Identificação de elementos regulatórios usando Genômica Comparativa e Phylogenetic Footprinting...

Identificação de elementos regulatórios usando Genômica Comparativa e

Phylogenetic Footprinting

Raonne Barbosa Vargas

Introdução

Motivação

Regulação Gênica

Introdução

Fatores de Transcrição

Locais de amarração dos fatores de transcrição (TFBS’s)

Elementos regulatórios

Auxílio da Computação no estudo da regulação gênica

Introdução

Figura 1 – Elemento Regulatório

Objetivo

Identificação de elementos

regulatórios

Sequência Promotora

Objetivo

Figura 2 – Definindo uma sequência promotora, onde serão procurados os elementos regulatórios.


“impressões de pegadas filogenéticas”

Hipótese

Conservação de elementos regulatórios em espécies próximas


Genes Ortólogos

Procedimento baseia-se na comparação de sequências genômicas

2 etapas:


1) Identificar genes ortólogos e obter sequências promotoras de cada um

2) Comparar sequências promotoras e extrair sub-sequências bem conservadas (motifs).

Estes motifs serão excelente candidatos a elementos regulatórios

Genômica Comparativa

Alinhamento Múltiplo

Agrupamento

Comparação com TRANSFAC

Algoritmo

Entrada:

Lista de genes

Conjunto de espécies

Algoritmo

ALGORITMO:

Para cada gene na lista de entrada:– Pesquise em HomoloGene para identificar os genes ortólogos a

este gene.– Se este gene possui ortólogos para todas as espécies consideradas

no conjunto de espécies da entrada: Para cada gene ortólogo:

– Pesquise em Entrez Gene para obter a localizaçãodo gene na sequência genômica de sua espécie.

– Pesquise em Entrez Nucleotide para obter a sequência promotora deste gene. Compute o Alinhamento Múltiplo das sequências promotoras. Extraia do alinhamento os motifs bem conservados.

Compute o agrupamento dos motifs. Compare com a base de dados TRANSFAC.

Algoritmo

Saída:

Lista de Motifs Lista de Grupos Lista de casamentos com TRANSFAC

Casos de Estudo

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Cachorro

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Galinha

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Cachorro / Galinha

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Mosca

Dados Biológicos

NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Consistência dos dados

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Figura 3 - NCBI

Dados Biológicos

HomoloGene – Genes Ortólogos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=homologene

Restrição das espécies



Figura 4 - HomoloGene

Dados Biológicos

Exemplo de Pesquisa no HomoloGene

ING5 (id 84289)

Humano / chimpanzé / camundongo / rato

Figura 5 – Pesquisa no HomoloGene

Dados Biológicos

Entrez Gene

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene

Objetivo: localização do gene



Figura 6 – Entrez Gene

Dados Biológicos

Exemplo:

ING5 Cromossomo: NC_000002.10 Início: 242290129 Fim: 242317569

Figura 7 – Pesquisa no Entrez Gene

Dados Biológicos

Entrez Nucleotide – Sequências Promotoras

promoter_start = gene_start – 1000

promoter_end = gene_start + 200

Figura 8 - Entrez Nucleotide - contém sequências de nucleotídeos de diversos genomas.

Dados Biológicos

Exemplo:

Região promotora do gene ING5

Cromossomo: NC_000002.10 promoter_start: 242289129 promoter_end: 242290329 Formato: FASTA

Figura 9 – Pesquisa no Entrez Nucleotide


Problema NP-Hard

Needleman e Wunsch

Programação Dinâmica

Idéia do Algoritmo


Ferramentas computacionais para alinhamento múltiplo

CLUSTALW

Heurística x Programação Dinâmica

Figura 10 – Exemplo de Alinhamento Múltiplo


Identificação dos Motifs

Tamanho do motif = 10 b.p.

Casamento perfeito entre todas as espécies em pelo menos 9 dos 10 nucleotídeos.

Figura 11 – Motif com 10 casamentos perfeitos

Figura 12 – Motif com 9 casamentos perfeitos

Figura 13 – Sub-sequência com 9 casamentos perfeitos e 2 imperfeitos – não é um motif


Casamentos imperfeitos completados por gaps (-)

Exemplo: motifs do estudo : humano / chimpanzé / camundongo / rato / mosca

Sequência do motif, id do gene, espécie, id do cromossomo, posição de início do gene, posição de término do gene e posição de início do motif.


Figura 14 – Motifs encontrados no estudo humano/chimpanzé/camundongo/rato/mosca

Agrupamento

Introdução

Fim da estratégia de Phylogenetic Footprinting

Objetivo do Agrupamento

Método restritivo

Apenas grupos com mais de 1 motif serão mais detalhadamente analisados

Agrupamento

Algoritmo K-Means

Um dos mais populares algoritmos iterativos de agrupamento.

Este algoritmo é aleatório e baseia-se na heurística de Loyd.

O número de grupos (K) deve ser definido previamente.

Agrupamento

Algoritmo

1) Os motifs são designados aleatoriamente para os K grupos.

2) Um vetor de expressão média (ou centróide) de cada grupo é computado.

3) Cada motif é movido para o grupo mais próximo (do qual mais se assemelha ao centróide).

4) Repete 2 e 3 até que nenhum motif possa ser movido para outro grupo.

Agrupamento

Evitando não-convergência

Evitando mínimos locais

Vários valores de K foram testados

Agrupamento

Número “K” de grupos Duas considerações: 1) Estamos interessados em grupos com alta

similaridade entre os seus elementos, mesmo que tenhamos muitos grupos unitários.

Solução: foi definido que seriam testados 100 valores diferentes de K entre 70% e 90% do número de motifs.

Agrupamento

2) Conceito estatístico W = within-cluster sum of distances Quanto maior K, menor será o W. Existe um K’ tal que:

K < K’ => Wi+5 >>> Wi

K > K’ => Wi+5 > Wi

500 - 2567.29833333

501 - 2320.36666667

503 - 2632.32833333

504 - 2493.36666667

506 - 2424.73666667

507 - 2623.43

509 - 2337.16583333

510 - 2367.40880952

511 - 2456.52166667

513 - 2407.99833333

514 - 2297.01333333

516 - 2435.60833333

517 - 2289.1

519 - 2092.85666667

520 - 2500.10166667

521 - 2296.41666667

523 - 2297.80333333

524 - 2170.43833333

526 - 2156.93833333

527 - 1908.535

529 - 2179.25

530 - 1986.35833333

531 - 1919.5

533 - 1830.58666667

534 - 1894.125

536 - 2128.43333333

537 - 1936.9

539 - 1929.86333333

540 - 1870.675

541 - 1919.23

543 - 1871.20166667

544 - 1843.55333333

546 - 1756.30333333

547 - 1623.95

549 - 1788.83833333

550 - 1738.21666667

551 - 1799.64642857

553 - 1679.4

554 - 1758.215

556 - 1643.48

557 - 1622.35333333

559 - 1727.74166667

560 - 1746.45

561 - 1759.0

563 - 1526.36666667

564 - 1466.25833333

566 - 1565.76333333

567 - 1527.86833333

569 - 1545.51833333

570 - 1452.1

572 - 1559.96833333

573 - 1243.94166667

574 - 1489.82166667

576 - 1463.59166667

577 - 1374.70833333

579 - 1382.34333333

580 - 1462.59166667

582 - 1374.045

583 - 1394.11666667

584 - 1334.05

586 - 1371.36833333

587 - 1211.65

589 - 1268.01666667

590 - 1236.69166667

592 - 1216.375

593 - 1173.65

594 - 1105.06666667

596 - 1113.3

597 - 1155.88333333

599 - 1148.95833333

600 - 1050.44166667

602 - 1065.525

603 - 970.8

604 - 1021.13

606 - 985.383333333

607 - 933.033333333

609 - 988.533333333

610 - 917.241666667

612 - 1062.25

613 - 992.441666667

614 - 979.941666667

616 - 887.083333333

617 - 1041.15

619 - 823.758333333

620 - 863.6

622 - 864.541666667

623 - 904.158333333

624 - 905.575

626 - 817.416666667

627 - 846.625

629 - 795.25

630 - 858.133333333

632 - 689.358333333

633 - 812.8

634 - 704.7

636 - 706.116666667

637 - 593.266666667

639 - 724.2

640 - 626.766666667

642 - 701.35

Agrupamento

K W

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1790.73846154

1459.11666667

1296.95

1034.98333333

818.425

627.166666667

683.875

446.733333333

404.433333333

417.9

11 - 76.3333333333

12 - 168.85

13 - 0.0

Figura 15 – Exemplo de Agrupamento

TRANSFAC

Figura 16 - TRANSFAC

TRANSFAC

1388 elementos regulatórios humanos anotados

Objetivos da comparação com TRANSFAC

TRANSFAC

Sequência de Consenso de um Grupo Um grupo do estudo

humano/chimpanzé/camundongo/rato:

CLUSTER 13576:

CCAGACACT- 222545 H.sapiens NC_000006.10 117219941 117256891 117219310

AAAGAACAT- 93081 H.sapiens NC_000013.9 102216460 102224143 102216728

AAAGACACT- 51297 H.sapiens NC_000020.9 31287463 31294773 31287424

AAAGACACT => Sequência de Consenso do grupo 13576

TRANSFAC

Casamentos relevantes

Alinhamento local sem gaps de tamanho pelo menos 5.

Exemplo de outro grupo do estudo humano / chimpanzé / camundongo / rato :

TRANSFAC

CLUSTER 13534:ATCCCTCCTC 1956 H.sapiens NC_000007.12 55054219 55242525 55054235CTCCCTCCTC 339287 H.sapiens NC_000017.9 35531749 35548144 35531706 - TCCCTCCTC => Sequência de Consenso do grupo 13534

Casamento relevante com TRANSFAC :

-TCCCTCCTC (sequência de consenso do grupo 13534)ATCCCTCCTC (motif do transfac com id R00377) TCCCTCCTC (casamento)

Figura 17 – Elemento regulatório anotado no TRANSFAC (R00377)

TRANSFAC

Figura 18 – Gene do grupo 13534 (id 1956)

TRANSFAC

A seguir temos mais exemplos do estudo humano / chimpanzé / camundongo / rato:

GENE MOTIF

EGFR (epidermal growth factor receptor); G000251

EGFR epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (id 1956)

LOC339287 - hypothetical protein LOC339287 (id 339287)

ATCCCTCCTC (R00377)

ATCCCTCCTC (Cluster 13534)

CTCCCTCCTC (Cluster 13534)

GENE MOTIF

DBH (dopamine beta hydroxylase); G002007

DBH dopamine beta-hydroxylase (id 1621)

OR52K2 olfactory receptor, family 52, subfamily K, member 2 (id 119774)

GTCCATGTGT (R09521)

GA-GTCCATG (Cluster 17159)

GC-CTCCATG (Cluster 17159)

GENE MOTIF

G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor); G000260

G-CSF (or CSF3) colony stimulating factor 3 (granulocyte) (id 1440)

AMHR2 anti-Mullerian hormone receptor, type II (id 269)

C9orf58 chromosome 9 open reading frame 58 (id 83543)

GAGATTCCAC (R02683)

TTCCCAGCTA (Cluster 21242)

TTCCAAGGTC (Cluster 21242)

TTCCAAGGTA (Cluster 21242)

GENE MOTIF

SI (sucrase-isomaltase); G000385

SI sucrase-isomaltase (alpha-glucosidase) (id 6476)

CPA2 carboxypeptidase A2 (pancreatic) (id 1358)

ITGB1BP2 integrin beta 1 binding protein (melusin) 2 (id 26548)

GGTGCAATAAAACTTTATGAGTA (R04239)

TTTATT-TCT (Cluster 22280)

TTTGTT-TCT (Cluster 22280)

TTTAGT-TAT (Cluster 22280)

GENE MOTIF

H4 (histone 4 pHu4A gene); G000295

H4 (or HRH4) histamine receptor H4 (id 59340)

NR1D1 nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1 (id 9572)

GGTTTTCAATCTGGTCCG(R00687)

TGTTTTGAGT (Cluster 41063)

TGTTTTGGGT (Cluster 41063)

TRANSFAC

Observações

Motifs agrupados diferentes do motif anotado no TRANSFAC que teve casamento relevante.

Comparando nomes de genes entre NCBI e TRANSFAC

Resultados

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato

Número inicial de genes humanos: 23516 genesNúmero de genes com ortólogos nas 4 espécies: 10738 genesNúmero de motifs identificados: 66903 motifsNúmero de grupos: K = 57536 grupos

57536 - 9738.3733333357670 - 9795.1166666757804 - 9765.1916666757937 - 9533.1383333358071 - 9449.37833333

Wmax – Wmin <= 400

Número de grupos com pelo menos 2 motifs: 8329 gruposNúmero de grupos com casamento relevante com TRANSFAC: 4498 grupos

Resultados

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Cachorro


7921 - 10681.45333337943 - 10608.8057965 - 10619.74619057987 - 10602.748009 - 10498.6733333



Resultados

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Galinha


968 - 2565.98333333971 - 2542.30333333973 - 2521.27666667976 - 2564.505978 - 2554.04833333



Resultados

Humano / Chimpanzé / Camundongo / Rato / Cachorro / Galinha


537 - 1936.9539 - 1929.86333333540 - 1870.675541 - 1919.23543 - 1871.20166667



Resultados



8 - 446.7333333339 - 404.43333333310 - 417.9



Resultados


Neste estudo, o grupo que possui um casamento relevante com TRANSFAC foi o grupo 0.

CLUSTER 0:

ATTTATT-TG 1506 H.sapiens NC_000016.8 66520974 66523266 66521109

GTGTGTG-GT 5459 H.sapiens NC_000005.8 145698869 145700200 145698417

GGTTATG-AA 8834 H.sapiens NC_000017.9 21041855 21058297 21042121

GTTTATG--- => Sequência de consenso

A tabela a seguir lista os genes de cada um desses motifs e também o de alguns dos motifs do TRANSFAC com casamento relevante.

GENE MOTIF

CTRL chymotrypsin-like (id 1506)

POU4F3 POU domain, class 4, transcription factor 3 (id 5459)

TMEM11 transmembrane protein 11 (id 8834)

B-ACT (beta-actin); G000214

TCR-delta (T-cell receptor delta); G000395.

apoB (apolipoprotein B); G000205

GCC (guanylyl cyclase C); G001742

ATTTATT-TG (Cluster 0)

GTGTGTG-GT (Cluster 0)

GGTTATG-AA (Cluster 0)

CCTTTTATGG (R00040)

AAATAAACAAGGAGATAGGGTGTTTATTT (R01429)

GCATTTATGAGCTG (R04012)

GTTTATAGCTCTGACCT (R08886)

Conclusões

ESTUDO Genes com ortólogos

Motifs Grupos Grupos com mais de 1 motif

Grupos com casamento relevante no TRANSFAC

Humano/Chimpanzé/ Camundongo/Rato 10738 66903 57536 8329 4498

Humano/Chimpanzé/ Camundongo/Rato/ Cachorro

9494 11002 7921 2329 867

Humano/Chimpanzé/ Camundongo/Rato/ Galinha

6974 1268 968 238 56

Humano/Chimpanzé/ Camundongo/Rato/ Cachorro/Galinha

6382 715 537 141 26

Humano/Chimpanzé/ Camundongo/Rato/Mosca

3444 13 8 4 1

Conclusões

Objetivo alcançado

Motifs conhecidos / motifs novos

Resultados (lista de motifs, grupos e casamentos com Transfac) para cada um dos 5 estudos conduzidos nesta pesquisa estarão disponíveis na web.

Trabalhos Futuros

Conhecimento sobre genes ortólogos

Filtro de locais de início da transcrição ortólogos.

Vários elementos regulatórios para um mesmo gene.

Apêndice I - Programação

Python

BioPython

CLUSTALW

The C Clustering Library

Esta apresentação foi parte do Projeto Final de Graduação de Raonne Barbosa Vargas, para obtenção do grau de

Bacharel em Ciência da Computação

Departamento de InformáticaUniversidade Federal do Espírito Santo

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