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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

MARIANA COUTO DA COSTA

INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO POR BIOAUTOGRAFIA DA Piper sp

(PIPERACEAE)

Itajaí (SC)

2013

MARIANA COUTO DA COSTA

INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO POR BIOAUTOGRAFIA DA Piper sp

(PIPERACEAE)

Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de farmacêutico pela Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde.

Orientadora: Prof. Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt Co-orientadora: Prof. Dra. Angela Malheiros

Itajaí (SC)

Abril de 2013.

Dedico este trabalho a meus pais, que me transmitiram os valores mais importantes: a bondade, o perdão, a honestidade, a persistência, a perseverança, a paciência e principalmente a Fé.

Que me ensinaram a trilhar o meu próprio caminho. Vocês são a base sobre a qual o meu caráter foi construído.

E por isso eu só posso dizer: Obrigada!

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me concedido a vida, por me dar

força, me iluminar na caminhada e por estar comigo em todos os momentos da

minha vida.

Aos meus pais, Antonio Xavier da Costa e Elisete Couto da Costa, que

sonharam com a minha vitória e torceram por mim desde que nasci.

Acompanharam-me com carinho, zelo e estímulo em mais uma etapa da minha vida.

Não mediram esforços para que eu chegasse até aqui, sempre me apoiando e me

incentivando em meus momentos difíceis, me ensinando a ter persistência diante

dos obstáculos e vencendo junto comigo. Deus conhece as nossas dificuldades!

Aos meus irmãos George Luiz e Vitória Maria, ao meu namorado Flávio e

toda a minha família por estarem sempre comigo, me ajudando, apoiando em todos

os momentos, sempre com a palavra certa, me fazendo sorrir e acreditar que tudo

isso vale a pena, e por aturarem as muitas crises de mal humor.

Agradeço as minhas orientadoras Professoras Dra. Christiane Meyre da Silva

Bittencourt e Angela Malheiros, por serem exemplos, pelo incentivo, paciência e

oportunidade, por me guiarem neste caminho. Com vocês aprendi muito e com

certeza será também em vocês que me espelharei na construção da minha carreira.

Meus sinceros agradecimentos.

Ao Professor Dr. Alexandre Bella Cruz e Theodoro Maciel Wagner, o Theo,

pela participação nesta Banca, trazendo contribuições importantes para o

crescimento e concretização do nosso trabalho.

A Professora Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva pelas dicas e principalmente

pela ajuda na formatação deste trabalho, sempre atenciosa estava disposta a nos

ajudar.

Aos meus grandes amigos Alexandra, Ingrid, Marcelo e Simone, que estavam

sempre ao meu lado, companheiros nos momentos de alegria, raiva e também

tristeza, compartilhando sorrisos, abraços, paródias, choros (muitos choros). Nós

construímos uma amizade verdadeira que ficará sempre em meu coração!

Não posso esquecer também do meu companheiro de dupla Precipício, da

nossa Banda, dos fãs e toda equipe, que estavam comigo desde o início da nossa

carreira, compartilhando os primeiros momentos de fama até o auge do sucesso...

Zé Barranko e Precipício Forever!

A todos os demais amigos e professores do Curso de Farmácia não

mencionados aqui, mas que com certeza conquistaram um espaço importante no

meu coração.

A todos que de uma maneira ou de outra, contribuíram direta ou indiretamente

na concretização deste trabalho.

Muita Obrigada!

“Não tenhas medo, pois eu estou com você.” (Is 41,10).

INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO POR BIOAUTOGRAFIA DA Piper sp

(PIPERACEAE)

Mariana Couto da COSTA Orientadora: Prof. Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt Co-orientadora: Prof. Dra. Angela Malheiros Defesa em: Abril de 2013 O gênero Piper é o mais importante da família Piperaceae com ampla distribuição nas regiões temperadas de ambos os hemisférios. Esta família caracteriza-se por apresentar em sua composição uma variedade de metabólitos secundários, tais como alcaloides, flavonoides, isobutilamidas, fenilpropanoides, terpenos, entre outros. São utilizadas no tratamento de muitas patologias, entre as quais estão infecções microbianas, problemas do trato respiratório, do aparelho digestivo e inflamações. Considerando as provas científicas evidenciadas em estudos anteriores, este trabalho objetivou o isolamento dos compostos majoritários presentes nos extratos etanólicos dos caules e folhas de Piper sp, a identificação dos compostos isolados, a obtenção do óleo essencial das folhas por arraste a vapor d’água, a caracterização dos óleos por cromatografia gasosa acoplada a espectro de massas e por fim a avaliação do potencial antimicrobiano através de bioautografia frente a cepa de Staphylococcus aureus.Para obtenção dos extratos, a planta coletada foi seca, separada, pesada e posteriormente submetida a maceração com etanol por 7 dias ao abrigo da luz. O isolamento deu-se da cromatografia em coluna e cromatografia em camada delgada. A identificação dos compostos isolados ocorreu por RMN de 1H, 13C e Dept, onde os dados obtidos foram comparados com a literatura. A obtenção do óleo essencial ocorreu com o auxílio do aparato Clevenger, tendo como líquido extrator a água. A caracterização dos óleos essenciais ocorreu com o cromatografo gasoso acoplado a especto de massas (CG/EM Shimadzu QP2010 S). Para a realização da bioautografia foi necessário as cromatoplacas com óleo essencial eluidas e secas, o meio de cultivo com a suspensão bacteriana, bem como, o reagente TCC (2 mg/mL).A investigação fitoquímica possibilitou o isolamento dos compostos 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo e 4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolideo. O óleo essencial obtido através das folhas secas caracterizado por CG/EM, evidenciou a presença de 36 compostos, sendo os majoritários γ-elemeno, E-Nerolidol e Espatulenol. A composição química do óleo foi comparada com a literatura e tratam-se de compostos de natureza sesquiterpênica, alguns destes presentes em outras espécies deste gênero apresentaram atividade biológica frente a diversas patologias, destacando-se a atividade antimicrobina. A bioautografia visou avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos, frente a cepas de S. aureus, esta atividade pode ser observada através do aparecimento de alos claros nas placas onde foram aplicadas as amostra do óleo essencial, demonstrando assim, uma atividade significativa de inibição do crescimento microbiano. Esta significativa atividade antimicrobiana deve-se ao fato da preseça de compostos que fazem parte do óleo essencial de Piper sp exercerem atividade inibitória do crescimento microbiano frente a diversos micro-organismos, como já descrito na literatura, dentre estes compostos está o E-Nerolidol, apresentando-se como um composto majoritário.

Palavras-chave: Piper sp, butenolídeos, óleo essencial, sesquiterpenos.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Partes aéreas (caules e folhas) de Piper sp............................................ 43

Figura 2 - Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com os

caules de Piper sp....................................................................................................

46

Figura 3 - Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com as

folhas de Piper sp.....................................................................................................

48

Figura 4 - Fluxograma dos rendimentos obtidos através da maceração das

partes aéreas (Caules e Folhas) de Piper sp...........................................................

53

Figura 5 - a) Cromatograma do extrato etanólico das folhas de Piper sp. em

335nm. b) Cromatograma do extrato etanólico dos caules de Piper sp. em 335nm

54

Figura 6 - a) Cromatograma do extrato etanólico das folhas de Piper sp em

285nm. b) Cromatograma do extrato etanólico dos caules de Piper sp e 285nm....

55

Figura 7 - Fluxograma da obtenção dos compostos HFC1 e HFC2 através das

folhas de Piper sp.....................................................................................................

56

Figura 8 - Fluxograma da obtenção dos compostos HFC1 e HFC2 através dos

extratos de caules e folhas de Piper sp................................................................

56

Figura 9 - Cromatograma e Perfil no UV do Composto HFC1 – 285 nm................ 57

Figura 10 - Estrutura do composto do composto 4,6-dimetóxi-5-Z-

fenilbutenolideo (HFC1)...........................................................................................

57

Figura 11 - Espectro de RMN-1H (300 MHz, Acetona D6) do HFC1........................ 59

Figura 12 - Espectro de RMN-13C (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC1...................... 59

Figura 13 - Espectro de RMN-13C/DEPT (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC1........... 60

Figura 14 - Cromatograma e Perfil no UV do Composto HFC2 – 285 nm............... 62

Figura 15 - Estrutura do composto do composto 4,6-dimetóxi-5-E-

fenilbutenolideo (HFC2)............................................................................................

62

Figura 16- Espectro de RMN-1H (300 MHz, Acetona D6) do HFC2......................... 64

Figura 17 - Espectro de RMN-13C (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC2...................... 64

Figura 18 - Espectro de 13C/DEPT (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC2.................. 65

Figura 19 - Cromatograma do óleo essencial de Pipersp....................................... 66

Figura 20 - Espectro de massa do composto γ-elemene........................................ 68

Figura 21 - Estrutura química do composto γ-elemene........................................... 68

Figura 22 - Espectro de massa do composto E-Nerolidol....................................... 69

Figura 23 - Estrutura química do composto E-Nerolidol.......................................... 69

Figura 24 - Espectro de massa do composto Espatulenol...................................... 70

Figura 25 - Estrutura química do composto Espatulenol......................................... 70

Figura 26 - Bioautografia realizada com o óleo essencial de Piper sp.................... 71

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição química do óleo essencial de diferentes espécies do

gênero Piper e atividade biológica....................................................................

39

Tabela 2 - Porcentagem dos constituintes majoritários do óleo essencial das

folhas de Piper malacophyllum.................................................................

40

Tabela 3 - Porcentagem dos constituintes majoritários do óleo essencial das

folhas de Piper malacophyllum. ............................................................................

41

Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos de RMN-1H e 13C para os

compostos HFC1 e HFC2 e dados da literatura para os compostos 1 (4,6-

dimetóxi-5-Z-fenilbutenolídeo) e 2 (4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolídeo).............

61

Tabela 5 - Composição química do óleo essencial de Piper sp analisado por

CG/EM............................................................................................................

67

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt – Acetato de etila

Act – Acetona

Acetona-D6- Acetona Deuterada

CC – Cromatografia em Coluna

CC1 – Coluna cromatográfica 1









CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CG – Cromatografia Gasosa

CG/EM – Cromatografia Gasosa acoplada a Espectro de Massas

CL50– Concentração Letal Média

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DCM – Diclorometano

DL50– Dose Letal Média

EtOH - Etanol

EM – Espectro de Massas

HFC1 – 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo

HFC2 – 4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolideo

Hex – Hexano

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

MRSA - Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina

MeOH - Metanol

RMA 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

TCC – Cloreto de 2 3,3 – trifenil – tetrazólico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 21

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 23

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 23

2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 23

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................... 25

3.1 Plantas Medicinais: Aspectos Gerais ..................................................... 25

3.2 Doenças infecciosas - A busca por novos antimicrobianos ................ 26

3.3 Óleos Essenciais ...................................................................................... 29

3.3.1 Métodos de extração de óleos essenciais .......................................... 31

3.3.2 Métodos caracterização de óleos essenciais ..................................... 32

3.4 Família Piperaceae e Gênero Piper ......................................................... 34

3.4.1 Gênero Piper - Composição química e atividade biológica dos óleos

essenciais. ...................................................................................................... 35

4 METODOLOGIA ........................................................................................... 43

4.1 Materiais .................................................................................................... 43

4.1.1 Material vegetal ..................................................................................... 43

4.1.2 Materiais e reagentes ............................................................................ 43

4.1.3 Equipamentos ........................................................................................ 44

4.2 Métodos ..................................................................................................... 45

4.2.1 Obtenção do extrato de Piper sp ......................................................... 45

4.2.2 Purificação dos extratos das partes aéreas de Piper sp ................... 45

4.2.3 Análise por CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......... 49

4.2.4 Obtenção dos óleos essenciais ........................................................... 49

4.2.4.1 Partição Líquido-Líquido – Piper sp ................................................. 50

4.2.5 Análise do óleo essencial por CG/EM ................................................. 50

4.2.6 Atividade antimicrobiana – Bioutografia ............................................. 51

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 53

5.1 Extração e Purificação ............................................................................. 53

5.1.1 Identificação do composto HFC1 ......................................................... 57

5.1.2 Identificação do composto HFC2 ......................................................... 61

5.2 Obtenção do óleo essencial .................................................................... 65

5.3 Atividade antimicrobiana – Bioutografia ................................................ 71

6 CONCLUSÃO ............................................................................................... 75

REFERÊNCIAS..................................................................................................77

21

1 INTRODUÇÃO

A importância e as contribuições das plantas medicinais para o tratamento e

a manutenção da saúde estão fora de qualquer controvérsia. Há uma abundância de

provas científicas de que as plantas são boas fontes de compostos bioativos que

podem contribuir no desenvolvimento de novos fármacos para patologias que

atualmente não são tratadas de maneira eficiente (GURIB-FAKIM, 2006; WAGNER,

2009).

As florestas tropicais são consideradas frequentemente como o mais

promissor habitat para a descoberta de novos medicamentos devido a alta

biodiversidade existente. Estima-se que existam aproximadamente cerca de 250 mil

espécies de plantas no globo terrestre e que mais da metade destas está

concentrada nestas florestas. Diante desta realidade há o interesse cada vez maior

da indústria farmacêutica pela descoberta de novos medicamentos a partir dos

produtos naturais (GURIB-FAKIM, 2006; YUNES; CECHINEL FILHO, 2009).

As plantas medicinais produzem diversos metabólitos secundários, dentre

eles estão alcaloides, esteroides, flavonoides e terpenos, que despertam grande

interesse, não só pelas atividades biológicas produzidas em respostas a estímulos

do meio ambiente, mas pela imensa atividade farmacológica (ALVES, 2010). Por

este fato, a pesquisa fitoquímica tem como objetivo conhecer os constituintes

químicos de espécies vegetais, para que assim possam ser investigados como um

possível potencial terapêutico (FOGLIO et al., 2003).

A pesquisa fitoquímica, nas últimas décadas, tem direcionado à busca por

antimicrobianos de origem vegetal, devido à resistência aos antimicrobianos

tradicionais desenvolvida por alguns micro-organismos. Muitas plantas podem servir

como alternativa terapêutica pela atividade antimicrobiana comumente associada

aos metabólitos secundários presentes em extratos, bem como seus óleos

essenciais. Também é promissora a utilização destes óleos como aditivos

alimentares, para retardar a deterioração dos alimentos ou para evitar o crescimento

de patógenos alimentares e micro-organismos resistentes aos antibióticos (SANTOS

et al., 2012).

Dentre as plantas medicinais de interesse terapêutico encontra-se as da

família Piperaceae, uma família tropical e subtropical, que ocorre em ambos os

22

hemisférios terrestres, incluindo aproximadamente 4.000 espécies. Diversas

espécies do gênero Piper são amplamente utilizadas na medicina popular em várias

partes do mundo e têm sido relatadas por produzirem compostos com propriedades

biológicas diversas como antimicrobiana, uso em problemas do trato respiratório, do

aparelho digestivo, anti-inflamatória e antileucêmica (LORENZI; MATOS, 2002;

SANTOS et al., 2012).

Estudos realizados em nosso núcleo de pesquisas tem revelado promissora

atividade antibacteriana e antifúngica para diferentes espécies do gênero Piper,

dentre elas esta P. solmsianum, P. aduncum e P. sp. Os extratos, compostos e

óleos essenciais da espécie Piper sp, espécie investigada neste estudo, demonstrou

toxicidades para um pequeno crustáceo, Artemia salina, onde foi considerado

citotóxico em concentrações inferiores a 1000 µg/mL. Apresentou significativa

inibição do crescimento para a bactéria Staphylococcus aureus e para o fungo

Saccharomyces cerevisiae, bem como atividade significativa contra bactérias gram-

positivas, sendo elas Streptococcus pyogenes, S. epidermides, S. saprophyticus e

Bacillus subtilis (CAMPOS et al., 2005, 2007; RIFFEL; SCHMIT, 2010; TOMIO, 2011,

MULLER, 2011).

Considerando a importância biológica das espécies deste gênero, e estudos

anteriores que evidenciam o potencial antimicrobiano da Piper sp, o presente

trabalho objetivou isolar e identificar os compostos majoritários, extrair o óleo

essencial, caracterizá-lo e investigar seu potencial antibacteriano, de forma a

confirmar o uso medicinal.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Investigar a composição química dos extratos e do óleo essencial e avaliar o

potencial antimicrobiano da Piper sp.

2.2 Objetivos Específicos

Obter o extrato etanólico bruto de folhas e caules da Piper sp;

Fracionar o extrato e purificar as substâncias majoritárias através de técnicas

cromatográficas;

Identificar a estrutura química das substâncias purificadas através de

ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono 13 (RMN 1He 13C);

Obter o óleo essencial da Piper sp por destilação por arraste de vapor d’água

em aparato de Clevenger;

Avaliar a composição química do óleo obtido por cromatografia em camada

delgada (CCD) e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

(CG/EM);

Avaliar a atividade antimicrobiana do óleo obtido através de bioautografia,

frente a cepa de Staphylococcus aureus.

25

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Plantas Medicinais: Aspectos Gerais

As plantas medicinais consideradas como aquelas que possuem

propriedades terapêuticas, são amplamente utilizadas na medicina popular contra

várias patologias. Seu uso vem crescendo gradativamente ao longo dos últimos

anos devido a vários fatores, como baixo poder aquisitivo da maioria da população

que procura uma medicina alternativa a menores custos e a busca de terapias não

clássicas. Outro fator é confirmação de eficácia das mesmas, comprovadas em

estudos experimentais, clínicos e pré-clínicos. De acordo com Organização Mundial

da Saúde (OMS), no início da década de 1990, entre 65% e 80% da população, em

países desenvolvidos, já utilizavam plantas medicinais como única fonte de cuidados

básicos de saúde. Sabe-se que 60% dos agentes antitumorais e anti-infecciosos,

atualmente disponíveis ou em estudos clínicos são de origem natural (MALHEIROS

et al., 2010).

O conhecimento e uso das plantas medicinais encontram-se muitas vezes

como único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. As plantas

simbolizam um grande potencial de cura para a maioria da população mundial hoje

em dia. Por isso, é de suma importância conhecer seus componentes químicos, na

tentativa de estabelecer propriedades terapêuticas, aplicação medicinal, possíveis

interferências e efeitos adversos (BARREIRO; BOLZANI, 2009; CRAGG;

NEWMANN, 2012).

Os produtos naturais têm exercido um importante papel ao longo dos anos

para a descoberta de novos fármacos. O número de medicamentos disponíveis na

terapêutica moderna desenvolvida a partir de plantas medicinais é expressivo,

muitos deles são utilizados de forma pura ou associados à outros substâncias

naturais ou sintéticas ou servindo como ponto de partida para novas moléculas mais

ativas e eficazes a partir de sua otimização estrutural (YUNES; CECHINEL FILHO,

2009).

Exemplos de plantas medicinais que a partir da composição química e da

atividade biológicas integraram a terapêutica são os alcaloides vimblastina e

vincristina, extraídos de Catharantus roseus, os quais são amplamente utilizados

26

para o tratamento de linfomas e leucemia infantil. Outro exemplo encontra-se o

diterpeno taxol ou paclitaxel, isolado em 1971 da Taxus brevifolia, constitui uma das

mais promissoras descobertas para a cura do câncer. Os efeitos benéficos dos

extratos de Digitalis purpúrea e D. lanata levaram à descoberta de poderosos

glicosídeos cardíacos ou cartiotônicos, incluindo a digoxina, a digitoxina e o

deslanosídeo (NIERO et al., 2010). O alcaloide da beladona (Atropa belladonna)

atropina que atua em problemas oculares, antiespasmódico, sedativo e anti-

hipertensivo (GURIB-FAKIM, 2006; GRAGG; NEWMAM, 2009).

Considerado como um detentor de uma das maiores biodiversidades do

planeta e fonte de substâncias biologicamente ativas, o Brasil vem despertando o

interesse de laboratórios de pesquisas farmacêuticas. Por este fato, a pesquisa e a

descoberta de novos fármacos, além de propiciar o avanço da pesquisa básica

multidisciplinar, contribui também para o desenvolvimento tecnológico nacional,

levando em consideração que muito pouco da flora brasileira é explorada como uma

fonte de substâncias de interesse farmacológico (BARREIRO; BOLZANI, 2009).

O mercado farmacêutico destaca-se dentro da cadeia produtiva, devido a

implantação de muitas empresas inovadoras, capazes de incorporar aos seus

produtos os principais avanços das ciências biomédicas, biológicas e químicas se

destacando como uma das mais rentáveis em escala global. O mercado de

fitoterápicos vem movimentando mundialmente cerca de US$ 21,7 bilhões,

representando cerca de 15% do capital da indústria farmacêutica mundial, e avança

em direção ao tratamento de diversas doenças (NIERO, 2009).

Portanto, é imenso o desafio das Universidades e/ou Centros de Pesquisas,

do Governo e das Indústrias Farmacêuticas nacionais no sentido de transformar o

patrimônio natural em riqueza de compostos bioativos para medicina, gerando

matéria-prima para o desenvolvimento de novos medicamentos capazes de

combater as mais diversas doenças que afligem os seres humanos (MALHEIROS et

al., 2010).

3.2 Doenças infecciosas - A busca por novos antimicrobianos

Dentre as doenças que afligem a sociedade, destacam-se as de caráter

infeccioso que vem aumentando no mundo em um ritmo acelerado, algumas destas

ressurgindo como emergentes. Vários são os fatores relacionados com essa

27

incidência, tais como viagens e comércio (especialmente alimentos), novas práticas

agrícolas, comportamento sexual alterado, intervenções médicas e uso excessivo de

antimicrobianos. Em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento as doenças

infecciosas são responsáveis por mais de 25% de todas as mortes (MIMS et al.,

2005).

As substâncias antibióticas representam talvez o maior avanço na

farmacoterapia, entretanto o uso indiscriminado destes antimicrobianos tem

provocado uma série de desequilíbrios e resistência microbiana, fazendo com que

se busquem novos antimicrobianos que sejam eficazes. A falta de efetividade da

terapia antimicrobiana pode estar relacionada a fatores como: escolha inapropriada

ou não especificidade do fármaco escolhido, idade e estado imunitário do paciente, e

não adesão ao tratamento, além da falta de conhecimento adequado dos conceitos

de farmacocinética e farmacodinâmica de cada fármaco na escolha terapêutica, bem

como falta de orientação ao paciente (ROSSI; ANDREAZZI, 2005; ANTUNES et al.,

2006).

Há um aumento significativo na frequência do isolamento de bactérias que

eram reconhecidamente sensíveis aos fármacos usados na clínica, mas que se

apresentam agora resistentes a todos ou quase todos os fármacos disponíveis no

mercado, como ocorre com várias bactérias multirresistentes. Muitas linhagens

multirresistentes de Staphylococcus aureus - MRSA (Methicillin Resistant

Staphylococcus aureus), por exemplo, reconhecido patógeno associado à infecção

hospitalar ou adquirida na comunidade, já eram sensíveis apenas ao tratamento com

vancomicina, mostrando-se resistentes aos aminoglicosídeos, β-lactâmicos,

macrolídeos, tetraciclinas, quinolonas e outros quimioterápicos (SALYERS;

CUEVAS, 1997, CHARTONE-SOUZA,1998 apud FERRONATTO et al., 2007;

COIMBRA et al., 2012).

O problema da resistência tornou-se mais grave devido às dificuldades para

a descoberta e o lançamento de novos antimicrobianos no mercado. Na busca de

novos antimicrobianos deve-se enfatizar aqueles de origem vegetal, uma vez que o

Brasil apresenta a maior biodiversidade do planeta e que muitas plantas já vêm

sendo vastamente usadas e testadas há centenas de anos com as mais diversas

finalidades por populações do mundo inteiro (SALYERS; CUEVAS, 1997,

CHARTONE-SOUZA,1998 apud FERRONATTO et al., 2007).

28

Tanto o surgimento de doenças infecciosas emergentes quanto o problema

da resistência microbiana tem impulsionado a pesquisa de novos agentes

antimicrobianos (MIMS et al., 2005).

As propriedades antimicrobianas de diversas plantas medicinais têm sido

reconhecidas empiricamente durante séculos, mas foram cientificamente

confirmadas apenas nas ultimas décadas (DUARTE, 2006). Dentre os produtos

oriundos do metabolismo secundário das plantas de maior interesse com atividade

antimicrobiana estão os terpenoides (monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos e

saponinas) (SALEEN et al., 2010).

Algumas provas científicas do potencial antimicrobiano das plantas

medicinais podem ser evidenciadas através de estudos conduzidos com o óleo

essencial de Cymbopogom citratus (DC) Stapf, utilizado na medicina popular contra

gripes, disenteria, dores de cabeça, calmante, antiespasmódico e antimicrobiano,

revelou a presença dos compostos mirceno, neral e gerania como principais

compostos (PEREIRA et al., 2004).

A planta Ocimum gratissimum L. amplamente distribuída na região tropical, é

usada na medicina popular em infecção do trato respiratório superior,

pneumonia,tosse, febre e conjuntivites. Estudos conduzidos com o óleo essencial

demonstram que o mesmo possui os seguintes compostos: 1,8 cineol,eugenol, metil-

eugenol, timol, p-cimeno, cis-ocimenoe cis-cariofileno, e em diferentes

concentrações inibiu crescimento de Staphylococcus aureus, Shigella flexneri,

Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus mirabilis e

Pseudomonas aeruginosa. Pesquisas realizados com Salvia officinalis, L. também

usada como erva medicinal, mostraram que seu óleo essencial possui atividade

antibacteriana e antifúngica devida à presença da substância 1,8-cineol (PEREIRA

et al., 2004).

Os óleos essenciais obtidos de plantas nativas de Baccharis dracunculifolia

e Baccharis uncinella, também conhecido como óleo-de-vassoura, são utilizados na

indústria de perfumaria, proporcionando um aroma exótico a diversos perfumes,

além de muitos estudos sobre atividades biológicas dessas espécies destacam os

efeitos alelopáticos, antioxidante, antimicrobianos, citotóxicos e anti-inflamatórios

(FERRONATTO et al., 2007).

29

3.3 Óleos Essenciais

Os óleos essenciais são originados do metabolismo secundário das plantas e

possuem composição química complexa, destacando-se a presença de terpenos e

fenilpropanoides. Constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos

vegetais e, estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência

vegetal, exercendo papel fundamental na defesa contra micro-organismos

(OLIVEIRA et al., 2005).

De acordo com Leite (2009) os óleos essenciais são compostos aromáticos,

geralmente voláteis, retirados dos vegetais, onde são encontrados pré-formados ou

na forma combinada. Também podem ser chamados de óleos voláteis, óleos

etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas

características físico-químicas, como por exemplo, a de serem geralmente líquidos

de aparência oleosa à temperatura ambiente, advindo, daí, a designação de óleo.

Entretanto, sua principal característica é a volatilidade, diferindo-se, assim, dos óleos

fixos, misturas de substâncias lipídicas, obtidos geralmente de sementes. São

solúveis em solventes orgânicos apolares, como o éter, e em água apresentam

solubilidade limitada, mas suficiente para aromatizar as soluções aquosas, que são

denominadas hidrolatos.

Segundo Simões et al., (2010), outras características podem ser destacadas

como: sabor, geralmente acre (ácido) e picante; cor, quando recentemente extraídos

são geralmente incolores ou ligeiramente amarelados; estabilidade, em geral, os

óleos voláteis não são muito estáveis, principalmente na presença de ar, luz, calor,

umidade e metais. Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos terpênicos,

alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos,

peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com

enxofre.

Na natureza, os óleos essenciais desempenham um papel importante na

proteção das plantas como antibacterianos, antivirais, antifúngicos,

inseticidas e também contra herbívoros, reduzindo seu apetite por essas plantas.

Podem exercer atração por alguns insetos favorecendo a dispersão de pólens e

sementes, ou repelir outros indesejáveis (BAKKALI et al., 2008).

Muitas plantas são utilizadas como uma alternativa terapêutica pela

atividade antimicrobiana comumente associada aos seus óleos essenciais, sendo

30

promissora também a utilização como aditivos alimentares, para retardar a

deterioração dos alimentos ou para evitar o crescimento de patógenos alimentares e

micro-organismos resistentes aos antibióticos. Embora seja menos investigada, a

utilização dos óleos essenciais para o tratamento de parasitoses vem adquirindo

maior importância. Os óleos essenciais podem ser eficazes no tratamento ou

prevenção de doenças parasitárias, visto que, possuem propriedades como baixa

densidade e rápida difusão através das membranas celulares em decorrência da sua

lipossolubilidade podem melhorar a inserção intracelular dos componentes ativos do

óleo essencial nos parasita (BURT, 2004; SILVA et al., 2010; SIQUEIRA et al.,

2011).

Os óleos essenciais são caracterizados por apresentarem doisoutrês

principaiscomponentes emconcentrações elevadas(20-70%) em comparação com

outroscomponentes presentes. Por exemplo,carvacrol(30%) e timol (27%) são os

principais componentes do óleo essencial do orégano. Linalol (68%) do óleo

essencialdo coentro, mentol (59%) e mentona (19%)do óleo de hortelã-

pimenta.Geralmente, estesprincipais componentes determinam aspropriedades

biológicas dos óleos essenciais (BAKKALI et al., 2008).

Atualmente, os óleos essenciais são empregados na indústria alimentícia,

farmacêutica, de cosméticos e produtos domissanitários. É estimado que cerca de

3000 óleos essenciais sejam conhecidos, dos quais aproximadamente 300 são

comercialmente importantes, destinados, principalmente, para o mercado de

fragrâncias. Os óleos essenciais apresentam inúmeras atividades farmacológicas

como: atividade antimicrobiana, antiviral, inibição da enzima acetilcolinesterase,

ação antioxidante, anti-inflamatória, antinociceptiva, anticancerígena, além de atuar

no sistema nervoso central com atividade depressora, antidepressiva e

anticonvulsivante. Alguns possuem ainda atividade anti-helmíntica e antiparasitária

(HENRIQUES et al., 2007; NIERO; MALHEIROS, 2010).

No Brasil, a produção de óleo essencial teve início ao final da segunda

década do século XX, tendo como base o puro extrativismo de essências nativas,

principalmente da árvore do Pau-Rosa (Aniba rosaeodora). Durante a Segunda

Guerra Mundial, o país passou a organizar a atividade, consolidando-a basicamente

para o atendimento do mercado externo. Tem um lugar de destaque na produção de

óleos essenciais, ao lado da Índia, China e Indonésia, que são considerados os 4

31

grandes produtores mundiais. A posição do Brasil deve-se aos óleos cítricos, que

são subprodutos da indústria de sucos (BIZZO, et al.,2009).

3.3.1 Métodos de extração de óleos essenciais

Os métodos de extração de óleos essenciais variam conforme a localização

do óleo volátil na planta (caules, folhas, cascas, frutos, inflorescências), e como

proposta de utilização do mesmo (SIMÕES et al., 2010).

Dentre as técnicas de extração mais comumente usadas esta a enfloração,

um método que consiste na utilização de material vegetal fresco, como folhas e

flores que tenham baixo teor de óleos essencial e que são extremamente delicados,

a ponto de não poderem ser usados outros métodos mais práticos, como o arraste

por vapor d’água. A parte vegetal é disposta, a temperatura ambiente, sobre uma

camada de gordura, durante certo período de tempo. Em seguida, a parte vegetal

esgotada é substituída por novas até a saturação total, quando a gordura é tratada

com álcool, este por sua vez é destilado a baixa temperatura (SIMÕES et al., 2010).

A destilação por arraste por vapor d’água é o método mais comum de

extração de óleos essenciais. Os óleos voláteis possuem tensão de vapor mais

elevada que a da água, sendo, por isso, arrastados pelo vapor d’água, saindo no

alto do destilador, e a seguir passam por um resfriamento, com o uso de uma

serpentina que está em contato com um líquido (água) de temperatura mais baixa,

provendo a condensação da água e do óleo. Pode-se ver a diferença de duas fases,

óleo e água, que são então separados por decantação. O destilador de óleos

essenciais do tipo Clevenger é o mais utilizado em pequena escala, por fornecer

bons resultados, mas tem limitações por ser de vidro e operar com pequenos

volumes, inviabilizando a extração de quantidades maiores e também em tempos

mais longos (BRAGA; CREMASCO, 2003).

Outra maneira de obtenção de óleos essenciais é a extração com solventes

orgânicos. São extraídos, preferencialmente, com solventes orgânicos apolares

(éter, éter de petróleo ou diclorometano) que, entretanto, extraem outros compostos

lipofílicos, além dos óleos voláteis. Por isso, os produtos assim obtidos raramente

possuem valor comercial (SILVA et al., 2010).

32

Na prensagem ou expressão das frutas cítricas extraem-se os óleos e o

suco. Depois, são efetuadas a centrifugação, a decantação ou a destilação

fracionada, para separar o óleo essencial puro (LEITE, 2009).

Já na extração por CO2 supercrítico a parte vegetal é colocada em um taque,

onde é injetado dióxido de carbono supercrítico, processo que ocorre a uma extrema

pressão de 200 atmosferas e temperaturas superiores a 31ºC. Nesta pressão o CO2

atinge o que seria um quarto estado físico, no qual a sua viscosidade é semelhante

à de um gás, mas a sua capacidade de solubilidade é elevada como se fosse um

líquido. Após a extração, a pressão diminui e o gás carbônico volta ao estado

gasoso, não deixando qualquer resíduo de solvente (MAUL, 1998).

Dados experimentais demonstram que o rendimento e a composição do óleo

essencial de plantas medicinais podem ser influenciados por fatores, como: parte da

planta utilizada para extração do óleo, idade da planta, época de colheita e

condições ambientais (SCHEFFER, 1998).

Existem diversos métodos, que variam dependendo da matéria prima a ser

utilizada e da receita oriunda da extração. Dados científicos encontrados com

relação ao processo de obtenção do óleo de eucalipto indicam que o método mais

comum trata-se da extração por destilação, através do processo de arraste a vapor.

O rendimento desse processo varia muito conforme a espécie de planta utilizada,

podendo ocorrer perdas nas propriedades sensoriais devido às altas temperaturas,

sendo um método geralmente usado para folhas e ervas (VITTI; BRITO, 2003).

O método de extração por arraste a vapor d’água, embora seja um método

clássico, é preferencialmente utilizado em estudos científicos para obtenção de óleo

tanto de material vegetal tanto fresco quanto seco (SIMÕES et al., 2010).

3.3.2 Métodos de caracterização de óleos essenciais

A cromatografia em camada delgada (CCD) é um método bastante usado na

análise de óleos, já que permite obter várias informações sobre um óleo volátil em

um curto espaço de tempo, com pouca amostra (menos de 1 mL) e com baixo custo.

O perfil cromatográfico em CCD é característico para cada óleo e permite, em muitos

casos, uma confirmação da identidade de um óleo e até a detecção de falsificações.

Geralmente são usadas placas de sílica gel como fase fixa e, como fase móvel,

33

existe uma grande variedade de sistemas de solventes. A detecção é feita,

inicialmente, sob luz ultravioleta e depois a placa é revelada com um regente

adequado para cada caso, com o objetivo de facilitar a visualização dos

componentes do óleo (COSTA NETO, 2004).

A cromatografia gasosa (CG) é uma das técnicas analíticas mais utilizadas.

Além de possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade

de detecção em escala de nano a picogramas (10–9 - 10-12g). A grande limitação

deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável

termicamente, embora amostras não voláteis ou instáveis possam ser derivadas

quimicamente (DEGANE, 1998).

A cromatografia gasosa acoplada à espectro de massas (CG-EM) é um

método de escolha para separar e quantificar substâncias componentes voláteis.

Apesar de seu alto poder de diferenciação, é um método muito simples de usar.

Como os óleos são suficientemente voláteis, a amostra é solubilizada em solventes

como hexano, antes de ser injetada no cromatógrafo. A identificação dos compostos

individuais pode ser realizada através da comparação do tempo de retenção relativo

da amostra com padrões. O índice de Kovats (IK), por sua vez, relaciona o tempo de

retenção dos compostos ao tempo de retenção de uma série de hidrocarbonetos

homólogos (SIMÕES et al., 2010).

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC – High

Performance Liquid Chromatography) é um método de análise que vem sendo

empregado na avaliação qualitativa e quantitativa de óleos voláteis desde a década

de 70 (SIMÕES et al., 2010). É uma das técnicas mais atuais em termos de

caracterização, detecção e subsequente separação, bem como controle final da

pureza do composto isolado.

A CLAE baseia-se na utilização de coluna contendo um suporte e uma fase

estacionária (sílica gel ou alumina) que oferece resistência ao fluxo da fase móvel,

portanto, fazendo-se necessária a utilização de pressão, distinguindo-se assim das

demais técnicas cromatográficas que utilizam a força gravitacional para a separação

dos compostos (MARASCHIN; VERPOORT, 2001; COLLINS et al., 2006). Dentre as

vantagens que esse sistema oferece pode-se citar: a possibilidade de separação de

compostos em baixas concentrações na planta, no extrato ou no próprio óleo

essencial, tempo curto de análise, fase móvel e estacionária com ampla faixa de

polaridade, esta que pode trazer seletividade ao processo de separação, podendo

34

também ser ajustada, além da decomposição de compostos instáveis na amostra

(MALHEIROS et al., 2010).

A ressonância magnética nuclear (RMN) é um método muito usado na

elucidação estrutural de compostos orgânicos, detectados pelas técnicas

supracitadas. Geralmente, é aplicada para substâncias puras, mas óleos voláteis

podem também ser analisados diretamente, após diluição em clorofórmio deuterado

(cerca de 20mg do óleo volátil em 3 ml de clorofórmio deuterado). É recomendável

que para este tipo de análise, utilize um aparelho de RMN de pelo menos 300 MHz

para melhor resolução dos compostos presentes nos óleos essenciais (BRUICE,

2006).

Para se estabelecer a constituição química de uma molécula é necessário o

conjunto de dados estruturais fornecidos pela técnica de RMN. O RMN de 1H

fornece o deslocamento químico dos vários tipos de hidrogênios presentes na

molécula; já a RMN de 13C fornece informações sobre os carbonos existentes

(DELLE MONACHE, 2001; ABAD et al., 2007).

3.4 Família Piperaceae e Gênero Piper

A família Piperaceae caracteriza-se como uma das mais primitivas entre as

angiospermas, em nosso país e é representada por quatro gêneros: Zippelia, Piper,

Piperomia e Manekia, dentre estes o gênero Piper é aquele com o maior número de

representantes (BARROSO, 1978; PARMAR et al., 1997; SANTOS et al., 2012).

O gênero Piper é o mais importante da família Piperaceae com ampla

distribuição nas regiões temperadas de ambos os hemisférios. No Brasil podem ser

encontradas de Norte a Sul do país (ALVES et al., 2010).Diversas espécies do

gênero Piper são amplamente utilizadas na medicina popular em várias partes do

mundo e têm sido relatadas por produzirem compostos com propriedades biológicas

e farmacológicas diversas (SANTOS et al., 2012).

Uma das características da Piper é possuírem um sabor forte e um cheiro

aromático. O gênero fornece a nossa culinária uma lista de especiarias,

principalmente temperos picantes, como também vem se destacando pelos

fármacos. Os mais importantes são as pimentas branca e preta preparadas a partir

de frutos de Piper nigrum (SENGUPTA; RAY, 1987; PARMAR et al., 1998).

35

A maioria das espécies são de crescimento rápido, apresentam-se como

arbustos, são plantas aromáticas e muitos delasapresentam atividade anti-séptica,

inseticida e antimicrobiana (GUERRINE et al., 2009).

Esta família caracteriza-se por apresentar em sua composição uma

variedade de metabólitos secundários, tais com alcaloides, flavonoides,

isobutilamidas, fenilpropanoides, terpenos, entre outros (CORREA et al., 2011).

Devido à sua grande importância econômica, ecológica e medicinal muitas

destas espécies têm sido utilizadas na alimentação e na medicina popular para o

tratamento de muitas patologias, entre as quais estão, antimicrobiana

(antibacteriana, antifúngica e no tratamento de feridas), problemas do trato

respiratório (asma, bronquite e tosse), do aparelho digestivo (dores abdominais,

diarreias, carminativas), anti-inflamatória (reumatismos) e antileucêmica

(BENEVIDES et al., 1999).

Embora, tenha-se evidências científicas das indicações terapêuticas, e do

grande potencial biológico da família Piperaceae, até 2004, apenas 10% das

espécies de Piper foram estudadas (LORENZI; MATOS, 2002; SANTOS et al.,

2012).

3.4.1 Gênero Piper - Composição química e atividade biológica dos óleos

essenciais.

Os óleos essenciais destas plantas são constituídos por uma ampla

diversidade de constituintes químicos como monoterpenos, sesquiterpenos,

arilpropanoides, aldeídos, cetonas e álcoois de cadeia longa (ALMEIDA et al., 2010).

Das propriedades biológicas investigadas, os óleos essenciais deste gênero têm

sido sistematicamente submetidos a ensaios de toxicidade contra diversos micro-

organismos de natureza bacteriana, fúngica e protozoária (SANTOS et al., 2012).

Muitos são os estudos realizados com o gênero Piper que visam à

investigação química, bem como a atividade biológica dos seus constituintes. A

análise por CG/EM dos óleos essenciais das folhas de Piper aduncum, P. arboreum,

P. caldense e P. tuberculatum, revelou a presença de dilapiol (46,7%),

biciclogermacreno, (17,3%), γ-Muuroleno (9,6%) e 2-epi-β-Funebreno (10,6%), como

constituintes principais destas espécies, respectivamente. Os óleos das espécies

avaliadas foram tóxicos para o ácaro Tetranychus urticae, conhecido como ácaro

36

rajado. Entre os óleos testados, o ácaro rajado foi mais susceptível aos óleos de P.

aduncum na concentração letal média de 0,01 μL/L de ar e P. tuberculatum na

concentração letal média de 0,50 μL/L de ar. A menor concentração entre os óleos,

que promoveu uma redução significativa do número de ovos foi 3x10-3μL/L de ar

para P. aduncum (ARAÚJO, 2011).

Outro estudo realizou uma comparação da composição química de três

espécies do gênero Piper, P. arboreum, P. dilatatum e P. hispidum, oriundas da

Mata Atlântica de Paraty – RJ e das matas do cerrado do Distrito Federal. As três

espécies do cerrado apresentaram predominância de sesquiterpenos. P. arboreum

apresentou como constituintes majoritários biciclogermacreno (12,1%), 10-epi-γ-

eudesmol (11,6%) e óxido de cariofileno (10,1%). Em P. dilatatum os constituintes

em maior quantidade foram cis-β-ocimeno (19,6%) e β-cariofileno (11,3%) e em P.

hispidum foram β-pineno (19,7%), α-pineno (9,0%) (POTZERNHEIM et al., 2005).

O estudo conduzido com espécie vegetal a P.aduncum que ocorre nas áreas

desmatadas da Amazônia brasileira, revelou a presença do composto dilapiol (35-

90%), um derivado de fenilpropano. Este óleo é responsável pela atividade biológica

fungicida contra Clinipellis perniciosa (vassoura) pela inibiçãode seusbasidiósporos,

em concentrações que variaram de 0,6 a1,0 ppm. Este mesmo óleo foi testado para

lavar e insetos adultos de Anopheles marajoarae Aedes aegypti, apresentando

atividade larvicida e inseticida (ALMEIDA et al., 2010).

Outras análises realizadas com o óleo essencial de P. aducum mostraram

atividade inibitória para o protozoário Artemisia absinthium, bem como para as

formas trofozoítas Trichomonas vaginalis. Os óleos extraídos das espécies P.

auritum e Pinuscaribaea, foram investigados contra as formas promastigotas de

Leishmania donovanie também para as formas trofozoítasdeT. vaginalis, sendo

ativos somente contra L.donovani (SARIEGO et al., 2008).

Os óleos essenciais defolhas, caules e inflorescências de Pipermarginatum,

colhidos na Mata Atlântica no estado de Pernambuco, foram obtidos por

hidrodestilação. As análises de GC-EM revelaram a presença de 40 componentes,

estando os compostos (Z) ou (E)-asarona e álcool patchoul, presentes nas folhas,

caules e inflorescências. O óleo essencial das inflorescências apresentaram

atividade potente contra as larvas do mosquito de Aedes aegypti (AUSTRAN et al.,

2009).

37

Os óleos essenciais obtidos por hidrodestilação das folhas e espigas de P.

gaudichaudianum H.B.K. da Costa Rica foram analisados por CG-FID, GC-EM e

RMN ¹³C.A análise do óleo obtido através das folhas desta espécie mostrou a

presença de sesquiterpenos, especialmente β-cariofileno e D-germacreno, assim

como a presença de fenilpropanoides. O óleo volátil mostrou picos de

monoterpenos, sendo β-pineno encontrado em maior quantidade (MUNDINA et al.,

2001).

O óleo essencial de P. gaudichaudianum, foi submetido também à análise de

atividade citotóxica, efeitos mutagênicos e genotóxicos em células V79. Os principais

componentes, o (E)-nerolidol (22,4%), humuleno-(16,5%), (E)-cariofileno (8,9%) e

biciclogermacreno (7,4%), apresentaram um efeito citotóxico dose-dependente para

células V79 e observou-se uma diminuição significativa na sobrevivência em

0,50µg/mL e superiores (PÉRES et al., 2009).

O óleo induziu um aumento significativo na frequência

de células micronucleadas a 4,6 e 10 µg/mL. Além disso, mostrou um significativo

aumento de peroxidação lipídica em doses de 0,5 µg/mL, sugerindo assim, que o

potencial oxidante pode ser responsável, pelo menos em parte, pelos seus efeitos

citotóxicos e genotóxicos (PÉRESetal., 2009).

A composição química do óleo essencial de P. jacquemontanum e

P.variabilenativas da Guatemala, foram analisadas. A análise do óleo essencial de

P. jacquemontanum mostrou a presença de 36 constituintes, sendo cânfora (69,4%),

canfeno (16,6%) e limoneno (13,9%) como maiores componentes (CRUZ et al.,

2011).

O óleo essencial da espécie P. claussenianum mostrou atividade inibitória

para doença Leishimaniose, causada pelo protozoário Leishmania amazonenses. O

efeito inibitório foi de 62,2%, mostrando assim, um interessante valor potencialdesta

plantasobre esta doença negligenciada, podendo ser fontede um novo

produtonatural para o tratamento da mesma (MARQUES et al., 2011).

Óleos essenciais de P. aduncum L. e P. hispidinervum C.DC. foram avaliados

quanto ao efeito inseticida em Sitophilus zeamais Motsch. por ação de contato,

fumigação e tópica, onde este foi mais suscetível ao efeito de contato do óleo de P.

hispidinervum em relação ao de P. aduncum, obtendo-se uma concentração letal

média (CL50) de 0,51 e 2,87mL/cm-2 de óleo, respectivamente. Mortalidade próxima

a 100% foi obtida nas concentrações de 20 e 30% do óleo de P. hispidinervum.

38

Quanto ao efeito fumigante, a susceptibilidade foi maior no óleo de P. aduncum do

que no de P. hispidinervum. Houve diferença significativa entre os óleos somente

nas concentrações de 0,1 e 1,0 mL/cm2(ESTRELA et al., 2006 ).

A dose letal média (DL50) foi semelhante nos dois óleos essenciais por

aplicação tópica, no entanto, a mortalidade foi maior com P. aduncum. Óleos

essenciais de P. aduncum e P. hispidinervum possuem efeito inseticida em S.

zeamais, mas as respostas dependem da concentração e do método de exposição a

que o inseto seja submetido (ESTRELA et al., 2006).

O potencial de toxicidade dos extratos, compostos e óleos essenciais da

Piper sp foi determinado através do ensaio com um pequeno crustáceo, Artemia

salina, onde foi considerado citotóxico em concentrações inferiores a 1000 µg/mL, e

com a bactéria Staphylococcus aureus e com o fungo Saccharomyces cerevisiae,.

No ensaio bioautográfico realizado contra S. aureus foram encontrados zonas de

inibição nos extratos de Piper sp, P. amplum, P. aduncum e P. cernuum,

demonstrando níveis significativos de atividade antimicrobiana (MULLER, 2011).

Os extratos de Piper sp e das espécies do gênero Piper citadas

anteriormente, apresentaram atividade significativa contra bactérias gram-positivas,

sendo elas Streptococcus pyogenes, S. epidermides, S. saprophyticus e Bacillus

subtilis (MULLER, 2011).

A composição química, bem como, a atividade biológica dos óleos

essenciais de diferentes espécies do gênero Piper podem ser observadas a seguir

nas tabelas 1, 2 e 3.

39

Tabela 1 - Composição química do óleo essencial de diferentes espécies do gênero Piper e atividade biológica.

Espécie Compostos/Porcentagem Atividade Biológica Referência

P. tubercalatum Dilapiol (46,7%), Biciclogeracreno (17,3%), γ-Muuroleno (9,6%), 2-epi-β-Funebreno (10,6%)

Toxicidade para o ácaro Tetranychus urticae. ARAÚJO, 2011.

P. caldense Dilapiol (46,7%), Biciclogeracreno (17,3%), γ-Muuroleno (9,6%), 2-epi-β-Funebreno (10,6%)

Toxicidade para o ácaro Tetranychus urticae. ARAÚJO, 2011.

P. arboreum Dilapiol (46,7%), Biciclogeracreno (17,3%), γ-Muuroleno (9,6%), 2-epi-β-Funebreno (10,6%), 10-epi-γ-eudesmol (11,6%), Óxido de cariofileno (10,1%)

Toxicidade para o ácaro Tetranychus urticae. ARAÚJO, 2011, POTZERNHEIM et al., 2005.

P. dilatatum cis-β-Ocimeno (19,6%), β-Cariofileno(11,3%)

Não avaliada. POTZERNHEIM et al., 2005.

P. hispidum β-Pineno (19,7%), α-Pineno (9,0%)

Não avaliada. POTZERNHEIM et al., 2005.

P. aduncum Dilapiol(35-90%), (E)-Nerolidol (20,3%), Linalol (13,3%) Atividade fungicida contra o fungo Clinipelli sperniciosa; Larvicida e inseticida contra Anopheles marajoara e Aedes aegypti; Atividade inibitória para o protozoário Artemisia absinthiume para as formas trofozoítas Trichomonas vaginalis.

ALMEIDA, et al., 2010; SARIEGO et al., 2008.

P. marginatum (Z) ou (E)-Asarona, Álcool patchoul Potente atividade contra as larvas do mosquito de Aedes aegypti.

AUSTRAN et al., 2008.

P. gaudichaudianum β-Cariofileno, D-Germacreno, β-Pineno, (E)-Nerolidol (22,4%), Humuleno-(16,5%), (E)-Cariofileno (8,9%),Biciclogermacreno (7,4%)

Atividade citotóxica, efeitos mutagênicos e genotóxicos em células V79.

MUNDINA et al., 2001, PÉRES et al., 2009.

P. variabile Cânfora (69,4%), Canfeno (16,6%), Limoneno (13,9%)

Não avaliada. CRUZ et al., 2011.

P. jacquemontanum Cânfora (69,4%), Canfeno (16,6%), Limoneno (13,9%)

Não avaliada. CRUZ et al., 2011.

P. claussenianum Todo óleo

Atividade inibitória para protozoário Leishmania

amazonense.

MARQUES et al., 2011.

40

Tabela 2 - Compostos majoritários (%) comuns às espécies de Piper e Pothomorphe analisados por CG e CG/EM (MESQUITA et al., 2005).

P.

aduncum

P.

amalago

P.

arboreum

P.

cernuum

P.

hispidum

P.

regnellii

P.

submarginalum

Pothomorphe

umbellata

P.

viscosanum

α-Pineno 3,2 9,3 1,1 4,1 4,6 v 28,2 v 5,1

Linalol 8,7 6,2 0,6 0,3 0,6 v - - v

Piperitona 7,0 - 0,4 - - - - - 3,4

E-Cariofileno 6,7 17,8 4,6 1,9 5,2 2,1 - 12,6 1,4

α-Selineno 2,3 - 1,4 V - - - 2,0 3,2

Delta-cadineno 3,1 - 3,4 0,3 1,3 - - 2,0 2,2

E-Nerolidol 14,2 - 2,7 0,6 1,2 - 19,8 7,0 -

Espatulenol 4,3 2,1 2,6 0,7 7,0 3,2 10,9 4,3 0,3

Óxido de cariofileno 2,6 18,0 15,2 0,4 6,4 1,4 - 4,9 0,4

Germacreno D 0,5 10,9 0,9 9,0 6,9 7,3 - 8,6 v

Biciclogermacreno - 16,4 4,7 - 5,0 - - 10,1 -

Elenol - 0,5 - 7,2 2,4 0,1 - 0,5 -

β-Eudesmol - 3,4 1,3 4,1 3,1 - - - -

Trans-Dihidroagarofurano - - 5,6 22,4 7,4 - - - -

Ledol - - 3,4 - - 2,5 - - -

10-Epi-γ-eudesmol - - 16,8 2,2 - - 2,2 -

β-Selineno 1,4 - 8,7 - - 7,3 - - -

Limoneno 2,0 1,1 4,9 0,3 5,8 v - v 45,5

β-Pineno 1,8 0,3 0,2 2,1 14,0 0,1 11,9 0,1 0,2

41

Tabela 3 - Porcentagem dos constituintes majoritários do óleo essencial das folhas de Piper

malacophyllum (SANTOS et al., 2012).

Constituintes Concentração(%)

(média ± DP)

α-Pineno 5,0 ± 2,1

Canfeno 20,8 ± 0,8

β-Pineno 1,2 ± 0,2

β-Mirceno 1,2 ± 0,3

Limoneno 1,8 ± 0,2

Eucaliptol 0,2 ± 0,0

Cânfora 32,8 ± 0,7

Borneol 1,1 ± 0,5

α-Terpineol 0,5 ± 0,0

Acetato de bornila 1,1 ± 0,2

α-Copaeno 0,7 ± 0,6

β-Elemeno 1,6 ± 0,4

α-Gurjuneno 0,2 ± 0,0

β-Selineno 0,4 ± 0,3

α-Cariofileno 2,9 ± 0,4

β-Selineno 2,2 ± 0,3

α-Muuroleno 1,1 ± 0,2

Amorfeno 0,5 ± 0,0

trans-calameneno 0,9 ± 0,2

α-Cadineno 0,5 ±0,1

E-Nerolidol 9,1 ± 0,6

Espatulenol 0,5 ± 0,1

Ledol 0,4 ± 0,0

Cadinol 0,5 ± 0,2

α-Eudesmol 1,3 ± 0,2

TOTAL

96,0

43

4 METODOLOGIA

4.1 Materiais

4.1.1 Material vegetal

As partes aéreas (caules e folhas) de Piper sp foram coletadas no município

de Blumenau no estado de Santa Catarina, em março de 2010 e uma segunda

coleta em fevereiro de 2012.

Uma exsicata desta espécie foi preparada e encontra-se no Herbário

Barbosa Rodrigues para a devida classificação da espécie.

Figura 1 - Partes aéreas (caules e folhas) de Piper sp.

4.1.2 Materiais e reagentes

O perfil cromatográfico dos extratos, frações, compostos puros e óleos

essenciais foram observados por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

realizada com placas de sílica gel 60 GF 254, com 20 µm de espessura dispostas

44

sobre folhas de alumínio. Primeiramente as substâncias foram analisadas na placa

por lâmpada ultravioleta (UV) e posteriormente as mesmas foram borrifadas com o

revelador químico anisaldeído sulfúrico, específico para revelação dos grupos

químicos esteroides e/ou terpenoides.

Nas Cromatografias em Coluna Clássica (CC), fez-se o uso de sílica gel

(0,063 – 0,200 mesh) como suporte. O diâmetro e a altura das colunas variavam de

acordo com a quantidade de material vegetal adsorvido. As eluições foram

realizadas com solventes orgânicos de pureza analítica com polaridade crescente,

foram eles hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt) e acetona (Act), além destes

foram utilizados para atividade cotidianas outros solventes como metanol (MeOH),

etanol (EtOH) e diclorometano (DCM), provenientes dos laboratórios Vetec, Quimex

e Dinâmica.

Para as análises de RMN de 1H e RMN de 13C foi utilizada acetona

deuterada (pureza 99,8% + 0,05% TMS) procedente da Cambridge Isotope

Laboratories Inc.

Na caracterização dos óleos essenciais por CG-EM utilizou-se o Hélio como

gás carreador (0,8 ml/min); temperatura do injetor: 260ºC e interface: 250ºC, Split:

1:20, no seguinte programa de temperatura: 70-260°C (70-20ºC até 210ºC; 8ºC/min

até 250ºC e 10ºC/min até 260ºC).

Todos os reagentes, solventes e demais suportes cromatográficos utilizados

para a purificação dos compostos foram adquiridos da Vetec ou Quimex com

recursos de projetos de pesquisa realizados pela Universidade do vale do Itajaí -

UNIVALI.

4.1.3 Equipamentos

Os extratos foram concentrados para obtenção do resíduo seco em

evaporador rotatório TECNAL TEC-221 com controle de temperatura.

Para a observação da fluorescência dos compostos analisados por CCD, foi

utilizada a radiação ultravioleta Minerallight (λ = 254 e 366 nm).

Os espectros de RMN de 1H e RMN de 13C foram obtidos em espectrômetro

BRUKER AC-300F 300 MHz, tendo como referência interna tetrametilsilano (TMS)

ou o próprio solvente para o aparelho presente na Univali, sendo a interpretação dos

dados auxiliada pela técnica de Dept.

45

Para obtenção dos óleos essenciais utilizou-se a técnica de extração por

arraste a vapor d’água com o auxílio do aparato Clevenger.

Nas análises cromatográficas realizadas por CLAE, utilizou-se um

cromatógrafo líquido da marca Waters®, equipado com uma bomba 600, detector de

varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de fotodiodos (Diodo Array) e injetor

automático com volume de injeção de 20mL. O software Empower (versão Pro) foi

utilizado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. Todos os

solventes utilizados foram de grau HLPC.

A separação dos constituintes ativos foi executada através de CLAE em uma

coluna de fase reversa C18, (250 X 4,6mmX5mm) da marca Phenomenex® Luna,

acoplada a uma pré-coluna C18 na temperatura de 30oC.

A caracterização dos óleos essenciais, extrato etanólico e partições líquido-

líquido, ocorreupor cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG-

EM Shimadzu, QP2010 S) com coluna capilar Rtx-Wax (30 m x 0.25 mm X 0.25mm).

4.2 Métodos

4.2.1 Obtenção do extrato de Piper sp

As partes aéreas (caules e folhas) da planta Piper sp coletadas em março de

2010, foram submetidas a secagem por 5 dias. Após a secagem as folhas e os

caules foram moídos separadamente obtendo-se 41,98 g e 90,00 g,

respectivamente.

Os caules e as folhas da planta passaram por um processo de maceração

por cinco dias utilizando-se etanol (EtOH) como líquido extrator. Os extratos,

separadamente, foram submetidos à concentração utilizando-se o evaporador

rotatório na temperatura máxima de 50 oC obtendo-se 6,71 g de extrato etanólico

dos caules (EPC) e 7,29 g de extrato das folhas (EPF).

4.2.2 Purificação dos extratos das partes aéreas de Piper sp - Caules e Folhas

O extrato etanólico dos caules de Piper sp (6,71 g) foi submetido à

cromatografia em coluna (CC1), utilizando-se como fase estacionária sílica gel 60.

Iniciou-se a eluição com hexano 100% com aumento gradativo de polaridade com

46

adição de acetato de etila. Ao longo do procedimento, a coluna cromatográfica

totalizou 58 frações que foram monitoradas através de CCD e reunidas pela

similaridade do perfil cromatográfico.

Considerando que a fração 17-25 proveniente da CC1, apresentou um bom

perfil cromatográfico e rendimento, esta foi submetida à purificação. A fração 17-25

(220,5 mg) foi submetida a uma nova coluna cromatográfica (CC2). Utilizou-se como

fase estacionária sílica gel e como fase móvel Hex:AcOEt, com polaridade

crescente, conforme mostra a figura 2.

Ao longo do procedimento, foram coletadas 117 frações que foram

monitoradas através de CCD. Foram reunidas as frações que apresentaram o

mesmo comportamento cromatográfico. A fração 40-43 apresentou-se como um

cristal incolor que quando analisado por CCD apresentou um perfil de pureza,

comprovada pela presença de uma única mancha na cromatoplaca, sendo assim,

este previamente identificado como HFC1, foi submetido à análise espectral por

RMN 1H e 13C.

Figura 2 - Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com os caules de

Piper sp.

O extrato etanólico das folhas da Piper sp (7,29g) foi submetido também à

purificação utilizando-se como fase estacionária sílica gel 60 e como fase móvel

Hex:AcOEt com aumento gradativo da polaridade. A coluna CC1, como mostra a

COLUNAS - CAULES

Piper sp

CC1

Extrato EtOH

6,71 g

CC2

Fr 17 - 25

220,5 mg

47

figura 3, totalizou 299 frações que foram monitoradas por CCD e reveladas com

anisaldeído sulfúrico. As frações que apresentaram comportamento cromatográfico

semelhante foram reunidas e pesadas. Foi possível observar a formação de cristais

nas frações 101-109, 110-117 e 130-159.

A fração 130-159 (50,5 mg), proveniente da coluna do extrato das folhas de

Piper sp por apresentar um perfil cromatográfico interessante com formação de

cristais foi submetida a uma coluna cromatográfica, esta que foi identificada como

CC2, como mostra a figura 3. Utilizou-se como fase estacionária sílica gel 60 e com

fase móvel Hex:Act com aumento gradativo da polaridade. Ao total foram obtidas 83

frações monitoradas por CCD, com fase móvel Hex:Act, que através do

comportamento cromatográfico variou em Hex:Act 90:10, 80:20 e 70:30. A fração 19

apresentou-se como um cristal incolor e puro, por este fato a mesma, previamente

identificada como HFC2 foi submetida a técnicas de espectrometria por RMN 1H e

13C.

A fração 101-109 (191,1 mg), obtida da coluna do extrato etanólico das

folhas de Piper sp - CC1, foi submetida a uma coluna cromatográfica. Utilizou-se

como fase estacionária sílica gel e com fase móvel Hex:AcOEt com aumento

gradativo da polaridade. A coluna denominada C3 totalizou 53 frações que foram

monitoradas por CCD, eluídas com fase móvel Hex:Act 70:30, e reveladas

anisaldeído sulfúrico. As frações que apresentaram um comportamento

cromatográfico semelhante foram reunidas e pesadas.

A fração 15-18 (511,3 mg), proveniente da coluna realizada com a fração

130-159 – CC2, foi submetida a uma coluna cromatográfica. Utilizou-se como fase

estacionária sílica gel e como fase móvel Hex:AcOEt, com polaridade crescente. Ao

longo do procedimento, a coluna CC4 totalizou 69 frações que foram monitoradas

através de CCD, eluídas com fase móvel Hex:Act 70:30, e reveladas anisaldeído

sulfúrico. As frações 7-13, 31-35 e 36-41 apresentaram um interessante perfil

cromatográfico quando avaliadas por CCD, sendo assim estas foram submetidas à

análise espectral por RMN 1H e 13C.

Através da fração 167-177(122,2 mg), proveniente da coluna cromatográfica

do extrato etanólico das folhas de Piper sp – CC1, realizou-se uma coluna

cromatográfica. Utilizou-se com fase estacionária sílica gel e como fase móvel

Hex:AcOEt, com aumento gradativo de polaridade. A coluna CC5 totalizou 97

frações que foram monitoradas por CCD, eluídas com fase móvel Hex:AcOEt 70:30,

48

e reveladas anisaldeído sulfúrico. As frações que apresentaram um comportamento

cromatográfico semelhante foram reunidas e pesadas.

A fração 185-199 (975,1 mg) oriunda coluna inicial do extrato das folhas de

Piper sp– CC1,foi submetida a uma coluna cromatográfica. Utilizou-se com fase

estacionária sílica gel e como fase móvel Hex:AcOEt, com aumento gradativo de

polaridade. A coluna CC6 totalizou 132 frações que foram monitoradas por CCD,

eluídas com fase móvel Hex:AcOEt 70:30, e reveladas anisaldeído sulfúrico. As

frações que apresentaram um comportamento cromatográfico semelhante foram

reunidas e pesadas.

Com a fração 118-129 (223,3 mg) também proveniente da coluna inicial do

extrato das folhas de Piper sp– CC1,realizou-se uma coluna cromatográfica, onde

utilizou-se como fase estacionária sílica gel e como fase móvel Hex:AcOEt, com

aumento gradativo de polaridade. A coluna CC7 totalizou 101 frações que foram

monitoradas por CCD, eluídas com fase móvel Hex:AcOEt 70:30, e reveladas

anisaldeído sulfúrico. As frações que apresentaram um comportamento

cromatográfico semelhante foram reunidas e pesadas, conforme mostra a figura 3.

Figura 3 - Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com as folhas de

Piper sp.

COLUNAS - FOLHAS - Piper sp

Extrato EtOH

7,29g

CC1

CC3

Fr 101 - 109

CC7

Fr 118 - 129

CC2

Fr 130 - 159

CC4

Fr 15 - 18

CC5

Fr 167 - 177

CC6

Fr 185 - 199

49

Devido à semelhança entre os perfis cromatográficos de ambos os extratos,

optou-se por realizar uma coluna cromatográfica com maior quantidade de planta

seca, agregando caules e folhas em um único extrato. Obteve-se 12,07 g de extrato

etanólico, que foi ressuspendido em acetona e empreguinado em sílica gel.

Preparou-se uma coluna cromatográfica – CC8 usando como fase

estacionária sílica gel e como fase móvel Hex:AcOEtcom aumento gradual da

polaridade.

Foram coletadas 203 frações que foram submetidas à CCD. Esta análise

possibilitou avaliar o perfil cromatográfico de cada fração, ou seja, a separação dos

compostos presentes nos extrato, sendo reunidas aquelas com o mesmo perfil.

Realizou-se também uma coluna cromatográfica com a fração 9-16 (700 mg)

oriunda coluna inicial dos extratos de caules e folhas esta que totalizou 40 frações

que foram monitoradas por CCD e reunidas conforme semelhança de perfil

cromatográfico.

4.2.3 Análise por CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Para as análises realizadas por CLAE, foram pesadas exatamente cerca de

0,5mg de cada extrato etanólico dos caules e folhas, os quais foram diluídos em

1mL de metanol grau HPLC. Em seguida as soluções foram filtradas com membrana

de PTFE modificada de 0,45 μm e colocadas em viais para posteriores análises por

CLAE.

O procedimento foi realizado em uma coluna de fase reversa C18, (250 X 4,6

mm X 5mm) da marca Phenomenex® Luna, acoplada a uma pré-coluna C18 na

temperatura de 30oC, utilizou-se como fases móveis a água ultra pura acidificada

com ácido fosfórico (Merck®) e o solvente metanol grau HPLC (Tedia®). As fases

móveis foram filtradas à vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm de

diâmetro e 0,45 µm de porosidade (RC-L58 Schleicher e Schuell) e degaseificados

em ultrasom (UltraSonic Cleaner Unique® USC 1400) por sonicação sob vácuo

(Bomba de Vácuo Tecnal TE® – 058).

Inicialmente trabalhou-se com metanol/água acidificada com ácido fosfórico

a pH 3,45, porém as fases móveis foram variadas em diferentes proporções a fim de

avaliar a melhor combinação de solventes com a fase móvel.

50

4.2.4 Obtenção dos óleos essenciais

As folhas secas foramtrituradas com o auxílio de um triturador de plantas e em

seguida devidamente pesada, obtendo-se 107,51 g. A obtenção do óleo essencial

ocorreu por arraste a vapor com o auxílio do aparelho Clevenger, por quatro horas.

4.2.4.1 Partição Líquido-Líquido – Piper sp

Ao témino da obtenção do óleo essencial, a água destilada utilizada no balão

de destilação (hidrolato) foi filtrada em funil de vidro e filtro de papel, 100 mL deste

líquido foi submetido à partição líquido-líquido com solventes de diferentes

polaridades.

Os solventes utilizados para extração foram diclorometano e acetato de etila.

A extração inciou com a adição 100 mL de DCM ao hidrolato presente no funil de

separação, este foi agitado e a fração de DCM coletada em um recipiente. A fração

aquosa (hidrolato) retornou ao funil de separação onde o procedimento foi repetido

por mais duas vezes, totalizando 300 mL da fração de DCM. Para a obtenção da

fração de ActOEt, a extração ocorreu da mesma maneira.

Às frações obtidas neste procedimento foi adicionado sulfato de sódio

anidro, para retirada total de água, em seguida estas foram filtradas com papel filtro

e funil de vidro e concentradas em rota-evaporador na temperatura máxima de 50 ºC

até obtenção de resíduo seco.

4.2.5 Análise do óleo essencial por CG/EM

O óleo essecial das folhas secas Piper spfoi analisado por cromatografia

gasosa acoplada a espectrômetro de massas(CG/EM Shimadzu, QP2010 S) com

coluna capilar Rtx-Wax (30 m X 0,25 mm X 0,25mm). Utilizou-se o Hélio como gás

carreador (0,8 mL/min); temperatura do injetor: 260ºC e interface: 250ºC, Split: 1:20,

no seguinte programa de temperatura: 70-60°C (70-20ºC até 210ºC; 8ºC/min até

250ºC e 10ºC/min até 260ºC).

A identificação da composição química do óleo essencial foi realizada pela

comparação dos espectros de massas obtidos com os dadosda biblioteca disponível

no aparelho (versão NIST 8.0).

51

4.2.6 Atividade antimicrobiana – Bioautografia

O óleos essenciais de Piper sp assim como as frações obtidas das partições

realizadas através do hidrolato da extração dos óleos essenciais, foram submetidos

a análise da atividade antimicrobiana com a cepa de Staphylococcus aureus, por

bioautografia.

Para a realização da bioautografia preparou-se placas cromatográficas com

as amostras. Os óleo essencias foram aplicados diretamente na cromatoplaca (2 µL)

e a fase móvel escolhida para eluição foi hexano:acetato de etila (7:3). As frações

foram pesadas separadamente (2 mg), solubilidados em acetona (0,5 mL) e foram

aplicados nas cromatoplacas (10 µL) e eluidos também com Hex:AcOEt (7:3). Após

a eluição a placa foi devidamente seca, para que assim não restasse solventes na

mesma.

Para realização da bioautografia utilizou-se como meio de cultura o ágar

Mueller-Hilton. As cromatoplacas foram depositadas em placas de petri, onde

posteriormente foram vertidos o meio de cultura fundido e arrefecido, adicionado de

uma suspensão bacteriana de S. aureus 106 células/mL, que após solidificação

foram incubados em estufa a 37 ºC por 24 horas.

Após a incubação, para melhorar a visualização dos resultados, foi borrifado

sobre as placas uma solução aquosa de cloreto de 2,3,5 – trifenil-tetrazólio (TCC), (2

mg/mL) e incubados novamente a 37 ºC por mais 4 horas.

O critério utilizado para interpretação dos resultados foi o aparecimento de

zonas claras em torno das substâncias aplicadas na CCD, indicando a respectiva

atividade antimicrobiana (HAMBURGER; CORDELL, 1987).

53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Extração e Purificação

O método escolhido para a extração dos metabólitos secundários dos caules

e folhas de Piper sp foi a maceração, por utilizar solvente a frio, impedindo assim,

que estes metabólitos se decomponham. Este procedimento teve a duração de sete

dias, onde as partes aéreas (caules e folhas) foram armazenadas ao abrigo da luz

solar. A extração foi realizada utilizando etanol como líquido extrator, um solvente

que apresenta uma polaridade alta possibilitando a extração tanto de compostos

apolares quanto os mais polares que estão presentes nos caules e folhas de Piper

sp.

Para o preparo do extrato etanólico das folhas, partiu-se de 41,98 g de

material vegetal seco e obteve-se 7,29 g de extrato, indicando assim um rendimento

de 17,37%. Na preparação do extrato dos caules partiu-se de 90,00 g de material

vegetal seco e obteve-se 6,71 g de extrato, indicando assim um rendimento de

7,46%, conforme mostrado na figura 4. As folhas apresentaram um maior

rendimento em relação aos caules. Isto pode ser explicado pela rigidez dos tecidos

que compõe cada uma das partes, os caules por serem mais rígidos dificulta a

penetração do solvente nas células.

Figura 4 - Fluxograma dos rendimentos obtidos através da maceração das partes aéreas

(Caules e Folhas) de Piper sp.

54

Os extratos etanólicos das folhas e dos caules de Piper sp foram submetidos

a cromatografia líquida de alta eficiência com o objetivo de analisar seus perfis

cromatográficos, bem com analisar similaridade entre as substâncias presentes nos

extratos.

Nos cromatogramas dos extratos de folhas e caules no comprimento de

onda de 335 nm, foi possível observar uma boa separação e semelhança no perfil

cromatográfico dos dois extratos analisados. Dois compostos majoritários foram

encontrados em ambos os extratos, com tempos de retenção de aproximadamente

10 e 14 minutos, como mostram as figuras 5 e 6, representando 43,63% e 56,37%,

respectivamente de proporção em relação as suas áreas.Para os dois compostos

majoritários percebe-se que o comprimento de onda de 285nm pode ser utilizado

também para sua análise.

Figura 5 - a) Cromatograma do extrato etanólico das folhas de Piper sp em 335nm. b)

Cromatograma do extrato etanólico dos caules de Piper sp em 335nm.

a)

b)

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

Minutes

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00

55

Figura 6 - a) Cromatograma do extrato etanólico das folhas de Piper sp em 285nm. b)

Cromatograma do extrato etanólico dos caules de Piper sp e 285nm.

a)

b)

Apesar dos perfis cromatográficos dos extratos de folhas e caules serem

semelhantes, optou-se neste trabalho por fracionar os extratos separadamente.

Os procedimentos realizados com as folhas e os caules possibilitaram o

isolamento dos compostos majoritários presentes na planta, denominados

inicialmente de HFC1 (59,0 mg) e HFC2 (147,0 mg). Posteriormente visando o

isolamento de uma maior quantidade dos compostos presentes em ambos os

extratos e pela semelhança cromatográfica dos mesmos, optou-se realizar uma

coluna agregando folhas e caules. Deste procedimento foram isolados novamente

os dois compostos majoritários identificados como HFC1 (88,40 mg) e HFC2 (179,50

mg), como mostram as figuras 7 e 8.

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00

10,5

17

13,4

39

26,6

84

48,0

45

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Minutes

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00

10,5

15

13,4

37

43,7

78

56

Figura 7 – Fluxograma da obtenção dos compostos HFC1 e HFC2 a partir das folhas de

Piper sp.

Figura 8 - Fluxograma da obtenção dos compostos HFC1 e HFC2 a partir dos extratos de

caules e folhas de Piper sp.

COLUNAS - FOLHAS - Piper sp

Extrato EtOH - 7,29g

CC1

CC3

Fr 101 - 109

Fr 19

Composto HFC1

Rendimento: 0,80%

CC7

Fr 118 - 129

CC2

Fr 130 - 159

CC4

Fr 15 - 18

Fr 31 - 35

Composto HFC2

Rendimento:

2,01%

CC5

Fr 167 - 177

CC6

Fr 185 - 199

57

5.1.1 Identificação do composto HFC1

O composto HFC1(147,5 mg) foi isolado da coluna CC3 (figura 7) e

posteriormente da coluna CC8 (figura 8), realizada com o extrato etanólico de folhas

e caules da Piper sp. Este composto apresentou-se como um cristal incolor. No

cromatograma apresentado na figura 9, pode-se observar que ele está puro.

Através do perfil no UV, observado na figura 9, é possível observar bandas

de absorção em 235 e 306 nm, referentes a transições de grupos cromóforos

conjugados.

Figura 9 - Cromatograma e perfil de absorbância no UV do composto HFC1 – 285nm.

O composto HFC1 foi avaliado por Ressonância Magnética Nuclear de

Hidrogênio (RMN-1H), de Carbono 13 (RMN-13C/Dept), conforme apresentado nas

figuras 11, 12 e 13. Os dados obtidos através desta análise foram comparados com

a literatura, e foram coincidentes com o butanolídeo 4,6-dimetoxi-5-Z-

fenilbutenolídeo, isolado da planta Piper malacophyllum, como mostra a figura 10.

Figura 10 - Estrutura do composto do composto 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo (HFC1).

OCH3

O

O

H3CO

234

56

7

8

9

10

11

12

58

Os dados de RMN de 1H e RMN de 13C do composto HFC1 foram

comparados com os dados do composto 4,6-dimetoxi-5-Z-fenilbutenolídeo, conforme

mostra a tabela 1. No espectro de RMN de 1H, apresentado na figura 11, é possível

verificar a presença de sinais referentes a hidrogênios aromáticos pelo

deslocamento químico entre δ 7,43 a 7,75 ppm (m), referentes aos hidrogênios

ligados aos carbonos 8, 9, 10,11 e 12. Observa-se também dois sinais de

hidrogênios (s) pertencente à metoxilas ligadas aos carbonos 4 e 6, pelos

deslocamentos químicos em δ 3,63 a δ 4,05 ppm (s). O deslocamento químico em δ

5,50 ppm (s), refere-se ao hidrogênio ligado ao carbono 3, como mostrado na figura

11.

No espectro de RMN de 13C, como mostra a figura12 é possível observar um

sinal em δ 171,6, referente ao carbono 4 e outro sinal em δ 168,2 ppm ao carbono

2, indicando assim, a presença de carbonila. Na região deδ128,0 a 130,1 ppm pode-

se observar a presença de carbono sp², olefínicos pertencentes ao anel aromático,

são eles os carbonos 8, 9, 10, 11 e 12. Em δ 88,8 ppm observa-se um sinal

referente ao carbono 3, que encontra-se desblindado devido a densidade eletrônica

que existe próximo a ele. Em δ 80,0 e 60,1 ppm carbonos pertencentes a metoxilas,

como pode ser evidenciado com os dados da tabela 1, bem como a estrutura do

composto 4,6-dimetoxi-5-E-fenilbutenolídeo, mostrada na figura 10.

No espectro de 13C/Dept, como mostra a figura 13, é possível observar que

não há a presença de carbonos do tipo CH2, pelo fato deste espectro não apresentar

sinais negativos. Na região entre δ 128,0 a 136,0 ppm pode-se observar a presença

de carbono sp², pertencentes a anéis aromáticos. Entre δ 59,9 e 60,0 ppm

encontram-se os carbonos pertencentes as metoxilas, ou seja carbonos do tipo CH3,

identificados pela presença de sinais positivos.

59

Figura 11- Espectro de RMN-1H (300 MHz, Acetona D6) do HFC1.

Figura 12 - Espectro de RMN-13C (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC1.

60

Figura 13 - Espectro de RMN-13C/DEPT (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC1.

61

Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos de RMN 1H e 13C para o composto HFC1 e

dados da literatura para o composto1 (4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo).

Posição

*RMN-1H δ(ppm),

mult, J (500 MHz)

CD3COCD3 1

RMN-1H δ(ppm), mult, J (

(300 MHz) Act

HFC 1

*RMN-13C δ(ppm),

mult, J (125 MHz)

CD3COCD3 1

RMN-13C δ(ppm), mult, J

(75,5 MHz) Act

HFC 1

2 - - 167,8 (C) 168,2 (C)

3 5,27 (s) 5,27 (s) 87,5 (CH) 88,8 (CH)

4 - - 170,8 (C) 171,6 (C)

5 - - 129,0 (C) 128,9 (C)

6 - - 144,0 (C) 144,6 (C)

7 - - 130,7 (C) 131,1 (C)

8 7,73 (m) 7,73 (m) 130,1 (CH) 130,1 (CH)

9 7,43 (m) 7,42 (m) 128,0 (CH) 128,7 (CH)

10 7,73 (m) 7,40 (m) 130,0 (CH) 130,0 (CH)

11 7,45 (m) 7,39 (m) 128,0 (CH) 128,5 (CH)

12 7,73 (m) 7,68 (m) 130,1 (CH) 130,0 (CH)

4- OCH3 3,99 (s) 3,98 (s) 58,9 (CH3) 80,0(CH3)

6- OCH3 3,65 (s) 3,63 (s) 58,8 (CH3) 60,1(CH3)

*LAGO et al., 2005.

5.1.2 Identificação do composto HFC2

O composto HFC2 (88,4 mg)foi isolado da coluna CC4 (figura 7) e

posteriormente da coluna CC8 (figura 8), realizada com o extrato etanólico de folhas

e caules da Piper sp. Este composto apresentou-se como um cristal incolor. No

cromatograma apresentado na figura 14, apresenta-se puro.

Este composto apresenta bandas de absorção em 229 e 315 nm, referentes

a transições de grupos cromóforos conjugados como pode ser observado no seu

perfil no UV na figura 14, mostrando grande semelhança ao composto previamente

identificado como HFC1 e reconhecido na literatura como 4,6-dimetóxi-5-Z-

fenilbutenolideo.

62

Figura 14- Cromatograma e perfil de absorbância no UV do composto HFC2 – 285nm.

O composto HFC2 foi avaliado por Ressonância Magnética Nuclear de

Hidrogênio (RMN-1H), de Carbono 13 (RMN-13C/Dept), conforme apresentado nas

figuras 16, 17 e 18. Os dados obtidos através desta análise foram comparados com

a literatura, bem como, ao composto isolado anteriormente. Este composto também

isolado da Piper malacophyllum é majoritário no extrato da mesma, recebendo o

nome de 4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolideo, sendo por sua vez um isômero do

composto 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo.

Figura 15 - Estrutura do composto do composto 4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolideo (HFC2).

234

56

789

10

12

H3CO

H3COO

O

11

A isomeria entre os dois compostos pode ser comprovada através de seus

dados de RMM de 1H e RMN de 13C, onde se pode observar a semelhança entre

seus deslocamentos químicos. No espectro de RMN de 1H, apresentado na figura

16, é possível verificar a presença de um único sinal referente a hidrogênios

aromáticos pelo deslocamento químico em δ 7,45 (s),hidrogênios que estão ligados

aos carbonos 8, 9, 10,11 e 12,diferenciando- se, por sua vez do composto HFC1 que

63

apresenta sinais entre δ 7,43 e 7,75 (m). Observa-se também dois sinais de H

pertencente à metoxilas ligadas aos carbonos 4 e 6, pelos deslocamentos químicos

em δ 3,65 a δ 3,66 ppm (s). O deslocamento químico em δ 5,30 ppm (s), refere-se

ao hidrogênio ligado ao carbono 3.

No espectro de RMN de 13C, como mostra a figura 17 observa-se um sinal

em δ 171,8, referente ao carbono 4 e outro sinal em δ 167,9 ppm, referente a

carbonila, este sinal aparece em δ 168,2 ppm no composto isolado anteriormente.

Na região deδ128,5 a 131,7 ppm (m)observa-se a presença de carbonos olefínicos

pertencentes ao anel aromático. Em δ 88,8 ppm observa-se um sinal referente ao

carbono 3 e em δ 59,5 e 58,9 ppm carbonos pertencentes as metoxilas,

diferenciando-se do composto HFC1 que apresenta estes sinais em δ 80,5 e 60,1

ppm.

Através do espectro de 13C/Dept mostrado na figura 18, é possível observar

que na região entre δ 128,0 a 136,0 ppm há a presença de carbono sp²,

pertencentes a anéis aromáticos identificados pela ausência de sinais negativos.

Entre δ 59,9 e 60,0 ppm encontram-se os carbonos pertencentes as metoxilas,

identificados pela presença de sinais positivos.

Os dados de RMN de 1H e RMN de 13C do composto 4,6-dimetoxi-5-E-

fenilbutenolídeo mostram grande semelhança aos dados presentes na tabela 1,

referentes ao composto 4,6-dimetoxi-5-Z-fenilbutenolídeo.

64

Figura 16 - Espectro de RMN-1H (300 MHz, Acetona D6) do HFC2.

Figura 17 - Espectro de RMN-13C (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC2.

65

Figura 18 - Espectro de RMN-13C/DEPT (75,5 MHz, Acetona D6) do HFC2.

Os compostos 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo e 4,6-dimetóxi-5-E-

fenilbutenolideo, isolados através do extrato etanólicos das folhas e caules da

Pipersp, foram isolados anteriormente no gênero Piper na espécie Piper

malacophyllum. Num estudo fitoquímico realizado por Lago et al.,(2005), estes

compostos apresentaram potente atividade antifúngica contra Cladosporium

cladosporioides e C. sphaerospermum. Esta importante e significativa atividade

associada aos butenolídeos conduziu ao desenvolvimento de metodologia analítica

baseada em eletroforese capilar para a quantificação rápida desses metabólitos em

extratos de P. malacophyllum (SANTOS et al., 2012).

5.2Obtenção do óleo essencial

A extração do óleo essencial realizada com as folhas secas de Piper

spapresentou um rendimento de 0,47%. Após a obtenção do óleo essencial, a água

66

destilada utilizada como líquido extrator foi filtrada e 100 mL deste líquido foi

submetido à partição líquido-líquido com solventes de diferentes polaridades, sendo

eles diclorometano e acetato de etila.

Através da partição realizada com 100 mL do hidrolato da extração do óleo

essencial das folhas secas, obteve-se 34,6 mg da fração de diclorometano e 42,1

mg da fração de acetado de etila.

O estudo cromatográfico realizado com os óleos essenciais das folhas secas

de Piper sp através da cromatografia gasosa acoplada a espectro de massas

(CG/EM), possibilitou a caracterização deste, onde foram identificados 36

compostos, sendo os majoritários os compostos referentes aos picos 4, 14, 16, 17 e

35, como mostra o cromatograma na figura 19.

Os espectros de massas destes compostos forma comparados com os

dados presentes na biblioteca Nist 8,0. Esta comparação possibilitou a identificação

dos compotos majoritário γ-elemeno, E-nerolidol e Espatulenol, referentes aos picos

4, 14 e 17, respectivamente. A composição química do óleo essencial da Pipersp,

através dos compostos identificados pode ser observada através da tabela 2.

Figura 19 - Cromatograma do óleo essencial de Pipersp.

67

Tabela 5 - Composição química do óleo essencial de Piper sp analisado por CG/EM.

Compostos Porcentagem (%)

Cymol 0,75

β-Elemeno 0,87

α-Bergamoteno 0,49

γ-elemeno 4,55

β-Farneseno 1,71

γ-muuroleno 2,81

Biciclogeracreno 1,93

α-Bulneseno 1,51

E-Nerolidol 24,69

Espatulenol 5,24

Delta-candinol 2,04

No espectro de massas do composto γ-elemeno, representado na figura 20,

foi possível identificar que o fragmento de peso molecular 121 g/mol representa o

pico base desta estrutura, ou seja, o pico de maior intensidade do espectro. O

fragmento de peso molecular 93 g/mol provavelmente refere-se ao íon C7H9+

característico da classe dos terpenos e sesquiterpenos, formado através da

isomerização provocada pelo aumento da conjugação, seguida por clivagem

alifática. O fragmento chamado de íon molecular refere-se ao pico que determina o

peso molecular final da estrutura deste sesquiterpeno, que neste caso é de 204

g/mol.

A intensidade dos demais fragmentos aparecem como frações do pico base.

A estrutura deste sesquiterpeno apresenta duplas ligações, estas por sua vez

favorecem a quebra alílica, dando origem ao íon carbônico alílico que é estabilizado

por ressonância. A estrutura química deste composto pode ser observada na figura

21.

68

Figura 20 - Espectro de massas do composto γ-elemeno.

Figura 21 - Estrutura química do composto γ-elemeno.

CH3

CH2

CH2

CH3

CH3

No espectro de massas do composto E-Nerolidol, representado na figura 22,

foi possível identificar que o fragmento de peso molecular 69 g/mol representa o pico

base desta estrutura. Como este composto também pertence à classe dos

sequiterpenos apresenta o fragmento de peso molecular 93 g/mol referente ao íon

C7H9+. O fragmento referente ao íon molecular é de 204 g/mol, determinando assim,

o peso molecular deste composto.

A estrutura química deste composto, assim como a do composto γ-elemeno,

apresenta duplas ligações, que favorecem a quebra alílica, dando origem ao íon

carbônico alílico.

O composto E-Nerolidol apresenta em sua estrutura química um álcool

terciário, como mostra a figura 23, o que pode ser evidenciado pela presença do

fragmento de peso molecular 31 g/mol característico da presença de hidroxila na

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

12193

41

107105

67 79

55

133 161

14765 18936 204

175137

69

molécula, assim com a presença dos fragmentos de peso molecular 45, 59 e 73

g/mol, este apresentados com menor intensidade no espectro.

Figura 22 - Espectro de massas do composto E-Nerolidol.

Figura 23 - Estrutura química do composto E-Nerolidol.

HO

No espectro de massas do composto Espatulenol, representado na figura

24, foi possível identificar que o fragmento de peso molecular 43 g/mol representa o

pico base desta estrutura. O fragmento chamado de íon molecular refere-se ao pico

que determina o peso molecular final da estrutura deste sesquiterpeno, que neste

caso é de 220 g/mol. A intensidade dos demais fragmentos aparecem como frações

do pico base.

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

69

41

93

1075581

13612195 16153

133 148 18917931 204

70

Figura 242 - Espectro de massas do composto Espatulenol.

Figura 25 - Estrutura química do composto Espatulenol.

CH3CH3

CH2

H

HOH

Os constituintes deste óleo pertencem à classe fitoquímica dos

sesquiterpenos e estes foram comparados com a composição química de outras

espécies do gênero Piper.

Com base na literatura, como mostram as tabelas 4 e 5 os constituintes

terpênicos são comuns nós óleos essenciais deste gênero assim como a classe dos

fenilpropanoides, muitos destes compostos presentes no óleo essencial de

diferentes espécies do gênero Piper apresentam atividade biológica frente a diversas

patologias, destacando a atividade inseticida, antifúngica, antiparasitária e

antibacteriana, como mostra a tabela 3. Estes compostos responsáveis pela

atividade biológica do óleo essencial das espécies do gênero Piper, encontram-se

na composição química do óleo essencial da Piper sp.

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43

91 119

105

7969 10755 205159

147131

145187

65177 20636 220174

71

5.3 Atividade antimicrobiana – Bioautografia

O ensaio biautográfico foi realizado como um teste preliminar para verificar

uma possível ação antibacteriana dos óleos essenciais extraídos da espécie

Pipersp, utilizando um inóculo do micro-organismo S. aureus. Neste estudo, foi

considerado produto ativo, aquele com atividade antimicrobiana, representado pela

presença de halo de inibição de crescimento, independente de seu tamanho.

De acordo com os resultados obtidos verificou-se que o óleo essencial

extraído das folhas de Pipersp apresentaram atividade antimicrobiana, detectadas

pelo aparecimento de halo claro evidenciando inibição do crescimento do micro-

organismo, o que pode observado na figura 26.

Figura 26 - Bioautografia realizada com o óleo essencial de Piper sp.

As frações de DCM e AcOEt, obtidas através do hidrolato da extração do

óleo essencial das folhas secas de Piper sp também foram avaliados por

biautografia, entretanto, a inibição do crescimento microbiólogico não foi

significativa, não sendo evidenciado a formação de halos claros na cromatoplaca.

Devido a composição química dos óleos essenciais estudos foram

realizados com os óleos essenciais de outras espécies vegetais como o óleo de

Piper sp Fase Móvel

Hex:AcOEt 7:3

72

Baccharis dracunculifolia, o alecrim do campo, mostrou atividade inibitória sobre

crescimento microbiano contra cepas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

e S.aureus (FERRONATO et al., 2007). Em relação aos compostos majoritários

apresentados no óleo essencial, estão β–pineno, β–mirceno, elemeno, β–cariofileno,

germacreno B, cadineno, espatulenol e cadinol (SOUSA, 2007).

Estudos realizados com o óleo essencial de camomila demonstram que este

apresenta em sua composição química os seguintes compostos, β–elemeno,

cariofileno, α–farneseno, azuleno, germacreno, espatulenol e óxido de bisabolol,

onde é possível destacar a presença dos compostos espatulenol e β–elemeno no

óleo essencial de Piper sp (ROMERO et al., 2005, ASOLINI et al., 2006).

Nogueira et al., (2008) observaram em seu estudo com óleo essencial de

camomila que não houve inibição de P. aeruginosa, no entanto, na concentração de

4% apresentou atividade inibitória sobre o crescimento de três linhagens de S.

aureus e sobre duas linhagens de Candida albicans, com halos de inibição variando

entre 10 e 12 milímetros de diâmetro. De acordo com os resultados obtidos,

verificou-se que tanto o extrato como o óleo essencial de camomila apresentaram

ação inibidora satisfatória sobre S. aureus.

Investigações anteriores realizadas com outras espécies do gênero Piper,

relatam que dentre os componetes majoritários presentes no óleo essencial da Piper

sp, os compostos Espatulenol e E-nerolidol, assim como o composto β-elemeno,

estão presentes na composição química do óleo essencial da Piper malacophylum.

O óleo essencial desta espécie, assim como outros óleos de diferentes espécies

deste gênero, tem apresentado significativa atividade contra diversos micro-

organismos, dentre eles bactérias, fungos e protozoário (SANTOS et al., 2012).

Outras espécies do gênero Piper, como a Piper tuberlacum, P. arboreum e

P. caldense, também apresentam óleos essenciais com composição química

bastante semelhante à composição do óleo de Pipersp, destacando a presença dos

compostos Biciclogermacreno e γ-muuroleno, responsáveis pela atividade tóxica

contra o ácaro Tetranychus urticae (POTZERNHEIM et al, 2005; ARAÚJO, 2011).

A Piper aduncum espécie do gênero Piper estudada pelo grupo de Pesquisa

Avaliação Biológica de Produtos Naturais e Sintéticos da UNIVALI, apresenta na

composição química do seu óleo essencial o composto E-nerolidol, sendo um dos

majoritários. Este composto, juntamente com outros diversos presentes em seu óleo

essencial desempenharam atividade antimicrobiana contra diversos micro-

73

organismos, dentre estas estão atividade fungicida contra Clinipellis pernisiosa e

inibitória para o protozoário Artemisia absinthium e para a forma trofozoita de

Trichomonas vaginalis, como mostrado na tabela 3 (ALMEIDA et al., 2010;

SARIEGO et al., 2010).

Tem sido registrado em ambito mundial um grande aumento da resistência

de bactérias, dentre elas o S. aureus.Considerando a significativa atividade inibitória

do crescimento microbiano através do óleo essencial da Pipersp, evidências

científicas da atividade antimicrobiana de diversas espécies do gênero Piper, bem

como o desequilibrio da ecologia humana e a resistência bacteriana como

consequência do uso constante de antibióticos, impulsiona-se a busca por novas

moléculas ou por fitoterápicos que possam suprimir esta deficiência (SALLEN et al.,

2010).

75

6 CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico das partes aéreas (caules e folhas) de Piper sp,

possibilitou o isolamento de dois compostos denominados inicialmente de HFC1 e

HFC2. Os compostos HFC1 e HFC2 foram comparados com a literatura, através de

seus dados de RMN 1H e RMN 13C e Dept foram elucidados estruturalmente,

compreendem respectivamente aos compostos 4,6-dimetóxi-5-Z-fenilbutenolideo e

4,6-dimetóxi-5-E-fenilbutenolideo, pertencentes à classe dos butanolídeos. Os

extratos e os compostos isolados foram analisados por CLAE e apresentaram perfil

químico semelhante, sendo os majoritários do extrato de folhas e caules de Piper sp.

O estudo cromatográfico realizado com os óleos essenciais das folhas

secas de Piper sp através da cromatografia gasosa acoplada a espectro de massas

(CG/EM), possibilitou a caracterização deste, onde foram identificado 36 compostos,

sendo os majoritários γ-elemeno, E-Nerolidol e Espatulenol.

A bioautografia visou avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos, frente a

cepa de S. aureus. foi considerado produto ativo, aquele com atividade

antimicrobiana, representado pela presença de halo de inibição de crescimento,

independente de seu tamanho. Verificou-se assim, que o óleo essencial das folhas

de Pipersp apresentaram atividade antimicrobiana, detectadas pelo aparecimento de

halo claro evidenciando inibição do crescimento do micro-organismo

Esta significativa atividade antimicrobiana deve-se ao fato da preseça de

compostos que fazem parte do óleo essencial de Piper sp exercerem atividade

inibitória do crescimento microbiano frente a diversos micro-organismos, como já

descrito na literatura. Dentre estes compostos está o E-Nerolidol, que apresenta-se

como um composto majoritário no óleo a espécie analisada, assim como elemeno

que também faz parte da composição, porém em menor quantidade.

77

REFERÊNCIAS

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