EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE XILANASE EM SISTEMA DE...
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMEN·.o DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE XILANASE EM SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de mestre em Biotecnologia Industrial Banca examinadora: Dr. Adalberto Pessoa Júnior Ora. Teima Teixeira Franco Ora. Adriana Maria Ferreira Milagres Estudante: Silgia Aparecida da Costa Lorena - SP - Brasil 1998
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMEN·.o DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE XILANASE EM
SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS
Dissertação de mestrado apresentada
como parte das exigências para a
obtenção do título de mestre em
Biotecnologia Industrial
Banca examinadora:
Dr. Adalberto Pessoa Júnior
Ora. Teima Teixeira Franco
Ora. Adriana Maria Ferreira Milagres
Estudante:
Silgia Aparecida da Costa
Lorena - SP - Brasil 1998
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍIICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EII BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE XILANASE EM
SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS
Este exemplar corresponde a versão
final da dissertação de mestrado
aprovada pela banca examinadora
Lorena - SP - Brasil 1998
- ·-
Dedico este trabalho as meus pais,
José Carlos da Costa in memoriam,
Maria de Lourdes Costa e aos meus
irmãos.
Agradecimentos
Ao professor Adalberto Pessoa Júnior pelo apoio, incentivo, pela
amizade e orientação.
Á professora Heizir Ferreira de Castro pela amizade, pelo incentivo,
pelas sugestões.
Á professora Inês Conceição Roberto, pelo incentivo, pelas sugestões e
orientação na aplicação das técnicas estatísticas.
Á todos os professores da Pós-Graduação do DEBIQ (Departamento de
Biotecnologia) da Faculdade de engenharia química de Lorena.
Aos demais funcionários e colegas do DEBIQ que não foram citados,
mas que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
À CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.
ii
CONTEÚDO Páginas
1 - INTRODUÇÃO...................................................................................... 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................. 3
2. 1 - Processos de purificação de produtos biotecnológicos.................... 3
2.2 - Diagramas de Fases......................................................................... 4
2.3 - Extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas........... 7
2.4 - Polietilenoglicol................................................................................. 8
2.5 - Reciclagem dos polímeros e sais..................................................... 8
2.6 - Escolha dos sistemas aquosos bifásicos......................................... 9
2.6.1 - Fatores que influenciam os sistemas aquosos bifásicos............ 1 O
2.6.2 - Massa molar do PEG 11
2.6.3 - Concentração dos polímeros....................................................... 13
2.6.4 - Efeito do pH 14
2.6.5 - Efeito dos sais............................................................................. 14
2.6.6 - Influência da temperatura........................................................... 15
2.7 - Xilanase 16
2. 7.1 - Xilanases de Penicillium janthinellum 22
2.7.2 -Aplicações industriais 22
3 - OBJETIVOS.......................................................................................... 24
4 - MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 25
4. 1 - Microrganismo.................................................................................. 25
4.2 - Reagentes........................................................................................ 25
4.3 - Meios de cultura 25
4.3.1 - Meio de manutenção dos fungos 25
4.3.2 - Meio de cultura formulado a partir do hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar............................. 25
4.4 - Produção da Xilanase 26
4.5 - Avaliação da atividade enzimática................................................... 28
4.6 - Determinação do teor de proteínas................................................. 29
4. 7 - Determinação das curvas binodiais................................................. 29
4.8 - Determinação das linhas de amarração.......................................... 30
4. 9 - Estudos eletroforéticos..................................................................... 32
iii
4.9.1 - Precipitação do caldo inicial com ácido tricloroacético (TCA) 32
4.9.2 - Precipitação com etanol. 32
4.9.3 - Ensaios eletroforéticos 33
4.1 O - Delineamento experimental da extração líquido-líquido de
xilanase em sistema de duas fases aquosas 33
4.11 - Delineamento experimental da extração líquido-líquido de
proteínas em sistema de duas fases aquosas 36
4.12 - Experimentos de extração líquido-líquido em sistema de duas
fases aquosas................................................................................ 37
4.13 - Metodologia de análise dos resultados.......................................... 39
5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES 41
5.1 - Extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas 41
5.1.1 - Determinação das curvas binodiais 41
5.1.2 - Influência do meio contendo xilanase nas curvas binodiais dos
diagramas de fases...................................................................... 45
5.1.3 - Estudo da influência da massa molar do PEG e do pH nos
coeficientes de partição das xilanases e das proteínas totais ..... 48
5.1.3.1 - Ensaios com PEGs de massas rnolares s 600 e os valores
de pH como variável............................................................ 48
5.1.3.2 - Ensaios com PEGs de massas molares de 1500 a 6000 e
os valores de pH como variável. 51
5.2 - Estudos de otimização do coeficiente de partição das xilanases
utilizando um planejamento fatorial 25 com 4 pontos centrais 53
5.3 - Estudos de otimização do coeficiente de partição das proteínas
totais utilizando um planejamento fatorial 25 com 4 pontos
centrais............................................................................................. 66
5.4 - Análise eletroforética em gel poliacrilamida das fases obtidas pela
extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas......... 78
6 - CONCLUSÕES...................................................................................... 82
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 83
8-APÊNDICE
iv
LISTA DE TABELAS Páginas
Tabela 4.1 - Fatores e níveis utilizados nos ensaios de extração das
xilanases em sistemas aquosos bifásicos 34
Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial utilizado para o estudo das
variáveis na extração líquido-líquido da xilanase em
sistema de duas fases aquosas............................................. 35
Tabela 5.1 - Composição dos sistemas de fases e os resultados de
atividade das xilanases, proteínas totais e coeficientes de
partição (K) para os PEGs com massas molares ~
600 50
Tabela 5.2 - Composição dos sistemas de fases e os resultados de
atividade das xilanases, proteínas totais e coeficiente de
partição (K) para os PEGs com massas molares de 1500 a
6000 52
Tabela 5.3 - Matriz de planejamento e resultados (K) obtidos no estudo
do processo de extração líquido-líquido em sistema de
duas fases aquosas das xilanases considerando um
planejamento fatorial 25 com ponto central........................... 55
Tabela 5.4 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de "Student",
para os parâmetros de extração líquido-líquido das
xilanases utilizando um planejamento 25 com ponto
central. 57
Tabela 5.5 - Planejamento fatorial 23 com estrela (a=1,41) empregado
para otimização do coeficiente de partição........................... 60
Tabela 5.6 - Coeficientes de regressão, erros-padrão e valores de t para
a resposta ( coeficiente de partição) obtida nos ensaios
realizados no planejamento completo 61
Tabela 5. 7 - Análise de variância para o modelo que representa o
coeficiente de partição das xilanases em sistemas de duas
fases aquosas....................................................................... 62
V
Tabela 5.8 - Valores de K observados experimentalmente e previstos
pelo modelo........................................................................... 64
Tabela 5.9 - Matriz de planejamento e resultados obtidos no estudo do
processo de extração líquido-líquido em sistemas de duas
fases aquosas das proteínas totais considerando um
planejamento fatorial 25 com ponto central........................... 67
Tabela 5.1 O - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student ,
para os parâmetros de extração líquido-líquido utilizando
um planejamento 25 com ponto central................................. 69
Tabela 5.11 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student,
para os parâmetros da extração das proteínas
totais 70
Tabela 5.12 - Análise de variância para as variáveis significativas (X2, ~
e X5) que representam a extração líquido-líquido das
proteínas totais em sistema de duas fases aquosas 71
Tabela 5.13 - Valores dos níveis de deslocamento, variáveis codificadas
e os resultados dos coeficientes de partição (K) obtidos
após a alteração da região de trabalho 72
Tabela 5.14 - Valores das variáveis X, e Xs codificadas pelas equações
5. 7 e 5.8 e os coeficientes de partição
obtidos 73
Tabela 5.15 - Análise de variância para as variáveis significativas (X3 e
Xs) que representam a extração líquido-líquido das
proteínas totais...................................................................... 7 4
Tabela 5.16 - Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t "Student"
e nível de significância para o modelo que representa o
processo de extração líquido-líquido das proteínas totais
em sistema de duas fases aquosas...................................... 75
Tabela 5.17 - Análise de variância da regressão para o modelo que
representa o processo de extração líquido-líquido de
proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas 75
vi
LISTA DE FIGURAS Páginas
Figura 2.1 - Diagrama de fase de um sistema polietilenoglicol (PEG)
4000/fosfato de potássio a 20ºC (ALBERTSSON, 1986)........ 4
Figura 2.2 - Sistema de duas fases aquosas formado por um polímero
(PEG) e um sal (fosfato de potássio)...................................... 6
Figura 2.3 - Modelo de um sistema de duas fases aquosas...................... 7
Figura 2.4 - (A) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da
xilana. AC: grupo acetil; a-4-0-ME-GLcA: ácido a-4-0-metil
glucurônico. (8) hidrólise de xilooligossacarídeos pela B- xilosidase.................. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 18
Figura 4.1 - Fluxograma experimental de obtenção da xilanase,
incluindo as etapas de preparo do substrato, incubação e
filtragem................................................................................... 27
Figura 4.2 - Fluxograma experimental para a obtenção das curvas
binodiais 31
Figura 4.3 - Fluxograma experimental da extração líquido-líquido de
xilanase em sistemas de duas fases aquosas........................ 38
Figura 5.1 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos
valores de pH.......................................................................... 42
Figura 5.2 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 1500 em diversos
valores de pH 43
Figura 5.3 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 4000 em diversos
valores de pH 43
Figura 5.4 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos
valores de pH.......................................................................... 44
Figura 5.5 - Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600,
1500, 4000 e 6000, pH = 8,0 44
Figura 5.6 - Comparação entre a curva binodial obtida e a encontrada
na literatura (ALBERTSSON, 1971 ) .
45
vii
Figura 5.7 (a, b, c) - Curvas binodiais para água (A) e para meio
fermentado (B) utilizando PEG 600 (a), PEG 4000 (b), PEG
6000 (C), em tampão fosfato de potássio pH = 8,0 47
Figura 5.8 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 600, 4000, 6000
para os pH 5,0, 6,5, e 8,0 e os níveis dos fatores (•)
representado na Tabela 4.1.................................................... 54
Figura 5.9 - Curvas de nível dos coeficientes de partição em relação às
variáveis X1 (pH) e X3 (o/oPEG)................................................ 58
Figura 5. 1 O - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre
PEG e % NaCI no planejamento 25......................................... 59
Figura 5.11 - Superfície de resposta para o coeficiente de partição K da
xilanase em função das variáveis ~ (o/oPEG) e Xs (o/oNaCI)
mantendo-se PEG4000, pH=7,0 e 10% de fosfato de
potássio................................................................................... 62
Figura 5.12 - Curva binodial (construída com água) para o sistema com
PEG4000, pH = 7,0 mostrando o ponto ótimo do
planejamento experimental para a extração das xilanases ..... 63
Figura 5.13 - Trajetória de deslocamento do passo ascendente proposto
na Tabela 5.13. .. .. 72
Figura 5.14 - Superfície de resposta para o coeficiente de partição K das
proteínas totais em função das variáveis X3 (o/oPEG) e Xs
(º/oNaCI)................................................................................... 76
Figura 5.15 - Curva binodial (construída com água) para o sistema com
PEG1000, pH = 7,0 mostrando o ponto ótimo do
planejamento experimental para a extração das proteínas
totais 77
Figura 5.16 - Eletroforese (SDS-PAGE) para a condição otimizada de
extração líquido-líquido das xilanases em sistemas de duas
Fases aquosas. Linha 1 - marcadores de massas molares
(116, 97, 66 e 45 kDa); linha 2 - marcadores de baixas
massas molares (66, 45, 36, 24 e 20, 1 kDa); linha
Vlll
3 - caldo inicial; linha 4 - fase superior do sistema; linha 5 -
fase inferior do sistema. 81
Figura 5.17 - Eletroforese (SDS-PAGE) para a condição otimizada de
extração líquido-líquido das proteínas totais em sistemas de
duas fases aquosas. Linha 1 - marcadores de massas
molares (116, 97, 66 e 45 kDa); linha 2 - marcadores de
baixas massas molares (66, 45, 36, 24 e 20, 1 kDa); linha 3 -
caldo inicial; linha 4 - fase superior do sistema; linha 5 - fase
inferior do sistema................................................................... 81
ix
RESUMO
Neste trabalho estudou-se a aplicação da extração líquido-líquido na separação da xilanase produzida pelo cultivo de Penicillium janthinellum em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, utilizando-se sistemas de duas fases aquosas compostos por polietilenoglicol (PEG) e fosfato de potássio.
O comportamento do coeficiente de partição (K) da xilanase em sistema de duas fases aquosas foi verificado através do estudo dos diagramas de fases, variando-se a massa molar do PEG, pH e o comprimento das linhas de amarração. Inicialmente três diferentes massas molares de PEG (300, 400 e 600) foram usadas com três valores de pH (7, 8 e 9), mantendo-se as linhas de amarração constantes. O maior valor do coeficiente de partição obtido (1,43) foi para o sistema PEG600, 10% PEG, 20% de fosfato de potássio pH 7,0. Três outras massas molares de PEG (1500, 4000 e 6000) foram usadas com quatro valores diferentes de pH (5, 6, 7, 8, e 9), mantendo-se os valores das linhas de amarração aproximadamente constantes. Em todos os casos, os valores de K não foram muito superiores a 1, significando com isto que as xilanases não particionaram preferencialmente para nenhuma das fases.
Um planejamento fatorial completo 25 com 4 pontos centrais foi também proposto para estudar a influência das variáveis pH (X1), massa molar (X2) e concentração de PEG (X3), concentração do tampão fosfato (Xi) e NaCI (Xs) no coeficiente de partição da enzima. Através do planejamento experimental proposto foi possível selecionar as variáveis significativas para o processo de extração da enzima xilanases e das proteínas totais. O trabalho resultou em dois modelos matemáticos principais que representam os processos de extração das xilanases (1) e das proteínas totais (2).
A
Y = 2.18 - 0.18Xs + 0.08Xs - 0.11Xs2 A
(1)
(2) Y = 4.94 + 1.SXs + 0.79Xs- 3.44Xs2
As condições ótimas para a extração das xilanases e proteínas totais foram obtidas pelas derivadas parcrais das Equações ( 1) e (2) respectivamente. O ponto ótimo para a extração das xilanases foi obtido nas seguintes condições: pH 7,0, PEG 4000, 8,83% de PEG, 10% de fosfato de potássio e 6,02% de NaCI. O valor de K obtido experimentalmente foi de 2,21 e o previsto pelo modelo de 2,33. A recuperação da enzima na fase superior foi de 80% e o aumento de pureza de 1 , 34 vezes. Para a extração das proteínas totais as condições otimizadas foram: pH 7,0, PEG 10000, 3,67% de PEG, 10% de fosfato de potássio e 12,4% de NaCI. O valor de K obtido experimentalmente foi de 5,25 e o previsto pelo modelo de 5,89.
Através das análises eletroforéticas realizadas das condições otimizadas das xilanases e das proteínas totais, foi possível concluir que as melhores condições de extração foram as apresentadas pelo modelo de extração líquido-líquido das xilanases, que apresentaram bandas de 14, 20 e 24 kDa. Com o processo de extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas foi possível pré-purificar as xilanases presentes no meio.
X
ABSTRACT
This work investigates the application of liquid-liquid extraction in the separation of xylanase enzyme produced by Penicillium janthinellum in hemicellulose hydrolysate sugar cane bagasse using aqueous two-phase systems composed of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate.
The behavior of the xylanase partition coefficient ( K) in aqueous two- phase systems was verified by studying the phase diagrams varying the PEG molecular weight, the pH and the length of the tie lines. lnitially, three different PEG molecular weights (300, 400 and 600) were used with three different pH values (7, 8, 9), maintaining the tie lines constant. The highest partition coefficient (K) obtained (1.43) was for system compsed of PEG600, 10% PEG, 20% and phosphate potassium, at pH 7.0. Three other PEG molecular weights (1500, 4000, and 6000) were then used with four different pH values (5, 6, 7, 8, 9) maintaining the tie line values approximately constant. ln ali cases, the K values were not much higher than 1, which means that the xylanases were not preferentially partitioned to none of the phases.
A complete 25 factorial design with 4 center points was also proposed to study the influence of the variables pH (X1), PEG molecular weight (X2) and concentration (X3), and concentrations of buffer phosphate (Xi) and NaCI (Xs) on the enzyme partition coefficient.
Through the proposed statistical experimental design it was possible to select the variables that were significant to the process of xylanase and total protein extraction. This study resulted in two principal mathematical models representing the process of e:xtraction of xylanase (Equation 1) and total protein (Equation 2).
/\
Y = 2.18 - 0.18.XS + 0.08Xs - 0.11Xs2 r;
Y = 4.94 + 1.5.XS + 0.79Xs - 3.44Xs2
(1)
(2)
The optimum conditions for xylanase and total protein extraction were obtained by derivatives partial of Equations (1) and (2), respectively. The optimum point for xylanase extraction was obtained under the following conditions: pH 7.0, PEG 4000, 8.83% PEG, 10% potassium phosphate and 6.02% NaCI. The K value experimentally obtained was 2.21 and the one predicted by model was 2.33. Enzyme recovery in the top phase was 80% and purity increase was 1.34 times. For total protein extraction the optimized conditions were: pH 7.0, PEG 10000, 3.67% PEG, 10% potassium phosphate and 12.4% NaCI. The K value experimentally obtained was 5.25 and the one predicted by the model was 5.89.
Electrophoretic analyses of the optimum conditions for xylanase and total protein extraction led to conclude that the best extraction conditions were those given by the model of liquid-liquid extraction of xylanases, which presented bands of 14, 20 and 24 kDa. With the process of liquid-liquid extraction in aqueous two-phase systems it was possible to prepurify the xylanases present in the medium.
xi
1- INTRODUÇÃO
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações
biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido à sua
extraordinária especificidade e poder catalítico, os quais normalmente são
superiores aos catalisadores químicos.
O Brasil, por suas características climáticas e territoriais, apresenta uma
grande biodiversidade e capacidade de gerar recursos renováveis em grande
escala. Em termos de produção e uso de enzimas, existe diversas matérias
primas que podem ser utilizadas em processos fermentativos e extrativos para
a produção de enzimas, e uma variedade de biomassas que podem ser
transformada por via enzimática em produtos úteis altamente diversificados e
de maior valor agregado. O consumo de enzimas no Brasil representa apenas
4% do mercado mundial, estimado em cerca de 1 bilhão de dólares, em 1996.
Para o mercado interno estima-se que 60% dessa demanda é representada
pelas amilases alimentícias e 40% pelas proteases e lipases aplicadas na
produção de detergentes.
Devido às potencialidades apresentadas pelas enzimas torna-se
importante o desenvolvimento de processos de recuperação e purificação em
grandes escalas que sejam econômicos e viáveis. Dentre as técnicas,
atualmente pode-se destacar a extração líquido-líquido em sistema de duas
fases aquosas.
O fenômeno de separação de fases foi inicialmente observado pelo
microbiologista holandês BEIJERINCK em 1896, ao misturar soluções aquosas
de gelatina e ágar, ou gelatina e amido solúvel. Os sistemas de duas fases
aquosas foram redescobertos posteriormente nos anos 60 por ALBERTSSON
(1956), que introduziu os sistemas formados por polietilenoglicol (PEG) com
sulfatos ou fosfatos. ALBERTSSON observou que nesses sistemas além da
separação de fases, ocorria a partição de biomateriais, verificando ainda que a
maior parte dos sistemas eram formados por água. Através destas
observações concluiu que este tipo de sistema fornecia um ambiente
1
favorável para as células, organelas celulares e proteínas biologicamente
ativas, podendo assim ser explorados para efeitos de separação. Os sistemas
de separação empregados por vários autores são os formados por
polietílenoglicol e dextrana. Porém visando os processos de extração em
grande escala, os sistemas polímero/sal têm atualmente recebido maior
importância devido às vantagens econômicas apresentadas em relação aos
sistemas polímero/polímero.
Neste trabalho foi estudada a recuperação da enzima xilanase
produzida pelo fungo Penicillíum janthinellum cultivado em hidrolisado de
bagaço de cana-de-açúcar, utilizando os sistemas de duas fases aquosas
formado por polietilenoglicol (PEG) e fosfato de potássio.
. -. -
2
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - Processos de Purificação de Produtos Biotecnológicos
A viabilidade da comercialização e da produção em escala industrial de
substâncias obtidas por meio da biotecnologia depende significativamente das
técnicas empregadas na purificação do composto desejado. A baixa
concentração inicial dos produtos obtidos, sensibilidade térmica e a
necessidade de preservar as principais propriedades dos compostos tornam os
processos de recuperação onerosos para os custos globais de produção.
Assim, a etapa de recuperação requer um método biocompatível e econômico
(ATKINSON e SAINTER, 1982; BAUGHMAN e LUI, 1994; CHAUDHURI, 1995).
Desenvolver técnicas de purificação eficientes, minimizando o número
de operações necessárias para a recuperação desejada, é uma das
preocupações atuais nesta área, pois isto significa redução de custos bem
como de perdas do produto (PESSOA JR., 1995). Além desses aspectos,
deve-se considerar o desenvolvimento de técnicas de fácil ampliação de
escala, já que os custos dos processos de purificação podem representar de
50 a 80% do custo total do produto (BEL TER et ai., 1988, GUPTA et ai., 1994
HOTHA e BANIK, 1997).
Dentre as técnicas atualmente estudadas para separação e purificação
de substâncias de origem biológica, especial ênfase tem sido dada à extração
líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas, por ser um método
eficiente, versátil e de baixo custo (GUAN et ai., 1992; BERGGREN et ai.,
1995; OTTO et ai.; SINHA et ai., 1996). Estes sistemas são constituídos por
duas fases aquosas parcialmente miscíveis que promovem a separação de
produtos biotecnológicos em condições amenas e em um ambiente adequado,
de forma a preservar suas principais características. Estes tipos de sistemas
resultam da incompatibilidade, em soluções, de dois polímeros (por exemplo
PEG e dextrana) ou entre um polímero e um sal apropriado (por exemplo:
fosfato ou sulfato) que ocorrem em função da concentração destes compostos.
3
A alta concentração de água (aprox. 65-90%) em tais sistemas favorece a
estabilidade das proteínas durante a separação quando, comparado com
sistemas de duas fases em solvente orgânico (HUSTEDT et ai., 1985a; SINHA
et ai., 1996, LI et ai, 1997).
2.2 - Diagramas de Fases
Em princípio a maioria, dos polímeros hidrofílicos, se não todos,
naturais ou sintéticos miscíveis com a água mostram separação de fase em
uma mistura com um segundo polímero ou com sais. A Figuras 2.1 mostra um
exemplo representativo para tal comportamento em sistemas comumente
empregados (KULA et ai., 1982; HUDDLESTON et ai., 1991).
o 8 • CD 10 Ili Q..
0'--~~~~..._~~~~-'-~~~~-' o 10 20
FOSFATO DE POTÁSSI0(41. P/P)
30
Figura 2.1 - Diagrama de fase de um sistema polietilenoglicol 4000lfosfato de potássio a zo'c (ALBERTSSON, 1986).
4
Na Figura 2.1 está representado um diagrama de fases para um sistema
polietilenoglicol/fosfato de potássio. A curva que divide a região de duas fases
da região de uma fase é chamada de curva binodial ou curva de equilíbrio. A
região acima da curva binodial é chamada de bifásica e a abaixo, monofásica.
Todos os sistemas que estão sobre o segmento de reta TMB (denominadas
linhas de amarração, retas paralelas à tangente que passam pelo ponto crítico,
neste caso o ponto C), possuem as composições químicas da fase superior
(rica em PEG) e da fase inferior (rica em sal) idênticas, porém com os volumes
destas fases diferentes (Figura 2.2) (KULA et ai., 1982; BAMBERGER et ai.,
1985; HUDDLESTON et ai., 1994 ).
No ponto crítico, C, (ponto no qual a adição de uma pequena
quantidade de água transforma um sistema bifásico numa solução
homogênea), teoricamente, as duas fases têm composições e volumes
idênticos e podem fornecer coeficientes de partição igual a 1 (KULA et ai.,
1982, HUDDLESTON et ai., 1991; LAHORE et ai., 1996).
Segundo os dados de literatura as curvas binodiais podem ser
determinadas por três métodos diferentes. O primeiro método consiste em
determinar a composição das fases que formam o sistema através da
cromatografia (HPLC) (ALBERTSSON, 1971, PLANAS etal., 1997). O segundo
método citado baseia-se em um processo de titulação entre os componentes
que formam os sistemas (PEG, tampão fosfato de potássio e água). A grande
vantagem deste sistema de titulação é a simplicidade e rapidez, porém como
o método baseia-se na observação visual de mudança das fases têm-se uma
imprecisão quando as fases se alternam (BAMBERGER et ai., 1985, VERNAU
et ai., 1990). O terceiro método que pode ser utilizado consiste combinação
entre os dois métodos citados anteriormente. Este método baseia-se na
preparação de vários sistemas de fases com composições diferentes. Em
seguida, adiciona-se água em cada sistema sob agitação até as soluções
tornarem transparentes. Finalmente determina-se a composição dos novos
sistemas monofásicos e com isto obtêm-se os pontos da curva binodial
(SEBASTIÃO et ai., 1995).
5
Fase Superior (Rica em PEG)
Fase Inferior (RicaemSaO
1 ' 1 I I 1 I I
' f I A 1 I I / I I , I ..
-· .... I I ·~ , I
\ ·~ I I I
IIJ ..... __ , / .. , I . . I \ • . . J . J .
\ . . I . . I . . •• I v .
' ~ . o'--~--~""'-~--=~==='2-~- o 10 20
% p/p Fosfatode potássio
Figura 2.2 - Sistema de duas fases aquosas formado por um polímero PEG e um sal (fosfato de potássio)
6
2.3 - Extração Líquido-Líquido em Sistema de Duas Fases Aquosas
Como citado anteriormente, a extração líquido-líquido de proteínas em
sistema de duas fases aquosas é um método eficiente e versátil. Esses
sistemas são constituídos por duas fases aquosas parcialmente miscíveis
(Figura 2.3), obtidas pela adição de um polímero/polímero (PEG/dextrana,
PEG/ficoll, PEG/polivinil álcool, dextrana/metil celulose, dextrana/ficoll e
outros) ou um polímero e um sal (PEG/fosfato de potássio, sulfato de sódio,
formitato de sódio, citratos e outros) (KULA et ai., 1985; HUDDLESTON et ai.,
1991; LU e T JERNELD, 1995; SCHMIDT et ai., 1996; SINHA et ai., 1996).
Quando comparada com outras técnicas de recuperação, essa técnica
apresenta diversas vantagens, tais como: operação rápida e contínua, altos
rendimentos, fácil ampliação de escala ("scale-up"), baixo custo dos materiais,
reciclagem dos polímeros, minimização da desnaturação de proteínas e
facilidade de separar materiais particulados (LAMARCA et ai., 1990;
CASCONE et ai. 1991; SCHMIDT et ai., 1996).
Figura 2.3 - Modelo de um sistema de duas fases aquosas
7
2.4 - Polietilenoglicol
O polietilenoglicol, (HO-(CH2CH20-)nH), é um composto de grande
importância comercial (GUAN et ai, 1992), produzido em grandes quantidades
e com massas molares variando de poucas centenas a milhares de daltons. A
designação PEG é usada para compostos de baixa massa molar (abaixo
20.000) e a designação PEO poli (óxido de etileno) é restrito para compostos
de altas massas molares (maiores que 20.000). O PEG é produzido pela
polimerização do óxido de etileno com um catalisador solúvel ácido ou básico,
enquanto que a produção de PEO envolve catálise heterogênea (HUSTEDT et
ai., 1985b; ASENJO et ai., 1994).
Os PEGs com massas molares menores que 1.000 são fornecidos na
forma de soluções incolores estáveis ou pastas. Os de massas molares
elevadas, acima de 1.000, são encontrados na forma de pó ou flocos brancos.
Podem ser estocados à temperatura ambiente, embora a 4°C a ocorrência de
oxidação em soluções seja retardada. A oxidação do PEG é detectada pela
diminuição do pH devido à liberação de grupos ácidos e pela alteração da
coloração da solução para marrom (BAMBERGER et ai. 1985).
O utilização do PEG é de grande interesse na biotecnologia
principalmente por excluir, em ambiente aquoso, outros polímeros de sua
vizinhança, não se solubilizando com eles. Por serem compostos
biodegradáveis e atóxicos, o descarte de PEG não é problemático (GUAN et
ai., 1992; SINHA et ai., 1996).
2.5 - Reciclagem dos Polímeros e Sais
A reciclagem das substâncias que constituem o sistema de duas fases
aquosas pode reduzir os custos do processo pela redução dos gastos com
produtos químicos e com o tratamento de águas de lavagem (LAMARCA et ai.,
1990). No momento, a reciclagem dos polímeros significa, na prática,
reciclagem do PEG da fase superior (SCHÜTTE, 1996). Em princípio, a
reciclagem do PEG pode ser feita de várias maneiras: reutilização direta do
8
PEG obtido no final do processo de extração em uma etapa inicial ou
intermediária de um novo processo, utilização após ultrafiltração ou extração
com solventes seguida de evaporação (BAMBERGER et ai. 1985).
A reutilização direta, parece ser o procedimento mais viável
economicamente para um processo industrial (UMAKOSHI et ai., 1996). Um
exemplo de reciclaguem direta é o processo de purificação da fumarase de
Brevibacterium ammoniagenes, na qual a fase superior (rica em PEG) da
segunda etapa de extração, sem um tratamento adicional, pode ser reciclada
para a primeira etapa do processo. Segundo HUSTEDT et ai., 1985b após três
etapa de reciclo do PEG a atividade específica da fumarase reduziu de 1 O a
15%.
A reciclagem dos sais também é possível. Um método plenamente
usado é o resfriamento da fase contendo fosfato de sódio a temperaturas
abaixo de 6°C. Este procedimento resulta na precipitação dos íons fosfato, e
torna possível a sua reutilização. Outros métodos para a reciclagem dos sais
como a dessalinização das fases e a eletrodiálise estão ainda em fases de
estudo (COIMBRA, 1995).
2.6 - Escolha dos Sistema Aquosos Bifásicos
Em princípio, todos os tipos de sistemas aquosos bifásicos podem ser
empregados na separação de biomoléculas. No aumento de escala, devem ser
avaliados os critérios como custos, quantidade de reagentes, tempo de
separação e reciclagem dos componentes envolvidos no processo (LAMARCA
et ai., 1990; GUAN et ai., 1992). No entanto, é reduzido o número de sistemas
polímero/polímero ou polímero/sal que podem ser utilizados em escala
ampliada. Os sistemas PEG/dextrana ou PEG/sais são os mais utilizados por
se encontrarem disponíveis no mercado em grandes quantidades, não serem
tóxicos e apresentarem propriedades físicas adequadas, principalmente com
relação às diferenças de densidades e de viscosidade (SINHA et ai., 1996).
Além disso, a adição de PEG e dextrana em alimentos é permitida em muitos
países, enquadrando-se dentro da legislação para aplicação em produtos
9
alimentícios e farmacêuticos. O mesmo pode ser dito para alguns tipos de sais
de citratos, fosfatos e sulfatos (KULA et ai., 1982, GUAN et ai., 1992, CHUNG
et ai., 1997).
Segundo KRONER et ai., (1984) os sistemas PEG/sal são mais
econômicos quando comparados com os sistemas PEG/dextrana. A separação
de fases é atingida mais rapidamente devido à menor viscosidade de uma das
fases. Isto facilita o uso de sistemas polímero/sal em aplicações industriais.
Devido às vantagens apresentadas pelo sistema PEG/sal, este foi
escolhido para o estudo de extração da enzima xilanase diretamente do meio
fermentado.
2.6.1 - Fatores que Influenciam os Sistemas Aquosos Bifásicos
A proporção entre a concentração de biomoléculas na fase superior
("top") e na fase inferior ("bottom") define os coeficientes de partição (K) nos
sistemas aquosos.
Equação 2.1: 1 K = Ct/Cb
Sendo: Ct = Concentração de biomoléculas na fase superior
Cb = Concentração de biomoléculas na fase inferior
As diferenças nos valores dos coeficientes de partição são resultados
das interações de fatores inerentes ao sistema. Estes fatores podem ser:
massa molar dos polímeros, concentração dos polímeros e sais, composição
iônica, pH e as características da proteína a ser separada, como massa molar,
carga, hidrofobicidade e conformação (KULA et ai., 1982, SCHMIDT et ai,
1994; SCHÜTTE, 1996; LAHORE et ai., 1996).
O coeficiente de partição da proteína pode ser expresso por meio das
propriedades intrínsecas das moléculas de proteínas, e que podem ser
divididas em grupos. Em função disso as correlações entre as propriedades
podem ser descritas, conforme a Equação 2.2.
10
Equação 2.2:
Log K = log K hidrof. + log K el. + log K tam + log K conf. + log Bioesp.
Sendo os sub-índices:
hidrof. = hidrofobicidade da molécula de proteína
el. = forças eletrostáticas
tam. = tamanho da partícula
conf. = conformação da partícula
bioesp. = bioespecificidade da partícula pelas fases
Nem todas as propriedades citadas na Equação 2.2 são igualmente
importantes, mas elas podem ser manipuladas para se encontrar uma melhor
partição da proteína de interesse (CASCONE et ai. 1991; SCHMIDT et ai.,
1994).
Deve ser lembrado que o mecanismo que causa a distribuição irregular
das biomoléculas ainda não são bem conhecidos. Apesar de existirem vários
modelos teóricos descritos na literatura, nenhuma teoria conclusiva existe
atualmente para guiar o esboço do sistema de separação de proteínas
(LAHORE etal., 1996; COIMBRAeta/.,1995).
Entre os diversos fatores que interferem no processo de extração em
duas fases aquosas, foram selecionados: massa molar e concentração do
PEG, pH e concentração dos sais (tampão fosfato e NaCI) para um estudo
inicial de purificação do caldo fermentado contendo a enzima xilanase.
2.6.2 - Massa Molar do PEG
A variação na massa molar dos polímeros em sistemas de duas fases
aquosas se resume em dois efeitos principais: o primeiro efeito demostra que à
medida em que a massa molar dos polímeros é aumentada, menor será a
concentração necessária para resultar na separação de fases. A massa molar
11
também influencia a partição do material biológico a ser purificado em
conseqüência das interações desfavoráveis entre os polímeros. Ao se variar a
massa molar de um polímero (ex: PEG) uma proteína particionda entre as duas
fases vai se comportar como se existisse uma força de atração exercida pelo
polímero de massa molar menor e a proteína. Este efeito prevalece na partição
de moléculas maiores e não é muito pronunciado para amino ácidos ou
pequenas moléculas (ASENJO et ai., 1990 ANDREASEN, 1994;
HUDDLESTON et ai., 1994; SCHMIDT et ai., 1996).
As diferentes massas molares dos polímeros podem ser usadas para
facilitar as separações de moléculas de proteínas de diferentes tamanhos. Isso
pode ser melhor exemplificado através dos resultados descritos por ASENJO,
(1990), que comparou os coeficientes de partição da enzima J3-galactosidase
em sistemas dextrana com massas molares de 40 e 500, sendo obtidos os
valores de K de 0,24 e 1,59 , respectivamente.
Como um novo exemplo, pode-se citar o trabalho de SCHMIDT et
a/.(1994) que utilizou um sistema PEG/fosfato para a recuperação de a-
amilase. Foi observado que, os maiores valores dos coeficientes de partição
foram obtidos para as menores massas molares do PEG. Este efeito também
ocorreu para o sistema PEG/dextrana. Esses autores também observaram que,
o aumento da massa molar do PEG de 600 para 6000 não alterou
significativamente a proporção de volume das fases formadas.
Segundo SCHMIDT et ai., (1996) o PEG é capaz de precipitar as
proteínas sem desnaturação de acordo com o aumento de sua massa molar.
Em baixas concentrações de PEG, o efeito de precipitação é mais acentuado
nas proteínas maiores. Para ilustrar esse efeito, os autores efetuaram uma
comparação entre a separação da amiloglicosidade (97k0a) e o inibidor de
tripsina (20k0a). Foi verificado que, a molécula de amiloglicosidase, possui
uma baixa solubilidade na fase superior (Ctop= 0,2 g/Kg) facilitando assim a sua
precipitação. O mesmo efeito de precipitação não foi significativo sobre o
inibidor de tripsina, que apresentou uma concentração muito maior na fase
superior (Ctop > 11 g/ Kg).
12
Nos estudos de separação da protease ácida obtida do Mucor
bacilliformis utilizando um sistema PEG/fosfato, LAHORE et. ai. (1995)
verificaram que o coeficiente de partição da enzima foi fortemente influenciado
pelo aumento da massa molar do PEG. Quando a massa molar do PEG foi
aumentada de 600 para 20000 foi constatado um decréscimo de 500 vezes no
valor de K ( 50 para O, 1 O). Esses autores também verificaram que a utilização
do PEG de massa molar 600, promove a partição das proteínas
preferencialmente para a fase superior. O mesmo efeito não foi verificado com
a utilização do PEG com massa molar de 20000, onde as protease ácidas e
proteínas contaminantes migraram para a fase inferior.
2.6.3 - Concentração dos Polímeros
Próximo do ponto crítico de um sistema fases, as moléculas tais como
proteínas migram quase que igualmente entre as fases. Se a concentração dos
polímeros (por exemplo: PEG, dextrana, metilcelulose, ficoll, polivinil álcool e
outros) for aumentada, o valor de K poderá aumentar ou diminuir de acordo
com o deslocamento do sistema. Como regra geral, o coeficiente de partição
de um sistema de duas fases aquosas pode aumentar quando for feita a
adição de um polímero, atingindo um valor máximo, e em seguida diminuir
quando da adição de uma nova carga de polímero. Nos casos de sistemas
contendo células fragmentadas, quando a concentração do polímero é
aumentada os fragmentos tendem a se adsorver na interface do sistema.
Desta forma, se os fragmentos estão na fase superior quando aproximamos do
ponto crítico eles poderão ser removidos desta fase para a interface ou para a
fase inferior de acordo com o aumento na concentração dos polímeros.
Dependendo das propriedades da superfície dos fragmentos celulares eles
poderão ser removidos seletivamente para a fase superior (ALBERTSSON,
1986,. ASENJO, 1990; LAHORE et ai., 1996).
Estudos feitos por SCHMIDT et ai., (1994) mostraram que o aumento da
concentração de PEG em um sistema PEG/fosfato causou um decréscimo de
3,2 vezes no coeficiente de partição da a.-amilase (de K= 45 para K= 14). E
13
ainda, em um sistema PEG4000/fosfato o aumento da concentração de PEG
de 14 % para 20 % proporcionou um aumento de 5 vezes no valor do
coeficiente de partição (de K=1,6 para K=7,8) da enzima.
2.6.4 - Efeito do pH
O pH influencia a dissociação dos grupos ionizáveis das proteínas
alterando as cargas da sua superfície e consequentemente, o seu coeficiente
de partição (LEHNINGER, 1976).
Estudos feitos por SCHMIDT et ai. (1994), usando o-amilase, revelaram
que o aumento do pH de 5,3 (K=0,7) para 9,5 (K=20), aumentou o coeficiente
de partição em 29 vezes. O aumento no coeficiente de partição com o aumento
do pH tem sido observado para várias outras proteínas, como por exemplo:
taumatina (CASCONE et.al., 1991 ), imunoglobulina-G, L-aspartase, fumarase,
hemoglobina e ribonuclease (HUDDLESTON et.al., 1991 ). As proteínas
carregadas mais negativamente (nos casos em que o pH é superior ao pi)
preferem a fase superior ("top") que é rica em PEG. A presença de um número
maior de cargas negativas, com o aumento do pH, promove as interações mais
fortes entre a a-amilase e as subunidades do PEG. Esses autores observaram
ainda, que quando o pH é aumentado ocorre um decréscimo na razão de
volume entre as fases.
2.6.5 - Efeito dos Sais
A composição do sais que podem ser incluídos nos sistemas de duas
fases aquosas são de suma importância para o sucesso da afinidade de
partição de todas as espécies de moléculas e partículas celulares. Usualmente
soluções tampão são adicionados aos sistemas com a finalidade de manter o
pH no valor desejado. Entretanto, quando é desejável a partição de
determinados materiais presentes no sistema outros tipos de sais, podem ser
utilizados visando uma boa partição sem a necessidade de utilização de um
ligante específico. Embora os sais se separem uniformemente entre as fases,
existem diferenças significativas no coeficiente de partição que depende do
14
tipo de sal utilizado. Isto significa que os íons têm diferentes afinidades pela
duas fases (ASENJO, 1990; HARRIS et ai., 1994; UMAKOSHI et ai., 1996;
LAHORE et ai., 1996).
A adição de sais neutros, tais como NaCI, em um sistema PEG/dextrana
diminuirá o coeficiente de partição das proteínas carregadas negativamente e
aumentará o coeficiente de partição das proteínas carregadas positivamente. A
magnitude do efeito aumenta na seguinte ordem: so4-2 < F< cr < r < e NH4+ <
Na+< K" (CASCONE et ai., 1991; HUDDLESTON et ai., 1991; SCHMIDT et ai.,
1996).
Nos estudo de partição da vancomicina (um glicopeptídeo) em sistema
de duas fases aquosas foi mostrado que o coeficiente de partição aumenta
com a adição de sais. No sistema PEG/fosfato, o coeficiente de partição
aumentou de 4 para 120 quando 8,8% de NaCI foi usado, enquanto que com a
mesma concentração de NaCI em sistema PEG/dextrana o coeficiente de
partição aumentou de 1,55 para 5 (LEE et ai., 1990). Nos estudos realizados
para a taumatina o coeficiente de partição também foi aumentado através da
adição de NaCI. Quando foi feito a adição de 8,8% de NaCI no sistema
PEG6000/fosfato o coeficiente de partição desta proteína aumentou
drasticamente (K=0,53 para K=33), gerando um aumento de 62 vezes no valor
de K (CASCONE et.al., 1991). Segundo os estudos feitos por LAHORE et.al.,
(1995) em experimentos utilizando um sistema PEG3350/fosfato, o valor de k
aumentou de 1, 1 para 35 quando foi adicionado 5,8% de NaCI. Para o
sistema PEG-3350/sulfato a adição de 8,8% de NaCI promoveu um aumento
no valor de K de 0,32 para 33.
2.6.6 - Influência da Temperatura
As mudanças de temperatura podem afetar diretamente a formação do
sistema de duas fases aquosas alterando a composição das fases e assim a
posição da curva binodial, bem como o comprimento das linhas de amarração.
Geralmente para baixas (menores que 20ºC) temperaturas a curva binodial
desloca-se em direção às baixas concentrações dos componentes que formam
15
as fases, resultando no aumento do comprimento das linhas de amarração. Os
sistemas de fases próximos do ponto crítico podem ser mais influenciados pela
mudança de temperatura devido à sua instabilidade, quando a curva binodial
é deslocada, podendo assim os sistemas passar facilmente para a região
monofásica (BAMBERGER et ai., 1985; T JERNELD et ai., 1990).
O efeito da temperatura na separação das fases para um sistema
polímero/polímero ( Dextrana/PEG, Dextrana/polivinil álcool, polivinilpirolidona
etc.) apresentam diferenças com relação aos sistemas formados por
polímero/sal (PEG/fosfato, PEG/sulfatos, etc.). Para os sistemas formados por
polímero/polímero foi constatado que com o aumento da temperatura foi
necessário uma concentração maior dos polímeros para a separação das
fases. Neste caso, para que a separação das fases sejam favorecidas deve-se
trabalhar em temperaturas inferiores à ambiente. Já para os sistemas
polímero/sal, ocorre justamente o contrário, em temperaturas maiores ou
próximas à ambiente a separação das fases do sistema é facilitada. Foi
também observado para sistema PEG/sal, que o aumento da temperatura
favorece o aumento da concentração de PEG na fase superior do sistema e
consequentemente ocorre uma redução da concentração do polímero na fase
inferior do sistema (BAMBERGER et ai., 1985; ZASLAVSKY, 1995).
2.7 - Xilanase
Dentre as proteínas estudadas, particular interesse tem sido dedicado
às enzimas cuja função consiste em catalisar reações de formação e quebra
das ligações químicas. Estão presentes no metabolismo dos organismos vivos
e são responsáveis pela biossíntese de inúmeros compostos (KARLSON,
1970).
Para este estudo foi escolhida a xilanase, uma enzima de grande
interesse, por apresentar uma vasta aplicação no setor industrial (CUROTTO
et ai., 1994).
Os fungos filamentosos são particularmente produtores interessantes de
xilanases do ponto de vista industrial, devido ao fato destes microrganismos
16
produzirem enzimas extracelulares. Além disto, os níveis de xilanases das
culturas de fungos são geralmente maiores que os produzidos por leveduras e
bactérias. Uma outra característica importante é que as xilanases produzidas
por fungos liberam um complexo de várias enzimas xilanolíticas que auxiliam
na degradação da xilana (HALTRICH et ai., 1996)
As xilanases utilizam como substratos naturais as hemiceluloses que
estão presentes em grandes proporções em diferentes tipos de biomassas
lignocelulósicas e consistem principalmente de xilanas. As xilanases são
enzimas que hidrolisam a maioria das hemiceluloses que apresentam ligações
glicosídicas do tipo f3 (1,4) entre os seus constituintes ( CHAUDHARY et ai.,
1997).
A hemicelulose é um heteropolissacárideo consituído por: D-xilose, L-
arabinose, D-manose, D-glicose e ácido D-glicurônico (DEKKER, 1983). A
classificação destes polímeros é feita geralmente de acordo com o resíduo de
açúcares presentes na cadeia principal da estrutura da hemicelulose, tais
como as D-galactanas (galactose) e a D-xilana (xilose) (MAGEE e KOSARIC,
1985).
A hidrólise da hemicelulose requer um conjunto de enzimas
extracelulares, devido à sua estrutura de heteropolissacarídeo, altamente
ramificado. As hemicelulases são classificadas dependendo do substrato sobre
o qual elas atuam. Por exemplo: as xilanases que hidrolisam hemiceluloses do
tipo xilana e as mananases hidrolisam a hemicelulose do tipo manana
(BASTAWDE, 1992). Devido a heterogeneidade das xilanas, sua hidrólise
requer um conjunto de isoenzimas para a sua degradação que pode ser vista
na Figura 2.4 (COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993; SUNNA et ai., 1997).
17
~-4-0-Me-GlcA
A I ACETILC XtLANAIESTERAse J
c==:=:::ii lC.·GLUCURONIOASE) Il o
C(-Arvf OH I c(·ARABINOFURANOSIDlSE I
c(·Ataf 8
I e-XILOSIOASE l
Figura 2.4 - (A) enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. Ac: grupo acetil; a-4-o-Me-GlcA: Ácido a-4-o-metil glucurônico. (B) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela f3-xilosidase.
18
Endoxilanases:
As endo-j3-1,4-D-xilanases (1,4-j3-xilana xilohidrolase; EC 3.2.1.8)
hidrolisam as ligações glicosídicas no interior das xilanas, resultando em um
decréscimo no grau de polimerização do substrato. O ataque à xilana não é ao
acaso, e a ligação para ser hidrolisada depende da natureza do substrato, ou
seja, da extensão, do grau de diversidade e da presença de substituintes na
cadeia. Durante o início da hidrólise da xilana, os principais produtos formados
são os xilooligosacarídeos que podem ser novamente hidrolisados em
xilotriose, xilobiose e xilose. A ação das endoxilanases diferenciam-se de
acordo com os endo produtos liberados (REILL Y, 1981; SUNNA et ai., 1997).
Uma propriedade físico-química importante das endoxilanases de fungos e
bactérias parece ser a relação entre a sua massa molar e o seu ponto
isoelétrico (pi). Conforme sugerido por WONG et ai.( 1988), as endoxilanases
podem ser agrupadas em proteínas ácidas e básicas, sendo que as básicas
apresentam massas molares inferiores a 30 kDa e as proteínas ácidas com
massas molares superiores a 30 kDa. Foi ainda verificado que
aproximadamente 70% das endoxilanases ácidas possuíam massas molares
superior a 30 kDa e quase que a mesma porcentagem de endoxilanases
básicas apresentaram massas molares inferiores a 30 kDa. As endoxilanases
purificadas de Myrothecium verrucarias citadas por FILHO et ai. (1993)
apresentaram um baixo pi 4,3 e massa molar de aproximadamente 16 kDa,
enquanto as endoxilanases obtidas por MATTE e FORSBERG, (1992)
purificadas de Fíbrobacter succinogenes apresentaram um pi de 8, O e massa
molar de aproximadamente 66 kDa.
Os fungos filamentosos são bem conhecidos como produtores de
enzimas que degradam xilanas. Recentemente um complexo xilanolítico
Aspergillus nidulans na presença de xilana como fonte de carbono tem
produzido pelo menos 3 endo-1,4-j3-xilanases com massas molares de 22, 24 e
34 kDa. As três proteínas foram purificadas e caracterizadas. A endo-xilanase
de massa molar 22 kDa foi considerada uma xilanase básica, enquanto as
outras duas foram consideradas ácidas (KUMAR e RAMÓN, 1996).
19
(3-Xilosidases
As (3-xilosidases ((3-D-Xilosídeos xilo-hidrolase; EC 3.2.1.3. 7) são
exoglicosidases que hidrolisam pequenos xilooligossacarídeos e xilobiose a
partir do terminal não redutor liberando xiloses (WONG et ai., 1988). São
enzimas capazes de promover a quebra de substratos artificiais como p-
nitrofenil (3-D-xilosídeo, o qual é usado para determinação de sua atividade
enzimática (COUGHLAN e HARLEWOOD, 1993). Os fungos e bactérias têm
sido mencionados como produtores de (3-xilosidases. Estas enzimas
apresentam massa molares maiores que as endoxilanases e que estão na
faixa de 60 a 360 KDa. Geralmente, as (3-xilosidases não são capazes de
hidrolisar xilanas, entretanto, em alguns trabalhos foram citados a lenta ação
desta enzima neste substrato para a produção de xilose. Entres os
xilooligômeros, a xilobiose destacou-se como bom substrato para a ação
enzimática da (3-xilosidases. A afinidade da enzima para com
xilooligosacarídeos decresce com o aumento do grau de polimerização (DP).
Um grande número de (3-xilosidases tem sido citadas por possuírem atividade
a-arabinosidase (exemplos: enzimas de A. niger (RODIONOVA et ai., 1983),
T.reesei (POUTANEN e PLUS, 1988). A maioria das (3-xilosidases estudadas
podem ser completamente inibidas pelos seus produtos de hidrólise a xilose.
Muitas (3-xilosidases têm atividades transferases, resultando em produtos de
massas molares maiores que o substrato utilizado (SUNNA e ANTRANIKIAN,
1997).
As exo-enzimas, do tipo a-L-arabinofuranosidase, a-D-glucuronidases
e acetil(xilana)esterase, participam da quebra dos grupos laterais do polímero
removendo os substituintes arabinofuranosil, ácido glicopiranosídico e os
grupos acetil, respectivamente (BIELY et ai., 1985; COUGHLAN,
HAZLEWOOD, 1993).
20
a-L-arabinofuranosidase:
As arabinosidases têm um importante papel na hidrólise das xilanas,
mas somente algumas destas enzimas têm sido isoladas e purificadas. Existem
dois tipos de arabinofuranosidases: as que têm ação exo a-L-
arabinofuranosidase (Ec 3.2.1.55) que apresentam atividade para o substrato
p-nitrofenil-a-L-arabinofuranosídeo e sobre as arabinanas ramificadas. A outra
arabinofuranosidase é a endo 1,5-a-L-arabinase (EC 3.2.1.99), que são ativas
somente em arabinanas lineares (VAN DER VEEN et ai., 1992). A maioria das
enzimas estudadas que degradam arabinanas são do tipo de ação exo. As
arabinofuranosidases naturais podem alcançar acima de 495 kDa e são
encontradas nas formas mono, di, tetra, hexa e octômeras. Foi constatado que
as enzimas liberadas pelo Aspergi/Jus niger degradam primeiro os resíduos da
ligação a-L-1,3-arabinofuranosil nas arabinas em uma proporção de
aproximadamente 30 % e em seguida prosseguem com a degradação das a-L-
1,5-arabinanas que podem ser convertidas completamente em arabinose. A
ação simultânea desta enzima com as xilanase promovem um aumento na
produção de xilose, xilobiose e arabinose ( SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
a-glucuronidases:
As a-glucuronidases (3.2.1-) hidrolisam as ligações a-1,2 entre o ácido
glucurônico e o resíduo de xilose em glucuronoxilanas. Devido à falta de
atividade da glucuronidase em fungos, esta enzima não foi citada até 1986
(PLUS et ai., 1986). Os cinco a-glucuronidases que foram purificadas até o
momento apresentaram massas molares acima de 100 kDa. A especificidade
das enzimas pelos substratos diferem de acordo com os microrganismos
produtores da enzima. Por exemplo, as enzimas produzidas por Agaricus
bisporus e S. olivochromogenes requerem um substrato de baixa massa molar
de glucuronoxilana. Elas liberam o ácido 4-0-metilglucurônico dos
xilooligômeros substituídos (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
21
Acetil(xilana)esterase:
As acetil(xilana)esterases (EC 3.1.1.6) removem os substituintes o-acetil
das posições do carbono-2 e 3 dos resíduos de xilose em acetil-xilanas. A
produção de acetil-xilana esterase de fungos foi pela primeira vez descrita por
BIELY et ai. (1985). O principal atraso da descoberta desta enzima foi devido à
falta de um substrato apropriado para a sua análise.
Ferúlico esterase e cumárico esterase:
A ferúlico esterease (EC 3.1.1.-) degrada as ligações éster entre a
cadeia lateral da arabinose e o ácido ferúlico na xilana. Da mesma maneira a
cumárico esterase (EC 3.1.1.-) degrada as ligações éster entre a arabinose e o
ácido p-cumarílico (MACKENZIE et ai., 1987; MÜLLER-HARVEY et ai., 1986).
A p-cunarílico esterase é um dímero com massa molar de 11 kDa. Ao contrário
da p-cumarílico as duas ferúlico esterase são monoméricas, com massas
molares de 68 e 24 kDa (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
2. 7 .1 - Xilanases de Penicillium janthinel/um
Do complexo enzimático produzido pelo fungo Penicillium janthinellum
as enzimas endoxilanase e P-xilosidase foram purificadas e caracterizadas por
MILAGRES 1994, RODRIGUES, 1997 e CORTEZ, 1998. Características
importantes como massa molar (endoxilanase 54,5 kDa e 20, 1 kDa; P-
xilosidase 74,5 kDA e 110 kDa), ponto isoelétrico (endoxilanase pl=5,5; P-
xilosidase pl=6,0) e estabilidade a variações de pH foram determinados. No
entanto, outros estudos de recuperação da xilanase com possibilidade de
ampliação de escala ainda são necessários.
2.7.2 -Aplicações Industriais
Tradicionalmente, a aplicação de xilanases em conjunto com enzimas
celulolíticas tem sido considerado principalmente para a bioconversão q~
materiais lignocelulósicos, especialmente resíduos agrícolas e florestais, para
obtenção de produtos importantes, como combustíveis e outros produtos
químicos (HAL TRICH et ai, 1996)
Na indústria de alimentos, a xilanase pode empregada na clarificação
de sucos e vinhos (BIELY et a/.,1985), e na fabricação de pães, visando
aumentar seu volume e melhorar a textura da casca e do miolo (MUTSAERS,
1991) e na etapa de filtração da cerveja, rompendo sólidos em suspensão
(VAN DER BROECK et ai., 1990). A xilanase pode também ser adicionada à
ração para aves e suínos, aumentando sua digestibilidade (BRICE e
MORRISON, 1991 ). Há também o interesse em utilizá-la para a produção de
xilose, xilobiose e xilo-oligômeros que podem ser empregados como insumos
para a obtenção de xilitol ou ácido láctico por via fermentativa (WONG et ai.,
1988; GILBERT et ai., 1992).
Na indústria de papel e celulose, as xilanases são bastante estudadas
para aplicações nas etapas de branqueamento da polpa de celulose, por
reduzirem o impacto ambiental causado pelas águas residuais da indústria de
polpa e papel (GUTIERREZ e TENGERDY, 1998). A habilidade das xilanases
no branqueamento da polpa kraft tem sido um sucesso e uma opção
economicamente competitiva devido a redução de compostos orgânicos
cloradas. Portanto, torna-se de grande relevância os estudos que visam a sua
produção e recuperação em larga escala (MILAGRES e DURAN, 1992, WONG
et ai., 1997).
23
3 - OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi estudar a técnica de extração
líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas para a recuperação da
enzima xilanase, obtida do cultivo de Penicillium janthinellum em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Durante a realização deste
trabalho os seguintes objetivos específicos foram cumpridos:
• Estudo dos diagramas de fases para avaliar a influência das variáveis pH,
massa molar do PEG e comprimento das linhas de amaração.
• Estudo do efeito das variáveis pH, massa molar e concentração do PEG,
concentração do tampão fosfato e NaCI no processo de extração líquido-
líquido da xilanase em sistema de duas fases aquosas. Para auxiliar o estudo
destas variáveis foi utilizado um planejamento fatorial completo 25 com pontos
centrais.
• Determinação do modelo estatístico a partir das variáveis significativas que
representam o processo de extração líquido-líquido das xilanases e das
proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas.
• Determinação da porcentagem de recuperação da enzima xilanase e o
aumento de pureza obtido após o processo de extração líquido-líquido em
sistemas de duas fases aquosas.
24
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 - Microrganismo
O microrganismo utilizado no presente trabalho foi o fungo Penicillium
janthinellum CRC 87M-115 isolado de madeira em decomposição em Lorena-
SP por MILAGRES (1988).
4.2 - Reagentes
Todos os reagentes e solventes empregados foram de grau analítico,
com exceção da xilanase (_Sigma-X-0502), de "birchwood", de grau comercial.
4.3 - Meios de Cultura
4.3.1 - Meio de Manutenção dos Fungos
O meio de cultura usado para obtenção de esporos de P. janthinellum
foi composto por 2% de glicose; 0,25% (v/v) de extrato de levedura, 2% (v/v)
de solução mineral (VOGEL, 1956), e 2% (v/v) de ágar-ágar pH 5,8
autoclavado por 15 minutos a 112°C. Cada mililitro de solução mineral
continha citrato de sódio dihidratado (O, 125g), fosfato monobásico de potássio
(0,25g), nitrato de amônio (O, 1 g), sulfato de magnésio heptahidratado
(0,015mg) e sulfato de manganês dihidratado (0,002mg), (MILAGRES, 1988).
4.3.2 - Meio de Cultura Formulado a Partir do Hidrolisado Hemicelulósico de
Bagaço de Cana-de-Açúcar
Para a produção do hidrolisado foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar
e o procedimento de hidrólise foi realizado, conforme descrito por MILAGRES,
LACIS (1991). Foi utilizado 46 mg de H2S04 p.a por grama de matéria seca em
uma relação de matéria seca: solução ácida de 1: 1 O. O bagaço foi seco a
25
aoºc até ser atingida a umidade de 10%, passando em seguida por um moinho
com peneira de 20 "mesh". Posteriormente, foi tratado com ácido (20 ml de
ácido sulfúrico p.a e 8L de água para 8009 de bagaço) e autoclavado a 121ºc
por 45 minutos. A fração líquida, constituída principalmente por hemicelulose,
foi recuperada por filtração em papel de filtro e levada a pH 5,5 com NaOH 1 N.
A partir do hidrolisado hemicelulósico foi preparado um meio para
cultivo de P. janthinellum com adição de solução de solução mineral de Vogel
(2% v/v) e extrato de levedura {O, 1 %). O meio foi autoclavado por 15 minutos a
112ºC.
4.4 - Produção da xilanase
A xilanase foi obtida através do cultivo de P. janthinellum em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, segundo o esquema
representado na Figura 4.1.
Em 100 ml de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-
açúcar, adicionou-se 1 g de extrato de levedura . Transferiu-se o hidrolisado
para uma proveta de 1000 ml, adicionou-se 20 ml de solução mineral de
Vogel e completou-se o volume da proveta. Distribuiu-se o meio em 40 frascos
Erlenmeyer de 125 ml ( contendo 25 ml de meio). A produção da xilanase foi
realizada após inoculação de 105 esporos de P.janthinellumlml nos frascos de
Erlenmeyer e cultivados em Shaker com agitação de 60 rpm, 30ºC por 5 dias.
O meio fermentado foi filtrado em papel de filtro (Millipore) utilizando-se vácuo.
A atividade enzimática foi determinada como descrita no item 4.5 obtendo-se
60,6 U/ml e o teor de proteínas de acordo com o item 4.6 foi de 190,9 mg/L.
26
1ªEtaDa
i Hidrolisado
2°EtaDa
3ªEtaDa
Raspagem dos fungos
1g de Extrato de levedura 20ml de solução de Vogel l
.. li .. i r Volume completado com + hidrolisado para 1000 ml
i ... Alíquota de 100 ml
... 40 Ertenmayer
... AutoclllVe por 15 min. 112"C
... lnóculo
Shaker JO"C 5 dias
... ... Filtragem
Armazenamento
Figura 4.1 - Fluxograma experimental de obtenção da xilanase, incluindo as etapas de preparo do substrato, incubação e filtragem
27
4.5 - Avaliação da Atividade Enzimática
A atividade de xilanase extracelular foi determinada pela medida da
quantidade de açúcares redutores liberados a partir de xilana, de acordo com
o método de BAILEY et ai., (1992). Os açúcares redutores foram dosados pelo
método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959).
A solução de xilana foi preparada a partir de 1 g de xilana ("Birchwood" -
Sigma) diluída em 80 mL de tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5. A
solução foi fervida sob agitação e o volume completado para 100 mL, com o
mesmo tampão.
Um volume de 0,9 mL de xilana 1 % foi colocado em tubos de ensaio e
incubados em banho termostatizado, à temperatura de 50°C por 5 minutos. Em
seguida, acrescentou-se 100 µL das amostras contendo enzima. Após 5 min,
adicionou-se de 1,5 mL de DNS para dosagem dos açúcares liberados, sendo
a mistura aquecida em banho de água fervente por 5 minutos. A reação foi
paralisada em banho de água à temperatura ambiente, as leituras foram feitas
a 540 nm (espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-150-02). As leituras de
cada amostra foram feitas calibrando o aparelho utilizando-se um controle
contendo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 e DNS.
Para detectar as unidades não redutoras não provenientes da hidrólise
enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O primeiro, denominado
controle do substrato, continha a xilana sem a ação da enzima. O segundo,
denominado de controle da enzima, foi constituído de tampão acetato, meio
fermentado contendo a enzima e o DNS, para detectar a presença de açúcares
redutores do próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com as amostras
foram descontadas as absorbâncias verificadas nos controles ( enzima e
substrato). A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose (Merck), nas
concentrações entre 2 e 1 O µmol/ml.
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de
enzimas necessária para liberar 1 µmol de açúcar redutor, expresso como
xilose, por minuto a 50°C.
28
4.6 - Determinação do teor de Proteínas
A determinação do teor de proteínas totais foi baseada na microanálise
do método de BRADFORD (1976).
Na microanálise de Bradford empregou-se o reagente "Comassie
Brilliant Blue" G-250 e padrões de BSA ("bovine serum albumin") nas
concentrações entre de 20 a 200 mg/L para a construção da curva de
calibração. Inicialmente "Comassie Brilliant Blue" (100 mg) foi dissolvido em 50
ml de etanol a 95% sob agitação vigorosa, sendo misturado com 100 ml de
ácido fosfórico a 85%. Diluiu-se a mistura com água deionizada para o volume
de 1000 ml, e a solução obtida foi filtrada para remoção de insolúveis
formados. As leituras foram feitas em espectrofotômetro a 595 nm em solução
contendo 1 ml desse reagente e O, 1 ml da amostra a ser analisada.
4. 7 - Determinação das Curvas Binodiais
As curvas binodiais foram determinadas através do método de titulação
(BAMBERGER et ai., 1985, VERNAU et ai. 1990), o fluxograma experimental
encontra-se representado na Figura 4.2. Colocou-se um tubo de ensaio sobre
uma balança analítica e adicionou-se uma massa conhecida de PEG
(aproximadamente 0,5 g) e em seguida foi feito a adição gota a gota da
solução estoque de fosfato de potássio (K2HPOJKH2P04). O sistema foi
agitado manualmente, e o aparecimento da turbidez indicou a passagem do
sistema para a região de duas fases. Anotou-se a massa de fosfato
adicionada. Em seguida, adicionou-se água até que a solução se tornasse
transparente novamente, indicando o retorno do sistema para a região
monofásica. Tornou-se a adicionar solução de fosfato gota a gota sob agitação
até atingir a turbidez novamente, esse foi o segundo ponto da curva binodial.
Repetiu-se o processo para obter os demais pontos da curva.
Com a massa de fosfato e PEG adicionados no tubo e a massa total, foi
calculado a composição do sistema e determinado os pontos da curva binodial.
Os cálculos para a determinação de cada ponto da curva foram feitos da
seguinte maneira:
29
% p/p de PEG = m PEG x 0,5 I m total
% p/p de fosfato = m fosfato X e fosfato I m total
onde: m PEG é referente a quantidade de solução estoque de PEG adicionada no tubo;
m fosfato é referente a quantidade de solução estoque de tampão fosfato adicionada no tubo;
m total é a massa total no tubo; C fosfato é a concentração da solução estoque de tampão fosfato em p/p;
0,5 é a concentração da solução estoque de PEG em p/p.
4.8 - Determinação das Linhas de Amarração
As linhas de amarração de cada diagrama de fases foram obtidas
através da razão de volumes das fases. Inicialmente, escolheu-se um sistema
na região bifásica, pesando-se a quantidade necessária de solução estoque
de PEG e tampão fosfato para se obter a sua composição. Em seguida, o
sistema foi misturado e centrifugado para a separação das fases. Os volumes
das duas fases foram lidos e a razão entre o volume da fase superior e o
volume da fase inferior foi calculada. O ponto referente ao sistema escolhido
foi plotado no diagrama de fases. Foram então traçadas diversas retas
passando por esse ponto e as distâncias entre o ponto até o cruzamento com
a curva binodial foram medidas (Segmentos TM e BM da Figura 2.1 ),
calculando-se a razão entre o segmento BM e o segmento TM. Comparou-se
esse valor com a razão de volumes calculada a partir do ensaio. A reta cuja
razão obtida graficamente apresentou aproximadamente o mesmo valor
experimental foi adotada como a linha de amarração que passou pelo sistema.
30
0.5 g PEG
r Tampão fosfato
.\
---+ --+ Agitação
~ Manual
( 1 0,100 , 11 Sistema Bifásico
Água -} li
Agitação Manual +---
Figura 4.2 - Fluxograma experimental para a determinação das curvas binodiais
31
4.9 - Estudos Eletroforéticos
4.9.1 - Precipitação do Caldo Inicial com Ácido Tricloroacético (TCA)
O extrato enzimático obtido foi liofilizado visando aumentar a
concentração de proteínas, utilizando um equipamento EDWARDS Pirani 501
nas seguintes condições: temperatura de - 40ºC e pressão de 10-1 atm. Uma
amostra deste extrato liofilizado contendo a enzima xilanase e 407,55 mg/ml
de proteínas totais foi concentrado pela precipitação com ácido tricloroacético
para ser analisado por eletroforese. A uma alíquota de 1 O ml do extrato
enzimático, adicionou-se 1g de TCA ( concentração final de 10 %). O material
foi mantido em banho de gelo por 1 hora e centrifugado a 6708 g (10000 rpm)
por 15 min a 4ºC. Os sobrenadantes foram desprezados, e os precipitados
lavados com acetona a - 20ºC e centrifugados a 6708 g por 15 minutos por
4°C. Os precipitados foram redissolvidos em 300 µI de solução de NaOH O, 1 M
( 9051,72 mg/ml de proteínas totais).
4.9.2 - Precipitação com Etanol
Promoveu-se a precipitação com etanol 80% de acordo a metodologia
descrita por CORTEZ, 1998. Teve como objetivo a remoção do PEG da fase
superior do sistema de duas fases aquosas. Adicionou-se uma alíquota de 20
ml da fase superior do ponto de ótimo da xilanase que em um becker de 200
ml que foi levado em um banho termostatizado de -3ºC e deixado em repouso
por 15 minutos para a estabilização. Em um tubo de ensaio adicionou-se o
etanol em volume suficiente para atingir a concentração de 80% v/v (20 partes
da fase superior para 80 partes de etanol), que foi levado ao banho e mantido
em repouso por 15 min. Através de uma bomba peristáltica o etanol foi
transferido ao becker contendo a fase superior, em uma velocidade suficiente
para que a temperatura no interior do recipiente não ultrapassasse 4°C. A
agitação foi executada com o auxílio de um bastão de vidro. Após a adição
completa do etanol, o meio foi mantido em repouso e refrigerado (-3ºC) por 15
min. Em seguida foi centrifugado a 2400 x g por 15 min. O precipitado foi
32
separado e em seguida redissolvido em tampão acetato de sódio pH 5,5, 50
mM. O teor de proteínas totais foi determinado pelo método da microanálise
Bradford (2623,87 mg/ml).
4.9.3 - Ensaios Eletroforéticos
As massas molares das enzimas foram determinadas através da
mobilidade eletroforética em condições desnaturantes em gel de poliacrilamida
12,5%, contendo SDS de acordo com o método descrito por WEBER et ai.
(1972). A corrida eletroforética foi realizada à temperatura ambiente,
utilizando tampão Tris-glicina pH 8,9 contendo SDS (O, 1 %). O aparelho foi
calibrado para 100 V e quando a linha frontal do azul de bromofenol atingiu o
gel separador, a voltagem foi aumentada para 200 V. A coloração dos géis foi
realizada durante 12 horas a 37°C com uma solução contendo 100 mg de azul
brilhante de "Comassie Blue" em uma mistura de 45 ml de metanol, 1 O ml de
ácido acético glacial e 45 ml de água destilada. A descoloração foi feita com
lavagens sucessivas em uma solução contendo 100 ml de ácido acético, 450
ml de metanol e 450 ml de água destilada.
Foram utilizados como padrões as seguintes proteínas: f3-galactosidase
(116kDa); Fosforilase (97,4kDa); Albumina de soro bovino (66kDa);
Ovalbumina (45kDa); Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (36kDa); Anidrase
carbônica (29kDa); Tripsogênio de pâncreas bovino (24kDa}, Inibidor de
tripsina (20, 1 kDa}, a-Lactalbumina ( 14,2 kDa).
4.1 O - Delineamento Experimental da Extração Líquido-Líquido de Xilanase em
Sistema de Duas Fases Aquosas
O delineamento experimental para verificar a influência das variáveis
pH, massa molar e concentração do PEG, concentração do tampão (K2HPO,J
KH2P04) e concentração de NaCI, foi realizado com uma repetição, seguindo
um planejamento 25 com 4 ensaios no ponto central. Os níveis dos fatores e a
matriz de planejamento desse projeto são mostrados nas Tabelas 4.1 e 4.2. Os
valores (-1 }, (O) e (+1) correspondem ao menor nível, o nível médio e o maior
33
nível, respectivamente. Os ensaios foram realizados em ordem aleatória, de
forma a minimizar a ocorrência de erros sistemáticos (BARROS NETO et ai.,
1995; BOX et ai., 1978).
Tabela 4.1 - Fatores e níveis utilizados nos ensaios de extração das xilanases em sistemas aquosos bifásicos.
Fatores
Níveis
Variáveis Mínimo Máximo P.Central
(-) (+) (O)
pH 5,0 8,0 6,5
PMPEG 600 6000 4000
%PEG 10,0 35,0 22,5
% Fosfato 10,0 25,0 17,5
%NaCI o 10,0 5,0
34
Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial utilizado para o estudo das variáveis na extração líquido-líquido da xilanase em sistema de duas fases aquosas.
Número da Seqüência Fatores da
análise análise X1 X2 ~ x, Xs H PMPEG o/oPEG % FOSF. o/oNaCI
1 25 2 36 + 3 20 + 4 28 + + 5 22 + 6 4 + + 7 34 + + 8 23 + + + 9 8 o o o o o 10 14 + 11 26 + + 12 6 + + 13 3 + + + 14 12 + + 15 19 + + + 16 7 + + + 17 35 + + + + 18 16 o o o o o 19 9 + 20 30 + + 21 17 + + 22 15 + + + 23 5 + + 23 21 + + + 25 29 + + + 26 1 + + + + 27 24 o o o o o 28 2 + + 29 33 + + + 30 31 + + + 31 11 + + + + 32 18 + + + 33 13 + + + + 34 27 + + + + 35 10 + + + + + 36 32 o o o o o
35
Após a seleção das variáveis pH, %PEG, %NaCI consideradas
significativas no planejamento inicial (Tabela 4.2) a otimização do coeficiente
de partição (K) foi realizada através de um segundo planejamento fatorial
completo de 23, com 3 pontos centrais de acordo com a metodologia de BOX et ai., (1978). A determinação do modelo estatístico com a superfície de resposta
correspondente foi feita utilizando-se um programa estatístico STATGRAPH
6.0. O modelo foi determinado através de regressão linear pelo método dos
mínimos quadrados aplicada a resultados experimentais obtidos no
planejamento fatorial completo 23 com repetição no ponto central. Estes
modelos são representados pela Equação 4.1.
/\ n n n-1 n
(4.1) i = 1 i = 1 i=1 j=i+1
Onde:
A
Yi = Variável resposta;
bo, b, b, e bu = Coeficientes;
Xi e Xi = Variáveis em estudo.
4.11 - Delineamento Experimental da Extração Líquido-Líquido de Proteínas
em Sistema de Duas Fases Aquosas
Para a determinação dos coeficientes de partição das proteínas totais
foram realizados os experimentos, segundo as matrizes apresentadas nas
Tabelas 4.1 e 4.2 respectivamente. Para as dosagens de proteína totais
utilizou-se a microanálise de Bradford. O modelo estatístico foi obtido através
da regressão linear pelo método dos mínimos quadrados o qual pode ser
representado pela Equação geral 4. 1 .
36
4.12 - Experimentos de Extração Líquido-Líquido em Sistemas de Duas Fases
Aquosas
A enzima xilanase foi extraída do meio fermentado utilizando um
sistema de duas fases aquosas. Os sistemas foram preparados pela
cornposrçao PEG/fosfato de potássio nas concentrações propostas no
planejamento experimental (item 4.1 O). A primeira etapa consistiu na adição
dos componentes necessários a formação do sistema. Por exemplo, o sistema
35% PEG/10% (K2HPOJKH2P04), 10% de NaCI, pH=8,0 foi formado para 10 g.
Os componentes foram adicionados em um tubo de centrífuga de 15 ml, sobre
uma balança analítica na seguinte ordem e pesos: 3,5 g de PEG, 1,0 g de
(K2HPOJ KH2P04) na proporção (13,93% K2HPOJ86,07% KH2P04), 1,0 g de
NaCI, 3,0 g de meio contendo a enzima e água até completar o peso de 10 g.
O sistema foi agitado em vórtice por 30 segundos e separado por
centrifugação (1 O min, 2500 g). Alíquotas das fases superior ("top") e inferior
("bottom") foram retiradas com uma pipeta automática e colocadas em tubos
Eppendorf para posterior análise. Com essas amostras determinou-se as
atividades enzimáticas e proteínas totais nas fases superior e inferior. A
Figura 4.3 mostra o fluxograma experimental representativo deste experimento.
37
13,93 % K2HP04 86,07 % KH2P04
10% NaCI 3,5g PEG
3g de meio contendo a
enzima+~O
Fase Superior
Atividade Enzimática e
Proteínas Totais
Tubo de ensaio de
15 mL
Fase inferior
Figura 4.3 - Fluxograma experimental da extração líquido-líquido de xilanase em sistemas de duas fases aquosas
Agitação em Vórtice por30 s
, , Centrifugação
por 10 min. 25009
Leitura dos volumes das fases separadas
Atividade Enzimática e
Proteínas Totais
38
4.13 - Metodologia de Análise dos Resultados.
Para a avaliação do processo de recuperação da xilanase foram
analisados os seguintes parâmetros: Coeficiente de partição (K) (aumento da
atividade específica ou aumento de pureza) recuperação em proteína total e
recuperação em atividade enzimática.
• Coeficiente de Partição (K)
~~--=_A_'_At, __ ~I ªI __ Kp __ =_c_uc_b _
Onde:
KE = Coeficiente de partição da enzima xilanase
At = atividade enzimática na fase superior
Ab = Atividade enzimática na fase inferior
Kp= coeficiente de partição das proteínas totais
Ct = concentração de proteínas na fase superior
Cb concentração de proteínas na fase inferior
• Definiu-se atividade específica (AE) como:
AE = atividade da enzima (U/ml) I proteínas totais (mg/ml)
Ambas relativas a mesma fase analisada.
• Definiu-se aumento de pureza (AP) como:
AP = AE2'AE1
Sendo:
39
AE2 = atividade específica na fase extraída (U/mmg);
AE1 = atividade específica da amostra antes da purificação (U/mg).
• Definiu-se como recuperação em proteína total (RP) como:
Rp = P2'P1 x 100
Sendo:
P2 = proteína total na fase extraída (mg);
P1 = proteína total antes da purificação (mg).
As massas P1 e P2 correspondem à concentração de proteína
multiplicada pelo volume da fase considerada.
• Definiu-se como recuperação em atividade enzimática (RA) como:
IRA= A2/A1 x 100
Sendo:
A2 = atividade na fase extraída (U);
A1 = atividade antes da purificação (U).
As atividades A1 e A2 correspondem à atividade enzimática multiplicada
pelo volume da fase considerada.
• Planejamento experimental e análise estatística
O fator resposta coeficiente de partição (K) tanto para a enzima quanto
para as proteínas foi analisado com o auxilio do programa estatístico
STATGRAPH 6.0.
40
5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 - Extração Líquido-Líquido em Sistemas de Duas Fases Aquosas
5.1.1 - Determinação das Curvas Binodiais
O estudo dos diagramas de fases teve como objetivo conhecer
comportamento da extração líquido-líquido em sistemas de duas fases
aquosas. Nas Figuras 5.1 a 5.4 estão representados os diagramas de fases
construídos para os PEGs de massas molares 600, 1500, 4000, 6000. Através
das curvas binodiais Figuras 5.3 e 5.4 verificou-se que o pH e massa molar do
PEG foram importantes para a formação dos sistemas de duas fases aquosas.
Com diminuição da variável pH e aumento da massa molar do PEG observou-
se o deslocamento das curvas binodiais para a esquerda em sentido as baixas
concentrações de PEG e fosfato de potássio que formam o sistema de duas
fases aquosas. Este mesmo efeito não foi constatado nas Figuras 5.1 e 5.2
onde foram utilizados os PEGs de massas molares 600 e 1500. A Figura 5.5
mostra um exemplo representativo de um diagrama de fases que foi construído
mantendo-se fixo o valor do pH 8,0 e variando-se a massa molar do PEG (600,
1500, 4000, 6000). Verifica-se que com o aumento da massa molar do PEG
ocorreu o deslocamento da curva binodial para a esquerda, no sentido as
menores concentrações dos componentes que formam os sistemas de fases.
Os resultados indicam que tanto a variação do pH quanto a variação da massa
molar do PEG podem influenciar a posição das curvas binodiais. O fato da
curva binodial ter sido deslocada para a esquerda indica que a quantidade de
PEG necessária para haver a formação de duas fases aquosas torna-se maior
com a diminuição do pH e da massa molar do PEG, ate um ponto onde não é
mais possível formar as duas fases, já que as soluções de PEG e fosfato
necessitam de uma quantidade mínima de água para se solubilizarem. Este
mesmo comportamento de deslocamento da curva binodial foi observado por
VERNAU e KULA, 1990 utilizando PEGs com massas molares 400, 1500, 41
: -, -
4000, 6000, 12000 e citrato de sódio pH 7,0. Estes autores concluíram que
com o aumento da massa molar do PEG e o valor do pH ocorria o
deslocamento da curva binodial. A similaridade entre a curva obtida
experimentalmente e descrita na literatura (ALBERTSSON, 1971) (Figura 5.6),
indica que o método de titulação empregado para a determinação da curva
binodial foi eficiente, tendo em vista que a curva descrita na literatura foi obtida
através da determinação da composição da fase superior e inferior do sistema
por HPLC. Para complementar este estudo foi necessário também conhecer o
comportamento das curvas binodiais construídas a partir do meio fermentado
(em substituição a água) contendo o complexo enzimático (Figura 5.7).
50
Q. - 40 Q.
'if/. ~ o 30 o <O
C) w 20 Q.
1 O
o o
pH 6,5 pH 7 ,O pH 8 ,O pH 9 ,O
5 1 5 25 20 1 O
Fosfato de Potássio(% p/p)
Figura 5.1 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de pH (Apêndice 1 ).
42
40 Q. - Q.
t 30 o o LO
e> 2 O w Q.
1 O
t----p H 6 ,O i---- p H 6 ,5 i----p H 7 ,O .----- p H 8 ,O
·---pH 9,0
o -1--,--,--,--,--,--...-...--,.--,.--,.--,.--,.--,.--,.--,.--,.--,--,--,,........,r--1 o 5 1 O 1 5
Fosfato de Potássio(% p/p) 20
Figura 5.2 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 1500 em diversos valores de pH (Apêndice 1 ).
50 pH 5,0
~ pH 6,5 Q.
pH 7 ·º - 40 Q.
'#. pH 8,0 - o 30 o
o ...,. C) 20 w Q.
1 O
o o 5 1 O 1 5 20
Fosfato de Potássio(% p/p)
Figura 5.3 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 4000 em diversos valores de pH (Apêndice 1 ).
43
50
pH 5,0 ~ 40 pH 6,5 Q. pH 7 ,O Q.
'#- pH 8,0
~ 30 pH 9,0 o o o (!) 20 C)
w a.
1 O
o
o 5 10 15 Fosfato de Potássio ('li, p/p)
Figura 5.4 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de pH (Apêndice 1 ).
50
40
Q. - Q. 30
'#. ~ C)
w 20
a.
1 O
o
o
PEG 600 PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000
25
Figura 5.5 - Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000, pH 8,0 (Apêndice 1 ).
5 1 O 1 5 20
Fosfato de Potássio ('li, p/p) pH 8,0
44
o. 40 - o. ~ o 30 o o CD
C) ui 20 o..
1 O
o o
Dados obtidos Dados Albertoson 1971
5 1 O 20 1 5
Fosfato de Potássio(% p/p)
Figura 5.6 - Comparação entre a curva binodial obtida experimentalmente e a encontrada na literatura (ALBERTSSON 1971 ), (Apêndíce 1 ).
5.1.2 - Influência do Meio Contendo Xilanase nas Curvas Binodiais dos
Diagramas de Fases
Para este estudo adotou-se um exemplo representativo utilizando-se os
PEGs de massas molares 600 (a), 4000 (b) e 6000 (c) e o valor de pH=8,0
(Figura 5. 7). As curvas binodiais foram construídas a 25ºC com água e com
meio fermentado contendo a enzima, conforme descrito no item 4.7. Observa-
se em todos os diagramas de fases que a curva binodial 8 (curva construída
com meio fermentado contendo a xi lanase) deslocou-se da curva A ( curva
construída com água) para a esquerda, em direção às baixas concentrações
dos componentes que formam as fases. A região acima da curva A é bifásica e
abaixo e monofásica. Quando a curva B foi construída, parte da região
monofásica da curva A passou a ser bifásica para a curva 8. O deslocamento
da curva B sugere que, os sais ou outros componentes presentes no caldo
fermentado, interferem no sistema ampliando assim a região de trabalho em
relação a curva A. Este mesmo efeito de deslocamento da curva foi descrito
por VEIDE et. ai., (1984) nos estudos efetuados com a enzima f3-D-
45
galactosidase obtida do cultivo de Escherichia coli, em um fermentador de 50
litros a 37°C. Estes autores utilizaram dois sistemas de fases diferentes, um
contendo PEG4000/fosfato de potássio e água pH=7,0 e o segundo contendo
PEG4000/fosfato de potássio e tris-HCI. Porém, MINANI (1997) utilizando a
enzima amiloglicosidase produzida pelo cultivo descontínuo submerso de
Aspergi/lus awamori, não verificou diferenças entre as curvas binodiais
construídas com água e as construídas com meio fermentado por Aspergi/Jus
awamori contendo amiloglicosidase.
46
a 40~~~~~~~~~~~ 35
30 25 20 15 10 5
0+--.--.--.....--..--.~r-..---r-~ o
' \ \
\ A \ \ o o
CD C> w o,
\ \
\
B \ '\
5 15 20 10
Fosfato de Potássio pH = 8,0
b
25
'
\ ,....... .e- a. 20 '$. - ' '
' A
8 ~ C> w o,
15 \ \
B ' 10 ' 5
0+---.~-.....~-.-~r--.-~~ o 5 10 15
Tampão Fosfato pH = 8,0
e
8 o CD C> w n,
0+---.~-.-~-.-~..---.-~~ o 5 10 15
Fosfato de Potássio pH = 8,0
Figura 5.7 (a, b, e). Curvas binodiais para água (A) e para meio fermentado (B) utilizando PEG 600 (a), PEG 4000 (b), PEG 6000 (e), em tampão fosfato de potássio pH= 8,0 (Apêndice 1 ).
47
5.1.3 - Estudo da Influencia da Massa Molar do PEG e do pH nos Coeficientes
de Partição das Xilanases e das Proteínas Totais.
De acordo com os estudos descritos nos itens 5.1.1 e 5.1.2 foi
constatado que a massa molar do PEG e o pH do sistema são importantes
fatores na avaliação do comportamento dos sistemas de duas fases aquosas.
Para verificar a influencia dessas duas variáveis sobre o coeficiente de
partição das xilanases e das proteínas totais, os ensaios foram divididos em
dois grupos: no primeiro grupo os testes foram realizados com PEGs de
massas molares 300, 400 e 600 e os valores de pH de 7,0 a 9,0 o segundo
grupo com PEGs de massas molares 1500, 4000 e 6000 e os valores de pH de
4,0 a 9,0.
5.1.3.1 - Ensaios com PEGs e Massas Molares s 600 e os Valores de pH como
Variável
A Tabela 5.1 mostra, os resultados de atividade enzimática das
xilanases, proteínas totais e os valores dos coeficientes de partição (K) obtidos
experimentalmente com os ensaios de extração líquido-líquido das xilanases e
das proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas para diferentes
composições. Neste estudo, foram utilizados os PEGs de massas molares
300, 400 e 600, e os valores de pH iguais a 7,0, 8,0, 9,0 e procurou-se manter
os valores das linhas de amarração (LA) aproximadamente constantes (11 cm)
e as mesmas relações de volumes das fases que formam os sistemas. A
determinação do comprimento das linhas de amarração, foi feita através da
medida das linhas nas respectivas curvas binodiais dos PEGs e valores de pH
em estudo, ampliando-se a escala dos gráficos. Para todas as composições
dos sistemas avaliados foram obtidos baixos valores dos coeficientes de
partição (K) tanto em relação as atividades xilanolíticas como em relação as
proteínas totais. O maior valor de K obtido (1,43) foi para o sistema
constituído de PEG600, 10% PEG, 15% fosfato de potássio e pH 7,0.
Observou-se também uma tendência de redução no valor de (K) quando foram
empregados valores mais elevados de pH (8,0 e 9,0) para os sistemas
48
constituídos de PEG 300 e 600. Está tendência não foi verificada com o
PEG400, que apresentou um coeficiente de partição (K) de 1,28 nas condições
de PEG400, 10% PEG, 20% fosfato de potássio e pH 9,0. Os valores próximos
de K tanto das xilanases quanto das proteínas totais indicam que para as
condições experimentais adotadas não foram adequadas para se obter uma
boa separação.
.- -.
49
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5.1.3.2 - Ensaios com PEGs de massas molares de 1500, 4000 e 6000 e o
valor de pH como Variável.
Neste estudo foram feitos ensaios utilizando-se PEGs com massas
molares de 1500, 4000, 6000 e valores de pH iguais a 4,0 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 e
9,0 (Tabela 5.2). De maneira similar à realizada anteriormente, procurou-se
manter o comprimento da linha de amarração aproximadamente constante (11
cm). As composições de PEG e fosfato de potássio utilizadas para a formação
dos sistemas de duas fases aquosas foram de 25% PEG e 10% fosfato de
potássio, respectivamente. Para os sistemas PEG1 SOO/fosfato pH 5,0,
PEG4000 e PEG6000 pH 4,0 não foi possível traçar as linhas de amarração
devido a imprecisão da forma das curvas binodiais destes sistemas. Verificou-
se que, a medida que o pH diminuiu, as curvas binodiais não apresentaram
concavidade suficiente para se traçar as linhas de amarração.
Os resultados apresentados na Tabela 5.2 mostraram que em todos os
ensaios os valores dos coeficientes de partição tanto das xilanases quanto das
proteínas totais não foram muito superior a 1, indicando que as xilanases e as
proteínas totais não particionaram preferencialmente para nenhuma das fases.
Verificou-se ainda (Tabela 5.2), um pequeno aumento no coeficiente de
partição (K) tanto das xilanases quanto das proteínas totais para os PEGs de
massas molares 1500 e 6000 pH 8,0 e o PEG4000 pH 7,0. Alterando-se a
composição dos sistemas para PEG4000 pH 8,0, PEG1500 e PEG6000 pH
9,0, respectivamente, os valores de K foram reduzidos. Os resultados obtidos
sugerem que o aumento da massa molar do PEG não apresentou nenhuma
influência significativa nos valores dos coeficientes de partição (K), tanto das
xilanases como das proteínas totais.
51
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ClJ i:n 1- 52
5.2 - Estudos de Otimização do Coeficiente de Partição das Xilanases
utilizando um Planejamento Fatorial 25 completo com 4 pontos centrais.
Como os resultados dos coeficientes de partição das xilanases
apresentados anteriormente não foram promissores, resolveu-se então estudar
o comportamento das variáveis independentes pH (X1 ), massa molar (X2) e
concentração do PEG (X3), concentração do tampão fosfato (N) e
concentração de NaCI (Xs) e o efeito de suas interações através do processo
de extração líquido-líquido das xilanases em sistemas de duas fases aquosas,
empregando-se a metodologia do planejamento experimental, conforme
mostrado nas Tabelas 4.1 e 4.2.
A escolha dos níveis dos fatores massa molar e concentração do PEG,
concentração de fosfato de potássio (KH2POJK2HP04) e NaCI foi feita com
base nos dados de literatura sobre a extração líquido-líquido em sistema de
duas fases aquosas (HUSTEDT et ai., 1985a, KULA et ai., 1982,
HUDDLESTON et ai., 1991). Com relação a variável pH para a enzima
xilanase a escolha foi feita de acordo com os dados de literatura citados por
(MILAGRES, 1988, MILAGRES, 1994). Na Figura 5.8 podemos observar os
níveis dos fatores apresentados na Tabela 4.1 sobre as curvas binodiais para
termos uma melhor visualização da região onde os experimentos foram
realizados.
53
50
40
~ 30 a. ~ (!:' 20 w Q.
10
o
o 10 15 20 5
Fosfato de Potássio (% p/p)
- PEG 600 pH 6,5
- PEG 600 pH 8,0 - PEG 4000 pH 5,0 - PEG 4000 pH 6,5 _ PEG 4000 pH 8,0 _ PEG 6000 pH 5,0
PEG 6000 pH 6,5 _ PEG 6000 pH 8,0
25
Figura 5.8 - Curvas binodiais de sistemas com PEG 600, 4000, 6000 para os pH 5,0, 6,5 e 8,0 e os níveis dos fatores (•) representado na Tabela 4.1 (Apêndice 1 ).
Na Tabela 5.3 são apresentados os resultados referentes aos
coeficientes de partição da xilanase decorrentes do planejamento experimental
completo, juntamente com os valores codificados das variáveis pH (X1), massa
molar (X2) e concentração do PEG (X3), concentração do tampão fosfato (Xi) e
concentração de NaCI (Xs). Verifica-se que o coeficiente de partição (K) em
50% dos ensaios foi igual a zero, indicando com isto que não houve separação
de fases devido as baixas concentrações de PEG e fosfato de potássio
utilizadas para formar os sistemas de duas fases ou devido a saturação do
meio. O maior coeficiente de partição obtido foi 2,34, nesta condição verificou-
se que as variáveis pH e concentração de NaCI apresentam-se em seus níveis
mais altos, a massa molar e concentração de PEG e fosfato em seu nível mais
baixo. Utilizando os valores dos coeficientes de partição apresentados na
Tabela 5.3 foi possível fazer uma análise mais completa com relação às
possíveis variáveis que afetam o processo de extração da xilanase. Os efeitos
principais das variáveis juntamente com suas interações sobre o coeficiente de
partição são apresentados na (Tabela 5.4).
54
Tabela 5.3 - Matriz de planejamento e resultados (K) obtidos no estudo do processo de extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas das xilanases considerando um planejamento fatorial 25
com ponto central.
Número da Seqüência Fatores da
análise análise X1 X2 X3 X4 xs K 1 25 o 2 36 + o 3 20 + o 4 28 + + 0,60 5 22 + o 6 4 + + 1,72 7 34 + + o 8 23 + + + 0,81 9 8 o o o o o 1,69 10 14 + o 11 26 + + 2,03 12 6 + + 1,16 13 3 + + + 1,72 14 12 + + o 15 19 + + + 0,57 16 7 + + + o 17 35 + + + + o 18 16 o o o o o 1,33 19 9 + o 20 30 + + 2,34 21 17 + + 1,42 22 15 + + + 1,94 23 5 + + o 24 21 + + + o 25 29 + + + o 26 1 + + + + o 27 24 o o o o o 1,57 28 2 + + o 29 33 + + + 1,36 30 31 + + + 2,11 31 11 + + + + 1,33 32 18 + + + o 33 13 + + + + o 34 27 + + + + o 35 10 + + + + + o 36 32 o o o o o 1,40
Obs: O número zero significa que não há separação de fase. K=(k1+K2)/2, Onde.K, e K2 são os coeficientes de partição - Repetição 1 e 2. X1 = pH; X2 = Massa molar do PEG; ~ = Concentração de PEG; ~ = Concentração de fosfato de potássio; Xs = Concentração de NaCI.
55
O efeito individual dos fatores experimentais e de suas interações sobre
o coeficiente de partição, foi avaliado com base no Teste t de Student (BOX et
ai, 1976) e os resultados estão mostrados na Tabela 5.4.
Verifica-se que, para as condições estudadas, os efeitos do pH (X1) e %
de PEG (X:3) assim como, as interações entre % PEG (X:3) e % NaCI (Xs),
apresentaram influências significativas ao nível de 5% de probabilidade.
Quanto ao pH (X1), nota-se pela Tabela 5.4 que a estimativa do efeito
foi positiva, indicando que, quando o nível deste fator é elevado do nível
codificado -1 para +1 (Tabela 4.1 ), o valor de K foi aumentado. Nota-se ainda
que o efeito do pH independe dos outros fatores experimentais visto que, não
ocorreu nenhuma interação significativa entre eles. Por outro lado, o efeito
principal da % de PEG não pode ser interpretado separadamente, devido ao
fato de que, a interação entre % PEG e % NaCI mostrou-se significativa
estatisticamente (P< 0,05).
56
Tabela 5.4 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e Teste t de "Student", para os parâmetros de extração líquido-líquido das xilanases utilizando um planejamento 25 com ponto central.
Efeitos Estimativa Erros-padrão t
Média 0,713 ± O, 104
X1 0,608 ± 0,224 2,71*
X2 0,191 ± 0,224 0,86
XJ -0,806 ± 0,224 3,36*
N 0,090 ± 0,224 0,41
x, O, 118 ± 0,224 0,53
X1X2 -0,394 ± 0,224 1,76
X1 XJ -0,221 ± 0,224 0,98
X1N -0, 141 ± 0,224 0,63
X1 Xs -0, 187 ± 0,224 0,80
X2X3 -0,376 ± 0,224 1,68
X2N 0,103 ± 0,224 0,46 -.
X2Xs -0, 195 ± 0,224 0,87 ·-
XJN -0,335 ± 0,224 1,50
XJXs -0,505 ± 0,224 2,25*
NXs -0,203 ± 0,224 0,90
*Significativo ao nível de 5% de probabilidade (t=2,08) X1 = pH; X2 = Massa molar do PEG; ~ = Concentração de PEG; ~ = Concentração fosfato de potássio; X5 = Concentração de NaCI.
A Figura 5.9 mostra o comportamento das variáveis X1 (pH) e XJ (%
PEG) com relação ao nível dos coeficientes de partição K. Nota-se através das
curvas de níveis uma tendência de aumento no coeficiente de partição com
elevação do nível do fator X1 (pH) e diminuição do fator X3 (%PEG).
57
-1
0,6 1,0
Figura 5. 9 - Curvas de nível dos coeficientes de partição em relação às variáveis X1 (pH) e~ (%PEG).
A Figura 5.1 O permite uma melhor interpretação do efeito de interação
entre % PEG (~) e % NaCI (Xs). Como pode ser visto, o aumento da
concentração de NaCI de O para 10%, com o menor nível de PEG avaliado
(10%), proporcionou um aumento de 0,63 unidades no valor de K. Por outro
lado, esta mesma variação na % de NaCI causou uma redução de 0,38
unidades no valor de K, quando a concentração de PEG foi fixada no maior
nível ( 35%). Verificou-se, ainda, que o aumento na concentração de PEG de
10% para 35%, sem a adição de NaCI, promoveu uma diminuição de 0,30
unidades no valor de K. Essa mesma variação (10% para 35%) causou, no
maior nível de NaCI (10%), uma diminuição de 1,31 unidades no valor de K.
58
(10%) 1
_, ºº~ +
(35%)
Figura 5.1 O - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre PEG e% NaCI no planejamento 25.
Após a seleção das três variáveis significativas (pH, %NaCI, %PEG),
ensaios para a otimização do coeficiente de partição (K) da xílanase foram
realizados. Para isto uma nova faixa experimental foi proposta para este
estudo utilizando um planejamento fatorial 23 ortogonal (o= 1,41) e 4 replicatas
no ponto central (Tabela 5.5), de acordo com BOX et ai., (1976). Os novos
níveis das variáveis independentes (pH, % PEG, % NaCI) foram calculados
substituindo os valores codificados (Tabela 5.5) nas Equações 5.1, 5.2 e 5.3.
X1= (pH -7,4)/0,5
XJ = (% PEG-13,0)/5
Xs = (% NaCI -5,6)/0,3
(5.1)
(5.2)
(5.3)
Onde:
pH, % PEG e% NaCI são os valores codificados como X1, XJ e Xs.
59
Como as variáveis X2 e N não apresentaram significância estatística pela
análise realizada, foi adotado para a variável X2 (massa molar do PEG) o valor
4000 por ser o mais utilizado em diversas referências consultadas e também
devido a facilidade de manuseio do PEG com esta massa molar. Para a
variável N adotou-se o nível mínimo do planejamento original (Tabela 4.1) que
foi 10%, evitando assim que os sistemas pudessem ser saturados por altas
concentrações de fosfato de potássio.
Tabela 5.5 - Planejamento fatorial 23 com estrela (a.= 1,41) empregado para otimização do coeficiente de partição.
Número da Fatores K
Análise X1 ( pH) ~( % PEG) Xs ( % NaCI)
1 -1 -1 -1 2,10
2 +1 -1 -1 2,07
3 -1 +1 -1 1,75
4 +1 +1 -1 1,62
5 -1 -1 +1 2,32
6 +1 -1 +1 2,13
7 -1 -1 +1 2,14
8 +1 +1 +1 1,85
9 -1,41 +1 o 2,10
10 1,41 o o 2,27
11 o o o 2,26
12 o -1,41 o 1,72
13 o +1,41 -1,41 2,27
14 o o +1,41 2,30
15 o o o 2,27
16 o o o 2,08
17 o o o 2,07
18 o o o 2,11
Os coeficientes de regressão do modelo, valores de te coeficientes de
determinação (R2) estão apresentados na Tabela 5.6. Considerando-se um
nível de 5% de probabilidade o efeito principal da variável X1 (pH), assim como
60
o efeito interativo desta com as demais não demonstrou significância
estatística sobre o coeficiente de partição (K). Ainda considerando um nível de
5% de probabilidade verificou-se que a variável ~ apresentou o efeito
principal e quadrático significativos sobre o coeficiente de partição. Por outro
lado, considerando um nível de 10% de probabilidade verificou-se que a
variável Xs (%NaCI) apresentou uma influência significativa sobre o coeficiente
de partição. A partir desses resultados conduziu-se uma análise de variância
para os efeitos considerando-se os termos que realmente se mostraram
significativos (Tabela 5. 7).
Tabela 5.6 - Coeficientes de regressão, erros-padrão e valores de t para a resposta (coeficiente de partição) obtida nos ensaios realizados no planejamento completo
Efeitos Coeficientes de Erro-padrão Valor de t
regressão
Constante 2,175 ± 0,044 49,489 ..
X1 -0,066 ± 0.053 1,237 - - ~ -0,361 ± 0,053 6,704*
Xs 0,157 ± 0,053 2,918-
X1~ -0,050 ± 0,066 0,758
X1Xs -0,080 ± 0,066 1,214
x,x, 0,085 ± 0,066 1,289
X1X1 -0,075 ± 0,066 1,138
~ -0,220 ± 0,066 3,337*
XsXs 0,025 ± 0,066 0,379
Erro-padrão estimado do erro puro com 3 GL (t=3, 18) * Significativo ao nível de 5% ** Significativo ao nível de 1 O % X1=pH; ~ = Massa molar do PEG; Xs = Concentração de NaCI
O coeficiente de determinação R2 (O, 70) obtido na análise de variância
dos efeitos, assim como a não significância (p < 0,05) da falta de ajuste ao
61
modelo, permitiu a determinação de um modelo estatístico representado pela
Equação 5.4 (Tabela 5.7).
Tabela 5.7 - Análise de variância para o modelo que representa o coeficiente de partição das xilanases em sistemas de duas fases aquosas.
Fonte de Soma dos
Variação Quadrados
XJ 0,390
Xs 0,074
XJ2 0,096
Falta de ajuste 0,128
Erro Puro 0,113
Total (Corr.) 0,803
GL Quadrado Valor de F Valor de p Médio
1
1
1
5
0,390
0,074
0,096
0,025
0,0003
0,0382
0,0216
0,1656
31,6
5,88
7,70
2,04
9 0,012
17
A
R 2 = 0,7; (P< 0.05); Valor tabelado (F = 3,48)
Y =2,18-0,18XJ+0,08Xs-0,11XJ2 (5.4)
Através da Figura 5.11, podemos verificar o contorno tridimensional da
superfície de resposta referente ao modelo, representado pela Equação 5.4
mostrando os valores de K como uma função da variável Xs ( % NaCI) e
XJ (% PEG).
- 1.591 - 1.640 - 1.689 - 1.738 - 1.787 - 1.836 B] 1.885 an 1.933 mJ 1.982 lilllll 2.031 IBI 2.080 - 2.129 - 2.178 - 2.227 - 2.276 - 2.324
Figura 5.11 - Superfície de resposta para o coeficiente de partição K da xilanase em função das variáveis X 3 (% PEG) e Xs (%NaCI), mantendo-se PEG4000, pH=7,0 e 10% de fosfato de potássio.
62
Através da derivada parcial da Equação 5.4 o coeficiente de partição da
xilanase atingiu o valor máximo (K=2,33) para os valores codificados de - 0,83
(para PEG) e +1,41 (para o NaCI) correspondendo às concentrações de 8,83%
e 6,02 %, mantendo-se a massa molar PEG4000, pH=7,0 e 10% de fosfato de
potássio. Na Figura 5.12 podemos observar a condição otimizada do
planejamento experimental, representado sobre o diagrama de fase. Verificou-
se (Figura 5.12), que o ponto de ótimo para a extração da xilanase obtido
através do planejamento experimental encontra-se sobre a curva binodial
construída com água. Segundo as referências (ALBERTSSON, 1986,
HUDDLESTON et ai., 1994) estudadas os sistemas que se encontram sobre a
curva binodial são considerados instáveis podendo assim passar para região
bifásica ou monofásica do sistema. Mas conforme citado no item 5. 1.2 quando
utilizamos o meio fermentado no sistema de duas fases, ocorre o
deslocamento da curva para a esquerda em sentido as baixas concentrações
dos componentes que formam as fases, portanto este ponto de ótimo deixa de
ser instável.
\ ~
o 15 5 10
Fosfato de Potáss:io("l6, p/p) pH = 7.0
Figura 5.12 - Curva binodial (construída com água) para o sistema com PEG 4000, pH = 7,0 mostrando o ponto ótimo do planejamento experimental para a extração das xilanases.
63
A Tabela 5.8 mostra uma comparação entre os valores de K (Yo)
obtidos experimentalmente com os valores previstos pelo modelo (Yp). Comparando-se os valores residuais com a variância do erro S/ (=0,23) nota-
se que nenhum dos resíduos individuais excede a 2 vezes a raiz quadrada da
variância dos resíduos (SEN RAMKRISHNA, 1997). Isto confirma uma boa
adequação do modelo de regressão.
Tabela 5.8 - Valores de K observados experimentalmente e previstos pelo modelo
Número de Valor Obtidos Experimentalmente Valor Previsto Residual
observações (Yo) (Yp) (Yo-Yp) 1 2,10 2,15 -0,05
2 2,07 2,15 -0,08
3 1,75 1,79 -0,04
4 1,62 1,79 -0, 17
5 2,32 2,31 +0,01
6 2,13 2,31 -0,18
7 2,14 1,95 +0,19
8 1,85 1,95 - 0,10
9 2,10 2,16 -0,06
10 2,27 2,16 +0,11
11 2,36 2,19 +0,17
12 1,72 1,68 +0,04
13 2,27 2,05 +0,22
14 2,30 2,27 +0,03
15 2,27 2,16 +O, 11
16 2,08 2,16 -0,08
17 2,07 2,16 -0,09
18 2,11 2,16 -0,05
Após as condições ótimas terem sido identificadas pela derivada parcial
da equação do modelo (Equação 5.4), novos ensaios foram realizados 64
utilizando-se pH=7,0, PEG4000, 8,83% PEG, 10% fosfato de potássio, 6,02%
NaCI obtendo-se um valor de K=2,21 que está muito próximo do valor previsto
pelo modelo (K=2,33). A recuperação da xilanase na condição otimizada na
fase superior foi de 80% apresentando um aumento de pureza de 1,34 vezes.
65
5.3 - Estudos de Otimização do Coeficiente de Partição das proteínas totais
utilizando um Planejamento Fatorial 25 completo com 4 pontos centrais.
Após a otimização do planejamento experimental proposto para o
estudo da extração líquido-líquido das xilanases em sistemas de duas fases
aquosas, decidiu-se investigar o comportamento das proteínas totais presentes
no meio fermentado. O objetivo deste estudo foi avaliar a partição das
proteínas totais e compará-la com a partição das xilanases, pois se as
condições de extração forem diferentes há a possibilidade de realizar a
extração em duas etapas. Para este novo estudo, foram utilizadas as mesmas
condições propostas na Tabela 4.1 e que encontram-se representadas na
Figura 5.8. As dosagens de proteínas totais foram feitas utilizando-se a
microanálise de Bradford. Na Tabela 5.9 são apresentados os resultados
referentes aos coeficientes de partição das proteínas totais decorrentes da
execução do planejamento fatorial completo, juntamente com os valores
codificados das variáveis pH, (X1), massa molar (X2) e concentração do PEG
(X3), concentração do tampão fosfato (N) e concentração de NaCI (Xs), a
ordem de realização dos experimentos foi feita por sorteio para se evitar
distorções na análise dos resultados obtidos experimentalmente. Verifica-se
ainda, (Tabela 5.9) que os valores dos coeficientes de partição (K) variaram na
faixa de O, 1, 2, 7 e 9. Os resultados iguais a zero, obtidos para os coeficientes
de partição (K) em determinados sistemas, indicam que não houve separação
de fases, provavelmente devido as baixas concentrações utilizadas ou pela
saturação dos mesmos.
66
Tabela 5.9 - Matriz de planejamento e resultados obtidos no estudo do processo de extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas das proteínas totais considerando um planejamento fatorial 25 com ponto central.
Número da Seqüência Fatores análise da análise X1 X2 X3 x, Xs KProteínas
1 25 o 2 36 + o 3 20 + o 4 28 + + 1,08 5 22 + o 6 4 + + 0,23 7 34 + + o 8 23 + + + 0,39 9 8 o o o o o 0,4 10 14 + o 11 26 + + 0,56 12 6 + + 1,05 13 3 + + + 0,68 14 12 + + o 15 19 + + + 0,18 16 7 + + + o 17 35 + + + + o 18 16 o o o o o 0,38 19 9 + o 20 30 + + 0,35 21 17 + + 7,9 22 15 + + + 1,89 23 5 + + o 24 21 + + + o 25 29 + + + o 26 1 + + + + o 27 24 o o o o o 0,44 28 2 + + o 29 33 + + + 0,42 30 31 + + + 9,47 31 11 + + + + 2,16 32 18 + + + o 33 13 + + + + 0,11 34 27 + + + + o 35 10 + + + + + o 36 32 o o o o o 0,43
Obs: O número zero significa que não há separação de fase. K=(k1+K2)/2 , K1 e K2 são os coeficientes de partição das proteínas totais - Repetição 1 e 2. X1 = pH; X2 = Massa molar do PEG; X3 = % PEG; ~ = % Fosfato de Potássio; Xs= % NaCI
67
O efeito individual dos fatores experimentais e de suas interações sobre
o coeficiente de partição, foram avaliados com base no teste t de "Student"
(BOX et ai., 1976) e os resultados estão mostrados na Tabela 5.10.
Verifica-se para as condições experimentais avaliadas (Tabela 5.1 O),
que as variáveis X2, ~ e Xs apresentaram efeito principal significativo ao nível
de 5% de probabilidade. Podemos observar que as variáveis X2 e Xs apresentaram sinal positivo como efeito principal e a variável X, sinal negativo.
Nota-se que os efeitos das interações entre X2X3 e X~s foram de sinal
negativo. Isto sugere que o valor de K pode ser aumentado com o aumento do
nível da variável X2 e decréscimo do nível da variável X3. O mesmo efeito não
foi verificado para a interação ~- Verifica-se ainda que o valor do
coeficiente de partição pode ser aumentado com diminuição do nível da
variável X, e aumento do nível da variável Xs. Por outro lado a interação entre
X2Xs foi de sinal positivo, sugerindo que o aumento de qualquer uma destas
variáveis pode aumentar o valor de K.
Nesta análise preliminar, podemos ainda observar que a variável pH
(X1) que anteriormente para as xilanases foi significativa, para o processo de
extração das proteínas totais não apresentou nenhum efeito. Por outro lado a
massa molar do PEG (X2) passou a apresentar efeito significativo no processo
de extração das proteínas totais. De acordo com os dados de literatura
(ASENJO, 1990; HUDDLESTON et ai., 1994) a massa molar do PEG pode
influenciar o sistema de separação de diferentes moléculas, devido às
variedades de massas molares existentes e aos sistemas que podem ser
formados.
Quanto às variáveis ~ e X5 o mesmo efeito de aumento de ~ e
diminuição de X5 pode ser observado nos dois estudos propostos. De acordo
com a literatura (CASCONE et ai., 1991; SCHMIDT et ai., 1994) , variando-se a
concentração de PEG podemos aumentar ou diminuir os valores do coeficiente
de partição. Foi constatado também, através da literatura (ASENJO, 1990;
LAHORE et ai., 1996) que as variações nas concentrações dos sais que
compõem o meio podem alterar os coeficientes de partição, de acordo com as
68
cargas apresentadas pelas moléculas de interesse, por isso torna-se
importante a sua investigação.
Tabela 5.1 O - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student, para os parâmetro de extração líquido-líquido das proteínas totais utilizando um planejamento 25 com ponto central.
Efeitos Estimativa Erros-padrão t
Média 0,761 ± 0,227
X1 -0,648 ± 0,482 1,34
X2 1,388 ± 0,480 2,89*
X3 -1,540 ± 0,482 3,19*
Xi 0,174 ± 0,482 0,36
Xs 1, 133 ± 0,482 2,35*
X1X2 -0,879 ± 0,482 1,82
X1X3 0,761 ± 0,482 1,58
X1Xi -0, 153 ± 0,482 0,32
X1Xs -0,906 ± 0,482 1,88
X2X3 -1,439 ± 0,482 2,98*
X2Xi 0,088 ± 0,482 0,18
X2Xs 1,144 ± 0,482 2,37*
X3Xi -0,215 ± 0,482 0,45
X3Xs -1,219 ± 0,482 2,53*
x,x, 0,078 ± 0,482 0,16
*Significativo ao nível de 5% de probabilidade (t=2,08) X1 = pH; X2 = Massa molar do PEG; X3 = % de PEG; Xi = % Fosfato de Potássio; X s = % NaCI.
Na Tabela 5.11 estão representados os valores estimados para as
variáveis significativas (X2 massa molar do PEG, X3 concentração de PEG e Xs
concentração de NaCI), para este estudo foram eliminados os efeitos das
variáveis X1 e Xi. Pelo resultado do teste t de "Student" pode-se observar que
estas variáveis apresentam valores superiores ao tabelado (2,045). Tendo em
vista a significância destas variáveis procedeu-se uma análise de variância
69
para verificar se os dados experimentais ajustam-se a um modelo linear
(Tabela 5.12).
Tabela 5.11 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student, para os parâmetros da extração das proteínas totais
Variáveis Estimativas Erros-padrão
Média 0,761 ± 0,237
X2 1,388 ± 0,501
X3 -1,540 ± 0,503
Xs 1, 133 ± 0,503
X2X3 -1,439 ± 0,503
X2Xs 1, 144 ± 0,503
XJXs -1,219 ± 0,503
t
2,770*
3,061*
2,252*
2,861*
2,274*
2,423*
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade (t = 2,045) X2 = Massa molar do PEG; ~ = o/o PEG; Xs = o/o NaCI
Verifica-se na Tabela 5.12 que, devido ao baixo coeficiente de
determinação apresentado R2=0,587 e também à falta de ajuste, que foi
considerada significativa (P< 0,05), o modelo linear não pode ser aplicado
para estes dados experimentais. Desta forma uma nova região de trabalho foi
investigada. Inicialmente foi proposto um passo ascendente, que tem por
objetivo a alteração da região de trabalho, buscando obter maiores valores
para a variável resposta coeficiente de partição (K). De acordo com a
estimativa dos efeitos, mostrado na Tabela 5.10, as variáveis X, e Xs (de sinal
negativo e positivo, respectivamente) sugeriram que o deslocamento da região
experimental fosse feito com a diminuição do nível da variável ~ e aumento do
nível de Xs. A variável X2 (massa molar do PEG) não foi codificada devido ao
fato de que os valores de massas molares de PEG disponíveis
comercialmente não se ajustam aos valores calculados pelas equações
matemáticas. Considerando que o planejamento experimental sugere um
aumento da massa molar do PEG e o maior valor disponível no laboratório foi
o PEG 10000, decidiu-se manter os ensaios variando apenas X3 e Xs e
fixando a massa molar de PEG 10000. Uma outra vantagem levada em
70
consideração para escolha do PEG 10000 foi devido a sua facilidade de
manuseio, por apresentar-se na forma de pó bem fino, torna-se fácil a
pesagem em tubos de centrifuga.
Tabela 5.12 - Análise de variância para as variáveis significativas (X2, XJ e Xs) que representam a extração líquido-líquido das proteínas totais em sistema de duas fases aquosas.
Variáveis Soma dos GL Quadrado Valor de F Valor de p
Quadrados Médio
X2 15,544 1 15,544 8,94 0,0059
X3 18,988 1 18,988 10,92 0,0027
Xs 10,271 1 10,271 5,91 0,0220
X2X3 16,574 1 16,574 9,53 0,0046
X2Xs 10,476 1 10,476 6,03 0,0208
x,x, 11,895 1 11,895 6,84 0,0144
Falta de ajuste 11,952 2 5,976 3,44 0,0468
Erro puro 46,936 27 1,738 .. - -
Total (Corr.) 142,639 35
R2 = O 587 * (P< 0,05) ' X2 = Massa molar do PEG; ~ = % PEG; Xs = % NaCI
Para o início do deslocamento da região experimental utilizamos como
ponto de partida o ponto central conforme mostrado na Tabela 5.13.
Observando-se as duas colunas dos níveis de deslocamento da Tabela 5.13,
verificou-se que para cada 0,22 unidades recuada no valor da variável X3
(%PEG) devemos aumentar O, 17 unidades no valor da variável Xs (%NaCI).
Substituindo-se os valores dos níveis de deslocamento (Tabela 5.13) nas
Equações 5.5 e 5.6 obteve-se os valores codificados das variáveis X3 e Xs. O
deslocamento do passo ascendente utilizando as variáveis codificadas pode
ser visto pela trajetória apresentada na Figura 5.13.
X3 = (% PEG - 22,5) / 12,5
Xs = (% NaCI - 5) I 5
(5.5)
(5.6)
71
Tabela 5.13 - Valores dos níveis de deslocamento, variáveis codificadas e os resultados dos coeficientes de partição (K) das proteínas totais obtidos após a alteração da região de trabalho.
Ensaios Níveis do deslocamento Variáveis codificadas
x, (%PEG) Xs (%NaCI) Xs (%PEG) x, (%NaCI)
1 o o 22,50 5,00
2 -1, 11 0,81 8,62 9,05
3 -1,33 0,98 5,87 9,90
4 -1,55 1,14 3,12 10,7
5 -1,77 1,30 0,37 11,5
XJ = % PEG; Xs = % NaCI
!<proteínas
0,76
2,31
3,24
4,93
o
Pode-se observar pela Figura 5.13 que os valores de K para as
proteínas totais aumentaram quando a % PEG diminuiu de 22,5% para 3, 12%
e quando a % NaCI aumentou de 5% para 1 O, 7%. O aumento no valor de K
pode ser constatado até o 4° ensaio a partir do qual ocorre um decréscimo no
valor de K de 4,93 para O. Quando se atingiu este valor máximo para o
coeficiente de partição (ensaio 4 da Tabela 5.13) deve-se parar e investigar a
região em torno deste ensaio. Para isto foi proposto um planejamento centrado
em torno do ponto correspondente ao 4° ensaio.
12 o 4,93
3,24 =- 10 u ~ z ;;/!! 8 - "" X
e 0,76 •
4 o 5 10 15 20 :25
X3 (% PEG)
Figura 5.13 -Trajetória de deslocamento do passo ascendente proposto na Tabela 5.13
72
A nova matriz do planejamento face centrada proposta para dar
continuidade a investigação das variáveis significativas (X3 concentração de
PEG e Xs concentração de NaCI), para o processo de extração líquido-líquido
da proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas encontra-se
representada na Tabela 5.14. Substituindo-se os sinais negativos e positivos
nas Equações 5.7 e 5.8 foi possível codificar os valores das variáveis X, e Xs
apresentados na Tabela 5.14. Os resultados obtidos dos coeficientes de
partição das proteínas totais (K) com a realização dos ensaios propostos
(Tabela 5.14), variaram na faixa de O a 7.
X3 = (% PEG - 3, 12) / 2,75
Xs = (% NaCI - 1 O, 7) / 1, 7
(5.7)
(5.8)
Tabela 5.14 - Valores das variáveis ~ e Xs codificados pelas Equações 5. 7 e 5.8 e os coeficientes de partição obtidos.
Ensaios %PEG %NaCI % PEG (X3) % NaCI (Xs) K proteína
1 0,37 9,0 o 2 + 8,62 9,0 2,19
3 + 0,37 12,4 o 4 + + 8,62 12,4 3,63
5 o 0,37 10,7 o 6 + o 8,62 10,7 3,19
7 o 3,12 9,0 3,45
8 o + 3,12 12,4 6,79
9 o o 3,12 10,7 4,5
10 o o 3,12 10,7 4,87
11 o o 3,12 10,7 5,09
OBS: Os ensaios 1,3,5 não apresentaram separação de fases K = Coeficiente de partição das proteínas totais X3 = % PEG; Xs = % NaCI
73
A partir dos resultados apresentados na Tabela 5.14 foi feito uma
análise de variância (Tabela 5.15) para as variáveis significativas (~ e Xs). Verificou-se através desta análise que as variáveis ~ e Xs e o efeito
quadrático da variável ~ apresentaram influência significativa (p<0,05). Foi
ainda possível constatar para a falta de ajuste do modelo p>0,05, isto indica
que o modelo quadrático apresenta um bom ajuste para a extração líquido-
líquido de proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas.
Tabela 5.15 - Análise de variância para as variáveis significativas (X3 e Xs) que representam a extração líquido-líquido das proteínas totais.
Variáveis Soma dos GL Quadrado Valor de F Valor de p Quadrados Médio
~ 13,530 1 13,530 152, 19 0,0065
Xs 3,808 1 3,808 42,84 0,0226
x,x, 0,518 1 0,518 5,83 O, 1371
x,x, 30,268 1 30,268 340,47 0,0029
XsXs 0,011 1 0,011 0,13 0,7534
Falta de ajuste 2,436 3 0,812 9,14 O, 1003
Erro puro 0,177 2 0,088
Total (Corr.) 52,725 10
R2 = O 95 * (p<0,05) 1
X3 = % PEG, X5 = % NaCI
Na Tabela 5.16 são mostrados os coeficientes de regressão, erros-
padrão, teste t de "Student" e os níveis de significância dos fatores para o
modelo que representa o processo de extração.
Verifica-se que as variáveis ~ e Xs apresentaram efeito principal
significativo, e ainda pode ser constatado o efeito quadrático de ~ (p<O, 05).
74
Tabela 5.16 - Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t "Student" e nível de significância para o modelo que representa o processo de extração Líquido-Líquido das proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas
Variáveis Coeficiente Erros-padrão t p
Média 4,94 ± 0,299 16,48 0,0000
X3 1,501 ±0,273 5,48 0,0009
Xs 0,796 ±0,273 2,91 0,0226
X} -3,438 ±0,405 -8,47 0,0001
R = 0,91 * (p<0,05) Xs= % PEG, Xs= % NaCI
Com base na análise de variância de regressão para o modelo (Tabela
5.17) observa-se que o modelo é significativo ao nível de 5% de probabilidade
proporcionando um coeficiente de determinação R2=0, 91. A porcentagem de
variação explicada pela regressão, isto é, a razão entre a soma quadrática
devido a regressão e a soma quadrática total é 94%. Este valor não pode ser
comparado com 100% por causa da contribuição da falta de ajuste devido ao
erro puro. A parcela explicável para o modelo é a diferença entre a soma
quadrática total e a soma quadrática exponencial ( erro puro). Neste caso o
nosso modelo poderia ser explicável em 99,66%.
Tabela 5.17 - Análise de variância da regressão para o modelo que representa o processo de extração líquido-líquido das proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas
CV GL SQ MO F p
Modelo
Falta de ajuste
Erro puro
3
5
2
49,580
2,968
0,177
16,526
0,593
0,088
36,789
6,67
0,0001
Total 10 52,724
R2= O 91 ' Cv = Causa de variação; GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática MQ = média quadrática % de variação explicada 94% o/o de variação explicável 99,66%
75
O modelo matemático para representar o processo de extração líquido-
líquido de proteínas totais em sistemas de duas fases aquosas, considerando
as variáveis significativas, pode ser expresso pela Equação 5.9.
A
Y = 4,94 + 1,5 ~ + 0,79 Xs - 3,44 ~2 (5.9)
A Figura 5.14 mostra o contorno tridimensional da superfície de
resposta referente ao modelo, que pode ser representado pela Equação 5.9
mostrando os valores de K como uma função da variável ~ ( concentração de
PEG) e Xs (concentração de NaCI). Através da derivada parcial da Equação
5.9 o coeficiente de partição das proteínas totais atingiu o valor máximo
(K=5,89), para o sistema PEG1000, 3,67% PEG, 10% fosfato de potássio e
12,4% NaCI.
- -0.397 - -0.004 - 0.389 - 0.782 - 1.175 - 1.568 l!lli!I 1.961 ~ 2.354 fRI 2.746 flll 3.139 11111 3.532 - 3.925 - 4.318 - 4.711 - 5.104 - 5.497
Figura 5.14 - Superfície de resposta para o coeficiente de partição (K) das proteínas totais em função das variáveis X 3 (% PEG) e Xs (%NaCI)
Novos experimentos foram feitos na condição otimizada do
planejamento em estudo. O valor do coeficiente de partição (K) das proteínas
76
totais previsto pelo modelo foi 5,89 e o valor obtido experimentalmente foi 5,25
sendo considerado bom, levando-se em consideração o desvio padrão.
Verifica-se através da Figura 5.15, que o ponto de ótimo para a extração das
proteínas totais obtido através do planejamento experimental encontra-se na
região monofásica da curva binodial (construída com água). Teoricamente
neste ponto não podemos ter separação de fases. Este mesmo fato pôde ser
observado no item 5.1.2. Podemos concluir que a presença do meio
fermentado no sistema faz com que a curva binodial desloque em sentido às
baixas concentrações dos componentes que formam o sistema de duas fases
aquosas.
30
\ ......--. ~ Q.
* C)
~ 20 C) C) C)
~
Cio
(!), tu o...
10
o 5 10 15 20
Fosfato de p ot.áss io (% p/p)
Figura 5.15 - Curva binodial (construída com água) para o sistema com PEG 10000, pH = 7, O mostrando o ponto ótimo do planejamento experimental para a extração das proteínas totais
77
5.4 - Análise Eletroforética em Gel Poliacrilamida das Fases Obtidas pela Extração Líquido-Líquido em Sistema de Duas Fases Aquosas
Segundo os estudos feitos por SUNNA e ANTRANIKIAN (1997), o
complexo enzimático produzido por diversos microrganismos pode apresentar
enzimas com várias massas molares. Dentre elas têm-se as endoxilanases
variando de 10 a 120 kDa, as p-xilosidases de 60 a 360 kDa, as a-L-
arabinofuranosidases de 38 a 495 kDa, as a-glucuronidases com massas
molares acima de 100 kDa, a acetil(xilana)esterase com massa molar em
torno de 30 kDa , a cumárico esterase de 20 e 70 kDa e a ferúlico esterase
com pequenas massas em torno de 1 O kDa.
A Figura 5.16 mostra o perfil eletroforético das bandas de proteínas do
caldo inicial obtido do cultivo de P. janthinellum em hidrolisado hemicelulósico
de bagaço de cana-de-açúcar (linha 3) e também das fases superior (linha 4) e
inferior (linha 5) após a extração feita na condição otimizada do planejamento
experimental das xilanases (pH=7,0, PEG4000, 8,83% de PEG, 10% de fosfato
de potássio e 6,02% de NaCI). O caldo inicial continha 42, 12 U/ml de xilanase
e 269,86 mg/ml de proteínas totais e após concentração por liofilização foi
obtido 63,67 U/ml para as xilanases e 407,55 mg/ml para as proteínas totais.
Na fração do caldo inicial aplicada na cavidade da linha 3 do gel verifica-se a
presença de 9 bandas de proteínas com massas molares na faixa de 1 O, 20,
30, 45, 60, 80 e 100 kDa. Observa-se após a extração líquido-líquido em
sistemas duas fases aquosas que as enzimas particionaram-se entre as fases,
ficando as de menores massas molares na fase superior e as de maiores
massas molares na fase inferior. Na linha 4 (fase superior obtida no ponto
ótimo de extração da xilanase) foi observada a presença de 3 bandas com
massas molares aproximadas de 14, 20 e 24 kDa. Comparando-se a linha 3
(meio inicial) com a linha 4 verificou-se que o meio inicial apresentou várias
bandas e após a etapa de extração apenas 3 delas estavam presentes. Pelos
resultados obtidos por RODRIGUES (1997) utilizando a técnica de extração
líquido-líquido por micela reversa e CORTEZ (1998), precipitação com etanol,
pode-se sugerir que as bandas de 20 e 24 kDa correspondem às
78
endoxilanases. Para esta otimização foi obtida uma recuperação de 80% e um
fator de enriquecimento de 1,34 vezes destas enzimas xilanolíticas na fase
superior do sistema. Com relação à banda de 14 kDa, verifica-se que este
valor está muito próximo dos resultados obtidos por FILHO et ai. (1993), que
purificou uma endoxilanase de 16 kDa produzida por Myrothecíum verrucaría e
dos resultados obtidos por DONNELLY e CRAWFORD, (1998) onde estes
autores obtiveram uma p-cumarílico esterease de 11 kDa. Portanto não
podemos afirmar com certeza se a banda de 14 kDa corresponde a uma
dessas enzimas citadas na literatura. A possibilidade da presença destas
enzimas poderia ser confirmada através da dosagem das atividades
enzimáticas específicas. Neste estudo foi feito uma tentativa de dosagem de
atividade enzimática da f3-xilosidase, porém devido a dificuldade de remoção
do PEG, quando foi feita a adição de carbonato de sódio para interromper a
reação, ocorreu a precipitação deste polímero dificultando desta forma as
leituras de absorbância.
Na linha 5 foi feita uma corrida eletroforética para a fase inferior do
sistema de extração. Verificou-se a presença de 3 bandas com massas
molares de aproximadamente 60, 80 e 100 kDa. Com relação à banda de 60
kDa provavelmente seja uma endoxilanse. Estudos de precipitação com etanol
feitos por CORTEZ (1998) mostraram bandas de 104/11 O kDa e MILAGRES
(1994) utilizando uma coluna Sephacryl 300 S e ultrafiltração obteve uma
banda de 74,5 kDa. Estes autores concluíram que estas bandas correspondem
à enzima f3-xilosidase, que está presente no complexo xilanolítico produzido
pelo P. janthínellum. Foi possível também através da literatura (SUNNA e
ANTRANIKIAN, 1997) verificar a presença de endoxilanases produzidas por
Fusaríum oxysporum com massa molar de 80 kDa.
Através da comparação da linha 3 com as linhas 4 e 5 verificou-se que
três enzimas de massas molares 1 O, 30 e 50 kDa que estavam presentes no
caldo inicial não apareceram nas linhas 4 e 5. É difícil de se explicar a
ausência destas bandas, no entanto a primeira hipótese que pode ser levada
em consideração, é a possibilidade destas enzimas terem aderido à interface
do sistema, impossibilitando assim a sua detecção. Uma segunda hipótese que
79
pode ser levada em consideração está relacionada com a redução da
concentração das proteínas após a partição, dificultando assim a detecção das
bandas.
A análise eletroforética da condição otimizada do estudo das proteínas
totais (pH=7,0, PEG10000, 3,67% de PEG, 10% de fosfato de potássio e
12,4% de NaCI) encontra-se representada na Figura 5.17. Verifica-se através
da linha 3 (fração do caldo inicial) uma reprodutibilidade das bandas
apresentadas na Figura 5.16. Na linha 4 está representada a amostra da fase
superior obtida após a extração feita no ponto ótimo do planejamento das
proteínas totais. Pode-se observar a presença de várias bandas na faixa de
1 O, 20, 24, 30 e 100 kDa. Conforme citado anteriormente, as bandas de 20 e
24 kDa correspondem possivelmente às endoxilanases purificadas por
RODRIGUES (1997). Na linha 5 encontra-se representada a amostra da fase
inferior após a extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas.
Verifica-se a presença de bandas na faixa de 30, 40, 60, 80 e 100 kDa. Com
relação às bandas de 30, 40 e 60 kDa provavelmente correspondam às
endoxilanases, devido à quantidade expressiva destas enzimas encontradas
na literatura apresentando estas massas molares (SUNNA e ANTRANIKIAN,
1997). As bandas de 80 e 100 kDa possivelmente são 13-xilosidases, pois
correspondem às mesmas bandas obtidas nas linha 5 da Figura 5.16.
Pode-se ainda verificar através das Figuras 5.16 e 5.17, que a análise
eletroforética para a condição otimizada de extração das proteínas totais foi
menos seletiva quando comparada com a análise eletroforética no ponto ótimo
das xilanases. No ponto ótimo das xilanases foi possível separar três enzimas
com massas molares menores na fase superior do sistema e três com massas
molares maiores na fase inferior, enquanto no ponto ótimo das proteínas
obteve-se apenas uma separação parcial das enzimas entre as fases superior
e inferior do sistema de duas fases aquosas.
80
1 2 3 ' 5 116 kDa 97 kDa
66kDa
45kDa
36kDa
29kDa 24kDa
20kDa
1'kDa
Figura 5.16 - Eletroforese (SDS-PAGE) para a condição otimizada de extração líquido-líquido das xilanases em sistemas de duas fases aquosas. Linha 1 - marcadores de massas molares (116 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa); linha 2 - marcadores de baixas massas molares (66 KDa, 45 kDa, 36 kDa, 24 kDa e 20, 1 kDa, 14 kDa); linha 3 - Caldo inicial; linha 4 - fases superior do sistema; linha 5 - fases inferior do sistema.
116k0a _!_ 2 3 4 5 97k0a - 66k0a - 45kDa - 36kDa 29kDa - 24kDa
20kDa
14kDa
Figura 5.17 - Eletroforese (SDS-PAGE) para a condição otimizada de extração líquido-líquido das proteínas em sistemas de duas fases aquosas. Linha 1 - marcadores de massas molares (116 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa); linha 2 - marcadores de baixas massas molares (66 KDa, 45 kDa, 36 kDa, 24 kDa e 20, 1 kDa, 14 kDa); linha 3 - Caldo inicial; linha 4 - fases superior do sistema; linha 5 - fases inferior do sistema.
81
6 - Conclusões
Baseado nos resultados obtidos, conclui-se que:
• As curvas binodiais dos diagramas de fases construídas com meio fermentado se deslocaram para a esquerda, permitindo com isso a separação de fases em concentrações de PEG e tampão fosfato de potássio menores que os sistemas compostos por água .
• O método de titulação empregado para a determinação das curvas binodiais demonstrou ser eficiente, pois essas curvas foram muito semelhantes às encontradas na literatura, que foram obtidas por determinação das composições das fases superiores e inferiores dos sistemas por HPLC.
• Nos ensaios realizados com PEG de massas rnolares s 600 o máximo valor do coeficiente de partição (K) obtido foi 1,43, para o sistema composto de PEG600, 10% PEG, 20% de fosfato de potássio e o valor de pH 7,0.
• Nos ensaios realizados para PEG com massas molares > 600, o máximo valor do coeficiente de partição (K) obtido foi 1,02 para o sistema composto de PEG1500, 10% PEG, 12,5% de fosfato de potássio e o valor de pH 8,0.
• As variáveis que mais influenciaram na extração da xilanase foram: concentração de PEG e concentração de NaCI, que podem ser representadas por equação matemática e por superfície de resposta.
• A extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas pode ser aplicada para a pré-purificação de enzimas do complexo xilanolítico de Penicillium janthinellum, pois 80% da xilanase foi recuperada na fase superior do sistema com um aumento de pureza de 1,34.
82
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICE 1
8 - APÊNDICE 1
Tabela 1 - Referente a Figura 5.1. Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de pH.
PEG 600 Fosfato de Potássio(% p/p) pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 8,0 pH = 9,0
1 46,0 2 42,0 43,0 40,0 3 43,0 38,0 39,0 38,0 4 39,0 35,0 36,0 36,0 5 35,0 32,0 33,0 33,0 6 31,0 29,0 31,0 30,0 7 28,0 26,0 28,0 27,5 8 25,0 24,0 25,0 25,0 9 23,0 22,0 22,0 22,0 10 21,0 19,9 20,0 20,0 11 19,0 17,0 18,0 18,0 12 17,0 16,0 16,0 16,0 13 15,0 14,0 14,0 14,0 14 14,0 12,2 12,0 12,0 15 13,0 11,0 11,0 10,6 16 11,9 10,0 9,8 9,0 17 10,9 9,0 8,0 7,3 18 9,0 8,0 7,0 6,0 19 8,0 7,0 5,5 4,3 20 6,3 6,5 4,0 3,0 21 5,5 6,0 3,8 22 4,2 5,0 3,0 23 3,9 2,0 24 3,0 1,5 25 2,0 1,0
Tabela 2 - Referente a Figura 5.2. Curvas binodiais de sistemas com PEG 1500 em diversos valores de pH.
PEG 1500 Fosfato de Potássio
(% p/p) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
pH = 6,0
26,0 23,0 20,3 18,0 15,5 13,3 10,0 9,0 8,0 6,0 5,0 4,0 3,5 3,0
pH = 6,5
31,0 27,2 24,5 22,0 19,5 17,0 15,0 13,0 11,0 9,0 8,0 6,2 5,5 5,0 4,2 4,0
pH = 7,0
42,0 39,0 36,0 32,3 29,0 26,0 23,0 20,0 17,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 5,0 3,0
pH = 8,0
29,0 25,0 22,0 19,0 17,0 15,0 13,0 11,0 9,0 8,0 4,0
pH = 9,0
39,0 35,0 31,0 28,0 24,3 22,0 19,0 16,0 14,0 11,0 9,0 7,0 5,0 3,0
Tabela 3 - Referente a Figura 5.3. Curvas binodiais de sistemas com PEG 4000 em diversos valores de pH.
PEG 4000 Fosfato de Potássio
(% p/p) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
pH = 5,0 pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 8,0
47,0 43,0 43,0 19,9 39,3 38,0 39,0 17,0 29,0 32,2 35,2 14,9 24,0 28,0 32,0 12,0 20,0 23,4 28,0 10,2 17,0 19,8 25,0 8,2 14,0 19,8 22,0 6,9 11,0 16,0 19,0 5,4 8,0 12,2 16,0 4,2 6,0 9,2 13,9 3,5 5,0 7,0 11,0 3,0 3,5 5,0 9,0 2,8 2,8 3,0 8,0 2,7 2,0 6,0 2,5 1,1 5,0 2,5 1,0 4,0 3,0 2,2 2,0
Tabela 4 - Referente a Figura 5.4. Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de pH.
PEG 6000 Fosfato de Potássio
(% p/p) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
pH = 5,0 pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 8,0
44,0 41,5 37,0 33,4 29,0 26,0 22,0 19,0 16,0 13,0 11,0 9,0 7,0 6,9 4,0 3,0 2,0
25,0 22,0 17,5 14,0 10,9 8,0 6,0 5,0 4,0 3,8 3,8 3,8
36,0 31,0 27,0 22,5 19,0 15,0 12,0 9,0 6,2 4,4 2,8 1,8
36,0 31,0 26,0 21,0 17,0 13,5 10,0 7,0 4,8 2,2 1,0 0,5
pH = 9,0
42,0 37,8 31,0 26,0 21,0 16,0 12,0 9,0 6,2 4,0 3,0
Tabela 5 - Referente a Figura 5.5. Curvas binodiais de sistemas com PEGs 600, 1500, 4000, 6000 pH= 8,0.
Fosfato de Potássio PEG 600 PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000 % /
1 46,0 43,0 2 43,0 38,0 36,0 3 39,0 32,2 31,0 4 36,0 29,0 28,0 26,0 5 33,0 25,0 23,4 21,0 6 31,0 22,0 19,8 17,0 7 28,0 19,0 16,0 13,5 8 25,0 17,0 12,2 10,0 9 22,0 15,0 9,2 7,0 10 20,0 13,0 7,0 4,8 11 18,0 11,0 5,0 2,2 12 16,0 9,0 3,0 1,0 13 14,0 8,0 2,0 0,5 14 12,0 4,0 1,1 15 11,0 1,0 16 9,8 17 8,0 18 7,0 19 5,5 20 4,0 21 3,8 22 3,0 23 2,0 24 1,5 25 1,0
Tabela 6 - Referente a Figura 5.6. Comparação entre a curva binodial obtida experimentalmente e encontrada na literatura (Albertsson 1971)
Fosfato de Potássio (% p/p) ALBERTSSON 1971 PEG 6000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
44,0 41,5 37,0 33,4 29,0 26,0 22,0 19,0 16,0 13,0 11,0 9,0 7,0
4,0 3,0 2,0
38,0 33,0 28,0 24,0 20,0 18,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0
3,0 2,0 1,0 0,9 0,7
Tabela 7 - Referente a Figura 5,7 (a, b, e). Curvas binodiais para água (A) e para meio fermentado (B) utilizando PEG 600 (a), PEG 4000, PEG 6000 (C), em tampão fosfato de potássio pH= 8,0.
a) PEG 600 Curva Binodial para água (A) Curva Binodial para meio (8)
PEG (% p/p) Fosfato de potássio (% p/p) 30,72 4,19 29,23 5,92 26,59 5,38 23,21 9,78 20,13 8,48 18,64 10,83 17,51 10, 17 16,07 12,62 15,31 12,02 14,59 13,33 13,08 11,95 12,58 13,02 11,58 12,88 10,69 13,24 9,69 14,35 8,41 15,78 7,56 16,17 6,67 17,20 5,63 17,86 4,51 19,86 3,58 20,41
PEG (% p/p) 33,75 30,66 24,85 23,08 20,76 19,72 18,21 16,96 15,76 14,81 13,76 13,36 12,61 11,97 11,39 10,88 10,04 9,29 8,91 8,60 8,26 7,22 6,72 5,94
Fosfato de potássio(% p/p) 3,13 6,50 5,24 7,53 6,78 8,45 7,81 10,02 9,32 11, 16 10,37 11,23 10,59 12,06 11,47 12,73 13,27 13,43 11,50 12,48 11,98 13,39 12,47 13,84
b) PEG 4000 Curva Binodial para água (a) Curva Binodial para meio (B)
PEG (% p/p) Fosfato de potássio (% p/p)
3,80 4,18 5, 19 4,80 5,35 6,28 6,97 6,55 6,85 7,24 7,64 8, 13 8,32 9,24 9,56 10,28 10,30 10,58 10,92
25,63 22,08 21,46 19,84 18,05 17,56 16,49 15,51 14,33 13,32 12,29 11, 14 10,36 9,69 8,72 7,53 6,56 5,69 4,84
e) PEG 6000
PEG (% p/p) Fosfato de potássio (% p/p)
2,31 3,65 4,48 5,69 6,54 7, 18 7,47 7,79 10,51 11,34 11,08 11,21 11,27 11,72 11,08 11,52
26,45 20,62 16,75 13,32 11,52 10,26 9, 11 8,19 7,25 6,27 5,71 4,96 4,45 4,38 4,14 4,07
Curva Binodial para água (A) Curva Binodial para meio (B) PEG (% p/p) Fosfato de potássio
(% p/p) 3,84 4,86 5,48 6,09 6,58 6,99 7,40 7,77 8,63 8,80 9,08 9,01 9,32 9,66 9,99 9,90
24,15 19,76 16,58 14,64 12,75 11,32 10,43 9,48 8,47 7,37 6,54 5,62 4,87 4,27 3,85 3,35
PEG (% p/p) Fosfato de potássio (% p/p)
2,23 3,29 4,19 4,75 5,63 5,18 6,85 6,64 6,80 5,92 6,67 7,19 9,30 9,60
23,19 18,13 13,85 12,27 11,97 11,61 7,91 7, 18 6,64 6,29 6,06 5,97 4,95 4,66
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APÊNDICE 2
Copyright :'ç 1998 bv Humana Press Inc. Ali rights of any nature whatsoever reserved. 0273-2289198, 70- 72-0629S 1 O. 75
Xylanase Recovery Effect of Extraction Conditions on the Aqueous Two-Phase System Using Experimental Design
SILGIA A. COSTA, ADALBERTO PESSOA JR, * ANo INÊs e. RosERTo
Oepartment of Biotechnology!FAENQU/L, Rod. ltaiubá-Lorena, Km 74,5. 1 2. 600-000, Lorena! SP, Brazil
ABSTRACT Toe partitioning of xylanase produced by Penicillium janthinellum in
aqueous two-phase systems (ATPS) using poly(ethylene glycol) (PEG) and phosphate (K2HP04.'KH2P04) was studied employing a statistical experimental design. Toe airn was to identify the key factors goveming xylanase partitioning. Toe interactions of five factors (PEG concentration molecular weight, concentration of buffer K2HPO./KH2PO.i, pH, and NaCl concentration) and their main effects on the partition coefficient (K) were evaluated bv means of a 25 full-factorial experimental design with four center points. The ºoPEG, 0 o\;aCI, and pH were the most impor- tant factors affecting the response variable (K). Response surface method- ology (RSM) was adopted and an empírica! second-order polynomial model was constructed on the basis of the results. The optimum partition conditions were pH 7.0, PEG = 8.83°0 and NaCI = 6.02°0. Adequacy of the model for predicting optirnum response value was tested under these conditions. The experimental xvlanase partition coefficient !Kl was 2.21. whereas its value predicted bv the rnodel \\ as 2 . .33. These re-ults indicate that the predicted model \,·a~ adequate for the prc,cess. PEG molecular weight and phosphare concentration did not atfect the xvlanase partition coefficient.
Index Entries: Aqueous two-phase svstern: xylanase: Pe111L-illiw11 iunthi- 11ell11111; experimental design.
INTRODUCTION Enzymes involved in lignocellulosic degradation i11 situ are of interest
for their potential application to processes utilizing lignocellulosic sub-
- ...... ::
•
630 Costa Pessoa, and /~aberto
strates. Xvlanases and xylanase-producing microorganisms can potentially be applied to the production of hydrolysates from agro-industrial wastes (lJ, to nutritional improvement of lignocellulosic feeds (2), and to the pro- cessing of food (3), agrofiber (4), and pulp (5). Efforts have been made by the pulp and paper industries to reduce the amount of chlorine needed for bleaching. Studies have been conducted on the effluent treatrnent and on the effectiveness of less toxic bleaching agents (6). Toe residual Iignin remova! by enzymatic method is actually a very interesting research area (7,8). According to Durán et al. (9), xylanases produced by Penicillium ian- thinellum can be used for reducing the chlorine charge in Eucalyptus-pulp bleaching with a simultaneous gain in brightness. The xylanase production has been investigated (10), but studies on downstream processes are still needed.
Extractive bioconversion using aqueous two-phase systems (A TPS) seems to be a very attractive rnethod for the integration of fermentation and downstrearn processing of extracellular proteins (11). ln addition to formíng a relatively rnild environment suitable for cell and protein extrac- tion, ATPS can be easily scaled up and continuously processed (12-14).
Toe aim of this work was to identify the key factors governing xyla- nase partitioning using A TPS. Differences in enzyrne partitioning can be ascribed to the interaction of the factors inherent in the system itself (such as choice of system components, polyrner molecular weight, concentration of polyrners and salts, ionic strength, and pH) with those of the target protein (such as hydrophobicity, charge, and molecular weight) (12). Toe effects of variables like PEG molecular weight, PEG concentration, pH, and phosphate and NaCl concentration on partition coefficient (K) of xvla- nase were studied. Full factorial experimental designs were ernploved since they require a reduced number of experiments and help to identify important and interacting factors deterrnining the enzyrne partition (15). Response surface rnethodology was used for optimizing xylanase partition coefficient (K) bv A TPS and a statistical model correlating the variables was obtained.
MA TERIALS ANO METHODS
Microorganism and Cultivation
Toe microorganisrn P. ianthinelutm, isolated from decaying wood by Milagres (16), was identified by the Biosystematic Research Center of Can- ada (Ottawa, Ontario, Canada) and deposited in their collection under the designation of CRC 87M-115. Toe strain was initially maintained in sílica stocks and later on agar slants. Toe spore inocula were obtained after cultivation at 30ºC for 5 d in rnedium containing 1 ~º glucose, 0.1 ºo yeast extract. 2ºo (\· v) concentrated salts solution based on Vogel's medium (17), and 2ºo agar-agar. Toe final concentration of spores was 10:=; rnL -1. The
·2c:
Aqueous T wo-Phose Xylonose Recovery 631
cultivation medium for enzyme production was composed of sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate (800 g of dry milled bagasse mixed with 8 L 0.25% H2S04 and autoclaved for 45 min at 121cC), supplemented with 2% (v/v) concentrated salts solution based on Vogel's medium and 0.1 °10 yeast extract. Toe medium was then autoclaved for 15 min at 121 ºC. Shake-flask cultures were gro\vn in Erleruneyer flasks (125 ml.) containing 25 mL of medium. Standard cultivation conditions were: tem- perature 30ºC; initial pH 5.5 (uncontrolled); cultivation time 96 h. Toe xylanase activity after this time was 876 nanokatals/rnl, -1.
Determination of Enzyme Activities
Xylanase activities were determined by incubating 0.5 mL of diluted culture filtrate with 0.5 mL of a "Birchwood" xylan suspension (10 g/L -1)
in 0.05 M phosphate buffer (pH 5.5) for 5 min at 50ºC. Toe released reducing equivalents were measured by a colorimetric assay (18) using xylose solu- tion as a standard reference. Activity units were expressed as micromoles of reducing equivalents released per min PEG concentration levei influ- enced this activity. Toe three concentration leveis tested-10, 22.5, and 35%-enhanced the enzyme activity by 2.6, 10, and 18%, respectively.
Preparation of Phase Systems
Phase systems were prepared from PEG, phosphate (KH2P04/
K2HP04), and NaCl in solid form. Three milliliters of medium containing xylanase was added to the systems and deionized water was used to adjust the desired final concentrations of the components. By varying the propor- tion between KH2P04 and K2HP04, the pH of the svstern was adjusted. Centrifugation (2500g for 10 min) was used after thorough vortex-mixing of the systern components; the phase volumes were measured using gradu- ated centrifuge tubes. Samples of the top and bottom phases were then assaved for enzyme activitv. During all partition experirnents. the tempera- ture w as -25ºC.
Experimental Designs and Statistical Analysis To quantify the partition coefficient (K), the fraction of enzymes pres-
ent in. the lower and upper phases after phase separation was used. This fraction (y), which is the response factor, was measured as a function of pH (Xi), PEG MW (X2), PEG concentration (X:;), phosphate concentration ( X-1), a,nd \:aCI concentration ( X:i). For each of the five factors, high (coded value: ~ 1) and low (coded value: - 1) set points were selected (Table 1 ). A TPSs representing all 32 (Z:\ set-point cornbinations were made, as well as an A TPS representing the center point in. which the value of all factors was in between (coded value: O). All factors were rneasured twice. whereas the center point was measured times.
... ,_:::
Costa, Pessoa. ond Roberto
Table 1 Factors and Leveis in the Five-Factor. Three-Level Response Surface Design
Lsed for Ophmizing the Xylanase Partition Coefficient by A TPS
Run Inferior leve! Superior levei Center point number Factors ( -1) ( +) (O)
X1 pH 5.0 8.0 6.5 X2 MWPEG 600 6000 4000 X3 % PEG 10 35 22.S Xi %Phosphate 10 25 17.5 X5 ~'oNaCI o 10 5
After statistical analysis (Tables 2 and 3) the optimization of xylanase partition coefficient (K) was achieved by three independent process vari- ables using a 23-factorial experimental design with six star points (a = 1.41) and four replicates at the center point (Table 4), according to the method of Box et al. (15). These independent variables (pH, %PEG, and º'oNaCl) acquired new values and are coded as X1, X3, and X5 in the follow- ing equa tions:
X1 = (pH - 7.4)/0.5
X3 (%PEG - 13.0)/5
X5 = (~';,NaCl - 5.6)/0.3
(1)
(2)
(3) where pH, ºoPEG and noNaCl are true values and X1, X.3, and X.5 are coded values,
A statistical examination of the results anda response surface study were carried out using the STA TGRA.PH 6.0 statistical program package. The polvnornial model ernploved was of the torrn:
:, = 13,. - !3:.\1 - !3:X: - !3;.\; - !3, :.\:.\: - !3, ;.\',.\, - !3:: ,.\:X, - !3: 1.\T - !3::.::X~ - í3, ,X~ (-!)
where: i3t• = constant. !31..::- !3i.:;, í3::., = cross product coetticients. !31 !32 !3, = linear coefricients. X1, X:, X_,, = coded independent variables. and 1311, 13:::.:::, 13:u = quadratic coefficients.
Chemicals Birchwood -l-O-methyl-l3-o-glucoroxylan {90"o xylose) was obtained
trorn Sigma (St. Louis, \10), and polytethvlene gl~·col) (PEG) from Merck ( Darrnstadt. Cerrnanv) .. .\11 the other chemicals were of analytical grade .
•
AquecL·s .,..,,,c:-Pfccse Xvicnose Reccvery 633
Table 2 Xylanase Partition Coefficient (K) from 23-Full Factorial Design with Center
Point under Different Treatments
Assay Assay Factors
number sequence X1 X: X3 X-1 Xs Kª 1 25 -1 -1 -1 -1 -1 o 2 36 +1 -1 -1 -1 -1 o 3 20 -1 +1 -1 -1 -1 o 4 28 +1 +1 -1 -1 -1 0.60 5 22 -1 -1 +1 -1 -1 o 6 4 +1 -1 +1 -1 -1 1.72 7 34 -1 +1 +1 -1 -1 o 8 23 +1 +1 +1 -1 -1 0.81 9 8 o o o o o 1.69
10 14 -1 -1 -1 +1 -1 o 11 26 +1 -1 -1 +1 -1 2.03 12 6 -1 +1 -1 +1 -1 1.16 13 3 +l +1 -1 +1 -1 1.72 14 12 -1 -1 +1 +1 -1 o 15 19 +l -1 +l +l -1 0.57 16 .., -1 +1 +1 +1 -1 o / - 17 +1 o ·- 35 +1 +1 +l -1 18 16 o o o o o l.33 19 9 -1 -1 -1 -1 +1 o 20 30 +1 -1 -1 -1 +l 2.34 21 17 -1 .J.. 1 -1 -1 +l 1.42 .., ... 13 .;-1 .... 1 -1 -1 -1 1.9-! 23 ::, -1 -1 -1 -1 .... 1 o 2-! 21 - l -1 -1 -1 - 1 o -,- 2~ - 1 -1 - 1 -1 -1 o _:, 2t, l - 1 -1 - 1 - 1 - l li 2~ 2-4 o o o o o 1.57 28 ... - 1 - 1 - l -1 -1 o - 29 '' -t-1 -1 - l +- l -1 1.36 -"-" 30 31 -1 -1 -1 -1 -1 2.11 31 11 -1 ...._ 1 -1 -'- l .... 1 l.3J 32 lS - 1 -1 -1 -'- 1 .... 1 o 33 13 -t- 1 -1 -1 +l - 1 o 3--1 .,- -1 +1 -1 .J.. 1 +1 o _, 35 10 +l +1 -1 +1 +1 o 36 32 o o o o o 1..10
'1 K = (K1 - K: l 2 a\·erage partition coefficient.
634 Ccstc Pessoa, or.d Roberto
Table 3 Estirnated Effect, Standard Errar and Students t Test of 25 Factorial Design
with Four Center Points
Variables Estirnated effects Standard error t Values
Average 0.713 =0.10-! X1 0.608 =0.224 2.71ª X2 0.191 ::':0.224 0.86 X3 -0.806 =0.22-l 3.36" Xi 0.090 =0.224 0.41 X5 0.118 :::0.224 0.53
X1X2 -0.394 ±0.22-l 1.76 X1X3 -0.221 ::':0.22-l 0.98 X1X4 -0.141 :t:0.224 0.63 X1Xs -0.187 :t:0.224 0.80 X2X3 -0.376 :t:0.224 1.68 X2Xt 0.103 :::0.224 0.46 X2X5 -0.195 :::0.224 0.87 X~.i -0.335 ::'::: 0.22-l 1.50 X~5 -0.505 ::: 0.22-l 2.25ª X.iXs -0.203 ::':0.22-l 0.90
• Significant at the 5°'o levei (t = 2.08012).
Table 4 Experimental Data for Xylanase Partition Coeffi.cient (K) Under Different
Treatments
Treatment pH ºoPEG "oNaCI K
l -1 -1 -1 2.10 .., -1 -1 -1 2.07 - ... - 1 -1 -1 1.75 _, -l -1 - 1 -1 1.62 ::, -1 -1 -1 2.32 (' - 1 - l , 2 L, -1
- 1 -1 - 1 2.1-l 8 ..... 1 -1 +1 1.85 9 - 1.-11 o o 2.10
10 1.-11 o o 2.27 11 o - 1.-l l o 2.36 12 o 1.-11 o 1.72 13 o o -1.41 2.27 1-l o o 1.41 2.30 15 o o o 2.27 16 o o o 2.08 17 o o o 2.07 18 o o o 2.11
' - ......... - -- - - ... ,. ........ -.. ... .,:., 7C-.72 !Y98 -.::-e ;3--:; = _ .. :--:~ _:·- . .... '-' - - -=-- . ·- 1.. ~·.
•
Aaueocs T wc-Phase X,:!cf"'ose Recovery 635
(IO'lft)
i ü o z
(O'!Ctl
(10,C.) PEG(%)
(35%)
Fig. l. Interpretation diagram of the interaction effects between %PEG and %NaCl in the 25 factorial design.
RESULTS ANO DISCUSSION
Toe partition coefficients obtained after xylanase extraction by A TPS, according to the factorial design, are presented in Table 2. Toe factor levels were defined based on phase diagrarns (MW PEG, <>;·;, PEG, % phosphate and ~~ NaCI factors) (19> and on the enzyrne characteristics (pH factor) (5). Toe individual effects of the experimental factors and their interactions on partition coefficient (K) are shown in Table 3 .. As can be seen the pH ( X1 ), ºoPEG ( X~) and the interactions between °oPEG ( x.: and 0o'.'\iaCl ( X,_) presented a signiricative influence on partition coefficient at the 3'\, level. The estimated effect for the pH ( X1) was positive indicating that frorn levei - 1 to + 1 the K value augments as a function of pl-í. The effect of this variable is independent oi the other factors since there was no significant interactions among thern. On the other hand. the rnain etfect of the o oPEG (X3) cannot be interpreted separatelv because its interaction with ~10NaCI (X,_) was significant at the 3°0 levei. As can be seen in Fig. L an íncrease in the NaCl concentration frorn O to 10°0 provides an increase of 0.63 U in the K value. ln this variation range, at 35°0 \.'aCL a reduction of 0.38 U in the partition coefficíent is observed. On the other hand. after increasing PEG concentration frorn 10 to 35%, without NaCI addition the K value éiecreases by 0.30 U. This variation (10 to 35"o) causes a decrease of 1.31 Units in the K value. As a function of these results. further optirnizing experiments were performed using a 23 orthogonal factorial design accord- ing to the Materiais and Methods section (Table -l). The regression coeffi- cients, t values and determination coefficients (R'-) for the full quadratíc
. ' . -cc,.i:=c =-·, .. \: ... t:,...... s·- . .;··:;:: _-·-:-·_·--,: .. :~·.
Table :i Regression Coefficients. t Values and R2 of Quadractic Response Surrace
for K Values
T erm of the model Regression coetficients Standard error t Values
Interception 2.173 ::: O.O+! 49.489 Factor X1 -0.066 ±0.053 1.237 Factor X3 -0.361 ±0.053 6.704ª Factor X5 0.137 z 0.053 2.918b X1X3 -o.os ::: 0.066 0.758 X1X5 -0.08 ±0.066 1.214 X3X; 0.085 ±0.066 1.289 X1X1 -0.075 ±0.066 1.138 X:03 -0.220 ±0.066 3.337ª XsX5 0.025 ±0.066 0.379
Standard error estimated from pure error with 3 df. (t = 3.18245). ª Significant at the 5% levei. ~ Significant at the 10% levei.
Fig. 2 Response surtace of xvlanase partition coefticient (K) as a function of 0oPEG, ''.,'.\aCL and pH
response-surtace models of K are shown in Table 3 and analysis of variance (Table 6). At the 5°0 probabilitv, the pH value demonstrated no significant influence on the parhtion coefficient (K) as a main effect and as a second- order interaction effect. considering the new pH range (between 6.9 and 7.9). On the other hand, NaCI (ºé,) presented a significant influence as a rnain effect, whereas PEG (''.,) also presenteei a second-order effect. Figure 2 illustrates the three-dimensional response surfaces and contour plots
:- ~··· . .;·· _-: ~ : ·-=-: ...... -
•
ACt.·:?01;s T wo-Phose Xyfcrose ?ecove,y 637
Table 6 Analvsis of Variance r _-\_'\"O\'.-\) for the Quadractic Model
Source ot Sum of Degrees of Mean F variations squares freedorn square V alue P value"
Factor X, 0.3906 1 0.3906 31.06 0.L)()()J Factor X3 0.07-10 1 0.07-10 5.88 0.0382 X/ 0.0968 1 0.0968 7.70 0.0216 Lack of fit 0.1286 5 0.0257 2.04 0.1656 Pure Error 0.1132 9 0.0126 Total (Corr.) 0.8033 17
R1 = 0.70. ª P < 0.05.
Table 7 Regression Results: Observed Responses and Predicted Values
Observation Actual value Predicted value Residual number (yo) (yp) (yo - _1/p)
1 2.10 2.15 -0.05 2 2.07 2.15 -0.08 3 1.75 1.79 -0.0-1 -1 1.62 1.79 -0.17 5 2.32 2.31 0.01 6 2.13 2.31 -0.18 7 2.1-1 1.95 0.19 8 1.85 1.95 -0.10 9 2.10 2.16 -0.06
10 ") ")"'.' 2.16 0.11 -·'-' 11 2.36 2.19 0.17 12 1.72 1.6.5 0.0-1 1~ ") -.- 2.05 0.22 -·-' 1-1 2.30 .., ..,- (1.l)~
15 ") -.- 2. 1 t> o.i l ___ , 1 t> 2.08 2. 1 o - 1_) l11' 1 ;- 2.07 2. l n - L1.()Y
18 2. 11 2. l o - L1L15
showing the expected K values as a function of '\,NaCI and 0oPEG attained with equation 5.
y = 2.1s - o.1sxy + o.osx~ - o.ux; (5)
The mathernatical rnodel (Eq. 3) enables the maximal point calculation (K
:'.)J8 Costa. Pessoa. ond Roberto
= 2.33) for the coded values oi -0.83 and -1.-!l corresponding to 8.83°0 of PEG and 6.02°'0 of NaCL respectively.
Each of the actual K values (y,,) is compareci with the values predicted frorn the rnodel. Yp, in Table 7. Toe comparison of the residuais with the error variance S/ (0.23) indicates that none of the individual residuais exceeds twice the square root of the residual variance. Ali of the above considerations indica te an excellent adequacy of the regression model (20). After the optirnum processing conditions were identified by the model derived by RSM, the xylanase partition was performed under the following conditions: PEG = 8.83%; pH 7.0 and NaCl = 6.02%. The experimental xylanase partition coefficient (K) was 2.21, whereas its value predicted by the model was 2.33. This experimental finding is in dose agreement with the model prediction. Of the xylanase recovered, 80% remained in the top phase.
CONCLUSIONS The partition behavior of P. janthinelium xylanase has been studied
in aqueous two-phase systems. The response surface methodology (RSM) was useful in optirnizing the xylanase partition coefficient and graphical analysis aided in locating optirnum conditions. The %PEG, %NaCl, and pH were the most irnportant factors affecting the response variable (K). The optirnum partition conditions were selected at pH 7.0; PEG = 8.83% and NaCl = 6.02%. Adequacy of the model for predicting optirnurn re- sponse value was tested using these conditions. The experimental xylanase partition coefficient (K) was 2.21, whereas the value predicted by the model was 2.33. These results indicate that the model was adequate for the pro- cess. ln the range of experimental conditions. MW PEG and phosphate concentration did not affect the xylanase partition coefficient. The results showed the feasibility of xylanase recoverv bv A TPS and the advantage of ernploving experimental design for determining optimal evtraction con- ditions.
1.:·
ACKNOWLEDGMENTS Silgia A. Costa acknowledges the financial support of CAPES/BraziL
in the form of a Master of Science tellowship. and FAPESPSão Paulo, Brazil. Thanks are also dueto Adriane M. F. Milagres for valuable sugges- tions. and to Maria Eunice M. Coelho for revising this text.
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