INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO IN VITRO

Essas reações, no laboratório, caracterizam os testes sorológicos ( baseados na pesquisa de anticorpos )

São utilizados , geralmente, quando o microrganismo que causa uma infecção tem algum problema para ser cultivado. Exemplo: sífilis, hepatites, doenças causadas por vírus, etc.

É também utilizado para determinação de doenças auto-imunes, determinação de tipo sanguíneo e HLA

A reação antígeno-anticorpo IN VITRO se processa em 2 estágios:

1- Há a combinação específica entre um determinante antigênico e o anticorpo correspondente;

2- Ocorre o fenômeno visível como precipitação ou aglutinação que se caracteriza pela formação de grumos.

1- PRECIPITAÇÃO

Neste teste, os antígenos se encontram em solução. O anticorpo liga-se às moléculas de antígeno em proporções variadas, mas a formação de um agregado ou malha ( ponto de precipitação ou insolubilização) só ocorre quando as concentrações dos reagentes (antígenos e anticorpos envolvidos) forem equivalentes.

2. TIPOS DE PRECIPITAÇÃO:

2.1. REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO

É obtida da seguinte maneira: em uma série de tubos, adiciona-se quantidade fixa de anticorpo e quantidade crescente de antígeno , de onde resultam 3 zonas:

1- Zona de excesso de anticorpo ou PRÓ-ZONA:*Todo o antígeno é precipitado e haverá anticorpo livre no sobrenadante

2- Zona de equivalência:

Há formação de complexos insolúveis (Ag-Ac).MALHA DE PRECIPITAÇÃO

3- Zona de excesso de antígeno

O fenômeno PRÓ-ZONA pode ocorrer no teste laboratorial para diagnosticar sífilis (VDRL) quando o paciente apresenta títulos de anticorpos muito elevados.A diluição do soro produz um resultado positivo.

2.2 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

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Pode ser realizado por :

Difusão simples; Difusão dupla;Em presença de um campo elétrico.

1- Difusão simples ou Imunodifusão radial de Mancini ou radial simples

a- É usado para medir IgG , IgM, componentes do complemento e outras substâncias presentes no soro.

b- Metodologia:

- Incorpora-se no gel o anticorpo específico para determinado antígeno;- Enche-se os orifícios do gel com 3 antígenos em concentrações

padronizadas e outros com o antígeno em concentração desconhecida;- Há difusão radial a partir do orifício e, quando o antígeno estiver

difundido, verifica-se a opacificação em forma de circular em torno do orifício;

- Após o término da difusão, faz-se a leitura dos halos correspondentes aos de precipitação dos padrões e dos desconhecidos e traça-se a reta:

- Lança-se em ordenadas as concentrações ( mg ou UI) dos padrões contra os quadrados dos diâmetros dos respectivos halos.

- Lê-se a concentração dos desconhecidos, a partir do quadrado do diâmetro sobre a reta, a qual deve ser estabelecida para cada experimento.

2- Dupla difusão ou Imunodifusão radial dupla (Outcherlony)

- Na dupla difusão, antígeno e anticorpo são colocados em diferentes poços no Agar e difundem-se um contra o outro. Onde as proporções são ideais , formam-se linhas de precipitação;

- A curvatura estará dirigida sempre para o orifício em que se encontra a substância de maior peso molecular;

- Esse método indica se os antígenos são idênticos, relacionados, mas não idênticos , ou não relacionados;

- Formam-se linhas de precipitação:

- de identidade- de não identidade - de identidade parcial

3- Imunoeletroforese

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- Uma amostra de soro é colocada em um poço em agar ou lâmina de vidro;

- Uma corrente é passada pelo Agar e as proteínas movem-se no campo elétrico de acordo com sua carga e tamnho;

- Uma canaleta é cortada no Agar e preenchida com anticorpo;- Como o antígeno e o anticorpo difundem-se um em direção ao outro,

formam uma série de arcos de precipitados - Indica auência, presença ou padrões incomuns de proteínas do soro.Ex: proteína do

mieloma humano.

2. AGLUTINAÇÃO

2.1. Definição

Ocorre entre antígeno particulado ou entre uma partícula inerte e recoberta de antígeno solúvel e seu anticorpo específico

A partícula inete pode ser: látex ou hemácia

2.2. Classificação

2.2.1. Aglutinação direta

Detectam anticorpos contra antígenos celulares relativamente grandes como os da superfície das bactérias e dos fungos

Exemplos de exames: Classificar sorotipos de Salmonellas: após o crescimento em agar e a devida

identificação das Salmonellas, pega-se um pouco da colônia crescida e, em uma lâmina, adiciona-se os anti-soros correspondentes a cada sorotipo. O antisoro que aglutinar a colônia corresponde ao sorotipo da bactéria

2.2.2. Aglutinação Indireta

Usa-se partículas de látex ou hemácias.→Exemplos de aglutinação indireta usando látex: Inibição da aglutinação passiva: prova para o diagnóstico imunológico da gravidez

→Exemplo de aglutinação indireta usando hemácias: Coombs direto e indireto

O soro de Coombs é um anti-anticorpo

Coombs direto:

É um teste laboratorial praticado com hemácias já sensibilizadas IN VIVO, ou seja, hemácias fetais que se quer saber se fixaram anticorpo materno;

Coloca-se as hemácias do bêbê em um tubo devidamente lavadas e adiciona-se o soro de Coombs, que é um anti-anticorpo.

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Coombs indireto:

O objetivo é a pesquisa de anticorpos no soro de mães sensibilizadas ou de pessoas Rh negativas que receberam transfusão de sangue Rho(D)

Outros exemplos de reação de aglutinação:

Na classificação sanguínea, pacientes que apresentam antígeno D (Rh) em pequena quantidade na superfície das hemácias são chamados D fraco;

Os anticorpos IgG terão dificuldade em aglutinar esses antígenos D e promover uma reação com grumos visíveis;

A adição de um soro contendo anti-IgG (soro de Coombs) permite a aglutinação das hemácias

4- REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO

Pode ser usado para detectar quantidades muito pequenas de anticorpo; Anticorpos que não produzem uma reação visível na precipitação ou aglutinação

podem ser evidenciados por fixarem o complemento durante a reação antígeno-anticorpo

A fixação do complemento foi usada antigamente para o diagnóstico da sífilis (teste de Wasserman) e ainda é utilizada para diagnosticar determinadas doenças virais, fúngicas e causadas por Riquétsias;

Quando se forma um complexo Ag-Ac , há possibilidade que haja fixação de complemento;

Somente os anticorpos IgM, IgG 1,2,3 são bons fixadores de complemento; O sistema indicador de fixação do complemento é hemácia de carneiro conjugadas

nas proporções ideais ao seu anticorpo específico preparado em coelhos (hemolisina)

Se o soro não contém anticorpo para o antígeno em estudo ou se há anticorpo, mas o antígeno correspondente está ausente, não há fixação de complemento e ao misturar-se o sistema indicador (EA), o complemento determina a hemólise.;

Quando, para o antígeno em questão, o soro contém Anticorpo, o Complemento é fixado e, ao se adicionar o sistema indicador, não ocorrerá hemólise

5- IMUNOFLUORESCÊNCIA

A técnica de imunofluorescência combina corantes fluorescentes, como o isotiocianato de fluoresceína, com anticorpos para que fluoresçam quando expostos à luz ultravioleta;

São de 2 tipos: Imunofluorescência direta e indireta

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

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São usados geralmente para identificar um microrganismo em uma amostra clínica; Durante o procedimento ,a amostra contendo o antígeno a ser identificado é fixada

sobre uma lâmina ; São,então, adicionados anticorpos marcados com fluoresceína e a lâmina é incubada

por um período curto sendo, a seguir, lavada para remover os anticorpos não ligadosao antígeno e, então, examinada ao microscópio de fluorescência para detecção de fluorescência amarelo-esverdeada.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

É usado para detectar a presença,no soro, de anticorpos específicos após a exposição a um microrganismo ;

O procedimento consiste na fixação de um antígeno conhecido a uma lâmina;

Adiciona-se então o soro a ser testado e, se algum anticorpo específico contra o microrganismo estiver presente, esse vai reagir com o antígeno formando um complexo;

Para que o complexo seja visualizado adiciona-se à lâmina uma antiimunoglobulina séria humana marcado com fluoresceína;

A antiimunoglobulina vai se ligar somente se o anticorpo específico estiver formando complexo com o seu antígeno;

Depois da incubação a lâmina é lavada para remover o anticorpo não ligado e é examinada ao microscópio de fluorescência;

Se o antígeno fixado à lâmina aparece fluorescente, significa que o anticorpo específico está presente no soro;

No microscópio de imunofluorescência , filtros adequados para evitar a passagem, pela ocular,de luz de baixo comprimento de onda,protegendo assim os olhos do observador.

6- ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Anticorpos ou antígenos podem também ser ligados à enzima de maneira que, ao ser adicionado à reação o substrato da enzima, é gerado um produto colorido que poderá ser medico por espectrofotometria;

A reação é desenvolvida em placas de plástico contendo séries de pocinhos onde são depositados os reagentes;

Antígenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do método, são adsorvidos à placa que, usualmente, é feita de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam à maioria dos antígenos, adsorção adequada;

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Métodos: indireto, sanduíche, competitivo.

a- Indireto:

Usado para a detecção e medida de anticorpos; Nesse caso, o antígeno é adsorvido à placa; Após lavagem, é adicionado o soro problema que supostamente contém anticorpos

específicos ao antígeno da reação; Depois do período de incubação e lavagem adiciona-se o substrato; O desenvolvimento de cor significa presença de anticorpos no soro problema; A variação de cor significa presença de anticorpos no soro problema; A variação de cor está relacionada à quantidade de anticorpo neste soro.

b- Sanduíche

Usado para detecção e medida de antígenos; Nesse método, o anticorpo específico é adsorvido à placa; Após lavagem, é adicionada a solução problema; Depois da incubação e lavagem aplicam-se anticorpos específicos marcados com a

enzima; Após a incubação e lavagem , coloca-se o substrato; A variação de cor é proporcional à quantidade do antígeno na solução problema.

c- Competitivo

Usado para a detecção e medida de antígenos; O anticorpo específico é adsorvido à placa; Após lavagem para remoção de proteínas não fixadas, é adicionada a solução

problema que supostamente contém o antígeno; O antígeno marcado com a enzima pode ser colocado após breve período ou então

ser mistuado à solução problema; Depois do período de incubação e lavagem, é adicionado o substrato Os poços contendo apenas o antígeno marcado (controle) desenvolvem cor; A inibição do desenvolvimento de cor nos poços que contêm as amostras da solução

problema é proporcional à quantidade de antígenos nessas amostras.

7- WESTERN- BLOT

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Método padrão confirmatório de positividade de HIV; O DNA ou RNA de um agente etiológico é tratado com endonucleases para criar

fragmentos de tamanhos diferentes; Os fragmentos do ácido nucléico são separados por eletroforese em gel e depois

transferidos para papel de nitrocelulose; Este papel depois é colocado em contato com o soro do paciente suspeito de

apresentar anticorpos contra um determinado microrganismo

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