INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO IN VITRO
Essas reações, no laboratório, caracterizam os testes sorológicos ( baseados na pesquisa de anticorpos )
São utilizados , geralmente, quando o microrganismo que causa uma infecção tem algum problema para ser cultivado. Exemplo: sífilis, hepatites, doenças causadas por vírus, etc.
É também utilizado para determinação de doenças auto-imunes, determinação de tipo sanguíneo e HLA
A reação antígeno-anticorpo IN VITRO se processa em 2 estágios:
1- Há a combinação específica entre um determinante antigênico e o anticorpo correspondente;
2- Ocorre o fenômeno visível como precipitação ou aglutinação que se caracteriza pela formação de grumos.
1- PRECIPITAÇÃO
Neste teste, os antígenos se encontram em solução. O anticorpo liga-se às moléculas de antígeno em proporções variadas, mas a formação de um agregado ou malha ( ponto de precipitação ou insolubilização) só ocorre quando as concentrações dos reagentes (antígenos e anticorpos envolvidos) forem equivalentes.
2. TIPOS DE PRECIPITAÇÃO:
2.1. REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
É obtida da seguinte maneira: em uma série de tubos, adiciona-se quantidade fixa de anticorpo e quantidade crescente de antígeno , de onde resultam 3 zonas:
1- Zona de excesso de anticorpo ou PRÓ-ZONA:*Todo o antígeno é precipitado e haverá anticorpo livre no sobrenadante
2- Zona de equivalência:
Há formação de complexos insolúveis (Ag-Ac).MALHA DE PRECIPITAÇÃO
3- Zona de excesso de antígeno
O fenômeno PRÓ-ZONA pode ocorrer no teste laboratorial para diagnosticar sífilis (VDRL) quando o paciente apresenta títulos de anticorpos muito elevados.A diluição do soro produz um resultado positivo.
2.2 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
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Pode ser realizado por :
Difusão simples; Difusão dupla;Em presença de um campo elétrico.
1- Difusão simples ou Imunodifusão radial de Mancini ou radial simples
a- É usado para medir IgG , IgM, componentes do complemento e outras substâncias presentes no soro.
b- Metodologia:
- Incorpora-se no gel o anticorpo específico para determinado antígeno;- Enche-se os orifícios do gel com 3 antígenos em concentrações
padronizadas e outros com o antígeno em concentração desconhecida;- Há difusão radial a partir do orifício e, quando o antígeno estiver
difundido, verifica-se a opacificação em forma de circular em torno do orifício;
- Após o término da difusão, faz-se a leitura dos halos correspondentes aos de precipitação dos padrões e dos desconhecidos e traça-se a reta:
- Lança-se em ordenadas as concentrações ( mg ou UI) dos padrões contra os quadrados dos diâmetros dos respectivos halos.
- Lê-se a concentração dos desconhecidos, a partir do quadrado do diâmetro sobre a reta, a qual deve ser estabelecida para cada experimento.
2- Dupla difusão ou Imunodifusão radial dupla (Outcherlony)
- Na dupla difusão, antígeno e anticorpo são colocados em diferentes poços no Agar e difundem-se um contra o outro. Onde as proporções são ideais , formam-se linhas de precipitação;
- A curvatura estará dirigida sempre para o orifício em que se encontra a substância de maior peso molecular;
- Esse método indica se os antígenos são idênticos, relacionados, mas não idênticos , ou não relacionados;
- Formam-se linhas de precipitação:
- de identidade- de não identidade - de identidade parcial
3- Imunoeletroforese
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- Uma amostra de soro é colocada em um poço em agar ou lâmina de vidro;
- Uma corrente é passada pelo Agar e as proteínas movem-se no campo elétrico de acordo com sua carga e tamnho;
- Uma canaleta é cortada no Agar e preenchida com anticorpo;- Como o antígeno e o anticorpo difundem-se um em direção ao outro,
formam uma série de arcos de precipitados - Indica auência, presença ou padrões incomuns de proteínas do soro.Ex: proteína do
mieloma humano.
2. AGLUTINAÇÃO
2.1. Definição
Ocorre entre antígeno particulado ou entre uma partícula inerte e recoberta de antígeno solúvel e seu anticorpo específico
A partícula inete pode ser: látex ou hemácia
2.2. Classificação
2.2.1. Aglutinação direta
Detectam anticorpos contra antígenos celulares relativamente grandes como os da superfície das bactérias e dos fungos
Exemplos de exames: Classificar sorotipos de Salmonellas: após o crescimento em agar e a devida
identificação das Salmonellas, pega-se um pouco da colônia crescida e, em uma lâmina, adiciona-se os anti-soros correspondentes a cada sorotipo. O antisoro que aglutinar a colônia corresponde ao sorotipo da bactéria
2.2.2. Aglutinação Indireta
Usa-se partículas de látex ou hemácias.→Exemplos de aglutinação indireta usando látex: Inibição da aglutinação passiva: prova para o diagnóstico imunológico da gravidez
→Exemplo de aglutinação indireta usando hemácias: Coombs direto e indireto
O soro de Coombs é um anti-anticorpo
Coombs direto:
É um teste laboratorial praticado com hemácias já sensibilizadas IN VIVO, ou seja, hemácias fetais que se quer saber se fixaram anticorpo materno;
Coloca-se as hemácias do bêbê em um tubo devidamente lavadas e adiciona-se o soro de Coombs, que é um anti-anticorpo.
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Coombs indireto:
O objetivo é a pesquisa de anticorpos no soro de mães sensibilizadas ou de pessoas Rh negativas que receberam transfusão de sangue Rho(D)
Outros exemplos de reação de aglutinação:
Na classificação sanguínea, pacientes que apresentam antígeno D (Rh) em pequena quantidade na superfície das hemácias são chamados D fraco;
Os anticorpos IgG terão dificuldade em aglutinar esses antígenos D e promover uma reação com grumos visíveis;
A adição de um soro contendo anti-IgG (soro de Coombs) permite a aglutinação das hemácias
4- REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO
Pode ser usado para detectar quantidades muito pequenas de anticorpo; Anticorpos que não produzem uma reação visível na precipitação ou aglutinação
podem ser evidenciados por fixarem o complemento durante a reação antígeno-anticorpo
A fixação do complemento foi usada antigamente para o diagnóstico da sífilis (teste de Wasserman) e ainda é utilizada para diagnosticar determinadas doenças virais, fúngicas e causadas por Riquétsias;
Quando se forma um complexo Ag-Ac , há possibilidade que haja fixação de complemento;
Somente os anticorpos IgM, IgG 1,2,3 são bons fixadores de complemento; O sistema indicador de fixação do complemento é hemácia de carneiro conjugadas
nas proporções ideais ao seu anticorpo específico preparado em coelhos (hemolisina)
Se o soro não contém anticorpo para o antígeno em estudo ou se há anticorpo, mas o antígeno correspondente está ausente, não há fixação de complemento e ao misturar-se o sistema indicador (EA), o complemento determina a hemólise.;
Quando, para o antígeno em questão, o soro contém Anticorpo, o Complemento é fixado e, ao se adicionar o sistema indicador, não ocorrerá hemólise
5- IMUNOFLUORESCÊNCIA
A técnica de imunofluorescência combina corantes fluorescentes, como o isotiocianato de fluoresceína, com anticorpos para que fluoresçam quando expostos à luz ultravioleta;
São de 2 tipos: Imunofluorescência direta e indireta
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
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São usados geralmente para identificar um microrganismo em uma amostra clínica; Durante o procedimento ,a amostra contendo o antígeno a ser identificado é fixada
sobre uma lâmina ; São,então, adicionados anticorpos marcados com fluoresceína e a lâmina é incubada
por um período curto sendo, a seguir, lavada para remover os anticorpos não ligadosao antígeno e, então, examinada ao microscópio de fluorescência para detecção de fluorescência amarelo-esverdeada.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
É usado para detectar a presença,no soro, de anticorpos específicos após a exposição a um microrganismo ;
O procedimento consiste na fixação de um antígeno conhecido a uma lâmina;
Adiciona-se então o soro a ser testado e, se algum anticorpo específico contra o microrganismo estiver presente, esse vai reagir com o antígeno formando um complexo;
Para que o complexo seja visualizado adiciona-se à lâmina uma antiimunoglobulina séria humana marcado com fluoresceína;
A antiimunoglobulina vai se ligar somente se o anticorpo específico estiver formando complexo com o seu antígeno;
Depois da incubação a lâmina é lavada para remover o anticorpo não ligado e é examinada ao microscópio de fluorescência;
Se o antígeno fixado à lâmina aparece fluorescente, significa que o anticorpo específico está presente no soro;
No microscópio de imunofluorescência , filtros adequados para evitar a passagem, pela ocular,de luz de baixo comprimento de onda,protegendo assim os olhos do observador.
6- ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
Anticorpos ou antígenos podem também ser ligados à enzima de maneira que, ao ser adicionado à reação o substrato da enzima, é gerado um produto colorido que poderá ser medico por espectrofotometria;
A reação é desenvolvida em placas de plástico contendo séries de pocinhos onde são depositados os reagentes;
Antígenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do método, são adsorvidos à placa que, usualmente, é feita de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam à maioria dos antígenos, adsorção adequada;
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Métodos: indireto, sanduíche, competitivo.
a- Indireto:
Usado para a detecção e medida de anticorpos; Nesse caso, o antígeno é adsorvido à placa; Após lavagem, é adicionado o soro problema que supostamente contém anticorpos
específicos ao antígeno da reação; Depois do período de incubação e lavagem adiciona-se o substrato; O desenvolvimento de cor significa presença de anticorpos no soro problema; A variação de cor significa presença de anticorpos no soro problema; A variação de cor está relacionada à quantidade de anticorpo neste soro.
b- Sanduíche
Usado para detecção e medida de antígenos; Nesse método, o anticorpo específico é adsorvido à placa; Após lavagem, é adicionada a solução problema; Depois da incubação e lavagem aplicam-se anticorpos específicos marcados com a
enzima; Após a incubação e lavagem , coloca-se o substrato; A variação de cor é proporcional à quantidade do antígeno na solução problema.
c- Competitivo
Usado para a detecção e medida de antígenos; O anticorpo específico é adsorvido à placa; Após lavagem para remoção de proteínas não fixadas, é adicionada a solução
problema que supostamente contém o antígeno; O antígeno marcado com a enzima pode ser colocado após breve período ou então
ser mistuado à solução problema; Depois do período de incubação e lavagem, é adicionado o substrato Os poços contendo apenas o antígeno marcado (controle) desenvolvem cor; A inibição do desenvolvimento de cor nos poços que contêm as amostras da solução
problema é proporcional à quantidade de antígenos nessas amostras.
7- WESTERN- BLOT
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Método padrão confirmatório de positividade de HIV; O DNA ou RNA de um agente etiológico é tratado com endonucleases para criar
fragmentos de tamanhos diferentes; Os fragmentos do ácido nucléico são separados por eletroforese em gel e depois
transferidos para papel de nitrocelulose; Este papel depois é colocado em contato com o soro do paciente suspeito de
apresentar anticorpos contra um determinado microrganismo
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