animais, pelo mais puro e sincero amor, em especial à Frida, que sempre esteve comigo enquanto eu estudava.

vii

“A compaixão para com os animais é das mais nobres

virtudes da natureza humana” (Charles Darwin)

viii

SUMÁRIO

LISTADEQUADROS.......................................................................................................ix

LISTADEFIGURAS..........................................................................................................x

LISTADESÍMBOLOSEABREVIAÇÕES.............................................................................xi

RESUMO......................................................................................................................xiii

ABSTRACT...................................................................................................................xiv

1.INTRODUÇÃO...........................................................................................................15

2.COLETADOMATERIAL..............................................................................................172.1. Células que podem ser utilizadas para isolamento e cultivo............................172.2. Cuidados....................................................................................................................182.3. Métodos de isolamento celular...............................................................................19

3.CULTIVOCELULAR.....................................................................................................203.1. Meios...........................................................................................................................203.2. Passagens..................................................................................................................213.3. Ciclo Celular...............................................................................................................223.4. Crescimento Celular.................................................................................................233.5. Influência do Ambiente............................................................................................25

4.ARMAZENAMENTODECÉLULAS...............................................................................264.1. Criopreservação........................................................................................................26

5.SINCRONIZAÇÃODACÉLULAPARAATN...................................................................28

6.RELATÓRIODEESTÁGIO...........................................................................................286.1. Local............................................................................................................................286.2. Atividades Realizadas..............................................................................................296.3. Conclusão..................................................................................................................31

7.REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS.................................................................................32

ix

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Atividades realizadas na Fazenda Santa Elza (Geneal - Uberaba - MG)

durante os meses de Agosto e Setembro de 2016................................................................ 30

Quadro 2: Atividades realizadas no Laboratório da Geneal (Uberaba - MG) durante os mês de Outubro de 2016........................................................................................................

30

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo celular e concentração de macromoléculas na célula......... 22

Figura 2: Fases do crescimento celular...................................................... 23

xi

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES

ABCZ – Associação Brasileira dos Criadores de Zebu

cm – Centímetros

CTZL – Centro de Transferência de Tecnologias de Raças Zebuínas com

Aptidão Leiteira

DF – Distrito Federal DMEN – Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (Meio Dulbecco Modificado)

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Deoxyribonucleic acid (Ácido Desoxiribonucleico)

EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EDTA – Ethylenediaminetetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-

Acético)

FIV – Fertilização in Vitro

FCS – Fetal Calf Serum (Soro Fetal Bovino) HEPES – 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Acid (Ácido N-(2-

Hidroxietil) Piperazina-N'-2-Etanossulfónico) HSP – Heat Shock Protein (Proteína de Choque Térmico) Kg – Quilograma

M – Molaridade

mg – Miligramas

mL – Mililitros

mm – Milímetros

mOsm – Miliosmol

μL – Microlitros

PBS – Phosphate-Buffered Saline (Solução tampão fosfato)

pH – Potencial Hidrogêniônico

RNA – Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucleico)

SOF – Fluido do Oviduto Sintético

TCM – Tissue Culture Medium (Meio de Cultura de Tecidos)

TN – Transferência Nuclear

UI – Unidade internacional

UnB – Universidade de Brasília

xii

UTI – Unidade de tratamento intensivo

ºC – Graus Celcius

O2 – Oxigênio

CO2 – Gás carbônico

NaHCO3 – Bicarbonato de sódio

xiii

RESUMO

O cultivo celular é uma etapa fundamental para o sucesso da clonagem

animal por transferência nuclear, pois é a partir dele que as células doadoras de

núcleo são isoladas, cultivadas e preparadas para serem efusionadas em ovócitos

enucleados. Além dessa utilidade, o cultivo de células também é empregado no

diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças, terapia celular, desenvolvimento

de novos produtos que antes eram testados em animais, preservação de recursos

genéticos e preservação de espécies. O fibroblasto é uma linhagem celular

amplamente empregada na clonagem animal e seu processamento inclui a coleta

de uma biópsia de pele, isolamento mecânico ou enzimático, passagens celulares,

sincronização e o congelamento, que é opcional.

Palavras-chave: banco celular, clonagem, cultivo celular, preservação de tecidos

transferência nuclear, fibroblasto

xiv

ABSTRACT

Cell culture is an essential step for the success of animal cloning due nucleus

transfer. From it is possible to isolate, culture and prepare nucleus donor cells to

effuse them in enucleated oocytes. Furthermore, cell culture is used in the

diagnosis, prevention and diseases treatment, cell therapy, development of new

products that were tested in animals before, conservations of genetic resources and

species. The fibroblast is a cell line widely used in animal cloning and its processing

technique includes collecting a skin biopsy, mechanical or enzymatic isolation, cell

passage, synchronization and cryopreserving, that is optional.

Keywords: cell bank, cell culture, cloning, nucleus transfer, fibroblast, tissue

preservation

15

1. INTRODUÇÃO A técnica de cultivo celular teve início no começo do século XX, com a

finalidade de estudar o comportamento de células animais fora do organismo e em

meio controlado. Entre 1906 e 1910, Ross Harrison isolou pequenos fragmentos da

medula espinhal de um sapo e os manteve viáveis durante alguns dias. O francês

Alexis Carrel mostrou, em 1912, que era possível manter células embrionárias de

galinhas viáveis durante várias décadas, desde que em condições assépticas e

utilizando meios com nutrientes necessários. O cultivo celular ganhou grandes

dimensões durante a Segunda Guerra Mundial (1939 – 1945), quando cientistas

iniciaram pesquisas para desenvolver vacinas virais contra a poliomielite

(CASTILHO et al., 2008).

O cultivo celular é um conjunto de técnicas que permitem manter células e

tecidos in vitro, conservando ao máximo suas propriedades fisiológicas,

bioquímicas e genéticas. Atualmente, a cultura celular não se limita apenas ao

estudo do comportamento de tecidos e células. Seu uso se estende à medicina,

diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças, terapia celular, desenvolvimento

de novos produtos que antes eram testados em animais, preservação de recursos

genéticos, preservação de espécies e transferência nuclear (TN) (CASTILHO et al.,

2008).

No Brasil existem laboratórios, como a Geneal – Genética e Biotecnologia

Animal, que fornecem o serviço de cultivo celular de biópsias de animais com alto

valor genético e comercial. Criadores utilizam dessa oportunidade como uma forma

segura de preservar um genoma específico. Este material fica armazenado em

nitrogênio líquido a -196ºC até o momento da necessidade da sua reconstituição.

Outro exemplo de laboratório é o Bio Cell, especialista em isolar e cultivar células

tronco para realizar terapia celular.

Existem dois tipos de cultivo celular, sendo eles o cultivo de células primárias

e o cultivo de linhagens celulares. As células primárias são isoladas diretamente

dos tecidos, possuem crescimento finito e resistem a um número determinado de

passagens. A linhagem celular é proveniente de subculturas celulares que foram

selecionadas para formar uma população celular de um único tipo. A linhagem

celular é classificada em limitada ou contínua e pode ser utilizada para formar os

bancos celulares que são armazenados através da criopreservação. Os

16

fibroblastos são um exemplo de linhagem celular de crescimento contínuo e,

atualmente, é muito utilizado como célula doadora de núcleo para a TN (CASTILHO

et al., 2008). Além do fibroblasto, vários tipos celulares podem ser utilizados para a

TN, dentre eles se encontram células somáticas, como as células da glândula

mamária, células do cumulus, células do oviduto, células endoteliais, epiteliais,

blastômeros, fibroblastos, células de Sertolli e células tronco. Essas células podem

ser obtidas tanto de um animal adulto, como de um feto ou um neonato (KATO;

TSUNODA, 2010).

A TN é uma biotecnologia da reprodução capaz de criar um animal

geneticamente idêntico a outro a partir da transferência do núcleo de uma célula

doadora para o interior de um ovócito enucleado. Essa técnica vem crescendo

significativamente dentro do rebanho bovino brasileiro, pois a partir dela o produtor

pode criar uma genética que será multiplicada, trazendo assim um aumento na

produtividade e eficiência do animal. Também é uma forma de garantir a

preservação de genomas importantes, servindo como um modo seguro para

preservar animais de alto valor zootécnico, além de permitir a reposição do plantel

em caso de morte dos animais. Esse valor, não está no animal em si, mas sim na

genética que pode ser comercializada da forma de sêmen (no caso de machos),

embriões (no caso de fêmeas, que não podem ter os ovócitos congelados) ou crias

obtidas de cruzamentos selecionados. Além disso, a TN é o passo inicial para se

criar animais transgênicos, que poderão ser utilizados no futuro para o tratamento

de algumas doenças em seres humanos, como a hemofilia por exemplo (PEREIRA;

FREITAS, 2009).

A Divisa Mata Velha TN1, nascida no dia 1º de setembro de 2009, foi o

primeiro clone bovino a ser registrado pela ABCZ (Associação Brasileira dos

Criadores de Zebu). Para sua produção, coletou-se uma biópsia de pele da prega

caudal. Na Embrapa Cenargen, em Brasília, realizou-se os procedimentos de

isolamento, cultivo e congelamento de células. A manipulação resultou em 18

embriões transferidos e cinco gestações confirmadas, onde apenas uma chegou

ao fim aos 292 de gestação (ABCZ, 2009). A Embrapa também é responsável por

produzir o primeiro clone bovino da América Latina, a bezerra Vitória, da raça

Simental, nascida em 2001(EMBRAPA, 2013).

17

Levando em consideração a importância do cultivo celular e o futuro

promissor da clonagem animal por TN, é importante estudar e analisar os principais

passos para o sucesso do processamento da célula. Dentre os fatores, serão

abordados os diferentes tipos celulares utilizados na TN, os cuidados necessários

para a coleta do material, os métodos de isolamento e cultivo celular, a

criopreservação do material e a sincronização da célula para a reconstrução

embrionária.

2. COLETA DO MATERIAL 2.1. Células que podem ser utilizadas para isolamento e cultivo

Diferentes tipos celulares, de tecidos distintos, podem ser utilizados para a

produção de clones a partir da TN. Estudos demonstram que é possível obter

embriões através de células embrionárias, células somáticas fetais, fibroblastos

fetais, células do cumulus, células do epitélio do oviduto e fibroblastos adultos

(PEREIRA et al., 2014), porém até hoje não se sabe exatamente o que faz uma

célula ser uma boa doadora de núcleo (OBACK; WELLS, 2002).

Os blastômeros foram as primeiras células isoladas e utilizadas para a

clonagem e são de fácil obtenção tanto no embrião produzido in vivo como no in

vitro. Antes da compactação, os blastômeros podem ser dissociados por

processamento em meios sem cálcio e magnésio (BRIGGS; KING, 1952). A

desvantagem da utilização do blastômero é que, por se tratar de uma célula

embrionária, ainda não se pode afirmar o potencial de produção do animal adulto.

As células do cumulus são obtidas através do cultivo de ovócitos,

provenientes de folículos ovarianos, em meio DMEN (Dulbecco´s modified Eagle´s

medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino. Quando as células crescem

e ocupam o fundo da placa de cultivo, elas são removidas com PBS (phosphate-

buffered saline), tripsina e EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) e transferidas

para uma nova placa para serem cultivadas (KRUMLAUF, 1987).

As células do oviduto são obtidas por meio da compressão, com uma pinça,

das células epitelias do oviduto e são cultivadas da mesma forma que as células

do cumulus (KRUMLAUF, 1987).

Os fibroblastos são obtidos a partir de uma biópsia da pele do animal geralmente retirada da orelha ou da prega caudal de animais vivos, doentes ou já

18

falecidos (CIBELLI et al., 2014). Por ser de fácil obtenção e manipulação para o cultivo in vitro, o fibroblasto é o tipo celular mais utilizado para a TN (PEREIRA et al., 2014).

Em um trabalho realizado em 2013 no CTZL (Centro de Transferência de

Tecnologias de Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira) na EMBRAPA Cerrados

(DF), obteve-se o primeiro clone bovino utilizando células adiposas como doadoras

de núcleo (SILVA et al., 2016).

2.2. Cuidados

A coleta do material é o primeiro passo a ser realizado durante o processo

de cultivo celular e é determinante no sucesso do isolamento da célula (PEREIRA

et al., 2014). Junto com a coleta, é necessário identificar o animal e os frascos de

armazenamento para garantir a autenticidade das células em respeito ao DNA,

animal e espécie (CASTILHO et al., 2008).

A escolha da origem da célula doadora é fundamental para o sucesso da TN

e ela precisa apresentar um genoma intacto. Dependendo da célula isolada, pode

haver erros genéticos e epigenéticos no genoma doador, reprogramação genética

e epigenética incompleta ou até mesmo uma associação entre os dois fatores

(OBACK; WELLS, 2002).

O local da retirada da biópsia deve ser analisado com cautela. Um dos

motivos é que a radiação ultravioleta pode causar danos no DNA, portanto é

preferível evitar coletar células de tecidos que recebem alta intensidade solar, como

orelha e regiões que ficam mais expostas a esta radiação. A área da biópsia deve

estar íntegra, sem lesões e/ou contaminações (BERNSTEIN et al., 1996). Uma boa

opção é realizar a biópsia na prega caudal, pois é uma área protegida da radiação

solar, de fácil manuseio e que não compromete a estética do animal.

A área da biópsia deve ser lavada, desinfetada e tricotomizada antes do

procedimento cirúrgico para reduzir os riscos de contaminação. É indicado realizar

anestesia epidural e infiltrativa com 10 mL de lidocaída 2%. A incisão na pele é

realizada com um bisturi, retirando-se uma amostra de tecido de aproximadamente

1 cm x 1 cm. O local da biópsia deve ser suturado com padrão simples separado e

fio não absorvível. O tecido deve ser lavado com solução fisiológica e mantido sob

refrigeração em meio de transporte adequado, contendo PBS, ou solução

19

fisiológica, 80 mg/mL de estreptomicina e 80.000 UI/mL de penicilina e a um pH 7,4

(PEREIRA et al., 2014). As amostras podem ser armazenadas a 4ºC durante 4 ou

5 dias sem perda significativa da viabilidade (CIBELLI et al., 2014).

Caso o procedimento não seja realizado com boas práticas de assepsia,

pode ocorrer contaminação microbiológica por bactérias, fungos, micoplasmas e

vírus. Quando há contaminação por bactérias ou fungos, o meio de cultura fica

turvo, o pH muda rapidamente e a cultura celular pode morrer. Já a contaminação

por micoplasma é mais difícil para ser observada, pois suas implicações incluem

redução na taxa de crescimento celular, alterações morfológicas, aberrações

cromossômicas e alterações no metabolismo de aminoácidos e ácidos nucleicos.

Os vírus crescem com facilidade em meios à base de soro fetal bovino e reduzem

a proliferação celular (CASTILHO et al., 2008).

Muitos cientistas são a favor da utilização de antimicrobianos para reduzir a

contaminação da amostra (CIBELLI et al., 2014). Porém, outros cientistas afirmam

que isso pode causar uma resistência microbiana ou ainda mascarar pequenas

contaminações. Quando a amostra é contaminada, o ideal é descartá-la e iniciar o

cultivo de uma nova amostra. Quando isso não é possível, deve-se fazer o uso de

antibióticos desde que a contaminação não seja viral, uma vez que os vírus não

respondem aos antimicrobianos (CASTILHO et al., 2008).

2.3. Métodos de isolamento celular

O princípio das técnicas de isolamento celular consiste na separação de uma

célula a partir da biópsia de um tecido (CASTILHO et al., 2008), utilizando

instrumentos mecânicos associados ou não aos químicos ou enzimáticos

(ROSSETTO et al., 2011). O método enzimático é mais rápido e tem menos

chances de contaminação em relação ao método mecânico, porém as duas

técnicas são bastante eficientes e amplamente utilizadas.

O método enzimático, também conhecido como digestivo, consiste em

manter a amostra de tecido em um meio contendo tripsina, colagenase ou pronase,

misturado ou não com EDTA. A presença da enzima proteolítica irá digerir o tecido

até que seja possível isolar as células desejadas (CASTILHO et al., 2008). Como

esta técnica baseia-se na digestão enzimática, é necessário acompanhar o

20

processo diariamente para evitar a completa destruição do tecido pelas enzimas

(DEMEESTERE et al., 2002).

Para o método mecânico, a biópsia é levada ao laboratório e cortada

finamente com uma lâmina de bisturi número 04 em uma placa de Petri em

condições estéreis para evitar contaminação. O tecido cortado é armazenado em

uma garrafa de cultivo celular de poliestireno tratada para aderência celular e com

meio de cultivo adequado contendo TCM199 (Tissue Culture Medium) e DMEN na

proporção de 1:1 e 10% de FCS (fetal calf serum). O material é cultivado por uma

a duas semanas a 38,5ºC e 5% de CO2, até que os fibroblastos cresçam a partir

das biópsias e ocupem o fundo da placa de cultivo. As células são então removidas

com tripsina e transferidas para outra placa até que haja quantidade o suficiente

para criopreservá-lás (CIBELLI et al., 2014).

Outra maneira de separar o tecido mecanicamente é através do Tissue

Chopper, um equipamento de baixo custo que realiza cortes seriados de acordo

com o tamanho desejado (HEUSER, 1980). Míxers, tesouras cirúrgicas, fórceps e

agulhas dissecantes também são uma alternativa para isolar células, porém não

são muito utilizados atualmente. É importante que os materiais sejam esterilizados

para evitar a contaminação do tecido (ROSSETTO et al., 2011).

3. CULTIVO CELULAR As células provenientes das biópsias podem ser cultivadas em DMEN

suplementado com 10% de FCS em condições de 38,5ºC e 5% de CO2. Após duas

semanas, os fibroblastos estão confluentes e podem ser tripsinizados para serem

transferidos para uma nova placa de cultivo, processo conhecido como Primeira

Passagem. Antes de serem utilizadas para a TN, as células são mantidas em

confluência ou cultivadas em meio contendo 0,5% de FCS (soro privação), afim de

aumentar a proporção de células em G0 e G1 (KEEFER et al., 2002).

3.1. Meios

A medida que as células vão crescendo, os meios precisam ser substituídos

para continuar fornecendo os nutrientes necessários. O intervalo entre a troca de

um meio e outro varia de acordo com a linhagem celular, taxa de crescimento e

metabolismo. Fatores como o aumento na densidade celular, queda no pH,

21

carência de nutrientes ou alteração morfológica indicam que há necessidade de

trocar o meio de cultivo (CASTILHO et al., 2008).

Algumas células são chamadas de aderentes, pois dependem de um

substrato sólido para formar uma monocamada e crescer. Essas células dependem

da superfície de contato com a placa de cultivo e seu crescimento é inibido quando

elas entram em contato com outras células. Existe ainda as células em suspensão,

um outro tipo celular que não depende de um meio sólido para se proliferar.

Fibroblastos, células epitelias e endotelias são aderentes, enquanto células

sanguíneas, neuroblastos e células do tipo linfoblastoide são células de suspensão

(CASTILHO et al., 2008).

As células de adesão só começam a se proliferar após estabelecer contato

com a placa de cultivo. Para isso é necessário a adsorção de fatores de adesão ao

substrato, tais como vitronectina e/ou glicoproteínas de fibronectinas, geralmente

associadas a íons de cálcio. Esses componentes podem ser obtidos do soro ou

podem ser produzidos pelas próprias células. Após isto, é necessário colocar o

tecido em contato direto com a placa, assim as células vão se aderir à superfície e

produzir proteoglicanos multivalentes de sulfato de heparina que se ligam às

glicoproteínas da membrana celular. A partir daí as células se proliferam e ocupam

a placa de cultivo (CASTILHO et al., 2008).

O material da placa de cultivo interfere no crescimento das células de adesão

e por isso, os mais empregados são o vidro e o plástico. Dentre eles, o poliestireno

é o mais utilizado atualmente, pois além de facilitar a adesão celular, tem coloração

transparente e baixo custo (CASTILHO et al., 2008).

3.2. Passagens

As células são cultivadas até atingirem 70% de confluência e então são

transferidas para outra placa de cultivo para serem subcultivadas (PEREIRA et al.,

2014). Até a primeira passagem, a cultura celular é primária e após isso ela já é

considerada uma linhagem celular. As culturas primárias são, geralmente,

heterogêneas, mas os fibroblastos se tornam predominantes após certo tempo. Na

placa de cultivo, as células vão crescendo e liberando fatores de crescimento que

promovem aderência e proliferação celular (CASTILHO et al., 2008).

22

Para realizar a passagem das células de aderência, é necessário remover o

meio de cultivo e adicionar tripsina, pronase, dispase ou colagenase, afim de

desprender as células do fundo da placa de cultivo. Em geral, é comum adicionar

EDTA para quelar o cálcio utilizado no processo de adesão das células. Em alguns

casos as células continuam aderidas mesmo após esse processo e, então pode-se

agitar a placa gentilmente para desprendê-las (CASTILHO et al., 2008).

Para as células em suspensão, o processo de passagem é similar ao

realizado para culturas microbianas. Não é necessário adicionar tripsina e nem

trocar o meio completamente, pois isso demanda centrifugação. A cultura pode ser

mantida a partir da diluição de um meio fresco após um certo crescimento celular.

Em casos onde há células de aderência e células de adesão em um mesmo tubo,

é necessário separá-las e cultivá-las em duas placas distintas (CASTILHO et al.,

2008).

Figura 1. Ciclo celular e concentração de macromoléculas na célula. [Adaptado

de CASTILHO et al., (2008)].

3.3. Ciclo Celular

Durante o ciclo celular (Figura 1), as células multiplicam proteínas, RNA,

DNA e organelas dando origem a 2 células distintas com o mesmo tamanho, forma

e material genético. O processo de duplicação celular tem duas fases distintas. A

fase S, de síntese, tem duração de 10 a 12 horas e é quando ocorre a duplicação

23

do DNA. A fase M, de mitose, dura menos de 1 hora e é onde há a separação dos

cromossomos e a divisão celular. Esta fase é dividida em prófase, prometáfase,

metáfase, anáfase, telófase e citocinese (CASTILHO et al., 2008).

Além do DNA, a célula também precisa duplicar suas organelas e proteínas,

o que demanda um pouco mais de tempo. Então há mais duas fases, a fase G1,

que ocorre entre a fase M e a fase S, e a fase G2, que ocorre entre a S e a M. Há

também a fase G0, de quiescência, onde a célula deixa de crescer por tempo

indeterminado até que a proliferação ocorra novamente (CASTILHO et al., 2008).

3.4. Crescimento Celular

As células em cultivo apresentam um padrão sigmoide de crescimento, que

reflete a adaptação da colônia, o condicionamento ambiental, a oferta de nutrientes

e, no caso das células de aderência, a superfície disponível para aderência. As

fases de crescimento celular (Figura 2) são divididas em: fase de latência (lag), fase

exponencial (log), plateau e senescência (CASTILHO et al., 2008).

Figura 2. Fases do crescimento celular (CASTILHO et al., 2008).

A fase de latência ocorre logo após a inoculação celular. Durante esse

período não há divisão celular, pois é um período de adaptação onde as células de

aderência estão resintetizando o glicocálice, perdido durante o processo de

tripsinização, se ligando e se espalhando pelo substrato. A duração dessa fase

24

depende da fase de crescimento que as células estavam na cultura anterior e da

concentração celular. Culturas que iniciaram em baixa densidade de células tem a

fase lag prolongada, o que não é desejável (CASTILHO et al., 2008).

A fase de crescimento exponencial (log) é quando a célula está em sua

máxima atividade de proliferação e a taxa de divisão celular varia entre 90 a 100%.

É o melhor momento para estudar a função celular, pois as células se encontram

em seu melhor estado fisiológico. A duração da fase log depende da concentração

inicial, taxa de crescimento celular, oferta de nutrientes a acúmulo de fatores de

inibição. O final da fase log das células de aderência coincide com a confluência,

ou seja, quando as células já ocupam toda a superfície da placa de cultivo

(CASTILHO et al., 2008).

Durante a fase de plateau, o crescimento celular é reduzido devido a redução

da oferta de nutrientes e aumento no acúmulo de metabólitos inibitórios. A taxa de

crescimento se equilibra com a taxa de morte celular e a taxa de divisão é reduzida

para 10%. Essa fase pode ser prolongada caso o meio seja substituído por um meio

novo, porém este é o período onde as células estão mais vulneráveis à lesões

(CASTILHO et al., 2008).

A fase estacionária (plateau) é seguida da fase de senescência, onde a

morte celular não é compensada pela proliferação. A morte celular pode ocorrer

tanto por necrose como por apoptose. A necrose é resultado de uma lesão

irreversível e perda de homeostase. Já a apoptose ocorre através da ativação de

uma cascata de componentes celulares que é controlada internamente, sem que

haja mediadores inflamatórios e lesão na membrana celular (CASTILHO et al.,

2008).

Durante o cultivo in vitro, qualquer alteração no ambiente e no meio pode

levar à morte celular. Qualquer célula que passe por um estresse muito grande,

como contato com altas concentrações de toxinas, grandes mudanças de pH e

fortes agitações por exemplo, pode sofrer necrose. Uma vez que o estresse é

grande e repentino, não há tempo para haver uma resposta celular e,

consequentemente, a morte acontece instantaneamente. Em um estresse

intermediário a célula pode sofrer lesão, mas sem morte instantânea, pois há tempo

de ativar o mecanismo de morte programada (apoptose). Já em estresse baixo, há

25

a produção de proteínas de choque térmico (HSPs), permitindo a viabilidade da

célula até que o estímulo seja removido (CASTILHO et al., 2008).

3.5. Influência do Ambiente

Para cultivar células in vitro, é necessário ter um meio de cultivo que se

aproxime do meio in vivo em relação à temperatura, concentração de oxigênio e

gás carbônico, pH, osmolaridade e oferta de nutrientes (CASTILHO et al., 2008;

FRESHNEY, 2010)

O meio é um dos fatores mais importantes para o cultivo celular, pois sua

função é controlar o pH e a osmolaridade, além de fornecer energia e elementos

essenciais para o crescimento celular. Quando esses requisitos não são atendidos,

a célula sofre apoptose. O soro fetal bovino, por exemplo, é um elemento do meio

de cultura rico em proteínas, que estimula o transporte de glicose, fosfato e

aminoácidos, além de aumentar a permeabilidade das membranas. É muito

utilizado devido à sua baixa concentração de imunoglobulinas e altas quantidades

de fatores de crescimento. Além disso, o soro fetal bovino possui propriedades

antioxidantes, antitóxicas e antiproteolíticas e protege contra danos mecânicos,

porém seu custo é muito alto (CASTILHO et al., 2008).

O ambiente da placa de cultivo deve ser o mais semelhante ao in vivo o

possível, pois o crescimento celular é muito dependente de fatores como pH,

temperatura, osmolaridade, concentração gasosa (O2 e CO2), substrato de

superfície disponível e condição das células em cultivo (FRESHNEY, 2010).

O controle do pH é essencial para o cultivo celular in vitro, sendo que, grande

parte das células animais se proliferam em pH entre 7,4 e 7,7. Para controlar o pH

é comum o uso do Vermelho fenol, um indicador de pH de coloração rosa a um pH

7,8, vermelho a 7,4, laranja a 7,0 e amarelo a 6,5 (CASTILHO et al., 2008).

O meio de cultura deve ser tamponado para compensar o CO2 e o ácido

lático proveniente do metabolismo da glicose. A maioria dos meios de cultura são

gaseificados adequadamente com CO2 em equilíbrio com NaHCO3. Cada meio

demanda uma concentração diferente de CO2 para manter seu pH e osmolaridade

e, em geral, as estufas são controladas com CO2 entre 5 a 10% (CASTILHO et al.,

2008).

26

As linhagens celulares apresentam uma ampla faixa de tolerância à pressão

osmótica, sendo ela de 260 a 320 mOsm/kg. No laboratório, é importante monitorar

a osmolaridade regularmente, pois ela pode ser alterada devido à adição de

soluções salinas, suplementos, fármacos, hormônios, agentes tampões ou até

mesmo através de transformações metabólicas. Outro fator que pode alterar a

pressão osmótica é o próprio frasco de cultivo, que não é selado para permitir a

troca gasosa entre o meio e o ambiente. Por isso, para evitar variações de

osmolaridade durante a cultura, a umidade relativa deve ser mantida próxima à

saturação (CASTILHO et al., 2008).

A temperatura tem uma função muito importante no cultivo celular, pois

influencia no crescimento celular e na solubilidade de vários componentes do meio

de cultura, como por exemplo o O2 e CO2, que apresentam baixa solubilidade. Por

isso, é fundamental manter as estufas a uma temperatura de 35 a 38,5ºC

(CASTILHO et al., 2008).

Dos componentes gasosos, o O2 e o CO2, são os que apresentam maior

importância e devem ser monitorados constantemente. A maioria das células

necessitam de O2 a uma concentração de 30 a 60%, o que pode ser controlado a

partir da gaseificação da superfície, borbulhamento de gás, difusão através das

membranas, aumento da pressão de O2 e pressão atmosférica (CASTILHO et al.,

2008).

4. ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS 4.1. Criopreservação

A criopreservação é uma técnica para preservar o material genético e é

classificada, em congelamento lento, congelamento rápido e vitrificação, de acordo

com a variação de temperatura e quantidade de crioprotetor utilizado. Por meio

desta técnica, as células podem ser armazenadas por longos períodos em

nitrogênio líquido, mantendo suas propriedades biológicas após o

descongelamento (PEREIRA et al., 2014). É importante lembrar que a vitrificação

pode causar danos às células devido às altas concentrações de crioprotetor. Da

mesma forma, o congelamento lento pode desidratar a célula de maneira excessiva

27

em consequência à exposição da célula a uma solução muito concentrada em

eletrólitos (CETINKAYA; ARAT, 2011).

No nitrogênio líquido, as células apresentam um nível de energia cinética

muito baixo ou quase nulo, o que impede os movimentos celulares e permitem o

armazenamento de um tecido viável por muitos anos. Essa técnica evita que a

célula apresente alterações em sua morfologia, função, taxa de crescimento e

cariótipo e, após o descongelamento, é possível realizar vários cultivos celulares.

Outra grande vantagem da criopreservação é a redução do risco de se perder uma

amostra por contaminação microbiológica ou celular, ou por falhas nas estufas

(CASTILHO et al., 2008).

Para congelar, as células precisam estar em crescimento celular ativo,

viabilidade acima de 90% e livre de contaminantes. O meio de congelamento é

composto por 90% de FCS e 10% de crioprotetor (KEEFER et al., 2002). A adição

de crioprotetores como o DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol, ao meio de

congelamento é importante, pois a baixa temperatura leva à formação de cristais

de gelo que lesionam a membrana celular, causando morte celular. Os

crioprotetores alteram a permeabilidade da membrana, permitindo a saída de água

durante o resfriamento. Essa desidratação causada na célula reduz o ponto de

congelamento para -5ºC e -15ºC e impede a formação de cristais de gelo no interior

da célula (CASTILHO et al., 2008).

Geralmente, após a segunda passagem as células são ressuspensas e em

seguida realiza-se a contagem celular na Câmara de Neubauer. O material deve

ser armazenado em palhetas de 0,25 mL ou criotubos devidamente identificados,

a uma concentração de 5 x 105 células/mL. É importante conservar o material em

compartimentos bem enumerados e especificados (KEEFER et al., 2002). É

indicado utilizar a técnica de congelamento lento, em torno de 1ºC por minuto, em

um freezer -80ºC. Após essa etapa, as células podem ser transferidas para o

nitrogênio líquido, onde ficam armazenadas a uma temperatura de -196ºC. O

descongelamento do criotubo deve ser em banho maria a 37ºC durante 5 minutos

(CASTILHO et al., 2008). As células armazenadas em palhetas são descongeladas

por meio de uma leve agitação em banho maria a 37ºC (STEINBERG et al., 1999).

Caso opte-se pela vitrificação, o pellet de 2 x 105 células/mL deve ser

suspendido, durante 5 minutos, em 50 μL de solução de equilíbrio, contendo 20%

28

de etilenoglicol, PBS e FCS. Após isso, a solução deve ser misturada, durante 1

minuto, a 200 μL de meio de vitrificação, composto por 40% de etilenoglicol, 18%

de Ficoll 400, 0,4 M de sacarose, PBS e FCS. As células podem, então, serem

colocadas em palhetas de 0,5 mL e mergulhadas imeditamente no nitrogênio

líquido, a uma temperatura de -196ºC. Após o descongelamento rápido em banho

maria a 37ºC, as células são ressuspensas em meio contendo sacarose, PBS e

FCS (CETINKAYA; ARAT, 2011).

5. SINCRONIZAÇÃO DA CÉLULA PARA A TN

No momento da transferência nuclear, as células devem estar sincronizadas

na fase G0 do ciclo de celular e isso é realizado utilizando soro privação ou

confluência celular (CIBELLI et al., 2014). 30 minutos antes da TN, as células são

preparadas por tripsinização e lavagem em SOF tamponado com HEPES

(PEREIRA et al., 2014).

Experimentos mostram que a soro privação tem sido utilizada por muito

tempo como método de escolha para sincronizar o núcleo das células doadoras.

Porém, a soro privação induz algumas células à apoptose e alguns cientistas

acreditam que isso pode interferir no sucesso da transferência nuclear (MIRANDA

et al., 2009).

A soro privação eleva a eficiência do blastocisto proveniente de fibroblastos

fetais (43%), mas não de fibroblastos adultos (28%). Em células adultas, não

aumenta as taxas de desenvolvimento de blastocistos. Porém, em células fetais,

eleva relativamente o desenvolvimento de embriões até a fase de blastocisto (HILL

et al., 2000).

6. RELATÓRIO DE ESTÁGIO 6.1. Local

O estágio curricular foi realizado sob supervisão do Médico Veterinário

Henrique Bayão na empresa GENEAL – Genética e Biotecnologia Animal,

localizada na Rodovia BR 050, Km 184, Uberaba – Minas Gerais, e teve a duração

de 3 meses, com início em 01/08/2016 e término em 04/11/2016, totalizando 580

horas.

29

A empresa foi fundada pela Brasif em 2009 e oferece os serviços de

fertilização in Vitro (FIV), clonagem de bovinos pela técnica de transferência nuclear

(TN) e preservação de material genético. A FIV auxilia a redução do intervalo entre

as gerações, além de proporcionar um maior número de descendentes de animais

geneticamente superiores e otimizar a utilização da genética tanto da fêmea como

do macho. A clonagem potencializa os programas de melhoramento genético e

permite a regeneração de animais mortos ou acidentados. A preservação do banco

genético inclui coleta de material, isolamento e congelamento de células em

botijões de nitrogênio.

Junto à GENEAL – Genética e Biotecnologia Animal, encontra-se a GENEAL

– Diagnóstico, responsável por receber amostras de DNA e realizar testes de

paternidade, maternidade e genotipagem.

A Fazenda Santa Elza, possui 300 hectares e é propriedade da GENEAL. É

subdividida em escritório, lavanderia, curral, UTI neonatal, baias e piquetes. As

vacas são separadas em lotes de enfermaria, leite, pré parto, prenhes,

protocoladas, vazias e descarte. O laboratório é dividido em FIV, isolamento de

células, clonagem, micromanipulação e preparação de meios.

6.2. Atividades Realizadas

As atividades foram separadas em duas etapas distintas, sendo os dois

primeiros meses na Fazenda Santa Elza e um mês no Laboratório. Os

procedimentos acompanhados estão listados nos quadros 1 e 2 abaixo e não

devem ser descritos detalhadamente em respeito ao sigilo da empresa.

Além das tarefas específicas, também foi possível acompanhar diariamente

a rotina da Fazenda e do Laboratório, o que inclui alimentação dos bezerros, trato

dos animais, limpeza das baias, pesagem, vermifugação e vacinação, manejo,

exame físico completo, realização de curativos, análises laboratoriais (volume

globular, proteína plasmática total, hemograma, leucograma e análises

bioquímicas), avaliação do colostro e seu armazenamento, esterilização dos

materiais do campo e do laboratório, limpeza dos laboratórios e controle das

estufas.

30

Quadro 1. Atividades realizadas na Fazenda Santa Elza (Geneal - Uberaba - MG)

durante os meses de agosto e setembro de 2016

Atividade Quantidade Atendimento neonatal 32

Aspiração folicular

Coleta de biópsia 5

Coleta de pelo para análise de DNA 52

Diagnóstico de gestação precoce 114

Eutanásia

Herniorrafia 5

Necrópsia

Parto - Cesariana 35

Parto - Normal 4

Parto – Manobra obstétrica 8

Protocolo de sincronização de vacas para

TE

176

Teste de brucelose 231

Transferência de embrião 114

Transfusão sanguínea 1

Quadro 2. Atividades realizadas no Laboratório da Geneal (Uberaba - MG)

durante o mês de outubro de 2016

Atividade Quantidade Análise bioquímica de amostras de sangue 12

Cultivo de células para análise de DNA 21

Esterilização e lavagem de materiais 4

Fertilização in vitro (FIV) 16

Hemograma 12

Isolamento celular 6

31

6.3. Conclusão

O estágio realizado na GENEAL proporcionou um conhecimento completo

sobre a clonagem animal, desde a coleta do material até a obtenção do produto

final, que é o bezerro saudável, mostrando assim que o sucesso da clonagem é

verdadeiro e promissor. As atividades também foram de grande relevância para o

meu aprimoramento profissional e pessoal, pois me trouxeram sabedoria,

confiança, alegria e certeza de que eu quero exercer a Medicina Veterinária como

profissão.

32

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Associação Brasileira dos Criadores de Zebu. Disponível em: <

http://www.abcz.org.br/Exposicoes/Conteudo/20691-ABCZ registra primeiro clone zebu%C3%ADno >. Acesso em: 14 de Novembro de 2016.

BERNSTEIN, E. F.; CHEN, Y. Q.; KOPP, J. B.; FISHER, L.; BROWN, D. B.;

HAHN, P. J.; ROBEY, F. A.; LAKKAKORPI, J.; UITTO, J. Long-Term Sun

Exposure Alters the Collagen of Thepapillary Dermis. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 34, n. 2, p. 209–218, 1996. Disponível em:

<http://www.jaad.org/article/S0190962296801149/fulltext>. Acesso em: 8 de Novembro de 2016.

BRIGGS, R.; KING, T. J. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into

Enucleated Frogs’ Eggs*. Proceedings of the National Academy of Sciences,

v. 38, n. 5, p. 455–463, 1952. Disponível em: <http://dx.doi.org/>. Acesso em: 14

de Novembro de 2016.

CASTILHO, L.; MORAES, A.; AUGUSTO, E.; BUTLER, M. Animal cell technology: from biopharmaceuticals to gene therapy. First ed. New York: Taylor & Francis Group, 2008.

CETINKAYA, G.; ARAT, S. Cryopreservation of Cartilage Cell and Tissue for

Biobanking. Cryobiology, v. 63, n. 3, p. 292–297, 2011. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/j.cryobiol.2011.09.143>. Acesso em: 14 de Novembro

de 2016.

CIBELLI, J.; GURDON, J.; WILMUT, I.; JAENISCH, R.; LANZA, R.; WEST, M. D.;

CAMPBELL, K. H. S. Principles of cloning. Segunda ed. San Diego: Elsevier, 2014.

DEMEESTERE, I.; DELBAERE, A.; GERVY, C.; VAN DEN BERGH, M.;

DEVREKER, F.; ENGLERT, Y. Effect of Preantral Follicle Isolation Technique on

in-Vitro Follicular Growth, Oocyte Maturation and Embryo Development in Mice.

Human Reproduction, v. 17, n. 8, p. 2152–2159, 2002. Disponível em:

<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12151451>. Acesso em: 15 de Novembro de 2016.

33

EMBRAPA. Bezerra Brasília é o novo clone da Embrapa. 22 de Novembro de

2016. Disponível em: <https://www.embrapa.br/cerrados/busca-de-noticias/-

/noticia/1491024/bezerra-brasilia-e-o-novo-clone-da-embrapa>. Acesso em: 22 de Novembro de 2016.

FRESHNEY, I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 6a. ed. New Jersey: Wiley-Liss, 2010.

HEUSER, J. Three-Dimensional Visualization of Coated Vesicle Formation in

Fibroblasts. 1980. Disponível em:

<http://jcb.rupress.org/content/84/3/560.abstract>. Acesso em: 15 de Novembro de 2016.

HILL, J. R.; WINGER, Q. A.; LONG, C. R.; LOONEY, C. R.; THOMPSON, J. A.;

WESTHUSIN, M. E. Development Rates of Male Bovine Nuclear Transfer

Embryos Derived from Adult and Fetal Cells. Biology of Reproduction, n. 62,

2000. Disponível em: <http://www.biolreprod.org/content/62/5/1135.full>. Acesso em: 18 de Julho de 2016.

KATO, Y.; TSUNODA, Y. Role of the Donor Nuclei in Cloning Efficiency: Can the

Ooplasm Reprogram Any Nucleus? The International Journal of Developmental Biology, v. 54, n. 11–12, p. 1623–1629, 2010. Disponível em:

<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21404183>. Acesso em: 8 de Novembro

de 2016.

KEEFER, C. L.; KEYSTON, R.; LAZARIS, A.; BHATIA, B.; BEGIN, I.; BILODEAU,

A. S.; ZHOU, F. J.; KAFIDI, N.; WANG, B.; BALDASSARRE, H.; KARATZAS, C.

N. Production of Cloned Goats after Nuclear Transfer Using Adult Somatic Cells.

Biology of Reproduction, v. 66, 2002. Disponível em:

<http://www.biolreprod.org/content/66/1/199.long>. Acesso em: 14 de Novembro de 2016.

KRUMLAUF, R. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical

Approach. Trends in Genetics, v. 3, p. 331–332, 1987. Disponível em:

<http://www.cell.com/article/0168952587902861/fulltext>. Acesso em: 8 de Novembro de 2016.

34

MIRANDA, M. dos S.; BRESSAN, F. F.; ZECCHIN, K. G.; VERCESI, A. E.;

MESQUITA, L. G.; MERIGHE, G. K. F.; KING, W. A.; OHASHI, O. M.; PIMENTEL,

J. R. V.; PERECIN, F.; MEIRELLES, F. V. M. Serum-Starved Apoptotic Fibroblasts

Reduce Blastocyst Production but Enable Development to Term after SCNT in

Cattle. Cloning Stem Cells, v. 11, n. 4, p. 565–573, 2009. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1089/clo.2009.0028>. Acesso em: 8 de Novembro de 2016.

OBACK, B.; WELLS, D. Donor Cells for Nuclear Cloning: Many Are Called, but

Few Are Chosen. Cloning Stem Cells, v. 4, n. 2, p. 147–168, 2002. Disponível

em: <http://dx.doi.org/10.1089/153623002320253328>. Acesso em: 14 de Novembro de 2016.

PEREIRA, A. F.; FREITAS, V. J. F. Clonagem em ruminantes: progresso e

perspectivas. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 33, n. 3, 2009.

Disponível em: <http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/download/pag118-128.pdf>. Acesso em: 14 de Novembro de 2016.

PEREIRA, A. L.; SANTOS, M. L. T.; BORGES, A. A.; NETA, L. A. Q.; SANTOS,

M. V. O.; FEITOSA, A. K. N. Isolamento e caracterização de células doadora

derivadas da pele para a transferência nuclear. Acta Veterinária Brasílica, v. 8,

2014. Disponível em:

<http://periodicos.ufersa.edu.br/revistas/index.php/acta/article/view/3947>. Acesso em: 14 de Novembro de 2016.

ROSSETTO, R.; LIMA, I. M. T.; SARAIVA, M. V. A.; VERDE, I. B. L.; SALES, E.

T.; FIGUEIREDO, J. R. Avanços no isolamento e sistemas de cultivo de folículos

pré-antrais. Acta Veterinária Brasílica, v. 5, n. 1, 2011. Disponível em:

<http://periodicos.ufersa.edu.br/revistas/index.php/acta/article/view/1964/4774>. Acesso em: 15 de Novembro de 2016.

SILVA, C. G.; MARTINS, C. F.; CARDOSO, T. C.; CUNHA, E. R.; BESSLER, H.

C.; MARTINS, G. H. L.; PIVATO, I.; BÁO, S. N. Production of Bovine Embryos and

Calves Cloned by Nuclear Transfer Using Mesenchymal Stem Cells from Amniotic

Fluid and Adipose Tissue. Cellular Reprogramming, v. 18, n. 2, 2016. Disponível

em: <http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/cell.2015.0064>. Acesso em: 5 de Dezembro de 2016.

35

STEINBERG, P.; FISCHER, T.; KIULIES, S.; BIEFANG, K.; PLATT, K.-L.;

OESCH, F.; BÖTTGER, T.; BULITTA, C.; KEMPF, P.; HENGSTLER, J. Drug

Metabolizing Capacity of Cryopreserved Human, Rat, and Mouse Liver

Parenchymal Cells in Suspension. 1999. Disponível em:

<http://dmd.aspetjournals.org/content/27/12/1415.long>. Acesso em: 24 de

Novembro de 2016.