Departamento de Biomedicina da Faculdade de Medicina do Porto

ruifonte@med.up.pt

Folatos,

vitamina B12 e

vitamina B6

Folatos é a designação atribuída a um conjunto de vitâmeros* que incluem na sua estrutura o ácido pteroico (ou tetrahidropteroico) ligado a um resíduo de glutamato ou a uma cadeia (<10) de resíduos de glutamato ligados entre si por ligações amida envolvendo o carboxilo em C5 (folil-poliglutamatos).

ácido pteroico

O vitâmero que é usado como suplemento dietético é quimicamente mais estável e é (impropriamente) designado por “ácido fólico”. Tem apenas um resíduo de glutamato e o resíduo de ácido pteroico está mais oxidado que nos folatos dos alimentos naturais.

Os folatos presentes nos alimentos naturais (espinafres, bróculos, cogumelos, fígado, etc.) contêm vários (geralmente 5 a 8) resíduos de glutamato e, em vez de ácido pteroico contém o ácido tetrahidropteroico (este resíduo contém mais 4 hidrogénios que o ácido pteroico)

ácido tetrahidropteroicoligado a uma cadeia de poliglutamato

No organismo dos mamíferos as formas que existem dentro das células e são metabolicamente ativas são (1) reduzidas (tetrahidrofolatos; H4-folatos) e (2) são folil-poliglutamatos.

As formas monoglutamadas (folil-monoglutamatos) atravessam membranas

e existem no plasma.

*Vitâmeros são compostos distintos que, administrados a um ser vivo, têm a mesma atividade vitamínica; podem, na maioria dos casos, substituir-se uns aos outros.

2

A absorção dos folatos naturais implica a hidrólise prévia da cadeia de poliglutamato que ocorre por ação de hidrólases da bordadura em escova. Os folil-monoglutamatos formados são maioritariamente absorvidos para o interior dos enterócitos por transporte mediado (simporte com protão.)

n H2O

n moléculas de glutamato

Folil-monoglutamatos

H+n glutamaton ATPn ADP + n Pi

sintétase de folil-poliglutamato

N5-metil-H4-folato (poliglutamato)

Nos enterócitos, a primeira reação é a adição de resíduos de glutamato (sintétase de folil-poliglutamato) e a consequente formação de folil-poliglutamatos. As formas oxidadas são reduzidas pela ação da redútase do dihidrofolato. Depois ocorre a adição de unidades monocarbonadas que levam à formação de compostos como o N5-metil-H4-folato.

N5-metil-H4-folato (monoglutamato)

Após hidrólise da cadeia de glutamatos o N5-metil-H4-folato (monoglutamato) sai (no polo basal dos enterócitos) para a veia porta por transporte mediado.

1) redução do ácido fólico poliglutamado pelo NADPH(formação de H4-folatos)

2) adição de unidades monocarbonadas

n H2O

n glutamato

Folil-poliglutamatos

Folil-monoglutamatosFolil-poliglutamatos

3

No plasma sanguíneo, a forma predominante é o N5-metil-H4-folato (monoglutamato) que nãoé substrato da sintétase de folil-poliglutamato. O N5-metil-H4-folato (monoglutamato) que entra para as células do organismo (1º) sofre desmetilação por ação da síntase da metionina seguida de (2º) adição de glutamatos. A adição de glutamatos torna os folatos melhores substratos das enzimas com que interagem.

H H

H4-folato

N5 N10

monoglutamatoH4-folato

N5 N10

H H

homocisteína

metionina

n glutamato

n ATP n ADP + n Pi

síntase da

metionina

(vit B12)

sintétase de folil-poliglutamato

A síntase da metionina é a única enzima capaz de converter o N5-metil-H4-folato (quer a forma monoglutamato quer a

poliglutamato) e tem como grupo prostético a cobalamina (B12).

H H

H4-folato

N5 N10

mono e poli…

homocisteína

metionina

Quando há défice de vit. B12

dá-se a “armadilha dos folatos”.“Todo” o folato do organismo fica na forma de N5-metil-H4-folato e deixa de cumprir os seus papeis metabólicos. Funcionalmente há um défice

de folatos.

↓

↑vit B12

H4-folato

N5 N10

CH3

monoglutamato

H

H4-folato

N5 N10

CH3

mono e poli…

H

H4-folato

N5 N10

CH3

monoglutamato

H

4

Dentro das células existem múltiplas formas de folatos (praticamente todas poliglutamatos) que se distinguem entre si pelo tipo de unidade monocarbonada ligada ao azoto N5, ao azoto N10 ou a ambos. As mais abundantes são o N5-metil-H4-folato, o N10-formil-H4-folato e o H4-folato .

N5 N10

H4-folato

N5 N10

CH2

H4-folato

N5 N10

CH

n.o. do C = +2

N5-metil-H4-folato; n.o. do C= -2

N5,N10-metileno-H4-folato; n.o. do C= 0

N5,N10-metenilo-H4-folato N5-formimino-H4-folatoN10-formil-H4-folato

NADPH ou NADH

NADP+ ou NAD+

desidrogénase do

metileno-H4-folato

redútase do

metileno-H4-folato NADPH

NADP+

H2O

ciclohidrólasedesamínase

NH4+

As diferentes formas podem converter-se umas nas outras, mas (1) a redução do N5,N10-metileno-H4-folato a N5-metil-H4-folato e (2) a desaminação do N5-formimino-H4-folato a N5,N10-metenilo-H4-folato são fisiologicamente irreversíveis.

H4-folato

N5 N10

H H

H4-folato

N5 N10

HC=OH

H4-folato

N5 N10

CH3H

H4-folato

N5 N10

HC=NH H5

O H4-folato é aceitador de unidades monocarbonadas no decurso dos metabolismos da serina, glicina e colina formando N5,N10-metileno-H4-folato.

H4-folato

N5 N10

CH2

H4-folato

N5 N10

CHH4-folato

N5 N10

HC=O

H4-folato

N5 N10

CH3

NADPH ou NADH

NADP+ ou NAD+

NADPH

NADP+

H2O

NAD+

NADHCO2 + NH3

Hidroximetiltransférase da serina Enzima de clivagem

da glicina

serina

glicina

H4-folato

N5 N10

H H

H4-folato

N5 N10

H H

colina

betaína

dimetil-glicina

sarcosina

O2

H2O2

NAD+

NADH

homocisteína

metioninabetaína-homocisteína

metil-transférase

H4-folato

N5 N10

H H

H4-folato

N5 N10

H H

A serina gera glicina e a glicina sofre desaminação oxidativa. Ambas as reações levam à formação de N5,N10-metileno-H4-folato.

Um dos três grupos metilo presentes na colina participa na regeneração de metionina; os outros dois levam à formação de glicina e N5,N10-metileno-H4-folato.

6

O H4-folato também é aceitador de unidades monocarbonadas no decurso do metabolismo da histidina e também participa na conversão do formato formado na síntese de colesterol e no catabolismo do metanol e do triptofano.

H4-folato

N5 N10

CH2

H4-folato

N5 N10

CH

H4-folato

N5 N10

HC=O

H4-folato

N5 N10

CH3

H4-folato

N5 N10

HC=NH

N5,N10-metenilo-H4-folato N5-formimino-H4-folatoN10-formil-H4-folato

H2O

ciclohidrólasedesamínase

NH4+

NADPH ou NADH

NADP+ ou NAD+

NADPH

NADP+

histidina

urocanato

FIGLU

glutamato

H4-folato

N5 N10

H H

NH4+

H2O

H2O

metanol

metanal

formato

triptofano

cinurenina

lanosterol

colesterol

H4-folato

N5 N10

H H

ATP

ADP + Pi

Sintétase do

N10-formil-H4-folato

Formiminotransférase

do glutamato

7

O N10-formil-H4 folato é o dador de unidades monocarbonadas a intermediários da via metabólica de síntese de novo das purinas.

PRPP

5-fosforibosilamina

GAR(glicinamida-fosforibosilo)

FGAR(formilglicinamidina-fosforibosilo)

AICAR(amino-imidazol-carboxamida-fosforibosilo)

FAICAR(formamido-imidazol-carboxamida-

fosforibosilo) IMP

H4-folato

N5 N10

HC=O

H4-folato

N5 N10

HC=O

H4-folato

N5 N10

H H

H4-folato

N5 N10

H H

Os carbonos 2 e 8 do anel purina provém do N10-formil-H4-folato.

8

O N5,N10-metileno-H4 folato é o dador de uma unidade monocarbonada ao 2’-desoxiuridilato na ação catalítica da síntase do timidilato . A síntese de TMP ocorre durante a fase S do ciclo celular. O TMP é o precursor do TTP, um dos substratos das polimérases de DNA.

Uma das possíveis consequências do défice de folatos é a anemia

megaloblástica que se caracteriza pela presença no sangue e na medula óssea de eritrócitos imaturos e de grande tamanho (megaloblastos).

Ciclo do dihidrofolato

megaloblastosnormoblastos

O aparecimento de megaloblastos pode ser explicada pelo papel do N5,N10-metileno-H4-folato na síntese de TTP (timidino-trifosfato) e do DNA. No défice de folatos a síntese e a reparação do DNA está prejudicada enquanto que a síntese de RNA e proteínas é menos comprometida. As células precursoras dos eritrócitos crescem de tamanho mas a divisão celular fica prejudicada.

9

A suplementação com folato nas mulheres na altura da conceção faz diminuir a incidência de defeitos do encerramento

do tubo neural nos embriões.A causa deste efeito dos folatos é desconhecida, mas poderá estar relacionada com a necessidade aumentada de folato nas células em rápida multiplicação (como é o caso das células do tubo neural do embrião).

O deficit de folatos pode provocar hiper-homocisteinemia, um sinal estatisticamente associado ao desenvolvimento precoce de aterosclerose. A razão da homocisteinemia ↑ está relacionada com a diminuição da “salvação da metionina” pela síntase da metionina.

H H

H4-folato

N5 N10

mono e poli…

H4-folato

N5 N10

CH3

mono e poli…

metionina

S-adenosil-metionina

S-adenosil-homocisteína

[homocisteína] ↑

Síntase da metionina

10

Os folatos são degradados por clivagem oxidativa do resíduo de ácido tetrahidropteroico do folil-poliglutamato, seguido da libertação (hidrólise) de glutamatos e acetilação. O produto N-acetil-aminobenzoilglutamato é excretado na urina.

H4-folato(poliglutamato)

pteridina

aminobenzoil-poliglutamato

n-1 H2O

n-1 moléculas de glutamato

aminobenzoil-glutamato

N-acetil-aminobenzoil-

glutamato

acetil-CoA

CoA

11

A vitamina B12 também é designada por cobalamina de que existem vários vitâmeros. A sua estrutura química é muito complexa contendo um ião de cobalto hexavalente que está no centro de um anel tetrapirrólico de corrina e que também está ligado a um azoto do anel dimetil-benzimidazol.

Os diferentes vitâmeros da vitamina B12, distinguem-se pelos diferentes grupos químicos que se ligam na sexta valência do cobalto. Exemplos:

R= -CH3 ⇒ metil-cobalamina

5’-desoxiadenosina ⇒ desoxiadenosil-cobalamina

-OH ⇒ hidroxi-cobalamina-N=C ⇒ ciano-cobalamina

dimetil-benzimidazol

corrina

No plasma sanguíneo a forma predominante é a metil-cobalamina e nas células (a forma de reserva) é a 5’-desoxiadenosil-cobalamina.

A cianocobalamina é a forma que está presente nas preparações farmacêuticas.

12A vitamina B12 está ausente nos vegetais. É produzida por microorganismos e existe na carne, peixe, ovos e mariscos.

Desde o estômago até ao sangue, a vitamina B12 interage com diferentes proteínas. Desliga-se das proteínas a que está ligada nos alimentos (por ação do pH ácido e da pepsina), para se ligar a proteínas R (haptocorrinas). No duodeno, desliga-se das proteínas R para se ligar ao fator intrínseco (uma proteína essencial para absorção). No plasma viaja ligada à transcobalamina.

B12-proteínas

célula parietal

H+

Fator intrínseco

célula principalpepsina

proteínas

B12Proteínas R

Proteína R – B12

Proteínas R digeridas

B12

Fator intrínseco – B12

cubilina

Fator intrínseco – B12Fator intrínseco hidrolisado

B12

endossoma

transcobalamina -B12

transcobalamina

Enterócito do íleo

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sangue

Embora os vegetarianos estritos (“vegan”) possam ter défice de vitamina B12 de causa dietética,

na maior parte dos casos, a causa dos défices de vitamina B12 está relacionada com alterações no processo que permite a sua absorção a partir de alimentos naturais.

São causas possíveis de défice de vitamina B12: 1-aclorídria inflamatória ou uso crónico de inibidores da bomba de protões.2-receção cirúrgica do estômago

As reservas de vitamina B12 estão maioritariamente no fígado e, porque a sua eliminação (urinária e biliar) é muito lenta, o organismo pode manter-se saudável durante anos após a interrupção da absorção de vitamina B12.

14

3-anemia perniciosa (doença auto imune com destruição das células parietais em que há anticorpos contra o fator intrínseco).

15

As manifestações de défice de vitamina B12 são:

1- Anemia megaloblástica causada por défice secundário de folatos (“armadilha dos folatos”).

2- Degenerescência subaguda combinada = desmielinização axonal com neuropatia irreversível que pode incluir demência grave. O mecanismo é desconhecido.

Porque a administração de ácido fólico trata e previne eficazmente a anemia megaloblástica pode mascarar um défice de vitamina B12 e a consequente desmielinização axonal.Na ausência de anemia o défice de vitamina B12 pode ser mais difícil de diagnosticar.

desmielinização

A cobalamina é o grupo prostético da síntase da metionina. No processo catalítico a

cobalamina aceita o grupo metilo do N5-metil-H4-folato convertendo-se em metil-cobalaminaque é o dador direto do grupo metilo à homocisteína.

H H

H4-folato

N5 N10

monoglutamato

H4-folato

N5 N10

CH3

monoglutamato

homocisteína

metionina

↑vit B12

A síntase de metionina é a única enzima que é capaz de catalisar a conversão do N5-metil-H4-folato em H4-folato. Por isso ocorre a “armadilha dos folatos” e, consequentemente, anemia megaloblástica.

O défice de vit. B12 provoca secundariamente défice de folatos porque o N5-metil-H4-folato que entra nas células (forma monoglutamato) vindo do plasma não é desmetilado. Sem H4-folato (desmetilado) não ocorre a adição de glutamatos. O N5-metil-H4-folato não se mantêm dentro da célula e há eliminação aumentada.

2’-dUMP

TMP

↓

H4-folato

N5 N10

CH2

↓

H H

H2-folato

N5 N10

↓

Síntase da metionina

plasma

urina

H H

H4-folato

N5 N10

poliglutamato ↓n glutamato

n ATP n ADP + n Pi

Sintétase de folil-

poliglutamato

serina

glicina

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TTP ↓

Para além da síntase da metionina só existe uma outra enzima que tem como grupo prostético a vitamina B12 (o vitâmero 5’-desoxiadenosil-cobalamina), a mútase da L-metil-malonil-CoA.

PropionatoIsoleucinaValinaMetioninaTreoninaÁcidos gordos de cadeia ímpar

propionil-CoA

CO2

ATP

ADP + PiD-metil-malonil-CoA

L-metil-malonil-CoA

mútase da L-metil-malonil-CoA

succinil-CoA

cobalamina

5’-desoxiadenosil-cobalamina

5’-desoxiadenosil-cobalamina

mútase da L-metil-malonil-CoA

ATP

trifosfato

apoenzima

5’-desoxiadenosil-

transférase

Quando há défice de vitamina B12 há ↑↑↑↑ de metil-malonil-CoA nas células e ↑ do ácido metil-

malónico no sangue e na urina que denuncia diminuição da atividade da mútase de L-metil-malonil-CoA. O mesmo acontece quando há défice congénito desta mútase, mas só no caso do défice de vitamina B12 é que há degenerescência subaguda combinada .

H2O

CoA

Ácido metil-malónico

3 Pi

H2O

NADPH

NADP+

17

Os vitâmeros da vitamina B6 são absorvidos no intestino na forma desfosforilada.

=O-NH2

-OH

Pi

H2O

Dentro das células uma cínase fosforila a piridoxina, o piridoxal e a piridoxamina formando os derivados fosforilados. A forma ativa é o piridoxal-fosfato (PLP). A formação do PLP a partir de piridoxamina-P e piridoxina-P é catalisada pela oxídase da piridox(am)ina-fosfato.

=O-NH2

-OH

OH

piridoxina

piridoxal

piridoxamina

cínase

+ ATP

→ADP + PLP

piridoxina-P

piridoxamina-P

O2

H2O2

O2

NH4+

H2O2

Oxídase da

piridox(am)ina-

fosfato

Oxídase da

piridox(am)ina-

fosfato

ácido piridóxico

No catabolismo forma-se ácido piridóxico que é eliminado no rim.

NH2

ALP

18

Cerca de 100 enzimas têm como grupo prostético o PLP (piridoxal-fosfato); a maioria envolvidas no metabolismo dos aminoácidos mas…

Glicogénio (n)

Glicogénio (n-1)

Pi

Glicose-1-P

Cerca de 80% do PLP do organismo está ligado às fosforílases de glicogénio hepático e muscular.

α-aminoácido X (glutamato)

α-aminoácido Y (aspartato, alanina, serina, tirosina, α-AAsramificados)

α-cetoácido Y (oxalacetato, piruvato, hidroxipiruvato, p-hidroxifenilpiruvato, α-cetoácidos ramificados)

α-cetoácido X (αααα-cetoglutarato)

As enzimas mais conhecidas que têm como grupo prostético o PLP são as transamínases:

Há muitas transamínases. Catalisam reações, geralmente fisiologicamente reversíveis, em que um dos substratos é (quase) sempre o glutamato que é dador do grupo amina a αααα-cetoácidos Y

formando-se o αααα-aminoácido Y correspondente…19

Para além das transamínases (da alanina, do aspartato, dos aminoácidos ramificados, etc.) o PLP também é o grupo prostético das descarboxílases dos L-aminoácidos, da enzima de clivagem da glicina, da hidroxi-metil-transférase da serina, da síntase da cistationina, da síntase do ácido δ-aminolevulínico (ALA)…

HH

H4-folato

N5 N10serina

glicina

NAD+

NADHCO2 + NH3

H4-folato

N5 N10

CH2

HH

H4-folato

N5 N10

HMT da serinaEnzima de clivagem

da glicina

histidina

glutamato

5-hidroxitriptofano

L-dopa

histamina

GABA

serotonina

dopamina

CO2

glicina

ácido δ-amino-levulínico (ALA)

heme

Des-

carboxílases

succinil-CoA

CoA + CO2

metionina

cistationina

serinahomocisteína

Alguns aminoácidos ou seus derivados são neurotransmissores... 20

(1956) Pub Healf Rep 71: 445

1) A importância da vitamina B6 na dieta ficou claramente demonstrada quando, em 1953, ocorreu nos EUA uma epidemia de convulsões em bebés alimentados exclusivamente com uma determinada marca de “leite de substituição”. A fórmula não continha vit. B6.

O deficit dietético de vit.B6 é raríssimo porque esta vit. existe em quase todos os alimentos naturais (os vegetais contêm piridoxina e os animais piridoxamina-P e PLP).

2) O deficit de vit. B6 também pode ocorrer em doentes (com tuberculose) tratados com isoniazida. A isoniazida reage (reação não enzímica) com o PLP causando a sua depleção…

Outras causas (raras) de défice de vit. B6:

3) Défice congénito de fosfátase alcalina (ALP) ⇒ o PLP que viaja no plasma não é desfosforilado… e só a forma desfosforilada pode penetrar nas células.

PLP

Piridoxal + Pi

célula

O2

H2O2

4) Défice de oxídase da piridox(am)ina-fosfato ⇒ a piridoxina-P e a piridoxamina-P não podem ser convertidas na forma ativa (PLP) 21

Porque é que um dos possíveis sintomas do deficit de vit. B6 são convulsões?

Relação com alterações nas concentrações intracerebrais de neurotransmissores formados ou metabolizados pelas enzimas “dependentes” do PLP…

Às vezes o défice de vit. B6 manifesta-se como um neuropatia periférica (perda de sensibilidade), mas não se sabe porquê.

Mutações no gene da síntase do ALA provocam uma anemia microcítica e hipocrómica (devido a alteração na síntese de heme da hemoglobina) que reverte com doses elevadas de vit. B6.

glicina

ácido δ-amino-levulínico (ALA

Heme (grupo prostético da hemoglobina)

succinil-CoA

CoA + CO2

síntase do ALA

(PLP)

22

Stipanuk, M. H. & Caudill, M. A. (2013) Biochemical, Physiological, Molecular Aspects of HumanNutrition, 3rd edn, Sunders, Elsevier., USA.Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A. & Rodwell, V. W. (2012) Harper's IllustratedBiochemistry, 29th edn, Lange, New York.Lamarre, S. G., Morrow, G., Macmillan, L., Brosnan, M. E. & Brosnan, J. T. (2013) Formate: anessential metabolite, a biomarker, or more?, Clin Chem Lab Med. 51, 571-8.Nelson, E. M. (1956) Association of vitamin B6 deficiency with convulsions in infants, PublicHealth Rep. 71, 445-8.Clayton, P. T. (2006) B6-responsive disorders: a model of vitamin dependency, J Inherit MetabDis. 29, 317-26.Mackey, A. D., Davis, S. R. & Gregory, J. F. (2006) Vitamin B6 in Modern Nutrition in Health andDisease (Shils, M. E., ed) pp. 452-461, Lippincott, Phyladelphia.Shane, B. (2006) Folic acid, vitamine B12 and vitamine B6 in Biochemical, Physiological, Molecular Aspects of Human Nutrition (Stipanuk, M. H., ed) pp. 693-732, Sunders, Elsevier, St. Louis.

Bibliografia

23