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Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centrode Tecnologia

Departamento de Engenharia Química Programa de Pós-graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Produção de enzimas por fungos em fermentação

semi-sólida utilizando bagaço de coco e pedúnculo de

caju como substratos

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior

Orientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo

Coorientadora: Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis

JANEIRO/2014

NATAL/RN

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior

PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR FUNGOS EM

FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA UTILIZANDO BAGAÇO

DE COCO E PEDÚNCULO DE CAJU COMO

SUBSTRATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como parte dos requisitos necessários para

obtenção do grau de Mestre em Engenharia

Química, sob orientação da Prof. Dr. Gorete

Ribeiro de Macedo e coorientação da Prof. Dr.

Cristiane Fernandes de Assis.

JANEIRO/2014

NATAL/RN

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / DEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.

Oliveira Júnior, Sérgio Dantas de.

Produção de enzimas por fungos em fermentação semi-sólida utilizando bagaço

de coco e pedúnculo de caju como substratos / Sérgio Dantas de Oliveira Júnior. -

Natal, 2014.

103 f.: il.

Orientador: Gorete Ribeiro de Macedo.

Co-orientador: Cristiane Fernandes de Assis.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação

em Engenharia Química.

1. Enzimas - Dissertação. 2. Coco - Dissertação. 3. Caju - Dissertação. 4. Fungos

- Dissertação. 5. Resíduos industriais - Dissertação. I. Macedo, Gorete Ribeiro de

II. Assis, Cristiane Fernandes de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

IV. Título.

RN/UF CDU 577.15(043.3)

OLIVEIRA JÚNIOR, Sérgio Dantas de. Produção de enzimas por fungos em fermentação

semi-sólida utilizando bagaço de coco e pedúnculo de caju como substratos. Dissertação de

Mestrado, UFRN, Programa de Pós Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, Área de

Concentração: Engenharia Química, Natal/RN, Brasil.

Orientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo

Coorientadora: Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis

RESUMO – A produção de enzimas por microrganismos utilizando resíduos agroindustriais

é importante e pode estar associada a diversas aplicações, tais como indústrias de alimentos,

química, têxtil entre outras. O objetivo deste trabalho é a produção de enzimas CMCase,

Xilanase, Avicelase e FPase através da fermentação em estado sólido (FES), usando como

substrato o bagaço do coco verde e o pedúnculo de caju seco, utilizando os microrganismos

Penicillium chrysogenum e um fungo isolado da casca do coco (Aspergillus fumigatus). A

metodologia do planejamento experimental fatorial e análise de superfície de resposta estudou

a influência da variação da umidade e do pH. Foram realizadas fermentações usando o bagaço

do coco como substrato, nos cultivos utilizando o Aspergillus fumigatus e o fungo Penicillium

chrysogenum, e uma mistura com 50% de bagaço do coco e de 50% do pedúnculo de caju

com o fungo Penicillium chrysogenum, as condições de cultivo foram: 120 horas a 30 °C em

BOD, variando umidade e pH. Com o objetivo de verificar a influência das variáveis:

umidade e pH, foi elaborado um planejamento experimental fatorial 22, sendo então dois

fatores e dois níveis para cada fator com três repetições no ponto central. Os níveis das

variáveis independentes utilizadas foram, na ordem crescente (-1, 0, +1), para umidade 66%,

70,5% e 75% e para o pH 3, 5 e 7. Foi usado o programa computacional STATISTICATM

(versão 7.0, da StatSoft, Inc.) para calcular os efeitos principais das variáveis e suas

interações. A metodologia de superfície de resposta foi usada para avaliar as condições da

FES. A caracterização química e físico-química do bagaço do coco verde determinou as

composições de Celulose (%) = 39,09; Hemicelulose (%) = 23,80; Lignina Total (%) = 36,22

e de Pectina (%) = 1,64. Já para a caracterização do pedúnculo de caju os valores foram de

Celulose (g) =15,91; Hemicelulose (%) = 16,77; Lignina Total (%) = 30,04 e Pectina (%) =

15,24. Os resultados obtidos indicam o potencial dos materiais como substrato para

fermentação semi sólida visando produção de enzimas. Os dois microrganismos utilizados

apresentaram como bons produtores de celulases. Os resultados mostraram o potencial do

fungo isolado na produção da enzima CMCase, com valor máximo de 0,282 UI/mL e para a

enzima Avicelase o valor máximo variou entre 0,018 – 0,020 UI/mL, usando apenas o bagaço

do coco como substrato. O fungo Penicillium chrysogenum apresentou os melhores resultados

para as enzimas CMCase = 0,294 UI/mL, FPase = 0,058 UI/mL, Avicelase = 0,010 UI/mL e

Xilanase = 0,644 UI/mL, usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como sustratos. O

fungo Penicllium chrysogenum apresentou atividades enzimáticas usando apenas o coco como

substrato, para CMCase = 0,233 UI/mL, FPase = 0,031 – 0,032 UI/mL, Avicelase = 0,018 –

0,020 UI/mL e Xilanase = 0,735 UI/mL. Portanto, concluiu-se que os microrganismos e os

substratos utilizados apresentam potencial para processos de produção de enzimas em cultivo

semi-sólido. Palavras-chave: Penicillium chrysogenum, Planejamento experimental, CMCase, Avicelase,

Xilanase, FPase.

ABSTRACT

The production of enzymes by microorganisms using organic residues is important and it can

be associated with several applications such as food and chemical industries and so on. The

objective of this work is the production of CMCase, Xylanase, Avicelase and FPase enzymes

by solid state fermentation (SSF) using as substrates: bagasse of coconut and dried cashew

stem. The microorganisms employed are Penicillium chrysogenum and an isolated fungus

from the coconut bark (Aspergillus fumigatus). Through the factorial design methodology and

response surface analysis it was possible to study the influence of the humidity and pH. For

Penicillium chrysogenum and the isolated fungus, the coconut bagasse was used as culture

medium. In another fermentation, it was used the mixture of coconut bagasse and cashew

stem. Fermentations were conducted using only the coconut bagasse as substrate in cultures

with Penicillium chrysogenum fungus and the isolated one. A mixture with 50% of coconut

and 50% of cashew stem was employed only for Penicillium chrysogenum fungus, the

cultivation conditions were: 120 hours at 30 °C in BOD, changing humidity and pH values. In

order to check the influence of the variables: humidity and pH, a 22 factorial experimental

design was developed, and then two factors with two levels for each factor and three

repetitions at the central point. The levels of the independent variables used in ascending

order (-1, 0, +1), to humidity, 66%, 70.5% and 75% and pH 3, 5 and 7, respectively. The

software STATISTICATM

(version 7.0, StatSoft, Inc.) was used to calculate the main effects

of the variables and their interactions. The response surface methodology was used to

optimize the conditions of the SSF. A chemical and a physic-chemical characterization of the

coconut bagasse have determined the composition of cellulose (%) = 39.09; Hemicellulose

(%) = 23.80, Total Lignin (%) = 36.22 and Pectin (%) = 1.64. To the characterization of

cashew stem, the values were cellulose (g) = 15.91 Hemicellulose (%) = 16.77, Total Lignin

(%) = 30.04 and Pectin (%) = 15.24. The results indicate the potential of the materials as

substrate for semisolid fermentation enzyme production. The two microorganisms used are

presented as good producers of cellulases. The results showed the potential of the fungus in

the production of CMCase enzyme, with a maximum of 0.282 UI/mL and the Avicelase

enzyme the maximum value ranged from 0.018 to 0.020 UI/ mL, using only coconut bagasse

as substrate. The Penicillium chrysogenum fungus has showed the best results for CMCase =

0.294 UI/mL, FPase = 0.058 UI/mL, Avicelase = 0.010 UI/mL and Xylanase = 0.644 UI/ mL

enzyme, using coconut bagasse and cashew stem as substrates. The Penicllium chrysogenum

fungus showed enzymatic activities using only the coconut as substrate for CMCase = 0.233

UI/mL, FPase = 0.031 to 0.032 UI/ mL, Avicelase = 0.018 to 0.020 UI/mL and Xylanase =

0.735 UI/ mL. Thus, it can be concluded that the used organisms and substrates have offered

potential for enzyme production processes in a semi-solid cultivation.

Keywords: Penicillim chrysogenum, experimental design, CMCase, Avicelase, Xylanase,

FPase.

Dedico esta Dissertação aos meus pais

e irmãos.

AGRADECIMENTOS

À minha querida orientadora Profa. Gorete Ribeiro de Macedo que durante

todos esses meses sempre vibrou com o trabalho e incentivou todos com seu

entusiasmo a persistir, com toda a sua sabedoria.

Aos meus pais que sempre me mostraram o valor da educação.

Aos meus amigos Pedro Ferreira, Pedro Henrique, Ruthinéia, Nathália Araújo e

Paulo Fortunato pelo incentivo e as conversas durante todos esses meses.

Ao meu irmão Diego e a minha irmã Maria Carolina pela confiança e o incentivo

que sempre me passaram.

Aos meus amigos e amigas de Fortaleza, em especial ao João Feijó, sempre

presente em todos os momentos vitoriosos na minha vida.

À Profa. Cristiane pelo apoio ao trabalho.

Aos amigos do LEB Francisco Canidé, Alexandre Guilherme, Carlos Padilha e

Michelle Vaz pela companhia no laboratório e apoio na produção das enzimas.

Ao Prof. Everaldo, excelente professor, pela colaboração no planejamento

experimental.

A todos os membros da banca: Profa. Gorete Ribeiro, Profa. Cristiane Fernandes

Prof. Mateus de Freitas, Profa. Sharline Florentino que aceitaram fazer parte da

banca examinadora trazendo importantes contribuições para o trabalho.

As minhas queridas e companheiras Francisca Pereira, Angelinne Costa, Paula

Luciana, Emilianny Rafaely, e Jútima Siqueira pelo apoio, companheirismo, pela

amizade criada e as risadas em todos os momentos.

A dona Neide pela amizade criada e a Mazinha pela ajuda em todos os

momentos que eu precisei.

Em especial a minha querida mãe Maria de Lourdes que sempre torceu pelo

meu sucesso, me incentivando, dando apoio e carinho.

Dissertação de Mestrado

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 vii

SUMÁRIO

Lista de figuras...................................................................................................................

x

Lista de tabelas...................................................................................................................

xiii

Nomenclatura..................................................................................................................... xiv

1. Introdução.....................................................................................................................

1

2. Revisão Bibliográfica....................................................................................................

5

2.1 - O coco.......................................................................................................................

6

2.2 - O caju.........................................................................................................................

8

2.3 – Fungos Filamentosos................................................................................................

10

2.3.1 - Fungo: Penicilum chrysogenum.............................................................................

11

2.4 – Enzimas.....................................................................................................................

13

2.4.1 - Celulases................................................................................................................

13

2.4.1.1. Endoglucanases.....................................................................................................

16

2.4.1.2. β-glucosidase........................................................................................................

16

2.4.1.3. Exoglucanases.......................................................................................................

16

2.4.2 – Pectinases...............................................................................................................

17

2.4.3 – Xilanase.................................................................................................................

18

2.5 - Fermentação Semi-Sólida..........................................................................................

19

2.5.1 . Vantagens da FSS...................................................................................................

21

2.5.2. Desvantagens da FSS...............................................................................................

22

2.5.3. Parâmetros que influenciam a produção enzimática por FES................................

22

2.5.3.1. Umidade................................................................................................................

22

2.5.3.2. Temperatura..........................................................................................................

23

2.5.3.3. pH.........................................................................................................................

23

2.5.3.4. Tamanho da partícula............................................................................................

23


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 viii

2.5.3.5. Concentração inicial do inóculo...........................................................................

24

3. Material e Método.........................................................................................................

25

3.1 - Bagaço de coco.........................................................................................................

26

3.2 - Pedúnculo de caju.....................................................................................................

26

3.3 - Caracterização química e físico-química do bagaço de coco verde e do

pedúnculo de caju..............................................................................................................

27

3.3.1. Determinação de sólidos totais................................................................................

27

3.3.2. Determinação de extrativos.....................................................................................

28

3.3.3. Determinação de polissacarídeos.............................................................................

28

3.3.3.1. Hidrólise com H2SO4 (72%)................................................................................

28

3.4 - Determinação de lignina..........................................................................................

29

3.4.1. Lignina insolúvel....................................................................................................

29

3.4.2. Teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais..................................................

29

3.4.3. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)..

30

3.5 - Determinação da pectina...........................................................................................

31

3.6 - Determinação dos minerais......................................................................................

32

3.7 - Microrganismos.........................................................................................................

33

3.8 - Isolamento de uma linhagem fúngica produtora de celulase................................

33

3.8.1. Identificação da linhagem fúngica produtora de celulase........................................

33

3.8.2. Meio para Triagem em placa de Petri......................................................................

34

3.9 - Ativação do inóculo...................................................................................................

34

3.9.1. Obtenção da solução de esporos e preparo do inóculo............................................

35

3.10 - Processo de Fermentação.....................................................................................

36

3.10.1. Condições da Fermentação....................................................................................

36

3.11 - Cinética da Fermentação.........................................................................................

37


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 ix

3.12 - Extração das enzimas..............................................................................................

37

3.13 - Determinação da enzima Celulase..........................................................................

38

3.13.1. Determinação da atividade CMCase (Endo-1,4-β-Dglucanase)..........................

38

3.14 - Determinação da atividade FPase...........................................................................

39

3.15 - Determinação da atividade da β –glicosidase........................................................

39

3.16 - Determinação da atividade da Xilanase..................................................................

40

3.17 - Determinação da atividade da Avicelase.................................................................

40

3.18 - Determinação da atividade da Pectinase.................................................................

41

3.19 - Determinação de açúcares redutores.......................................................................

42

3.20 - Determinação da quantificação de proteínas por Bradford.....................................

42

3.21 - Determinação da celulose residual..........................................................................

43

3.22 - Planejamento Experimental.....................................................................................

44

4 - Resultados e Discussão................................................................................................

46

4.1 - Caracterização dos resíduos: Bagaço do coco e pedúnculo de caju.........................

46

4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde...............................................

49

4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde...............................................

49

4.3 - Determinação dos minerais do pedúnculo de caju....................................................

51

4.4 - Seleção de microrganismo produtor de celulase.......................................................

53

4.4.1. Isolamento de linhagem fúngica produtora de celulases........................................

53

4.4.2. Triagem em meio Avicel.........................................................................................

54

4.5 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando um

fungo isolado da casca do coco nas fermentações com o coco como

substrato.............................................................................................................................

56

4.6 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o

Penillium chrysogenum nas fermentações com a mistura de bagaço do coco e o

pedúnculo de caju como substratos...................................................................................

60


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 x

4.7 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o

Penillium chrysogenum nas fermentações com apenas o bagaço do coco como

substrato.............................................................................................................................

69

4.8 - Cinética do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e do Penicillium

chrysogenum.....................................................................................................................

76

5. Conclusões....................................................................................................................

84

6. 6. Referências Bibliográficas.............................................................................................

86


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Representação esquemática das partes estruturais características do coco

verde. Fonte: EMBRAPA, 2010........................................................................................

6

Figura 2.2 - Pedúnculo de caju. Fonte: EMBRAPA, 2000................................................

9

Figura 2.3 - Ilustração da Placa Penicillium chrysogenum. Fonte: SUPER NOVA

CIÊNCIA, 2012.................................................................................................................

12

Figura 2.4 - Representação do Sistema enzimático envolvido na degradação da

celulose. Fonte: Adaptado por Aron et al., 2005..............................................................

14

Figura 2.5 -Estrutura da parede celular de plantas. Fonte: IPPA, 2008........................

15

Figura 2.6 - Estrutura primária de uma molécula de pectina. Fonte: Alkorta, et al.,

1998...................................................................................................................................

17

Figura 2.7 - Fermentação semi-sólida em frascos Erlenmeyer em BOD. Fonte:

Autor..................................................................................................................................

20

Figura 3.1 - Representação dos resíduos utilizados como substratos: (a) bagaço do coco

e (b) pedúnculo de caju......................................................................................................

27

Figura 4.1 - Aspecto da morfologia cultural da cepa de fungo isolado da casca do coco

(Aspergillus fumigatus)......................................................................................................

54

Figura 4.2 - Crescimento do fungo Penicillium chrysogenum em palca de Petri com

Avicel.................................................................................................................................

55

Figura 4.3 - Crescimento do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco

em palca de Petri com Avicel............................................................................................

55

Figura 4.4 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a

atividade da CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do

coco como subtrato............................................................................................................

57


atividade Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do

coco como subtrato............................................................................................................

57

Figura 4.6 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática

CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como

substrato.............................................................................................................................

58


Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como

subtrato...............................................................................................................................

59


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xii

Figura 4.8 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade

CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo

de caju como subtratos...........................................................................................................

62


Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo

do caju como subtratos..........................................................................................................

63


Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo

do caju como subtratos..........................................................................................................

64


FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do

caju como subtratos...............................................................................................................

64


CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo

de caju como substratos.........................................................................................................

66


Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o

pedúnculo de caju como substratos...................................................................................

66


Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo

de caju como substratos.........................................................................................................

67

Figura 4.15 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase

para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de

cajucomo substratos...............................................................................................................

68


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xiii


Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

subtrato..................................................................................................................................

71


CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

subtrato..................................................................................................................................

71


Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

subtrato..................................................................................................................................

72


FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

subtrato..................................................................................................................................

72


Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

substrato.................................................................................................................................

73


CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

substrato.................................................................................................................................

74


Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

substrato................................................................................................................................

75


para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como

substrato.................................................................................................................................

77


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xiv

Figura 4.24 - Perfil dos teores de açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose

residual produzidos pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante 10 dias de

cultivo....................................................................................................................................

77


residual produzidos por Penicillium chrysogenum durante 10 dias de cultivo......................

78

Figura 4.26 - Perfil de atividade de CMCase e Avicelase durante os 10 dias na

fermentação semi-sólida, utilizando o fungo isolado (Aspergillus fumigatus).................

80

Figura 4.27 - Perfil de Atividade das enzimas CMCase, Xilanase, Avicelase e FPase

durante os 10 dias na fermentação semi-sólida, utilizando o fungo Penicillium

chrysogenum e o coco como substrato..................................................................................

81


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Produção de coco e área produzida nos principais países................................

8

Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os valores de cada componente presente no

extrato hidrolisado.................................................................................................................

30

Tabela 3.2 - Condições instrumentais utilizadas no ICP/OES..........................................

32

Tabela 3.3 - Parâmetros para a identificação dos minerais..............................................

32

Tabela 3.4 - Composição do meio de triagem em placas de Petri........................................

34

Tabela 3.5 - Ensaios do planejamentos fatorial ( 22 )..........................................................

44

Tabela 3.6 - Proporção da matéria prima e microrganismo utilizado nas fermentações.....

45

Tabela 4.1 - Caracterização do bagaço do coco verde e do pedúnculo de caju.....................

47

Tabela 4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde.....................................

50

Tabela 4.3 - Determinação dos minerais no pedúnculo de caju............................................

52

Tabela 4.4 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da

CMCase e Avicelase produzida pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus).......................

56


CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo Penicillium chrysogenum

usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como substratos.....................................

61


CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo Penicillium chrysogenum

usando o bagaço do coco como substrato............................................................................

70


Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 xvi

NOMENCLATURA

Aa Atividade de água

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

abs Absorbância

ACC Amêndoa da castanha de caju

ART Açúcares redutores totais

A.E Atividade enzimática

DNS ácido 3,5 – dinitro-salicílico

FES Fermentação em estado sólido

FS Fermentação submersa

FSS Fermentação semi-sólida

FPU Uma unidade de atividade em papel de filtro

h Hora

L litro

min Minutos

N Nitrogênio

P Fósforo

p/v Peso por volume

Pa pressão de vapor de água do substrato

Pt. Proteína

rpm Rotações por minuto

UI/mL Unidade de atividade por mililitro

v/v Volume por volume

PDA Potato Dextrose Agar

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

Capítulo 1 - Introdução

2

1. Introdução

O Brasil é o maior produtor mundial de frutas tropicais, apresentando terras de

excelentes qualidades que são utilizadas para cultivo de uma ampla variedade de frutas. Na

região Nordeste do Brasil destacam-se os subprodutos de frutas em virtude da ampla

disponibilidade (Rogério, 2005). Podem ser citados então os subprodutos oriundos do cultivo

e do processamento agroindustrial de abacaxi, abacate, banana, caju, coco, mamão, manga,

maracujá, uva, acerola, goiaba, laranja, tomate e urucum.

O grande consumo de água de coco verde (in natura ou industrializada) vem

aumentando a geração de resíduo oriundo da casca desse fruto, o que acaba representando um

grave problema quanto ao descarte desse material, principalmente nas grandes cidades onde

são levados para lixões e aterros sanitários. As cascas de coco verde correspondem

aproximadamente 85% do peso bruto do fruto e a sua degradação leva em torno de 8 anos

(Rosa et al., 2001). O coco verde, por ser um material rico em matéria orgânica e reciclável,

pode ser utilizado na fabricação de vários produtos. Isso em decorrência da sua composição,

que tem como principais componentes a celulose e hemicelulose, os quais proporcionam

grandes índices de rigidez e dureza. A indústria de processamento de coco (verde ou maduro)

gera uma quantidade significativa de resíduos. Nesse caso, “coir” é o nome dado às fibras que

constituem o mesocarpo grosso ou casca do coco (Cocos nucifera L.) e que são usadas para

produção de tapetes, esteiras e como substrato agrícola.

Deve-se considerar ainda que, no Nordeste do Brasil é encontrada a maior diversidade

do gênero Anacardium, por essa razão, (Johnson, 1973) considerou o Estado do Ceará como

local de origem do cajueiro. Além disso, cerca de 98% da área brasileira cultivada com

cajueiro, está situada no Nordeste segundo Pessoa et al., (1995). No Brasil, devido a grande

presença de espécies, este se divide em dois grupos: o tipo comum (gigante), o mais

difundido, apresentando porte elevado com altura variando de 5 a 8 m, podendo atingir até 15

metros. O diâmetro da copa, em geral, varia de 12 a 14 m e, em casos excepcionais, até 20 m

(Barros, 1995). Por sua vez, cajueiros do tipo anão precoce caracterizam-se por apresentar

porte baixo, em média 4 m, diâmetro da copa de 6 a 8 m, grande precocidade etária e

florescimento entre 6 e 18 meses (Barros et al., 1998).

A amêndoa da castanha de caju é rica em vitaminas, ácidos graxos não saturados e

proteínas. O pedúnculo apresenta teores elevados de vitamina C, açúcares, minerais (cálcio,

ferro e fósforo) e fibras. O aproveitamento do pedúnculo de caju é inferior a 20% do total


3

produzido, sendo utilizado para o consumo in natura, fabricação de doces, compotas e

bebidas diversas. Uma das causas para esse baixo aproveitamento está relacionada ao tempo

de deterioração do mesmo, que ocasiona excessivas perdas no campo e na indústria (Campos,

2003). O agronegócio do caju é uma das principais atividades do Nordeste brasileiro com

produção de cerca de 200 mil toneladas de amêndoas e dois milhões de toneladas de

pedúnculo. A utilização industrial do pedúnculo de caju é direcionada principalmente ao

mercado interno com a produção de sucos e doces (Oliveira e Andrade, 2007) que geram

resíduos, o pedúnculo de caju, que, em geral são reaproveitados para enriquecimento da ração

animal ou descartados por falta de incentivo de seu uso na alimentação humana.

Como alternativa para utilizar materiais que seriam descartados e sem qualquer tipo de

cuidado uma alternativa seria a utilização desses resíduos na produção de enzimas por

fermentação utilizando fungos filamentosos, pelo fato de serem excelentes microrganismos

que se adapatam as condições adversas, como baixa umidade, pH e temperaturas variadas. O

processo de fermentação semi-sólida (FSS) envolve o crescimento e metabolismo de

microrganismos, na ausência ou quase ausência de água livre, empregando um substrato

sólido, ou suporte. A FSS se apresenta como uma tecnologia para usar resíduos gerados,

como substratos, diminuíndo possíveis problemas ambientais (Rocha, 2010). Processos

utilizando substratos sólidos são economicamente importantes para os países como Brasil,

com uma abundância de biomassa e resíduos agroindustrais, que podem ser utilizados como

matérias-primas baratas (Castilho et al., 2000). Esta técnica tem muitas vantagens sobre a

fermentação submersa incluindo altos rendimentos e a baixa demanda de energia (Krishna,

2005).

Os resíduos agrícolas contêm de 20 a 60% de celulose, 20 a 30% de hemicelulose e 15

a 30% de lignina. O bagaço de coco contém aproximadamente 23 a 43% de celulose e o

restante de hemicelulose (3 a 12%) e lignina (35 a 45%) (Rosa et al., 2001). De acordo com

Gouveia et al., (2009) o pedúnculo de caju apresenta 20,56% de celulose, 10,17% de

hemicelulose e 32,26% de lignina.

Os microrganismos que atuam degradando os materiais celulósicos são capazes de

produzir enzimas chamadas de celulases, de acordo com Castro, (2006). Com os valores de

celulose, hemicelulose e lignina presentes no bagaço do coco e do pedúnculo de caju após a

caracterização dos mesmos, é possível a produção de enzimas em especial as celulases, que

são enzimas que atuam na degradação de substratos lignocelulósicos.


4

O objetivo deste trabalho foi o estudo da produção de enzimas através da

fermentação em estado sólido, usando como substratos o bagaço de coco e o pedúnculo de

caju seco, utilizando um fungo natural isolado da casca do coco e o Penicillum chrysogenum.

Com base na metodologia do planejamento experimental fatorial e análise de superfície de

resposta, estudou-se a influência da umidade inicial do meio e o do pH.

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Capítulo2 - Revisão Bibliográfica

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior janeiro/ 2014 6

2. Revisão Bibliográfica

2.1. O coco

O gênero Cocus é constituído pela espécie Cocus nucifera L. que, por sua vez, é

composta por algumas variedades. As mais importantes, no âmbito do agronegócio,

socioeconômico e agroindustrial, são as variedades Typica (var. Gigante) e Nana (var. Anã),

que acredita-se ter originado de uma mutação gênica da Gigante (Frutas do Brasil, 2002;

Santos et al.,1996).

O coco, fruto formado a partir de uma semente chamada drupa, é constituído

basicamente por um epicarpo, que consiste em uma camada externa fina e lisa que forma a

sua casca; mesocarpo, camada intermediária fibrosa de onde obtém-se a fibra; endocarpo,

uma camada lenhosa e dura e a castanha chamada de albúmen sólido, que é a parte do fruto de

maior valor comercial, além da água de coco (Figura 2.1). O fruto chega a alcançar o peso

médio de 3 a 4 Kg e a quantidade de água diminui à medida que o coco amadurece (Portal

São Francisco, 2005).

Figura 2.1 - Representação esquemática das partes estruturais características do coco verde.

Fonte: EMBRAPA, 2010.

O fruto do coqueiro é constituído por albúmen líquido (água de coco), albúmen sólido

ou amêndoa, endocarpo e casca. A casca representa em torno de 57% do fruto sendo

composta pelo mesocarpo (fibra e pó) e epicarpo (camada mais externa da casca). O volume e

o peso da casca variam com as condições climáticas da região de plantio, com a adubação,



com os tratos culturais e fitossanitários do coqueiro e com a variedade cultivada (EMBRAPA,

2010).

A fibra de coco extraída do mesocarpo, parte espessa fibrosa do fruto apresenta uma

elasticidade superior a outras fibras vegetais, além de uma elevada capacidade de resistir à

umidade e a altas variações nas condições climáticas. É constituída de materiais

lignocelulósicos, cujas características são a baixa densidade, a boa flexibilidade no

processamento e a facilidade de modificação a agentes químicos, além de ser fonte de

recursos renováveis e biodegradáveis (Pannirselvam et al., 2000; Vale et al., 2006).

Quanto à sua composição, as fibras são formadas basicamente de celulose,

hemicelulose, lignina, pectina e minerais. A celulose é o principal constituinte da estrutura,

sendo um polissacarídeo linear de alta massa molecular formado principalmente de glicose,

responsável pela estabilidade e resistência das fibras. A hemicelulose é um polissacarídeo

formado pela polimerização de vários açúcares (glicose, xilose, galactose, arabinose e

manose) e atua como ligante entre a celulose e a lignina (Passos, 2005).

A lignina é um polímero complexo responsável pela formação da parede celular. Sua

concentração nas fibras influencia na estrutura, na morfologia, na flexibilidade e taxa de

hidrólise. As fibras com alto teor de lignina são de excelente qualidade e alta flexibilidade

(Passos, 2005).

A pectina, um polissacarídeo com função aglutinante, é um dos constituintes da parede

celular. Os componentes minerais são os responsáveis pela formação das cinzas após a

incineração das fibras (Passos, 2005).

As fibras das cascas de coco possuem uma quantidade menor de celulose, contudo, o

percentual de lignina é grande, cerca de duas a quatro vezes maior que os valores existentes

nas fibras de juta e sisal, tornando-a extremamente vantajosas frente às outras fibras. O teor de

lignina nas fibras varia em função da idade do fruto, girando entre 20% nas fibras de coco

jovem e de aproximadamente 35% no fruto maduro (Passos, 2005).

Estima-se que o Brasil possui uma área plantada de 280 mil hectares de coqueiro,

destinados à produção do fruto verde para o consumo da água de coco (Tabela 2.1). As cascas

geradas representam 80% a 85% do peso bruto do fruto e cerca de 70% de todo lixo gerado

nas praias brasileiras representam cascas de coco verde. Este material tem sido direcionado

aos aterros sanitários, com toda a sua matéria orgânica, potenciais emissores de gases estufa



(metano). Assim, proliferando focos de vetores transmissores de doenças, mau cheiro,

possíveis contaminações do solo e destruição da paisagem natural (Rosa et al., 2001).

Tabela 2.1 - Produção de coco e área produzida nos principais países.

Fonte: FAO, 2004.

O reaproveitamento de resíduos agro industriais em processos biotecnológicos tem

sido uma boa solução na reutilização de materiais que podem conter muitas substâncias de

alto valor agregado que, geralmente são rejeitados pelas indústrias, como por exemplo, o

bagaço do coco. Oliveira, (2010) isolou um fungo da casca do coco e produziu enzimas

celulolícas utilizando o bagaço do coco como substrato avaliando uma linhagem de

Trichoderma spp para a produção de enzimas. Em outro trabalho de mesma autoria utilizou o

microrganismo Aspergillus niger NRRL 2001e verificou a influência do pH e da temperatura

na atividade celulase produzida em meio contendo bagaço de coco verde (cocos nucifera l.)

como substrato.

2.2. O Caju

O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta tropical, originária do Brasil.

Apesar de ser encontrada em quase todo o território nacional, a Região Nordeste é

responsável por mais de 90% da produção nacional de caju (Melo Filho, 2002).

O verdadeiro fruto do caju, a castanha, é dotado de amêndoa oleaginosa, com teor de

óleo de 55 a 60%, 15 a 20% de proteínas e em torno de 5% de carboidratos, é consumida no

mercado interno e produto de exportação (Medina et al., 1980). Além de frágil, o pedúnculo é

altamente perecível. A vida útil do caju após a colheita, quando armazenado em temperatura

ambiente não ultrapassa 48 horas; sob-refrigeração à 5 ºC, com 85% a 90% de umidade

País Produção (ton) Área Colhida (ha)

Indonésia 19.500.000 2.950.000

Filipinas 15.319.500 3.379.740

Índia 10.894.000 1.940.000

Brasil 2.759.044 287.016

Mundo 60.713.136 11.230.626



relativa e devidamente embalado, a vida útil do caju é de cerca de dez a quinze dias (Cruz,

1989; Montenegro et al., 2003).

O pedúnculo pode ser aproveitado de diversas maneiras, como por exemplo, para a

produção de sucos, geléias, cajuína, sorvete entre outros produtos (Aguiar et al., 2000; Paiva

et al., 2000).

A amêndoa da castanha do caju constitui-se o principal produto de utilização do

cajueiro. O líquido da casca da castanha (LCC) e o pedúnculo, entretanto, também são

derivados de grande importância no aproveitamento do cajueiro. O pedúnculo é consumido

“in natura” ou industrializado sob a forma de diversos produtos. O grande valor nutritivo do

pedúnculo é uma característica do fruto (Figura 2.2) sob a forma de vitaminas e sais minerais,

nele encontrando-se a vitamina C em níveis quase cinco vezes maiores que na laranja, tendo

ainda, entre outros, a presença de cálcio, ferro e fósforo. (Cavalcanti, 2002; Araújo, 1995).

Figura 2.2 - Pedúnculo de caju. Fonte: EMBRAPA, 2000.

A cajucultura é uma das cultivares mais importantes no Brasil, principalmente na

economia nordestina, em razão do fruto se destacar como produto de exportação, além do

potencial de agregação de valor por meio do aproveitamento do pedúnculo (Souza et al.,

2004).

No Brasil, a agroindústria do caju está concentrada na região Nordeste, tendo

apresentado em 2008 uma produção anual de 243.253 toneladas, onde os estados do Ceará,

Piauí e Rio Grande do Norte participam com 90% dessa produção (IBGE, 2008). O parque

industrial é composto por 12 empresas (8 no estado do Ceará, 3 no Rio Grande do Norte e 1

no estado do Piauí), onde são processadas anualmente até 360 mil toneladas de castanha,

gerando 70 mil toneladas de amêndoa de castanha de caju (AAC) e 45 mil toneladas de

líquido da casca da castanha (LCC) (Teixeira, 2007). O Ceará representa 50% da área



cultivada de caju no país, sendo responsável pela geração de 30 mil empregos diretos e cem

mil empregos indiretos.

A utilização de resíduos, bagaços e cascas oriundos de indústriais de alimentos em

processos biotecnológicos tem sido uma alternativa eficaz para o seu uso, os quais são

descartados sem qualquer tipo de tratamento adequado e agravando os problemas ambientais.

O pedúnculo de caju é um exemplo de material que em sua grande parte é rejeitado, como

observado por Guedes, (2010), que estudou a influência de pré-tratamentos de dois resíduos

lignocelulósicos (bagaço do pedúnculo de caju e casca de coco) utilizados como substratos na

indução à síntese de enzimas celulolíticas. Ribeiro, (2010) estudou o extrato enzimático

celulolítico produzido por Trichoderma reesei ATCC 2768, utilizando-se bagaço do coco e o

pedúnculo de caju. Santos, (2007) observou a produção de pectinases através da fermentação

em estado sólido, usando como substrato o pedúnculo de caju seco e como agente da

fermentação o microrganismo Aspergillus niger CCT 0916. Deste modo, mostra-se o

potencial dos resíduos e bagaços utilizados como substrato para produção de enzimas.

2.3. Fungos Filamentosos

Os fungos são seres vivos eucariontes, multicelulares, alguns unicelulares (leveduras)

que desempenham diversos papéis na natureza. Como por exemplo, os fungos

decompositores, que apresentam um papel importante no ecossistema, decompondo material

orgânico, tornando muito dos nutrientes contidos nele disponíveis para outros organismos. A

decomposição libera dióxido de carbono na atmosfera e retorna compostos nitrogenados e

outras substâncias ao solo, onde eles podem ser utilizados novamente. Suas atividades são tão

necessárias para a continuidade da existência do mundo quanto são aquelas dos produtores.

Para que haja uma classificação adequada em relação a que filo um fungo pertence, as

características macroscópicas e microscópicas devem ser identificadas. Existem

características que podem descrever fungos pertencentes a mais do que um filo, sendo

algumas dessas específicas.

As colônias aveludadas ou pulverulentas são formadas por fungos multicelulares, os

fungos filamentosos. O corpo de um fungo filamentoso é composto de longos filamentos de

células conectadas, as hifas. Quando elas são divididas em unidades celulares uninucleadas,

são chamadas de hifas septadas. Os septos possuem poros que fazem com que o citoplasma



das células se comunique. Em algumas classes de fungos as hifas não têm septos e são

denominadas cenocíticas. O conjunto de hifas é denominado micélio. Este pode ser do tipo

vegetativo ou reprodutor. No primeiro caso, o micélio libera enzimas digestivas sobre o

substrato, permitindo a digestão extracelular do alimento, que depois será absorvido pelo

fungo, isso apenas ocorre nas extremidades. Enquanto houver alimento, o fungo permanecerá

no mesmo local, crescendo continuamente (Rodrigues e Lacaz, 1992).

Os fungos filamentosos podem crescer na faixa entre 1,5 e 11, mas as leveduras não

toleram pH alcalino. Muitas vezes, a pigmentação dos fungos está relacionada com o pH do

substrato.

Os fungos filamentosos atuam com eficiência na degradação de compostos celulósicos

devido à produção de enzimas celulases que reduzem as estruturas dos substratos através da

hidrólise. As principais celulases atuantes na degradação de material lignocelulósico, a partir

da hidrólise, são as endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidades (Sun e Cheng, 2002).

Essa degradação ocorre devido ao complexo sistema enzimático produzido pelos fungos

filamentosos, como Celulases, Hemicelulases, Xilanases, Pectinases, Proteases, entre outros.

2.3.1. Fungo Penicillum chrysogenum

Penicillium constituem um grupo de microrganismos que sintetizam grandes

quantidades de metabólicos secundários, em certos casos atingem uma produção de 75% a

mais que outras classes de microrganismos (Cafêu et al., 2005). As espécies de Penicillium

têm uma alta diversificação, tanto na sua morfologia, representada na Figura 2.3, quanto na

produção de metabólitos secundários, como exemplo os antibióticos, micotoxinas,

antioxidantes, anticancerígenos, inseticidas, herbicidas, enzimas e fungicidas, (Frisvad et al.,

2004; Samon et al., 2000).



Classificação científica:

Reino: Fungi

Divisão: Ascomycota

Subdivisão: Pezizomycotina

Classe: Eurotiomycetes

Ordem: Eurotiales

Família: Trichocomaceae

Gênero: Penicillium

Espécie: chrysogenum

Figura 2.3 - Ilustração da Placa de Penicillium chrysogenum. Fonte: SUPER NOVA

CIÊNCIA, 2012.

Porém, algumas espécies desse gênero também são produtoras de micotoxinas. A

importância desses compostos tóxicos varia muito de acordo com os fatores ecológicos e

biológicos para cada espécie. As espécies Penicillium citrionigrum e Penicillium islandicum

produzem toxinas potentes, mas como ambas são raras na natureza, as toxinas produzidas por

essas espécies não são consideradas importantes (Pitt, 2002).

O Penicillium é microrganismo oportunista de plantas, espécies desse gênero

encontram-se amplamente distribuídas, e apresentam impactos negativos e positivos. Muitas

espécies de Penicillium são reconhecidas por produzirem metabólicos tóxicos, as micotoxinas

mais importantes encontradas em alimentos são ocratoxina A, pantulina, critinina e

citreoviridina (Pitt, 2002). Em muitas regiões tropicais e subtropicais, o clima permite a

produção agrícola durante o ano todo, porém, essas mesmas condições, alta umidade e ótimas

temperaturas também são propícias ao desenvolvimento de fungos. A deterioração de grãos

armazenados é um problema para a economia (Ribeiro et al., 2003). Doenças de pós-colheita

podem causar grandes perdas em diversos produtos agrícolas. A produção de frutos cítricos



geralmente é produzida em regiões subtropicais, muitas vezes distantes do mercado

consumidor, sendo inevitável o seu armazenamento e consequentemente o desenvolvimento

dos fungos (Yahyazadeh et al., 2008). Os fungos estão entre os principais fatores que podem

prejudicar a comercialização de frutas cítricas, perdas econômicas na produção de citrus

podem ser enormes. A indústria de citrus envolve uma grande quantidade de recursos

financeiros no mundo todo, existem diversos fatores que podem modificar a produção de

citrus, sendo a presença de fungos uma das mais importantes, em particular a presença de

fungos como Penicillium italicum e Penicillium digitatum (Gómez-Sanchis et al., 2012).

Numerosas espécies do gênero Penicillium apresentam um valor particular, as espécies

mais conhecidas nesse aspecto são Penicillium notatum, produtor do antibiótico – penicilina,

descoberta por Alexander Fleming em 1928-1929. Na indústria de alimentos destacam-se

Penicillium camemberti e Penicillium roqueforti, estes espécies estão relacionada com a

produção de determinados tipos de queijos (Chavez et al., 2006).

Bhat et al. (1989) encontraram oito endoglicanases em culturas de Penicillum

pinophtluma. Entretanto, Lee et al. (2010), estudando uma nova espécie, o Penicillium

purpurogenum, encontraram uma endoglicanase. Jorgensen et al. (2003) encontraram três

endoglicanases (EGa, EGb1 e EGb2) duas celobioidrolases (CBHa e CBHb) e uma xilanase

(XYL) em culturas do P. brasililianum.

31

2.4. Enzimas

São proteínas especiais que têm ação catalisadora e são produzidas pelas células,

estimulando ou desencadeando reações químicas importantíssimas para a vida, que

dificilmente se realizariam sem a presença delas. Esses biocatalisadores orgânicos são

produzidos pelas células, mas podem evidenciar a sua atividade intra ou extracelularmente. A

característica principal da ação enzimática sobre o organismo é sua especialidade. Cada tipo

de enzima atua sobre um composto ou substrato associado, cuja estrutura deve se encaixar à

enzima de modo que os centros ativos coincidam perfeitamente.



2.4.1. Celulases

O conjunto de enzimas envolvidas na degradação da celulose é denominado celulase,

elas são capazes de romper as ligações glicosídicas β-1,4, entre as unidades de glicose. A

maioria dos estudos sobre celulase refere-se a enzimas microbianas devido ao potencial de

converter material celulósico insolúvel em glicose. A celulase é oriunda de microrganismos,

animais e plantas e é formada por C1-celulase, C2-celobiase e exocelulase.

De acordo com Peixoto, (2006) as enzimas celulase podem ser divididas em:

1. Endo-β(1-4) glucanase ou β(1-4) D-glucano-4-glucanohidrolase ou Cxcelulase ou

CMCase: hidrolisa ligações β(1-4) ao acaso dentro da cadeia de celulose liberando glicose,

celobiose e celodextrinas.

2. Exo-β(1-4) glucanase ou Avicelase ou exo glucana-4-glucanohidrolase ou C1

celulase: hidrolisa as ligações glicosídicas da celulose a partir da extremidade não redutora

liberando celobiose;

3. Celobiase ou β(1-4) glicosidase: hidrolisa as ligações do tipo β(1-4) (celobiose,

trealose, gentiobiose) e libera glicose;

4. Exo-β(1-4) D-glucana-glicohidrolase: hidrolisa as ligações β(1-4) glicosídicas de

celodextrinas e libera glicose. A atividade diminui com a diminuição da cadeia do substrato.

A Figura 2.4 representa a ação das enzimas que degradam a celulose.

Figura 2.4 - Representação do sistema enzimático envolvido na degradação da celulose.

Fonte: Adaptado por Aron et al., 2005.



Na indústria alimentícia, as celulases são usadas em vários processos, principalmente

na extração de componentes do chá verde, proteína de soja, óleos essenciais, aromatizantes e

do amido da batata doce. Essas enzimas participam ainda dos processos de produção do

vinagre de laranja e do ágar e na extração e clarificação de sucos de frutas cítricas. Na

natureza existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, mas

apenas alguns são capazes de degradar a celulose natural.

A maioria das celulases microbianas comercialmente utilizadas é produzida pelas

espécies Trichoderma viridae, Aspergillus niger e Penicillum oxalicum. O potencial de

mercado destas enzimas tem sido estimado em cerca de 400 milhões de dólares por ano, com

crescente aplicação na produção e desenvolvimento de biocombustíveis e na biotecnologia

(Zang et al., 2006).

A celulase de origem fúngica é produzida quando o microrganismo é inoculado em

meios de culturas que contenham celulose, sefarose (polissacarídeo bastante utilizado na

produção de resinas para a purificação de proteínas), lactose ou celobiose como fonte de

carbono. A maior produtividade é obtida quando se utiliza a celulose na forma pura

(cristalina) ou complexada (Peixoto, 2006). Gao et al., (2008) citam a importância do

interesse nas celulases e suas aplicações industriais: extração de suco de frutas, indústria de

celulose e papel, indústria têxtil etc.

A Figura 2.5 esquematiza a estrutura da parede celular e seus principais componentes.

Figura 2.5 - Estrutura da parede celular de plantas. Fonte: IPPA, 2008.



Entretanto, um grande problema se apresenta referente ao custo de produção da

enzima. Na natureza esses microrganismos são bastante eficientes na degradação da celulose,

porém os seus extratos enzimáticos não são tão eficazes como in vitro. Desde modo é

necessário que haja um pré-tratamento da celulose usando ácido ou base, ou até mesmo

moendo, para que haja a destruição das porções cristalinas desse polímero. Assim, a produção

de celulases por meio da fermentação semi-sólida seria uma boa alternativa, já que os

microrganismos são bons produtores desta enzima.

2.4.1.1. Endoglucanases

São enzimas do complexo celulásico, responsáveis pela iniciação da hidrólise,

clivando as ligações glicosídicas da cadeia celulósica de forma randômica. Atuam no meio

das regiões amorfas, liberando oligossacarídeos de diferentes graus de polimerização,

produzindo novas cadeias terminais (Wood et al., 1989; Lynd et al., 2002).

A disposição do sítio ativo das endoglucanas facilita o ataque da enzima ao longo da

cadeia de celulose, permitindo uma redução no grau de polimerização. Isso ocorre devido à

maior exposição das ligações glicosídicas na região amorfa que são mais facilmente atacadas,

pois as interações de hidrogênio que ocorrem entre as cadeias são mais fracas (Pinto, 2006;

Schülein, 2000).

2.4.1.2. β-glucosidase

As β-glucosidases, também denominadas celobiases, possuem a função de hidrolisar a

celobiose gerada pelas celobiohidrolase e endoglucanases em glicose. Estas enzimas não são

consideradas como celulases legítimas, pois não atuam diretamente na cadeia celulósica,

apenas sobre o substrato solúvel. Porém sua presença é muito importante para a eficiência da

hidrólise da celulose, pois remove da mistura a celobiose formada (Medve, 1997; Miettinen-

Oinonen, 2007).

2.4.1.3. Exoglucanases

Atuam nas extremidades redutoras e não redutoras da cadeia de celulose e

oligossacarídeos. Algumas pesquisas mostram que a celobiohidrolase é responsável pela

ruptura física do substrato, acarretando a desestratificação das fibras através do aumento das

regiões intersticiais. Esse fenômeno transforma as regiões cristalinas em amorfas, tornando-as

mais suscetíveis à ação da celulase, aumentando a taxa de hidrólise (Lynd et al., 2002).



2.4.2. Pectinases

As pectinases são enzimas capazes de hidrolisar ligações glicosídicas do tipo α-1,4

entre as unidades de ácido galacturônico ou o do seu derivado metoxilado. As pectinases

formam um grupo de enzimas que degradam substâncias pécticas, hidrolisando ligações

glicosídicas ao longo da cadeia carbônica. Podem ser despolimerizantes ou desesterificantes e

são produzidas por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras (Figura 2.6) (Bobbio,

1989; Cheftel e Cheftel, 1976; Turquois et al., 1999).

Figura 2.6 - Estrutura primária de uma molécula de pectina. Fonte: Alkorta, et al.,1998.

As pectinas fazem parte de um grupo de substâncias denominadas de substâncias

pécticas, as quais também incluem o ácido péctico, ácido pectínico e protopectina,

apresentando-se como um polissacarídeo complexo de alta massa molecular (Campbell et al.,

1979).

As pectinases foram algumas das primeiras enzimas a serem utilizadas

comercialmente nas preparações de vinhos e sucos de frutas ao redor de 1930 e somente a

partir de 1960, quando os estudos sobre a natureza química de tecidos vegetais se tornaram

mais aparentes, é que os cientistas começaram a utilizar as enzimas mais eficientemente. As

pectinas são de grande interesse para indústria de alimentos. Essas substâncias estão sendo

utilizados na forma de pó, como ingrediente, devido a sua capacidade de atuar como agentes

geleificantes, principalmente na elaboração de geleias.

As pectinases são muito utilizadas nas indústrias de sucos de frutas para reduzir

viscosidade, melhorar e aumentar a eficiência de filtração e de clarificação no tratamento

preliminar da uva em indústrias vinícolas; na maceração, liquefação e extração de tecidos



vegetais; na fermentação de chá, café e cacau, para melhorar a extração de óleos vegetais, na

extração de polpa de tomate e no tratamento e degomagem de fibras naturais para as

indústrias têxteis e de papel. As pectinases também são utilizadas para reduzir o amargor

excessivo em cascas de citrus, restaurar o aroma perdido durante secagem e melhorar a

firmeza de pêssego e picles processados. A infusão de pectinase e β-glicosidase aumentam o

aroma e as substâncias voláteis de frutas e vegetais, aumenta a quantidade de agentes

antioxidantes em óleo de oliva extra virgem e reduz a indução ao ranço (Shen et al., 1999).

2.4.3. Xilanase

Xilanases são β-glucanases capazes de catalisar a hidrólise do xilano e que devido à

sua estrutura heterogênea demandam complexo xilanolítico para sua total degradação e não

apenas uma enzima. As xilanases são divididas em endoxilanases e as 1,4- β-xylosidases.

Dependendo de sua origem biológica, uma ou mais isoformas de endo – 1,4-β-xilosidase (1,4-

β-D-xilano-hidrolase) clivam o xilano randomicamente em suas ligações β-1,4 em pequenos

fragmentos como xilotriose e xilobiose. A β-xilosidase (β- D-xilosídeo-xilohidrolase)

hidrolisa xilobiose e pequenos xilo-oligossacarídeos em regiões não redutoras até xilose.

Endo-xilanases, os maiores componentes do sistema xilanolítico de microrganismos, têm sua

ação facilitada por enzimas acessórias que removem as ramificações da cadeia do xilano

como a α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, acetilxilano esterase e ácido felúrico

esterase, entre outras (Prade, 1995; Simão et al., 1997; Zanoelo et al., 2004; Polizeli et al.,

2005; Collins et al., 2005).

As enzimas xilanolíticas são produzidas por uma variedade de microrganismos, no

entanto os fungos são os produtores principais, secretando Xilanases que auxiliam no

branqueamento das xilanas. Atualmente, a produção de Xilanases em escala industrial é

dominada por espécies de Trichoderma e de Aspergillus (Haltrich et al., 1996; Phan et al.,

1998).

A importância das enzimas Xilanases está relacionada com seu potencial de aplicação

na indústria e sua eficiência nos processos de clareamento de polpa de papel, recuperação de

fibras celulósicas têxteis e bioconversão da biomassa em combustíveis e substâncias químicas

(Prade, 1995). Na panificação, por exemplo, as Xilanases são adicionadas ao pão para

aumentar o seu volume específico, determinando a textura do miolo e seu sabor final

(Camacho e Aguiar, 2003). Na fabricação de cerveja ocorre liberação de longas cadeias

arabinoxilanas, que aumentam a viscosidade podendo deixar a cerveja turva. As Xilanases



auxiliam na solubilização das arabinoxilanas a oligossacarídeos menores, diminuindo sua

viscosidade e conseqüentemente eliminando a turbidez da cerveja. A produção de etanol a

partir de pentoses como a xilose é uma maneira viável que vem sendo estudada (Rizzatti,

2004).

De acordo com Medeiros, (2007) foi possível verificar o potencial de Xilanases

presentes no filtrado de cultura e de xilanases purificadas de Penicillium chrysogenum no

processo de branqueamento de polpa celulósica de pseudo caule de bananeiras frutíferas.

Justificando o seu potencial para a produção da enzima Xilanase como descrito neste trabalho.

2.5. Fermentação Semi-Sólida

A fermentação semi-sólida (FSS) também chamada de fermentação sólida ou em

estado sólido vem se destacando nos estudos e avanços obtidos no aproveitamento de

resíduos. A FSS é um processo microbiano que se desenvolve na superfície de materiais

sólidos, que apresentam a propriedade de absorver ou de conter água, com ou sem nutrientes

solúveis. Estes materiais sólidos podem ser biodegradáveis ou não. Para a FSS, é necessário

que os microrganismos cresçam com nutrientes difusíveis sob ou sobre a interface líquido-

sólido, o substrato deve garantir as condições necessárias ao desenvolvimento dos mesmos,

para se evitar o gasto com pré-tratamentos severos, e com substâncias que venham a ser

adicionadas ao substrato por falta de algum elemento importante (mineral) ao crecimento do

microrganismo (Viniegra-Gonzalez, 1997).

Este tipo de fermentação se caracteriza por ser de dois tipos: uma, em que as

condições para o estado sólido são propiciadas pelo próprio substrato, representado na Figura

(2.7). Na outra FSS, o desenvolvimento do processo se dá utilizando um suporte inerte

(Couto; Sanromán, 2005; Moraes et al., 2001).



Figura 2.7 - Fermentação semi-sólida em frascos Erlenmeyer em BOD. Fonte: Autor.

A aplicação comercial da FSS pode ser dividida em dois tipos (Mitchell et al., 2002):

a) Aplicações sócio-econômicas, tais como: a compostagem de resíduos, valorização

de produtos lignocelulósicos e fibras alimentares;

b) Aplicações economicamente lucrativas, tais como: a produção de enzimas, ácidos

orgânicos e alimentos fermentados.

A FSS apresenta diversas vantagens devido a suas características físicas e químicas,

especialmente sua reduzida atividade de água. A FSS difere bastante da Fermentação

Submersa (FSm), relativamente à esporulação e produção de enzimas, assim como de

metabólitos secundários, bem como no modo de mistura e difusão. É um processo que

favorece do reduzido teor de água, gerando um processo industrial limpo, com baixos níveis

de água residual, economizando energia no processo de recuperação (“downstream”)

(Viniegra-Gonzalez, 1997).

De acordo com alguns grupos de pesquisadores, o uso da FSm era melhor, pois,

acreditava-se ser ela mais conveniente e mais produtiva. Nos últimos cinquenta anos esses

grupos cresceram mais e mais e a FSS foi sendo esquecida. Foi uma decisão mais ou menos

arbitrária, pois não levou em conta o conhecimento científico dominado nos dois processos,

nem se fez qualquer tipo de comparação efetiva. As razões foram provavelmente a maior

facilidade para conduzir o processo de FSm, a monitoração e o controle (Smail et al., 1995).



2.5.1. Vantagens da FSS

De acordo com os autores Bramorski (1997) e Lu, Maddox e Brooks (1998) algumas

vantagens da FSS em relação a FSm :

• O meio é geralmente simples, constituído de produtos agrícolas não refinados que

podem conter todos os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo. Isto

significa que o pré–tratamento pode ser simplesmente um cozimento, com água para

umidificar ou dilatar o substrato, ou a quebra do substrato na superfície para aumentar a

acessibilidade aos nutrientes internos ou a moagem de grandes partículas de substrato para

partículas menores;

• O tratamento de efluentes e disposição de resíduos é geralmente simples ou

minimizado. Geralmente todo o produto é utilizado, principalmente se é intencionado ao uso

como suplementação alimentar de animais;

• O custo de esterilização é reduzido, pois se aquece menos água;

• O espaço ocupado pelo equipamento de fermentação é pequeno, considerando-se o

rendimento do produto. Utiliza-se menor quantidade de água e o substrato é concentrado;

• Como a maioria das bactérias requer altos níveis de mistura líquida, a FSS exclui, ou

reduz, sensivelmente, o problema da contaminação bacteriana;

• O meio é facilmente aerado, desde que haja espaço entre as partículas do substrato;

• A solubilidade e difusão de oxigênio e outros gases, são maiores na FSS;

• O resíduo remanescente possui um volume reduzido e este resíduo não apresenta

condições para o desenvolvimento de patógenos;

• Geralmente, o único componente necessário a ser adicionado ao meio é água,

embora, ocasionalmente, outros nutrientes como fonte de nitrogênio ou minerais possam ser

adicionados;

• Torna-se possível a obtenção de esporos que são impossíveis de se obter em cultura

submersa;



• Menor custo dos equipamentos;

• Exige menor demanda de energia.

2.5.2. Desvantagens da FSS

• Os tipos de microrganismos que podem ser usados são limitados, em função das

condições do processo, tais como: baixa concentração de água livre.

• Em operações de grande escala, o calor gerado pelo metabolismo microbiano deve

ser removido, o que se torna mais difícil na FSS que no processo submerso;

• A transferência de oxigênio entre as partículas do meio pode se tornar um problema,

quando se utiliza granulometria do substrato muito elevado;

• Medidas de pH, O2, CO2 e cálculo de rendimento de produto são mais complexos;

• Controle de temperatura é crítico e, muitas vezes, é necessário controlar a

composição da atmosfera no que diz respeito a O2, CO2 e outros metabólitos voláteis;

• A mistura dificulta o controle de crescimento microbiano e de variáveis como

agitação, aeração e concentração de nutrientes e produtos.

2.5.3. Parâmetros que influenciam a produção enzimática por FSS

2.5.3.1. Umidade

A umidade do meio de cultivo é um dos principais parâmetros que influencia a

fermentação em estado sólido. O tipo de substrato, o microrganismo utilizado e o produto

final desejado são os principais fatores que determinam o teor de umidade que o substrato

deverá ser presente.

O substrato com a umidade adequada deverá apresentar condições para que haja

transferência de nutrientes e de oxigênio. No entanto, as partículas devem apresentar aberturas

que facilitam a passagem de gases e do calor. Portanto um alto teor de umidade acabaria

prejudicando a porosidade do meio, e assim diminuiria as trocas dos gases e aumentaria a



tempetatura interna do meio. Entretanto, se a umidade for muito baixa irá prejudicar o

crescimento do microrganismo, portanto irá influenciar no produto final em interesse. A

umidade na fermentação sólida pode variar de 18 a 85%, variando em função da capacidade

de absorção do meio de cultivo utilizado (Del Bianchi et al., 2001, citados por Lima, et al.,

2001).

2.5.3.2. Temperatura

O crescimento microbiano gera calor que deve ser dissipado, pois altas temperaturas

prejudicam o crescimento dos microrganismos. Um dos problemas da FES é a remoção do

calor. O uso da refrigeração mostra-se inadequado para dissipar o calor metabólico (Hasan,

2002). Para que haja um controle do calor, pode-se injetar ar comprimido, controlar a

temperatura do equipamento (Schmidell et al., 2001).

2.5.3.3. pH

O controle do pH durante a FES é muito difícil de ser realizado devido à

heterogeneidade e consistência do material. Uma maneira de controlar a variação do pH é a

utilização de substratos com boa capacidade tamponante ou adição de soluções-tampão

durante a etapa de umidificação do substrato (Schmidell et al., 2001).

2.5.3.4. Tamanho da partícula

O tamanho da partícula é requisito muito importante, pois está diretamente associado

as trocas gasosas, ao crescimento do microrganismo e a disponibilidade de recursos para o

consumo do microrganismo. Por tanto, é importante a escolha do tamanho das partículas, por

que partículas pequenas oferecem uma maior área de contato, o que é importante para o

crescimento do microrganismo, porém partículas muito pequenas acabam se aglomerando,

dificultando assim a respiração e aeração do meio fermentativo, ocasionando um baixo

crescimento do microrganismo. No entanto, partículas maiores favorecem uma melhor

respiração e aeração, porém limita o crescimento do microrganismo. Assim é importante

determinar o tamanho adequado de partícula para satisfazer a condição respiração/aeração e o

crescimento microbiano (Hasan, 2002).



2.5.3.5. Concentração inicial do inóculo

Sandhya et al., (2005) afirmaram que o tamanho do inóculo é um importante fator

biológico, o qual determinará a biomassa produzida pela fermentação. Portanto, uma

quantidade adequada de concentração de inóculo, em relação à quantidade de substrato

utilizado, é necessária para garantir a fermentação do meio, suprir a necessidade e não esgotar

os nutrientes necessários para o desenvolvimento microbiano.

CAPÍTULO III

MATERIAL E MÉTODOS

Capítulo 3 - Material e Métodos


3. Material e Métodos

3.1. Bagaço de coco

A casca e o mesocarpo fibroso foram utilizados para a obtenção do bagaço da casca de

coco verde. A coleta foi feita em um quiosque na praia de Ponta Negra- Natal (RN). Após a

seleção dos cocos, as etapas do processo foram à dilaceração do material com facão, lavagem,

secagem, moagem e armazenamento. A desidratação dos resíduos da casca de coco foi

realizada em secador do tipo bandeja a 70 °C por cinco dias, e moído em triturador (moinho

tipo Willye, TE – 680, marca: Tecnal), sendo em seguida classificados em peneira de 20

mesh, diâmetro de abertura de 0,850 mm e, posteriormente, armazenados em sacos plásticos à

temperatura ambiente.

3.2. Pedúnculo de caju

O resíduo do caju foi lavado e esmagado para a retirada da polpa, foi obtido a partir do

pedúnculo de caju adquirido de uma empresa produtora de castanhas CIONE, localizada na

cidade de Fortaleza-CE. Os frutos estavam maduros e apresentavam coloração vermelha. Os

cajus foram lavados em água corrente, o pedúnculo limpo foi triturado e peneirado para

separação do suco. O material fibroso foi lavado 15 vezes com 3 L de água a cada lavagem

para a retirada dos açúcares (Fawole e Odunfa, 2003). O bagaço úmido foi disposto em

bandejas de polietileno e levados a estufa com circulação de ar a temperatura de 70 ºC por um

período de 48 horas. Após o término da secagem o resíduo foi peneirado para a separação das

partículas maiores.

Os dois resíduos secos e com a granolumetria padronizadas foram usados para a

caracterização físico-química e como meio para o crescimento dos microrganismos na

fermentação semi sólida. Na Figura 3.1 estão respresentados o bagaço do coco verde e o

pedúnculo do caju, respectivamente.



(a) (b)

Figura 3.1 - Representação dos resíduos utilizados como substratos: (a) bagaço do coco e (b)

pedúnculo de caju.

3.3. Caracterização química e físico-química do bagaço de coco verde e do

pedúnculo de caju

3.3.1. Determinação de sólidos totais

A metodologia aplicada é da NREL - Determination of Total Solids in Biomass (Sluiter

et al., 2008). Em um béquer de 100 mL, previamente tarado, foi pesads cerca de 3 gramas de

bagaço. O béquer foilevado para estufa 105 °C por 24 horas. Após esse período, o material

então foi colocado em dessecador para efetuar uma nova pesagem. A umidade foi

determinada em triplicata e calculada conforme a Equação (3.1).

(

) (3.1)

Sendo:

% U = percentual de umidade

Mseca = massa seca obtida pela diferença entre o peso do conjunto depois da estufa e o peso do

béquer.

Múmida = massa úmida obtida pela diferença entre o peso do conjunto antes de ser levado para

estufa e o peso do béquer.



3.3.2. Determinação de extrativos

Para a determinação de extrativos método adaptado de NREL - Determination of

Extractives in Biomass (Sluiter et al., 2008), foram pesados 3 g de bagaço, que foram

submetidos a um tratamento em um aparelho de Soxhlet, utilizando três reagentes e água por

último em temperaturas diferentes durante 24 horas. Os reagentes utilizados foram o

Diclorometano (50 °C), Etanol/Tolueno (1:2 V/V, 120 °C), Etanol 95% (80 °C) e Água (120

°C).

Ao final do processo extrativo, o cartucho com o material seco foi colocado em estufa

à 100 °C até peso constante. A percentagem de extrativos foi calculada com base na diferença

de massa, conforme a Equação (3.2).

Sendo:

%Ext: percentual de extrativos

Mi: massa seca não extraída

Mf: massa seca extraída

3.3.3. Determinação de polissacarídeos

3.3.3.1. Hidrólise com H2SO4 (72%)

A determinação dos polissacarídeos foi empregado o método da NREL- Determination

of Structural Carbohydrates and Lignin Biomass (Crocker et al., 2008). Uma amostra de

aproximadamente de 2 g (base seca) foi transferida para um béquer de 100 mL e tratada com

13 mL de H2SO4 72%, sob vigorosa agitação, por 7 minutos em um banho com controle de

temperatura a 45,0 ± 0,5 °C.

(3.2)



A reação foi interrompida com a adição de 50 mL de água destilada, sendo a mistura

reacional transferida para frascos Erlenmeyers de 500 mL, onde se completou o volume de

água adicionando-se 275 mL. O Erlenmeyer foi fechado e autoclavado por 15 minutos a 1,05

atm. O frasco foi então retirado e resfriado até a temperatura ambiente. O material hidrolisado

foi separado dos sólidos por filtração, utilizando-se papel de filtro seco e tarado. O hidrolisado

foi recolhido em um balão volumétrico de 500 mL e o sólido contido no papel de filtro foi

lavado com porções de 50 mL de água destilada até atingir o volume do balão.

3.4. Determinação de lignina

3.4.1. Lignina insolúvel

O material retido no papel de filtro, após a hidrólise ácida, que corresponde à lignina

insolúvel e inorgânica, foi submetido a uma lavagem com água destilada até isenção de

sulfatos (aproximadamente 1500 mL) e seco em estufa à 50 °C. Por diferença de massa, foi

determinado o teor de lignina insolúvel e inorgânico (cinzas). Para se obter o teor de lignina

insolúvel real foi necessário se determinar as cinzas do material retido no papel de filtro.

3.4.2. Teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais

Após a determinação da lignina insolúvel em meio ácido, o resíduo no papel de filtro

foi transferido para um cadinho de porcelana previamente tarado. A amostra foi calcinada

lentamente até 300 °C, em seguida, por mais duas horas à 800 °C, em mufla.

Para a determinação das cinzas totais segui a metodologia proposta em NREL -

Determination of Ash in Biomass (Templeton et al., 2008), foi pesado aproximadamente 2 g

do bagaço em cadinho de porcelana previamente tarado. O material foi digerido em mufla à

300 °C e calcinado à 800 °C por duas horas. Por diferença de peso de massa, o teor de cinzas

da lignina insolúvel e das cinzas totais foi determinado de acordo com a Equação (3.3).

(3.3)



Sendo:

% cinzas = porcentual em massa de cinzas

Mc = massa de cinzas (diferença entre massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho

vazio)

Ma = massa da amostra seca (base seca)

3.4.3. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE)

A determinação dos teores de celulose e de hemicelulose depende das concentrações

de carboidratos e de ácidos orgânicos presentes no hidrolisado. Fatores de conversão são

usados para converter as massas destes compostos em massas de celulose e hemicelulose

(Tabela 3.1). Estes fatores se baseiam na estequiometria de conversão dos componentes em

suas moléculas percursoras: celulose ou hemicelulose.

A análise dos carboidratos e ácidos orgânicos foi realizada por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência (CLAE) utilizando a coluna Shim-Pack SCRH-101H (Shimadzu Co. Japan)

com detector de índice de refração- IR a uma temperatura de 65 °C, e uma solução de ácido

sulfúrico 0,005 M utilizada como fase móvel sob fluxo de 0,6 mL/min.

Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os valores de cada componente presente no extrato

hidrolisado.

Componente Fator de conversão

Celobiose 0,95

Glicose 0,9

Xilose 0,88

Arabinose 0,88

Ácido Acético 0,72

HMF 1,29

Furfural 1,37



O volume de injeção na coluna foi de 20 µL. As amostras foram previamente filtradas

em membranas de 0,22 µm, para remoção de possíveis partículas insolúveis. As

concentrações de cada componente foram obtidas através de curvas de calibração que

correlacionam as concentrações dos padrões preparados com as respectivas áreas dos

cromatogramas.

3.5. Determinação da pectina

Os métodos de determinação de pectinas se baseiam na extração por água quente

seguida por precipitação com álcool e, após a purificação, pesagem na forma de pectato de

cálcio ou ácido livre.

Foram pesados 20 g da amostra em um béquer de 1000 mL, adicionando-se 400 mL de

solução de HCl 0,05 N levando-se para aquecimento por duas horas a 80-90 °C, recolocando-

se água quando necessário. Após este período a suspensão foi resfriada até temperatura

ambiente e, então, foi transferida para uma proveta de 500 mL completando-se o volume com

água destilada. A solução foi filtrada com auxílio de algodão.

Do extrato filtrado foi medido 200 mL em uma proveta que foi transferido para um

béquer de 1000 mL, acrescentando-se 250 mL de água destilada. A solução foi neutralizada

com NaOH 1 N, usando papel indicador de pH. Após a neutralização, foi adicionado 10 mL

de NaOH 1 N em excesso, com agitação constante. Essa solução ficou em repouso por uma

noite (overnight). No dia seguinte, foi adicionado 50 mL de ácido acético (1 N) e após 5

minutos foram acrescentados 25 mL de solução de CaCl2 (1 N), com agitação. A solução foi

colocada em ebulição por 2 minutos e depois deixou-se em repouso por 3 horas. Logo em

seguida, a mesma foi filtrada com papel de filtro devidamente tarado. O precipitado foi então

lavado com água destilada fervendo, usando-se nitrato de prata para verificar a presença de

cloretos. O papel de filtro contendo o pectato de cálcio foi colocado na estufa a 105 °C até

peso constante (Rangana, 1979). A pectina foi expressa em % de pectato de cálcio através da

Equação (3.4).

( ) ( )

(3.4)



3.6. Determinação dos minerais

Após a determinação do teor de cinzas, os mesmo foram solubilizados com ácido

nítrico (10%) e submetidos às análises por Espectrometria de Emissão Ótica em Plasma

Indutivamente Acoplado (ICP/OES)-(Tabelas 3.2 e 3.3). Para a determinação dos minerais

presentes na constituição dos resíduos.

Tabela 3.2 - Condições instrumentais utilizadas no ICP/OES.

Parâmetros Condições

Potencial do plasma 1150 W

Gás refrigerante 4mL/min

Gás auxiliar 0,5 mL/min

Visão Axial

Nebulizador MiraMist

Pressão de nebulizador 0,16 μPa

Tabela 3.3 - Parâmetros para a identificação dos minerais.

Elemento λ (nm) *(LD) **(LQ) Método

Ca 422,673 0,3333 1 USEPA 6010C

Cu 324,754 0,01 0,03 USEPA 6010C

Fe 259,94 0,01 0,03 USEPA 6010C

P 178,29 0,01 0,03 USEPA 6010C

Mg 383,826 0,3333 1 USEPA 6010C

Mn 293,93 0,01 0,03 USEPA 6010C

K 766,491 0,3333 1 USEPA 6010C

Na 588,995 0,3333 1 USEPA 6010C

Zn 213,856 0,01 0,03 USEPA 6010C

*LD-Limite de detecção

**LQ-Limite de quantificação.



3.7. Microrganismos

Um dos agentes de fermentação que foi usado é uma linhagem do fungo filamentoso

Penicilllium chrysogenum (807) da coleção ARS Culture Collection – BFPM Research Unit,

National Center for Agriculture Utilization Research e um fungo isolado casca do coco.

3.8. Isolamento de uma linhagem fúngica produtora de celulase

Um fungo produtor de celulases foi isolado da casca de coco. A linhagem foi

inoculada em frascos Erlenmeyer contendo caldo batata-dextrose e incubadas à 30 °C em

Incubadora Refrigerada com Agitação orbital a 200 rpm (TE-421, TECNAL). Após 48 horas,

as cepas foram transferidas para placas de Petri contendo ágar celulose com a seguinte

composição: 0,5 g/L de MgSO4 (sulfato de magnésio); 0,5 g/L de KCl (cloreto de potássio);

3,0 g/L de NaNO3 (nitrato de sódio); 0,01 g/L de FeSO4.7H2O (sulfato de ferro); 1,0 g/L de

K2HPO4 (fosfato de potássio); 15 g/L de ágar-ágar; 5,0 g/L de celulose microcristalina. As

placas foram incubadas à 30 °C por 120 horas (Braga et al., 2009). As colônias que

apresentaram halo foram selecionadas como produtoras de celulases.

3.8.1. Identificação da linhagem fúngica produtora de celulase

O microrganismo foi identificada no laboratório BIOTRENDS, localizado em

Fortaleza. O microrganismo foi cultivado em placas de Petri contendo o meio Ágar Batata

durante 5 dias à 30 °C para ativação e validação de pureza. A cultura foi crescida em meio

Caldo Batata por 24 h e utilizada na extração de DNA com o detergente catiônico CTAB

(brometo de cetil-trimetilamônio), baseado no protocolo descrito por Warner, (1996). Após

quantificação e avaliação de pureza, o DNA genômico foi utilizado nas reações de PCR para

amplificação da região compreendendo o espaço Interno Transcrito (ITS1), o gene 5,8S e o

espaço Interno Transcrito (ITS2) utilizando os iniciadores ITS1 (5’-CTT GGT CAT TTA

GAG GAA GTA A-3’) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3’) (White et al.,

1990). Os produtos de PCR após serem analisados por eletroforese em gel de agarose foram

purificados, quantificados e utilizados nas reações de sequenciamento. Foram realizadas 2



reações de sequenciamento utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4. As duas sequências obtidas

foram de ótima qualidade e após alinhamento foi possível obter uma sequência consenso com

tamanho de 610 pb.

3.8.2. Meio para Triagem em placa de Petri

O fungo foi cultivado em meio sintético contendo AVICEL (Fluka Biochemika, Suiça)

como única fonte de carbono. A composição do meio é mostrada na Tabela 3.4. Este meio foi

esterilizado a 1 atm por 20 min.

Tabela 3.4 - Composição do meio de triagem em placas de Petri.

3.9. Ativação do inóculo

Após ser retirado da ampola na qual estava armazenado,o microrganismo Penicillium

chrysogenum foi inoculado em placas contendo agar batata dextrose (BDA) que foram

incubadas a ± 28 °C por 7 dias sendo, em seguida, realizados repiques em novas placas com a

mesma constituição. Os esporos foram retirados das placas adicionando-se 2 mL de água

esterilizada. Deste modo, eles eram usados na etapa de ativação e utilizados para o primeiro

repique em meio BDA em placas de Petri durante 5 dias à 30 ºC, bem como para a realização

do segundo repique para a produção do inóculo da fermentação.

Os esporos do segundo repique foram utilizados para obtenção de grande quantidade

de esporos no meio de sabugo de milho. Cada repique podia ser mantido sob refrigeração por

um período de quatro meses. (Couri; Farias, 1995)

Componentes Concentração (g/L)

NaNO3 3,0

K3PO4 1,0

MgSO4 0,5

KCl 0,5

FeSO4.7H2O 0,01

Agar 20,0

Avicel 5,0



Para cada Erlenmeyer de 125 mL foram pesados 4,6 g de sabugo de milho seco e

moído e adicionado 6 mL da solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas

ao sabugo. A fim de preparar a solução umidificante, foi preparada 100 mL de solução de

fosfato de potássio monobásico 200 g/L (solução A), 100 mL de solução B contendo 3,96 g

de sulfato de zinco heptahidratado e 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado e 50 mL de

solução 56 g/L de peptona. As soluções foram autoclavadas (20 min à 121 °C) e,

posteriormente, 0,19 mL da solução A e 0,025 mL da solução B foram adicionadas às 50 mL

da solução peptonada. Para inoculação do meio de sabugo de milho foram transferidos 1 mL

de uma solução 0,2% (v/v) de Tween 80 para tubos com os microrganismos de segundo

repique. Com auxílio de uma alça de platina os microrganismos foram suspensos e transferiu-

se 1 mL para cada frasco com o sabugo. Os frascos foram agitados e incubados em estufa à 30

ºC por um período de 5 dias. Após este período os frascos foram armazenados sob

refrigeração e utilizados como inóculo nos ensaios de fermentação.

3.9.1. Obtenção da solução de esporos e preparo do inóculo

No processo fermentativo, houve a padronização da quantidade de esporos inoculados,

tudo para que não houvesse diferença a mais ou a menos no crescimento do microrganismo e

para que as atividades enzimáticas não ficassem tão diferentes.

O repique do fungo foi feito em câmara de fluxo laminar, sendo que a obtenção do

inóculo para a FES foi realizada através da propagação dos esporos da cepa de Penicillium

chrysogenum e do fungo isolado, utilizando meio de cultura com Agar-agar e PDA (Potato

Dextrose Agar) em Erlenmeyers de 125 mL autoclavados. Antes de inocular os esporos, 6

mL de uma solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas ao sabugo. A fim

de preparar a solução umidificante, foi preparada 100 mL de solução de fosfato de potássio

monobásico 200 g/L (solução A), 100 mL de solução B contendo 3,96 g de sulfato de zinco

heptahidratado e 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado e 50 mL de solução 56 g/L de

peptona. As soluções foram autoclavadas (20 min à 121 °C) e, posteriormente, 0,19 L da

solução A e 0,025 mL da solução B foram adicionadas às 50 mL da solução peptonada.

A inoculação do microrganismo ocorreu com a transferência de 1 mL de solução

Tween 80 a 0,2% (p/v) para as placas contendo o fungo. Com o auxílio de uma ponteira,

raspou-se a superfície do meio com o objetivo de descolar os esporos aderidos ao meio BDA.

Coletou-se 1 mL da solução de Tween contendo esporos e transferiu-se para o meio com



sabugo, tomando-se o cuidado de distribuí-lo bem por todo o substrato e foram incubado no

DBO à 30 °C por cinco dias.

Após esse período foi obtida a solução de esporos, pela adição de solução com Tween

80 a 0,2% (p/v) sob agitação. A contagem dos esporos foi realizada em câmara de Neubauer,

com auxilio do microscópio binocular (modelo BX 51, OLYMPUS). A concentração de

esporos utilizada como inóculo foi de 1×106 esporos/g de meio sólido (Coelho et al.,2001).

Após realizar as contagens, a quantidade de esporos por mL foi calculada. A

quantidade média de esporos foi dividida por 2 para representar um dos lados da câmara e

multiplicada pelo fator 10.000. Esse fator corresponde a transformação do volume de 0,1 μL

por lado da câmara para se determinar o número de esporos presentes por mL de suspensão,

como representado na Equação (3.5).

( ) (3.5)

3.10. Processo de Fermentação

As fermentações foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL de volume contendo 5 g

de material composto por bagaço de coco quando o microrganismo utilizado foi o Penicillium

chrysogenum e o fungo isolado, houve fermentação com uso de metade de bagaço de coco e

metade com resíduo de caju, ou seja, 2,5 g de bagaço de coco com 2,5 g de bagaço de caju,

apenas o Penicillium chrysogenum foi utilizado nessa fermentação e autoclavados a 1,0 atm

(121 ºC) durante 15 min.

3.10.1. Condições da Fermentação

Foram pesados 5 g do substrato em base seca adicionados 5 mL do inóculo com uma

concentração de 1,0 x 106 esporos/mL (Coelho et al.,2001) e uma quantidade da solução

salina nutriente (0,1%, nitrato de amônio 0,1% e sulfato de magnésio heptahidratado 0,1%

(p/v), com pH corrigido para 3, 5 e 7 com ácido clorídrico 3 M e hidróxido de sódio 0,1 M)



que variava de acordo com a umidade desejada (66, 70,5 e 75%), onde os volumes variados

foram de 5, 7 e 10 mL respectivamente. As fermentações ocorreram em frascos do tipo

Erlenmeyer de 250 mL, essas medições foram de acordo com o planejamento experimental.

Os frascos foram esterilizados e então os microrganismos inoculados e incubados em BOD à

30 °C. Após 120 horas de fermentação foi realizada a etapa de extração do complexo

enzimático.

3.11. Cinética da Fermentação

Tendo em vista as condições estabelecidas nas fermentações preliminares, realizadas

de acordo com o planejamento experimental, foi acompanhada a cinética de produção

enzimática por um período de 10 dias à temperatura ambiente de 30 ± 2 ºC em BOD, sendo

realizadas amostragens a cada 24 horas. As amostras foram analisadas determinando-se as

atividades de Celulases, Xilanase, açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose

residual.

.

3.12. Extração das enzimas

A extração das enzimas ao término da fermentação foi realizada com adição de 4 mL

de solução tampão acetato 200 mM (pH 4,5) por grama de bagaço utilizado no processo

fermentativo, ou seja 20 mL no total, agitando-se manualmente com um bastão de vidro

durante 1 hora em banho-maria à 30 °C. A separação de células e do caldo contendo as

enzimas foi realizada por filtração com papel de filtro, o material filtrado foi centrifugado em

seguida por 20 minutos a 3500 rpm à 4 °C. O sobrenadante foi recuperado e armazenado a -

18 ºC para posterior análise das atividades enzimáticas. Todos os ensaios foram realizados em

duplicata.



3.13. Determinação da enzima Celulase

3.13.1. Determinação da atividade CMCase (Endo-1,4-β-Dglucanase)

A atividade celulolítica da endoglucanase (Endo-1,4-β-Dglucanase) foi determinada

pelo método da carboximetilcelulose (CMC) de acordo com a metodologia adaptada de Ghose

(1987). Uma solução de carboximetilcelulose (CMC) 4% (p/v) era preparada em tampão

citrato de sódio 50 mM (pH 4,8). Uma alíquota de 0,5 mL desta solução foi adicionada em

tubo de ensaio e levada a banho termostático à 50 °C por 1 minuto para equilibrar a

temperatura. O mesmo volume (0,5 mL) de solução enzimática foi adicionado e a mistura foi

incubada no banho-maria à 50 °C por 10 minutos. A solução final foi analisada pelo método

do DNS, usando a solução de CMC (4%) como branco. Determinou-se o teor de açúcar na

solução enzimática antes da reação realizando-se, para tanto, a mesma diluição com tampão

citrato de sódio 50 mM pH 4,8 que foi realizado na mistura reacional com a solução de CMC.

Sendo a atividade enzimática expressa em U.mL⁻¹.

A atividade enzimática foi expressa em UI (μmol de produto liberado/minuto),

conforme Equação (3.6).

(

) ( )

( )

* Apenas se for necessário diluir o sobrenadante (solução de enzima)

** Fator obtido da curva padrão

A concentração da enzima foi expressa por UI/mL, conforme as Equação (3.7) e (3.8).

(

) ( )

( )

(3.6)

(3.7)



* Apenas se for necessário diluir o sobrenadante (solução de enzima)

** Fator obtido da curva padrão

3.14. Determinação da atividade FPase

A quantificação da atividade FPásica foi realizada em papel de filtro de acordo com a

metodologia adaptada de Ghose (1987). O substrato utilizado foi o papel de filtro Whatman

N°. 1 cortado em tiras de 1,0 x 6,0 cm. O substrato foi colocado em tubos de ensaio e

adicionado 2,0 mL de 0,05 mol.L-1

de tampão citrato pH 4,8 e 1 mL do extrato enzimático

(diluído quando necessário) e incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à 50 ºC

por 60 minutos. A reação foi interrompida pela retirada de 1 mL da mistura e adicionada a

tubos de ensaio contendo 1,0 mL de DNS, terminando a reação de formação de açúcares. A

determinação dos mesmos foi feita segundo metodologia adapatada de Miller (1959). Uma

unidade de atividade em papel de filtro (FPU) corresponde a 1 mol de açúcares redutores,

expresso como glicose, liberados por minuto. Como representado nas equações 3.7 e 3.8.

3.15. Determinação da atividade da β –glicosidase

Em pequenos tubos de ensaio foi adicionado 1,0 mL do caldo contendo enzima,

diluída em tampão citrato de sódio pH 4,8 à 50 ºC, adicionando-se 1,0 mL da solução do

substrato celobiose, misturando-se e depois incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI

1232) à 50 °C por 30 minutos. A reação foi interrompida pela imersão do tubo em água

fervente por 5 minutos. Transferiu-se o tubo para um banho em água fria e determinou-se a

glicose produzida usando um kit baseado na reação de glicose oxidase-peroxidase (GOD-

POD). Foi adicionado 1,0 mL do sobrenadante (diluído se necessário) em tubos já contendo

1mL de tampão citrato de sódio. Pipetou-se 10 µL da mistura em um tubo contendo 1 mL do

reagente GOD-POD. Realizando-se a determinação da glicose. O branco para zerar o

espectrofotômetro (Termo Spectonic, Genesys 10 uv), era constituído de 1mL do reagente

GOD-POD.

(3.8)



A partir da concentração de glicose foi determinada a atividade enzimática (UI/mL).

Uma unidade de atividade β-glucosidásica (UI) foi definida como a quantidade de enzima que

catalisa a liberação de 1 μmol de glicose por minuto,medida por espectrofotometria (leitura a

505 nm) sob as condições de ensaio padrão.

3.16. Determinação da atividade da Xilanase

A atividade da Xilanase foi determinada pela liberação da quantidade de açúcar

redutor de uma solução a Xilana (1%) (Sigma) preparada em solução tampão citrato de sódio

0,05 mol.L-1

, pH 5,0, à 50 ºC. A mistura reacional consistiu de 2 mL de uma solução de

xilana, aclimatada por 10 minutos na temperatura da reação e 1 mL do complexo enzimático,

previamente diluído segundo a necessidade. A reação processou-se em tubos incubados a 50

ºC por 30 minutos em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232). A reação foi interrompida

pela retirada de 1 mL da mistura que foi adicionada a tubos de ensaio contendo 1 mL de DNS,

parando a reação de enzimática. A quantidade de açúcar redutor liberado foi determinada pelo

método de DNS (Miller, 1959). Uma unidade (UI) de atividade enzimática correspondeu a

1μmol de xilose liberada por minuto medida por espectrofotometria (leitura a 540 nm) nas

condições de ensaio.

3.17. Determinação da atividade da Avicelase

Em tubos de ensaio, adicionou-se 1mL da solução de Avicel 101 (1%). O volume final

do ensaio podia variar, no entanto, mante-se uma proporção de 1:1 entre as quantidades de

sobrenadante e solução de substrato (AVC), em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à

50 °C sob agitação por 1 minuto para equilibrar a temperatura. Adicionou-se 1mL do

sobrenadante (solução de enzima) diluindo-se quando necessário, que foi incubado em banho-

maria à 50 °C por 2 horas, em seguida centrifugando-se os tubos por 5 minutos em centrífuga

(Centrifuge 5804 R, EPPENDORF), retirando-se da amostra 0,5 mL e adicionando-se 2,5 mL

de DNS. A determinação de açúcares redutores foi realizadopelo método do DNS. O branco

foi feito para zerar o espectrofotômetro. Adicionando-se 0,5 mL de AVC (1%) e 2,5 mL de

reagente DNS. O tempo zero foi feito para determinar a concentração de açúcares redutores

no sobrenadante, antes da ação da enzima no AVC (1%). Transferiu-se 0,5 mL do

sobrenadante para tubos de ensaios contendo 0,5 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH



5,0. Agitou-se e transferiu 0,5 mL da solução obtida para tubos contendo 2,5 mL de reagente

DNS. Realizou-se a determinação de açúcares redutores.

3.18. Determinação da atividade da Pectinase

A metodologia para determinação da atividade da pectinase foi a mesma descrita por

Rodríquez –Fernández (2007).

Em tubos de ensaio foram adicionados 0,9 mL da solução pectina 0,5% em tampão

citrato 0,1 M para pH 4, incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à 50 ºC

durante 5 min. Adicionar 0,1 mL do extrato contendo a enzima. Agitando-se imediatamente

os tubos. A reação foi incubada à 50 ºC durante 15 min adicionou 2,5 mL de DNS e

imediatamente agitou-se. Os tubos de ensaio foram colocados em um banho-maria com água

fervendo durante 5 minutos, após os 5 minutos os tubos foram resfriados até temperatura

ambiente e adicionados 2,5 mL de água destilada em cada tubo de ensaio. As amostras foram

lidas em espectrofotômetro (Termo Spectonic, Genesys 10 uv) utilizando o comprimento de

onda 540 nm.

A unidade de atividade foi determinada com a quantidade de ácido galacturônico

liberado por mililitro por minuto (mmolmL-1

min-1

) nas condições estabelecidas.

Para o cálculo da atividade enzimática, os açúcares liberados pela reação enzimática

foram determinados utilizando o método do ácido dinitrosalicílico (Miller,1959). As amostras

foram lidas no espectrofotômetro (540 nm).

Uma curva padrão do ácido galacturônico 0,001%, foi construída tomando volumes

diferentes da solução de ácido galacturônico (0,2 - 0,8 mL) e completando-se o volume com

água destilada até 1 mL. O branco foi feito adicionando-se 1mL de água destilada num tubo

de ensaio. Foi adicionado 2,5 mL do reativo DNS em cada tubo de ensaio. Um gráfico de

D.O. (densidade óptica) versus concentração (concentração do ácido galacturônico) foi

também obtido o coeficiente angular (m) e o intercepto da reta (n), onde foram calculados por

mínimos quadrados, e considerados na equação (3.9).



A atividade da pectinase será calculada pela Equação (3.9).

( ) (

) (

)

A: Atividade enzimática (U/mL).

DO: Densidade óptica da amostra.

m: Coeficiente linear da curva padrão (mmol de Ac. Galact./mL).

n: Interseção da curva padrão.

VR: Volume de reação (1 mL).

Va: Alíquota do extrato enzimático (0,1 mL).

t: Tempo de reação (min).

d: Diluição.

3.19. Determinação de açúcares redutores

Durante o cultivo, a determinação de açúcares redutores foi realizada pelo método do

ácido 3,5 –dinitrosalicílico (Miller, 1959). A determinação da concentração de açúcares

redutores foi feita adicionando-se 0,5 mL da amostra a 0,5 mL do reagente DNS em tubos de

Folin-Wu que foi deixado para um banho em água fervente por 10 minutos. Após este tempo,

resfriava-se os tubos em banho com água em temperatura ambiente e completava-se o volume

a 2,5 mL com água destilada, os quais eram homogeneizados e, a seguir, efetuava-se a leitura

da absorbância. A calibração do zero no aparelho foi feita utilizando um teste em branco, em

que 1 mL de água destilada substituía a amostra, seguindo o mesmo procedimento. O método

foi previamente padronizado por uma curva de calibração de glicose (0,1 a 1,0 mg/mL com

intervalos de 0,1 g/L). As leituras foram realizadas a 540 nm em espectrofotômetro (Termo

Spectonic, Genesys 10 uv).

3.20. Determinação da quantificação de proteínas por Bradford

O conteúdo total de proteína do soro de leite foi quantificado a partir de uma curva

padrão tendo como referência lisozima usando o método do Biureto (Gornal; Bardawill;

David, 1949). Nesse caso foi utilizado um espectrofotômetro UV-Visível (Thermo Spectronic

modelo Genesys 10uv).

(3.9)



A reação de Biureto é um método que pode ser usado para determinar a quantidade de

proteína solúvel em solução. O reagente Biureto (sulfato de cobre em uma base forte) reage

com bandas peptídicas mudando a cor da solução. O espectrofotômetro é usado então para

medir a intensidade da cor resultante: quanto mais escura a solução, mais proteína solúvel em

solução.

Utilizou-se 1 mL da amostra pronta e adicionou-se 1,5 mL do reagente de Bradford. O

conteúdo de todos os tubos foi agitado, logo após ficou em repouso em temperatura ambiente

por 15 minutos em seguida, efetuou-sea leitura de absorbância em espectrofotômetro a 595

nm.

A curva padrão que correlaciona valores de absorvância ao conteúdo protéico de

soluções foi obtida utilizando-se albumina bovina sérica, como padrão, em concentrações na

faixa de 0,1 a 1 mg/mL com intervalos de 0,1 mg/mL. Os pontos da curva padrão foram

submetidos às mesmas etapas que as amostras dos extratos enzimáticos, para sua

quantificação.

3.21. Determinação da celulose residual

O conteúdo de celulose das culturas foi determinada pela metodologia (Updegraff,

1969) com adaptações. Um grama da cultura (do resíduo fermentado) foi pesado e suspenso

em solução de ácido nítrico, ácido acético (6 mL: 150 mL de 80% ácido acético com 15 mL

de ácido nítrico puro) e fervido durante 30 minutos em banho-maria. O sobrenadante foi

removido com uma pipeta Pasteur. Os peletes foram aferridos, após arrefecimento e

centrifugação (3000 x g, durante 20 min), as pelotas foram lavadas com água destilada (10

mL), e a celulose residual foi seco à 70 °C sob pressão reduzida até peso constante. Cada

valor medido de conteúdo de celulose residual é uma média de duas repetições de cada

amostra de cultura.



3.22.Planejamento Experimental

Com o objetivo de verificar a influência das variáveis: umidade e pH, foi elaborado

um planejamento experimental fatorial 22, sendo então dois fatores e dois níveis para cada

fator com três repetições no ponto central como mostra a Tabela (3.5). Os níveis das variáveis

independentes que serão utilizadas é na ordem crescente (-1, 0, +1), para umidade inicial

66%, 70,5% e 75% e para o pH serão 3, 5 e 7.

Foi usado o programa computacional STATISTICTM

(versão 7.0, da StatSoft, Inc.)

para calcular os efeitos principais das variáveis e suas interações, bem como os dados

relativos à Análise de Variância (ANOVA). A metodologia de superfície de resposta foi usada

para avaliar as condições da FES.

Tabela 3.5 - Ensaios do planejamento fatorial ( 22 ).

*Ponto central

O objetivo principal do planejamento fatorial para o fungo isolado e para o fungo

Penicillium chrysogenum, variando o pH e a umidade para avaliar a produção das enzimas em

meio contendo apenas coco, e uma mistura de coco e caju.

Ensaio pH Umidade (%)

1 3,0 (-1) 66,0% (-1)

2 3,0 (-1) 75,0% (+1)

3 7,0 (+1) 66,0% (-1)

4 7,0 (+1) 75,0% (+1)

5* 5,0 (0) 70,5% (0)

6* 5,0 (0) 70,5% (0)

7* 5,0 (0) 70,5% (0)



A Tabela 3.6 - mostra a proporção utilizada do bagaço do coco e do pedúnculo de caju

usados nos experimentos e qual o microrganismo que foi inoculado para realização das

fermentações seguindo o planejamento fatorial.

Tabela 3.6 - Proporção da matéria prima e microrganismo utilizado nas fermentações.

Bagaço do coco (g) Pedúnculo de caju (g) Microrganismo utilizado

5 0 Fungo isolado

5 0 Penicillium chrysogenum

2,5 2,5 Penicillium chrysogenum

CAPÍTULO IV

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Capítulo 4 – Resultados e Discussão


4. Resultados e Discussão

4.1.Caracterização dos resíduos: Bagaço do coco e pedúnculo de caju

A caracterização é importante para se conhecer a composição dos resíduos com

relação ao conteúdo de nutrientes e a composição química dos resíduos, que são importantes

na síntese das enzimas e para o crescimento dos microganismo no subtratos.

Os valores de celulose, hemicelulose, lignina e pectina são apresentados na Tabela

(4.1) esses valores são importantes para que se possa compreender a composição da matéria

prima usada nas fermentações, pois, o bagaço do coco o pedúnculo de caju foram usados

como subtratos para o crescimento de um fungo isolado e para o fungo filamentoso

Penicillium chrysogenum, as fermentações permitiram determinar o potencial de produção de

enzimas desses microrganismos, e a caracterização desses materias é uma maneira de

informar a quantidade de uma fonte de carbono e de nitrogênio.

Tabela 4.1- Caracterização do bagaço do coco verde e do pedúnculo de caju.

Análises Bagaço do coco verde Pedúnculo do caju

Teor de Umidade (%) 9,24 ± 0,14 5,36 ± 0,30

Teor de Extraíveis (%) 25,39 ± 0,24 6,24 ± 0,47

Teor de Cinzas (%) 0,46 ± 0,02 0,54 ± 0,30

Lignina Total (%) 36,23 ± 0,12 30,04 ± 0,65

Hemicelulose (%) 23,79 ± 0,31 16,77 ± 0,98

Celulose (%) 39,09 ± 0,48 15,91 ± 1,09

Pectina (%) 1,64 ± 0,06 15,24 ± 0,48

O bagaço e o pendúnculo são matérias orgânicas vegetais ricas em polissacarídeos

(açúcares complexos), como a celulose e hemicelulose, compostos encontrados nas paredes

celulares das células vegetais. Também está presente a lignina (biomassa lignocelulósica).

Esses três materiais juntos constituem mais de 75% da biomassa vegetal e conferem

resistência mecânica à planta. O restante da biomassa é composta por substâncias como

proteínas, óleos vegetais e minerais.



Os extraíveis do material vegetal, tais como ceras, álcoois, lipídeos, esteroides, ácidos

graxos, hidrocarbonetos e flavonoides, não foram contabilizados por que não era o interesse

no estudo aqui apresentado, no caso o teor de extraíveis do bagaço do coco foi de 25,39% e

do pedúnculo de caju foi de 6,24%. Alguns desses compostos extrativos podem ser tóxicos.

Essas moléculas podem variar de acordo com a espécie analisada e o processamento ao qual

será submetido o material vegetal. O restante dos materiais são considerados substâncias não-

extrativas, pois compõem as cinzas que restam quando a matéria orgânica é queimada, o teor

de cinza do bagaço do coco foi de 0,46% e do pedúnculo do caju foi de 0,54%. Esses

compostos são inorgânicos, conhecidos como sais ou minerais, como potássio, sílica,

manganês, sódio, cálcio, entre outros. A composição das substâncias não-extrativas depende

das condições de solo, de clima e meio ambiente.

Os valores de umidade, extraíves, cinzas, lignina, hemicelulose e pectina, foram

quantificados para determinar a composição dos resíduos bagaço do coco e do pedúnculo de

caju. O teor de extraíveis é importante para que não seja contado como teor de lignina.

A composição do pedúnculo do caju e do coco variam largamente em função da

variedade, do estado de maturação, do tamanho, da duração da colheita e de variações

ambientais regionais, entre outros fatores. De acordo com os resultados esses dois materiais

que na sua maior parte são descartados, são constituídos de altos teores de celulose,

hemicelulose, lignina total e pectina, desde modo não há necessidades de grandes

complementos nutricionais para o crescimento e o desevolvimentos dos microrganismos

usados nas fermentações.

A composição do bagaço do coco de acordo com Rosa et al, (2001) apresentou as

seguintes porcentagens de lignina (35 a 45%), celulose (23 a 43%) e de hemicelulose (3 a

12%), comparando com os resultados obtidos com o do autor, confirma-se que o bagaço de

coco é um excelente material lignocelulósico, apresentando uma porcentagem de celulose de

39,09%, conferindo uma boa resistência e flexibilidade ao material, o teor de hemicelulose foi

de 23,79%, revelando a sua alta resistência a ataques químicos e enzimáticos e o teor de

lignina total encontrado foi 36,23% por não ter sido realizado qualquer tipo de pré-tratamento

no bagaço, o teor de lignina foi alto, podendo ocasionar uma limitação no crescimento de

microrganismo ou até inbir e se comparado ao valor do autor, o valor encontrado está de

acordo.



De acordo com a de Gouveia et al, (2009) para a caracterização do pedúnculo de caju,

as porcentagens de celulose (20,56%), hemicelulose (10,17%) e lignina (35,26%),

comparando com os valores encontrados a porcentagem de celulose foi de 15,91%

confirmando a sua resistência e flexibilidade, a porcentagem encontrada de hemicelulose foi

de 16,78%, assim como o bagaço do coco o pedúnculo é resistente a ataques químicos e

enzimáticos, já o teor de lignina encontrado foi de 30,04% pelo seu alto teor encontrado, tanto

no bagaço do coco quanto no pedúnculo de caju a presença de lignina pode dimuir ou até

mesmo nem permitir o crescimento de microrganismos, dificultando a ação das enzimas sobre

os materiais, desde modo os valores encontrados por este autor é semelhante ao encontrado

aqui descrito, comprovando que o bagaço de coco e pedúnculo de caju são ricos em celulose e

apesar dos teores de lignina terem sidos altos, o fungo isolado e o fungo Penicillium

chrysogenum conseguiram se desenvolver e produzir enzimas.

4.2. Determinação dos minerais no bagaço do coco verde

Os minerais foram quantificados após a determinação do teor de cinzas, os mesmo

foram solubilizados com ácido nítrico 10% e submetidos às analises por ICP/OES. Todos os

ensaios foram realizados com três repetições e os valores apresentados são uma média dos

resultados obtidos.

Segundo os autores Brígida et al, (2010) e Kämpf e Fermino (2000) a composição

elementar depende consideravelmente da composição do solo onde a cultura do coco está

sendo produzida, a época do ano e a quantidade de chuvas.

A Tabela 4.2 mostra a composição mineral para o bagaço do coco. A determinação

dos minerais serve para verificar a ausência ou o execesso de um determinado componente,

por que alguns minerais são tóxicos aos fungos quando estão presentes em excesso. No caso

de algum componente em falta ou em baixa concentração torna-se necessário a suplementação

de algum componente quando for inocular o microrganismo.



Tabela 4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde.

Mineral Valor (mg/L)

Ni ND

Pb 1,35

Mn 19,12

Cd 0,182

Cu 11,97

Zn 13,72

Cr 0,825

Fe 60,99

*ND – Não determinado

O valor de Cu presente no bagaço do coco pode estar relacionado com uma possível

contaminação durante o processo de conservação adotado ou também com a origem do

coco.No entanto, as concentrações de Fe e Mn variam muito, essas variações nesses

elementos podem estar associadas ao tipo de solo.

O teor de zinco presente nas cinzas do bagaço do coco pode ser devido a possíveis

processos galvânicos utilizados por algumas indústrias em suas atividades, localizadas

próximas às áreas de cultivo ou ao ponto de venda (Gonçalves, 2008). Outra hipótese é a

drenagem urbana, carreando zinco presente no solo como fertilizante agrícola. A adição

global de zinco no solo através de fertilizantes é da ordem de 260 a 1.100 ton/ano (Campos et

al., 2005). O elemento cromo também se mostrou presente nas amostras do bagaço do coco,

essa presença pode ser em decorrência de indústrias de ligas metálicas que possam estar

contaminando os solos.

O teor de chumbo presente pode ser devido ao tráfego intenso na região que libera

vapores de chumbo para a atmosfera, os quais são depositados na superfície através das

chuvas por exemplo, à ocupação urbana desordenada, as quais lançam esgoto no rio e deste

modo contaminando os mesmos.

O cádmio é encontrado na natureza quase sempre junto com o zinco, em proporções

que variam de 1:100 a 1:1000, na maioria dos minérios e solos, na agricultura uma fonte

direta de contaminação pelo cádmio é a utilização de fertilizantes fosfatados. Sabe-se que a

captação de cádmio pelas plantas é maior quanto menor o pH do solo (solo do cerrado).

Portanto as chuvas ácidas são um fator determinante no aumento da concentração do Cádmio

nos produtos agrícolas.



Os principais metais pesados presentes no solo e nos produtos utilizados na agricultura

são Co, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Sn e Zn (Abreu et al., 2002). Entre esses, deve-se

ressaltar que alguns são essenciais às plantas (Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, e Zn), bactérias fixadoras

de nitrogênio (Co e Mo), animais (Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, e Zn) e microrganismos (Co, Cr,

Cu, Mg, Mn, Ni, e Zn). A contaminação dos solos por metais pesados pode ter origem natural

ou antropogênica, sendo esta a principal razão do aumento crescente dos metais pesados nos

solos, provocando distúrbios muitas vezes de difícil recuperação para o ambiente (Abreu et

al., 2002). As plantas acabam absorvendo esses metais que são transferidos para as folhas,

frutas e outras partes.

Cooley et al, (1986) observaram que o metal pesado cádmio em dosagens maiores

causa efeitos deletérios sobre o metabolismo celular e progressiva inibição da esporulação do

fungo, deste modo pode-se concluir que os metais pesados (cádmio e chumbo) presentes no

bagaço do coco não irão prejudicar o crescimento dos microrganismos nas fermentações

utilizando o bagaço do coco como sustrato devido as baixas concentrações. Uma propriedade

importante das enzimas celulolíticas é sua capacidade de ser influenciada por outras

moléculas, especialmente metais, sejam sofrendo efeitos inibitórios ou indutores. Dentre os

íons avaliados, os que inibem mais frequentemente as celulases são Hg+2

, Cu+2

, Ag+ e Zn

2+,

que chegam a provocar até a perda total da atividade catalítica, estando presentes em

concentrações tão baixas quanto 2 mM (Lima et al., 2005).

4.3. Determinação dos minerais do pedúnculo de caju

Os teores de minerais foram determinados por espectrometria de emissão atômica com

fonte de plasma indutivamente acoplado – ICP/OES, segundo AOAC, 2000, com

mineralização por via seca acordo com a amostra. Os dados dos mineirais do pedúnculo de

caju foram obtidos da Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (Taco, 2011).

Diversos meios de suplementação são descritos na literatura com o objetivo de suprir

as necessidades nutricionais microbianos em termos de carbono, nitrogênio, fósforo, minerais

e vitaminas são utilizados (Aguiar e Menezes, 2000). Em relação ao sistema celulolítico da

maioria das linhagens fúngicas, este precisa ser induzido pela presença do substrato. Gong e

Tsao (1975) relataram diversas fontes de celulose complexa (ex: bagaço de cana e resíduos

lignocelulósicos), gentibiose, soforose e lactose como indutoras da produção de celulases em



fermentação submersa. No entanto, a resposta das células fúngicas aos diferentes meios varia

dependendo da concentração e tipo de indutor, tornando necessário o conhecimento das

exigências nutricionais do microorganismo com o intuito de estimular a síntese enzimática.

A Tabela 4.3 mostra a composição mineral para o pedúnculo de caju. Os minerais

contemplados são: cálcio, ferro, magnésio, manganês, fósforo, sódio, potássio, cobre e zinco.

A determinação dos minerais é importante para verificar a ausência ou o execesso de um

determinado mineral, pois, alguns minerais são tóxicos aos fungos quando estão presentes em

excesso. No caso de algum componente em falta ou em baixa concentração torna-se

necessário a suplementação de algum componente quando for inocular o microrganismo.

Tabela 4.3 - Determinação dos minerais no pedúnculo de caju.

Mineral Valor (mg/100 g)

Ca 1

Mg 10

Mn 0,12

P 16

Fe 0,2

Na 3

K 124

Cu 0,07

Zn 0,1

Fonte: TACO, 2011.

A disponibilidade dos nutrientes para as plantas vai depender das entradas e saídas dos

elementos no solo e das transformações que aí ocorrem. A conversão entre formas orgânicas e

minerais, imobilização e mineralização, operada por organismos do solo, é uma componente

importante na ciclagem do nitrogênio, fósforo, enxofre e micronutrientes. A taxa de

mineralização depende das condições de vida dos organismos em termos de características do

solo (pH, arejamento, temperatura, e teor de água) e dos resíduos orgânicos (granulometria,

teores de lenhina e fenóis, e equilíbrio entre o carbono por um lado, e o nitrogênio, o fósforo e

o enxofre por outro)(Bertoldi et al, 1983).

A disponibilidade dos micronutrientes (ferro, manganésio, zinco, cobre e níquel)

depende do pH, do potencial redox e do teor de matéria orgânica dos solos. As deficiências de

ferro, manganésio e zinco são vulgares em solos calcários, enquanto que a toxicidade de

manganésio é frequente em solos ácidos ou alagados (Lindsay e Norwell 1978).



Muitas espécies fúngicas podem se desenvolver em meios mínimos, contendo amônia

ou nitritos, como fontes de nitrogênio. Oligoelementos (ferro, zinco, manganês, cobre,

molibdênio e cálcio) são exigidos em pequenas quantidades (Ehlers, 1994).

O fósforo é necessário para a formação dos ácidos nucleicos e para a síntese dos

compostos orgânicos de alta energia - adenosina trifosfato (ATP). O fósforo é fornecido na

forma de sais de fosfato para ser usado por todas as células microbianas (Ehlers, 1994).

A maior parte das células necessita de alguns ions metálicos como cálcio, potássio,

magnésio, ferro, manganésio, zinco, cobre, molibdénio, níquel, cobalto e sódio para as suas

várias atividades celulares. Estes ions são necessários em quantidades ínfimas

(micronutrientes), sendo usados como cofatores e ativadores de enzimas (Ehlers, 1994).

4.4. Seleção de microrganismo produtor de celulase

4.4.1. Isolamento de linhagem fúngica produtora de celulases

A análise comparativa da sequência obtida com outras depositadas em bancos de

dados mundiais (GenBank) revelou 100% de identidade com sequências de fungos da espécie

Aspergillus fumigatus. Logo, concluiu-se que se trata de um fungo filamentoso pertencente a

esta espécie. A classificação taxonômica:

Domínio: Eukaryota

Reino: Fungi

Filo: Ascomycota

Classe: Eurotiomycetes

Ordem: Eurotiales

Família: Trichocomaceae

Gênero: Aspergillus

Espécie: Aspergillus fumigatus



O aspecto morfológico da cultura após crescimento está apresentado em placa de Petri

na Figura 4.1.

Figura 4.1 - Aspecto da morfologia cultural da cepa de fungo isolado da casca do coco

(Aspergillus fumigatus).

4.4.2. Triagem em meio Avicel

A primeira etapa de avaliação do potencial celulolítico das 2 linhagens de fungos

filamentosos, a primeira do gênero Penicillium e a segunda do fungo isolado (Aspergillus),

consistiu na observação do crescimento dos fungos em placa de Petri contendo substrato

celulósico, Avicel, como única fonte de carbono. Pode-se observar durante esse processo que

as duas linhagens avaliadas apresentaram capacidade de hidrolisar o substrato celulósico,

Avicel, caracterizando a presença de celulases, especificamente de exoglucanases, produzidas

por essas linhagens, como é mostrado nas Figuras 4.2 e 4.3.

Apesar de alguns autores considerarem que na presença de Avicel as enzimas

produzidas serão Avicelases, para que essa enzima exerça sua função é necessária à presença

de endoglucanases para iniciar o processo de hidrólise do substrato. Todo o experimento foi

realizado em duplicata.



Figura 4.2 - Crescimento do fungo Penicillium chrysogenum em palca de Petri com Avicel.

Figura 4.3 - Crescimento do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco em palca

de Petri com Avicel.

A princípio, de acordo com a função catabólica dos fungos filamentosos, as enzimas

deveriam ser produzidas na presença da celulose, porém a maioria dos fungos do gênero

Penicillium apresentam enzimas indutivas. Estas enzimas se formam durante o crescimento

do fungo e na presença de um indutor (Kubicek et al., 2009). Portanto, a presença de Avicel

no meio de cultura desse experimento em placas de Petri, além de ser fonte de carbono para o

crescimento das linhagens de Penicillium e para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus),

funcionou como um indutor na produção de celulases por esses fungos. As duas linhagens que

conseguiram crescer no meio de cultura com Avicel como única fonte de carbono e com

função de indutor, apresentaram habilidade de degradar esse substrato devido capacidade de



produção do complexo celulolítico,especialmente das exoglucanases. Desde modo, os ensaios

em placas com Avicel podem ser utilizados para um screening rápido de microrganismos.

Este teste permitiu concluir a capacidade que as duas linhagens tem em hidrolisar o substrato

celulósico.

Um planejamento fatorial (22) foi utilizado para verificar a influência das variáveis:

umidade e pH, usando o fungo isolado e o fungo Penicillium chrysogenum, conforme item

3.21.

4.5. Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando um fungo

isolado da casca do coco nas fermentações com o bagaço do coco como substrato.

A Tabela 4.4 - apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de

atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo isolado por fermentação

semi sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram avaliados as atividades

enzimáticas CMCase e Avicelase.

Tabela 4.4 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase e

Avicelase produzida pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus).

*Ponto central

De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.4 para atividade CMCase, apenas a

umidade é significativo para um nível de 95%. O pH e a interação não influenciaram

positivamente na produção da CMCase. A umidade é um parâmetro importante para a síntese

da enzima. O mesmo não ocorre para o diagrama de Pareto da Figura 4.5 para atividade da

Experimentos pH Umidade(%)

A. E. CMCase

(UI/mL)

A. E. Avicelase

(UI/mL)

1 3 66 0,282 ± 0,002 0,011 ± 0,002

2 3 75 0,252 ± 0,003 0,013 ± 0,021

3 7 66 0,279 ± 0,006 0,010 ± 0,001

4 7 75 0,267 ± 0,023 0,010 ± 0,021

5* 5 70,5 0,216 ± 0,001 0,018 ± 0,008

6* 5 70,5 0,218 ± 0,003 0,019 ± 0,003

7* 5 70,5 0,224 ± 0,002 0,020 ± 0,004



Avicelase, nenhum dos efeitos e a interação não foram significativos, mostrando assim que a

umidade, o pH e a interação entre eles não é satisfatória para a produção desta enzima nestas

condições.

Figura 4.4 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade da

CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como

subtrato.


Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como

subtrato.

No caso a umidade demonstrou exercer influência na síntese das enzimas. O elevado

teor de umidade inicial pode afetar o crescimento do microrganismo, pois a porosidade do



meio e a difusão de oxigênio são reduzidas, dificultando a formação do produto (Raimbault e

Alazard, 1980). Por outro lado, em baixos teores de umidade inicial, a produção enzimática

também pode ser reduzida porque o fungo sofre modificações na membrana celular,

conduzindo a limitações de transporte e afetando o metabolismo microbiano (Acuña-

Arguelles et al., 1994). Portanto, o importante é trabalhar com uma umidade intermediária,

que mantenha o equilíbrio entre a disponibilidade de água, expansão do substrato e efeitos de

difusão do oxigênio.

As fermentações ocorreram com a temperatura fixa, à 30 °C. As melhores condições

apresentadas para a produção da enzima CMCase foram dos experimentos 1 e 3. A umidade

de 66% consistiu no melhor resultado para a produção da enzima CMCase, com atividades

enzimáticas de 0,282 e 0,279 UI/mL, mostrando assim uma alta capacidade de degradar a

CMC. No caso da atividade da Avicelase os experimentos que apresentaram a melhor

produção da enzima foram os 5, 6 e 7, ou seja, os pontos centrais, apresentando os valores de

0,018 , 0,019 e 0,020 UI/mL, neste caso a umidade intermediária (70,5%) e pH (5)

influenciaram em uma maior produção da enzima.

A Figura 4.6 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e

umidade sobre a atividade da enzima CMCase. As condições para produção da CMCase

foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi

de 0,282 UI/mL.

Figura 4.6 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática CMCase

para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como substrato.


umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da Avicelase




de 0,020 UI/mL. Observa-se pouca inclinação da superfície de resposta, indicando que os

efeitos não são significativos para 95% de confiança, para os níveis avaliados.

Figura 4.7 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Avicelase

para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como subtrato.

A fermentação em meio semi-sólido reproduz o habitat natural dos fungos

filamentosos, de modo que esses microrganismos são capazes de crescer satisfatoriamente em

substrato sólido e excretar grandes quantidades de enzimas, como por exemplo, as celulases

(Silva et al., 2005). A escolha por um substrato específico para o cultivo em estado sólido,

leva em consideração o custo e à viabilidade. O cultivo em substratos lignocelulósicos

possibilitam fornecer elementos à nutrição fúngica, semelhante ao que ocorre em habitats

naturais.

A atividade de Avicelase também foi observada por Menezes e Hennies (1991), que

obtiveram valores próximos a 0,25 UI/mL de celulase quando utilizaram bagaço de cana-de-

açúcar pré-tratado com solução de hidróxido de sódio 4% como total de fonte de carbono, na

presença do fungo Aspergillus niger. Desde modo existe a necessidade de um pré-tratamento

para a remoção, pelo menos parcial da lignina presente na fibra vegetal, possibilitando maior

consumo do substrato e indução às sínteses enzimáticas, como verificado por Aguiar e

Menezes (2000).

Segundo os autores Ferreira et al. (2011) o valor da atividade enzimática da CMCase

observada foi de 2,291 UI/mL com umidade de 60% durante 96 h usando por meio da

fermentação em estado sólido do resíduo de cajá sob ação do fungo Aspergillus niger.



De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, comparado-se com o do autor

pode-se afirmar que a linhagem é boa produtora de celulases, seu crescimento foi bem efetivo

no substrato semi-sólido, além de apresentar elevadas concentrações no extrato enzimático

bruto, quando a produção de celulases utilizando o bagaço do coco. De acordo com os

resultados, principalmente o da CMCase.

Destaca-se que não houve atividade para as enzimas, Pectinase, FPase, Xilanase e β-

glicosidase. No caso da ausência da atividade da Pectinase uma das hipóteses é o baixo teor

de pectina que foi de 1,64% o indutor da atividade de poligalacturonase. No caso da ausência

da atividade da Xilanase mesmo o bagaço do coco apresentando uma concentração de

hemicelulose de 23,79% possivelmente o fungo isolado não foi capaz de hidrolisar a

hemicelulose. Com relação a ausência da enzima β-glicosidase pode estar ligada a falta de

ação deste microrganismo na clivagem da celobiose em unidades de glicose (Galbe e Zacchi,

2002). Na ausência da atividade da FPase pode ser pela dificuldade de acesso das enzimas ao

substrato, se comparado aos outros substratos que possuem uma área superficial bem maior.

4.6. Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o

Penicillium chrysogenum nas fermentações com a mistura de bagaço do coco e o

pedúnculo de caju como substratos.

A Tabela 4.5 apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de

atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo Penicillium chrysogenum

por fermentação semi sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram realizados

ensaios das atividade enzimáticas CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase usando o bagaço do

coco e o pedúnculo de caju como substratos, na proporção de 50% de massa para cada

resíduo.



Tabela 4.5 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo

Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como substratos.

*Ponto central

Experimentos pH Umidade(%) A.E. CMCase (UI/mL) A. E. Avicelase (UI/mL) A. E. Xilanase (UI/mL) A. E. FPase (UI/mL)

1 3 66 0,305 ± 0,004 0,003 ± 0,001 0,514 ± 0,003 0,058 ± 0,006

2 3 75 0,240 ± 0,007 0,001 ± 0,001 0,408 ± 0,001 0,030 ± 0,005

3 7 66 0,294 ± 0,008 0,010 ± 0,006 0,644 ± 0,006 0,026 ± 0,001

4 7 75 0,219 ± 0,001 0,002 ± 0,001 0,465 ± 0,005 0,028 ± 0,013

5* 5 70,5 0,240 ± 0,001 0,003 ± 0,002 0,416 ± 0,001 0,030 ± 0,004

6* 5 70,5 0,262 ± 0,001 0,001 ± 0,001 0,419 ± 0,001 0,026 ± 0,003

7* 5 70,5 0,249 ± 0,003 0,002 ± 0,002 0,413 ± 0,006 0,031 ± 0,003



O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das

variáveis possuem sobre a atividade de celulases, estabelecendo quais destes efeitos

encontram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido para a análise estatística (95%).

De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.8 para atividade CMCase, apenas a

umidade é significativo para um nível de 95%. O pH e a interação não influenciaram na

produção da CMCase. O mesmo ocorre para atividade Avicelase como representado na Figura

4.9, na qual apenas a umidade influenciou de maneira significativa para a produção desta

enzima. Nessas figuras mostra-se claramente que o pH e a interação entre os parâmetros não

apresentam efeito significativo para a produção dessas duas enzimas usando o bagaço do coco

e o pedúnculo do caju como substratos.


CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de

caju como subtratos.




Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do


A umidade é um parâmetro importante para a produtividade dessas duas enzimas, a

melhor umidade foi de 66% com pH 3 para a enzima CMCase e a umidade de 66% com pH 5

para a enzima Avicelase.

De acordo com o diagrama de Pareto das Figuras 4.10 e 4.11 para as atividades

Xilanase, Fpase, a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros é significativo para um

nível de 95%. A umidade, o pH e a interação entre as variáveis influenciaram de maneira

significativa para a produção destas enzimas. Nas Figuras 4.10 e 4.11 mostram claramente

que a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros apresentam efeito significativo para a

produção dessas duas enzimas usando o bagaço do coco e o pedúnculo do caju como

substratos. A umidade é um parâmetro importante para a produtividade dessas duas enzimas,

a melhor umidade foi de 66%. Na Figura 4.11 o pH 3 no caso, é o parâmetro que mais

influencou na produção da FPase, mas a umidade e a interação entre eles foram significativas.




Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do


Figura 4.11- Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade

FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do caju

como subtratos.

A umidade é considerada um fator crítico para o crescimento dos fungos em substrato

sólido. Como a quantidade de água é sempre limitada, ao contrário da fermentação submersa,

onde há um grande excesso, o controle do nível de umidade é essencial à otimização do

processo em fermentação sólida. Um alto teor de umidade diminui a porosidade, a difusão de

oxigênio, a eliminação de dióxido de carbono e aumenta o risco de contaminação por

bactérias. Por outro lado um baixo teor de umidade pode levar a um menor crescimento do

microrganismo (George et al., 2001).



Dessa forma de acordo com os resultados é possível perceber que existe uma relação

entre a umidade ideal com a melhor atividade enzimática, sendo que os melhores resultados

apontam melhor condição ao teor de umidade de 66%.

Os picos de atividade enzimática de CMCase, FPase, Avicelase e Xilanase foram

atingidos em valores de umidade de 66% para mistura bagaço de coco e pedúnculo de caju em

todas as fermentações testadas com o fungo Penicillium chrysogenum. A água exerce um

papel importante na FES, pois é responsável pela difusão de solutos, gases e metabólitos

inibitórios, bem como pela absorção celular (Pandey, 2003).

Para cada espécie de microrganismo utilizado, existe um valor ótimo de umidade do

substrato para o crescimento celular, que pode não coincidir com o melhor valor para a

expressão do produto que se pretende obter no processo, como por exemplo, enzimas

(Amorim, 2011).

Na FES, o microrganismo possui um limite de água para suas atividades metabólicas e

seu crescimento, a atividade de água (Aw) ótima para fungos é por volta de 0,7; para

leveduras 0,8, e para bactérias 0,9, no caso do Penicillium (diversas espécies) a sua atividade

de água é aproximadamente de 0,85, e uma pequena mudança nesses valores ótimos causa um

grande distúrbio no crescimento e metabolismo dos microrganismos (Andrade, 1999).

Como mostrado na Figura 4.11 o pH é o parâmetro que mais influenciou

significativamente, o pH pode variar em resposta às atividades metabólicas dos micro-

organismos, devido à produção de ácidos durante a fermentação ou mesmo do consumo

destes e a formação de compostos como uréia, por exemplo, que tendem a elevar o pH (Brand

et al., 2000).




de 0,305 UI/mL.



Figura 4.12 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática CMCase

para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como

substratos.

De acordo com Bassos (2010), a atividade máxima de endoglucanase para T. ressei

9414 foi de 0,50 UI/mL. Comparando os resultados do experimento com o do autor,

evidencia-se a capacidade que o microrganismo (Penicillium chrysogenum) possui em

degradar a celulose do bagaço do coco quanto do pedúnculo de caju.


umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da Avicelase


de 0,010 UI/mL.

Figura 4.13 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Avicelase


substratos.

Como observado por Martín et al (2007) obtiveram uma produção de 0,10 UI/mL de

Avicelase com o fungo Penicillium echinulatum cultivado na presença de 0,5% de farinha de



trigo. Evidenciando-se que o microrganismo testado (Penicillium chrysogenum) nos

experimentos não apresentou boa atividade se comparado aos resultados dos autores.

A Figura 4.14 – ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e

umidade sobre a atividade da enzima Xilanase. As condições para produção da Xilanase


de 0,644 UI/mL.

Figura 4.14 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Xilanase


substratos.

De acordo com Siqueira, Siqueira et al, (2010) utilizando os microrganismo Mucor sp

apresentou atividade enzimática da Xilanase de 0,560 UI/mL e para o Penicilium citrinum a

atividade enzimática da Xilanase observada foi de 0,412 UI/mL. Desde modo ao comparar

esses resultados com os resultados obtidos no presente trabalho utilizando apenas o

Penicillium chrysogenum com atividade máxima de 0,644 UI/mL, mostra-se que o

microrganismo utilizado é um bom produtor de Xilanase, ou seja a enzima está hidrolisando a

xilana de maneira bem efetiva.


umidade sobre a atividade da enzima FPase. As condições para produção da FPase foram no

tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi de 0,058

UI/mL.



Figura 4.15- Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase para o

fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como

substratos.

De acordo com Wen et al, (2005) utilizando T. ressei observou atividade da celulase

total de aproximadamente 0,30 UI/mL em bagaço de cana-de-açúcar não tratado depois de 6

dias, valor bastante superior ao encontrado no experimento realizado.

Não houve determinação da atividade da Pectinase, uma das hipóteses é o baixo teor

de pectina encontrado no bagaço do coco que foi de 1,64% e para o pedúnculo de caju o valor

encontrado de pectina foi de 15,24%, mesmo com um alto teor de pectina encontrado e sendo

o indutor da atividade de poligalacturonase, mesmo havendo a mistura entre os dois resíduos

não foi possível a indução da enzima Pectinase, o fungo Penicillium chrysogenum não foi

capaz de hidrolisar a pectina. A ausência da enzima β-glicosidase pode estar ligada a falta de

ação deste microrganismo na clivagem da celobiose em unidades de glicose (Galbe e Zacchi,

2002).

Entre os produtores de celulases estão o gênero Aspergillus, Cladosporium,

Funsarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium, Clostridium e

Trichoderma (Lynd et al, 2002).

A produção de enzimas do complexo celulolítico não está somente ligada à linhagem

do microrganismo, mas as técnicas e substratos utilizados no processo (Rugger et al, 2004).

Diversos fatores podem influenciar na produção do complexo celulolítico. Técnicas de

cultivo, modo de extração, a umidade utilizada, o pH, a concentração do inóculo, a

temperatura entre outros fatores.



4.7. Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o

Penicillium chrysogenum nas fermentações com o bagaço do coco como substrato.

A Tabela 4.6 apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de

atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo Penicillium chrysogenum

por fermentação semi-sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram realizados

ensaios das atividade enzimáticas CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase usando o bagaço do

coco.



Tabela 4.6 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo

Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como substrato.

Experimentos pH Umidade(%) A.E. Avicelase (UI/mL) A.E. CMCase (UI/mL) A.E. Xilanase (UI/mL) A.E. FPase (UI/mL)

1 3 66 0,011 ± 0,003 0,067 ± 0,008 0,541 ± 0,008 0,031 ± 0,001

2 3 75 0,013 ± 0,001 0,029 ± 0,008 0,588 ± 0,011 0,032 ± 0,001

3 7 66 0,01 ± 0,002 0,176 ± 0,011 0,513 ± 0,003 0,032 ± 0,006

4 7 75 0,01 ± 0,002 0,233 ± 0,008 0,735 ± 0,001 0,032 ± 0,002

5* 5 70,5 0,018 ± 0,001 0,049 ± 0,002 0,611 ± 0,002 0,032 ± 0,006

6* 5 70,5 0,019 ± 0,001 0,055 ± 0,001 0,608 ± 0,006 0,032 ± 0,001

7* 5 70,5 0,020 ± 0,001 0,052 ± 0,003 0,619 ± 0,001 0,031 ± 0,002

*Ponto central



De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.16 para atividade da Avicelase,

a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros não é significativa para um nível de

95%. O pH, a umidade e a interação entre os parâmetros não influenciaram de maneira

significativa para a produção dessa enzima nessas condições. Já para atividade da

CMCase como é representado na Figura 4.17 o pH influenciou de maneira significativa

para a produção desta enzima e a interação entre os parâmetros também, já a umidade

não influenciou significativamente.


atividade Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco

como subtrato.


atividade CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco

como subtrato.



De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.18 para atividade da Xilanase,

a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros foram significativa para um nível de

95%. Desde modo a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros influenciaram de

maneira significativa para a produção dessa enzima. Já para atividade da FPase como

mostrado na Figura 4.19 nenhum dos parâmetros e nem a interação entre eles é

significativa para a produção desta enzima. Mostrando assim que a produção desta

enzima não é favorecida nestas condições.


atividade Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco

como subtrato.

Figura 4.19- Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a

atividade FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como

subtrato.



Os maiores valores atingidos para as atividades enzimáticas de CMCase, Fpase,

Avicelase e Xilanase foram obtidos em valores de umidade de 70,5 e 75% para o

bagaço do coco como sustrato. Confirmando novamente que a umidade é um parâmetro

importante para a produção das enzimas.


umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da

Avicelase foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade

enzimática máxima foi de 0,020 , 0,018 e 0,019 UI/mL os valores correspondentes aos

pontos centrais, onde a umidade utilizada foi 70,5% e com pH 5.


Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como

substrato.

A atividade de Avicelase também foi observada por Menezes et al (2009),

resultados com a enzima Avicelase mostrou pouca atividade desta enzima em relação ao

substrato testado. Sendo que a maior atividade alcançada foi com a linhagem Pleurotus

sajor-caju com 0,08 UI/mL, utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Se

comparar esses resultados com os resultados obtidos nos experimentos deste trabalho

utilizando o Penicillium chrysogenum os melhores valores da atividade Avicelase foram

0,018-0,020 UI/mL, comprovando-se que este microrganismo possui a capacidade em

degradar a celulose.





foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática

máxima foi de 0,233 UI/mL o valor correspondente ao experimento 4, onde a umidade

utilizada foi 75% e com pH 7.


CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como

substrato.

A atividade de CMCase também foi observada por Menezes et al (2009), de

acordo com os resultados obtidos as amostras apresentaram baixas atividades desta

enzima, sendo que a maior foi produzida pela linhagem Pleurotus tailandia com

atividade de 0,06 UI/mL, utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Assim

ao comparar esses resultados com os resultados obtidos nos experimentos deste trabalho

utilizando o Penicillium chrysogenum com atividade máxima de CMCase de 0,233

UI/mL, evidencia-se a capacidade que o microrganismo possui em degradar a celulose.

Desde modo as enzimas Avicelase (exoglucanase) e Carboximetilcelulase

(endoglucanase) formam um sistema enzimático hidrolítico importante para a

degradação da celulose (Bayer e Lamed, 1992).




umidade sobre a atividade da enzima Xilanase. As condições para produção da Xilanase

foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima

foi de 0,735 UI/mL os valores correspondente ao experimento 4, onde a umidade

utilizada foi 75% e com pH 7.


Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como

substrato.

A atividade de Xilanase também foi observada por Menezes et al (2009), as

linhagens Pleurotus tailandia e Pleurotus sajor-caju apresentaram atividades de

Xilanase de 0,11 UI/mL quando utilizaram bagaço de cana-de-açúcar sendo que os

resultados não foram significativos. Desde modo ao comparar esses resultados com os

resultados obtidos no presente trabalho utilizando apenas o Penicillium chrysogenum

com atividade máxima observada foi de 0,735 UI/mL, mostra-se que o microrganismo

utilizado é um bom produtor de Xilanase, ou seja a enzima está hidrolisando a xilana de

maneira bem efetiva.


umidade sobre a atividade da enzima FPase. As condições para produção da FPase

foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática

máxima foi entre 0,031 e 0,032 UI/mL, ou seja, não houve diferença entre os valores

encontrados nos experimentos realizados.




para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como substrato.

De acordo com Castro et al (2006) observaram atividade de FPase de 0,028

UI/mL, muito semelhante ao encontrado no presente trabalho. Uma hipótese para a

baixa atividade em papel de filtro pode ser justificada pela dificuldade de acesso das

enzimas ao substrato, uma vez que a área superficial é muito menor que a dos demais

substratos utilizados.

Não houve determinação das enzimas Pectinases e β-glicosidase para a

fermentação usando apenas o bagaço do coco como sustrato. O baixo teor de pectina

encontrado no coco não foi sufiente para induzir a produção da enzima Pectinase. Do

mesmo modo para atividade da enzimática β-glicosidase, pelo fato de ser uma enzima

intracelular, era necessário que houvesse o rompimento celular para que a enzima

pudesse atuar na conversão da celobiose em glicose.

4.8. Cinética do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e do Penicillium chrysogenum.

As cinéticas estabelecidas para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e

Penicillium chrysogenum ocorreram durante 10 dias. A cinética para o fungo isolado

(Aspergillus fumigatus) foi realizada para saber como era o comportamento do mesmo

frente ao meio de cultivo e qual enzima seria produzida por ele. A cada 24 horas foi



retirado um ponto para a determinação de proteína total (PT), açúcares redutores totais

(ART), CMCase, Avicelase e celulose residual.

As condições propostas são em decorrência da maior atividade enzimática para

os dois microrganismos, ou seja, a umidade de 66 e 75% foram onde apresentaram os

maiores picos das atividades, e o pH 5 foi levado em consideração ao encontrado na

literatura, pois é o melhor para o desenvolvimento do Penicillium chrysogenum. Do

ponto de vista prático foi melhor ter trabalhado com as umidade de 66% para o fungo

isolado (Aspergillus fumigatus) e de 75% para o Penicillium chrysogenum, pois, foram

os valores de umidade que apresentaram a maior produtividade das enzimas, além disso,

a atividade da água inibe o possível crescimento de outras espécies como bactérias e

leveduras (Oriol et al., 1988).

A Figura 4.24 ilustra o perfil de açúcares redutores totais, proteínas e celulose

residual quando utilizado o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco,

durante 10 dias de fermentação.


residual produzidos pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante 10 dias de

cultivo.

Para a cinética do fungo Penicillium chrysogenum foram determinados os teores

de açúcares redutore totais, proteína total, celulose residual e quantificados os teores das

enzimas Xilanase, FPase, CMCase e Avicelase.



A Figura 4.25 ilustra o perfil de açúcares redutores totais, proteínas e celulose

residual quando utilizado o fungo Penicillium chrysogenum, durante 10 dias de

fermentação.


residual produzidos por Penicillium chrysogenum durante 10 dias de cultivo.

Com relação ao substrato, a resposta das células fúngicas aos diferentes

indutores varia dependendo da concentração e do tipo de indutor ou pela presença de

glicose ou outros açúcares presentes no meio de crescimento. Os indutores para a

síntese celulolítica têm duas funções, pode servi como fonte de carbono para o

crescimento celular, ou até mesmo para a síntese enzimática (Gong e Tsao, 1975). As

Figuras 4.24 e 4.25 demonstram a degradação da celulose em ambas as cinéticas,

observa-se o consumo do substrato pelos dois microrganismos ao longo dos processos,

em virtude do seu uso para o desenvolvimento dos mesmos, como observado a

degradação da celulose o que proporcionou a produção de outros metabólitos.

Com o objetivo de quantificar o teor de açúcares redutores totais provenientes da

possível degradação da celulose e posteriormente o consumo pelos dois fungos

utilizados no decorrer do cultivo, foi realizada a quantificação de açúcares redutores

totais. Embora tenha sido utilizado o bagaço do coco de mesma fonte, o microrganismo

usado poderia causar diferenças no açúcar redutor. Contudo, é importante salientar que

a concentração de açúcares redutores totais presentes no meio de cultivo diminui com o



passar das horas de cultivo em ambas as cinéticas, o que provavelmente está ligado ao

consumo dos açúcares presentes no meio de cultura como fonte de carbono. A redução

dos ART foi esperada, como observado na Figura 4.24 utilizando o fungo isolado

(Aspergillus fumigatus), após 72 houve uma redução e a partir de 168 h o teor de ART

se manteve estável. Para o fungo Penicillium chrysogenum representado pela Figura

4.25 o perfil de ART decresce de maneira bem acentuada entre 0 e 72 h , reduzindo-se

ainda de modo expressivo até 120 h, onde se mantém constante até 168 h, seu valor

decresce ao atingir 192 h e em seguida permanece constante. Em ambas as cinéticas, o

consumo do substrato é intenso, confirmando que além de ser um bom material para o

crescimento dos fungos, o bagaço do coco foi consumido para o seu desenvolvimento e

para o seu metabolismo.

Nas duas cinéticas realizadas foi possível observar o consumo das proteínas, em

ambas há uma redução do teor de proteína,utilizando o bagaço do coco como sustrato,

existe diferença no consumo das proteínas, isso em decorrência dos mecanismos de

ação dos microrganismos que são específicos, podendo variar conforme a cultura e o

ambiente. Embora os valores observados tenham sido diferentes em decorrência da ação

dos microrganismos serem diferentes, em especial para a hora zero, a redução na

concentração de proteínas nos meios pode estar ligada a utilização como fonte de

nitrogênio da proteína ou a possível ação de proteases, ou até mesmo relacionado com a

taxa de renovação de proteínas durante a esporulação, alguns fatores afetam a

esporulação, a redução da concentração de nutrientes, tensão de oxigênio ou

composição do meio, podendo estar ligada a produção desses enzimas. (Neto, 2012). Na

Figura 4.25 observa-se o aumento de proteína no tempo 96 horas isso pode indicar

síntese de proteínas (enzimas) para a degradação da celulose, observando o declíneo até

ficar constante.

A ordem de degradação das fontes de carbono pelo microrganismo vai depender

da energia que demande a degradação de cada fonte, ou seja, as primeiras a serem

degradadas demandam menor esforço energético do microrganismo (Fernández, 2009).

A Figura 4.26 representa o comportamento das duas enzimas produzidas pelo

fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante os 10 dias, a CMCase apresentou a maior

atividade (0,615 UI/mL) no segundo dia. Após 48 horas ocorreu uma redução bastante

acentuada até as 96 horas, haja visto que o microrganismo não está mais hidrolisando o

subtrato para quebrar a celulose. Para a enzima Avicelase a atividade máxima foi



alcançada em 96 horas com uma atividade de 0,022 UI/mL, e em seguida houve uma

redução na sua produção.

Figura 4.26 - Perfil de atividade de CMCase e Avicelase durante os 10 dias na

fermentação semi-sólida, utilizando o fungo isolado (Aspergillus fumigatus).

As enzimas carboximetilcelulase (endoglucanase) e avicelase (exoglucanase)

formam um sistema enzimático hidrolítico importante para a degradação da celulose

(Bayer e Lamed, 1992). Essas duas enzimas presentes na cinética em questão pode

comprovar o potencial de hidrólise do substrato que este fungo isolado (Aspergillus

fumigatus) possui em degradar a celulose, haja visto que a maior produtividade foi da

enzima CMCase no segundo dia, confirmando desde modo que a celulose do bagaço do

coco está induzindo a produção das enzimas celulolíticas constitutivas que iniciarão a

hidrólise da celulose, induzido a síntese de endoglucanases (CMCase). A redução das

atividades, possivelmente está ligado ao esgotamento de seu substrato, o polissacarídeo

celulósico. Uma outra hipótese é a repressão catabólica supostamente possa estar

acontecendo, ocasionando uma redução nas atividades dessas enzimas, a inibição pode

ser provocada por metabólitos ou ácidos produzido durante a fermentação.

Os açúcares agiriam como verdadeiros indutores, direta ou indiretamente,

influenciando a ligação de proteínas ao DNA, promovendo, assim, a expressão dos

genes para celulases. A presença de substratos facilmente assimiláveis, a repressão do



catabólito, o acúmulo do produto final ou fontes de carbono restritas podem inibir a

síntese destas enzimas (Ilmén et al., 1997).

A Figura 4.27 mostra o comportamento das quatro enzimas produzidas pelo

fungo Penicillium chrysogenum durante os 10 dias, no caso da CMCase a mesma

apresentou o maior valor no quinto dia, com atividade máxima de 0,431 UI/mL, após

120 horas ocorreu uma redução bastante acentuada até as 168 horas, haja visto que o

microrganismo não está mais hidrolisando a celulose. Para a enzima Avicelase a

atividade máxima foi alcançada em 96 horas com uma produção de 0,397 UI/mL e, em

seguida houve uma queda na sua produção entre 96 e 120 horas, para a Xilanase seu

pico máximo foi de 0,931 UI/mL em 96 horas havendo uma redução brusca até 120

horas. Para a FPase sua atividade máxima foi em 72 horas com uma produção de 0,470

UI/mL e depois houve uma redução da atividade da mesma.

Figura 4.27 – Perfil de Atividade das enzimas CMCase, Xilanase, Avicelase e FPase

durante os 10 dias na fermentação semi-sólida, utilizando o fungo Penicillium

chrysogenum e o coco como substrato.

Observa-se em ambas as cinéticas a ocorrência de um pico de produção

enzimática em curto período, nos tempos entre 72 e 120 horas. A redução das atividades

pode estar relacionada à desestabilização da enzima pelo efeito do pH, uma vez que se

torna difícil o controle do pH devido a formação de metabólicos secundários, o aumento



da temperatura em decorrência do metabolismo do microrganismo ou ainda à produção

de enzimas inibidoras pelo microrganismo, conforme já relatado por Palma et al.(2000).

O aumento da atividade enzimática em função do tempo de fermentação pode

ser explicado em razão da grande disponibilidade de açúcares redutores da matéria-

prima, necessários para o desenvolvimento do microrganismo. Entre 24 e 120 horas de

fermentação todas as enzimas apresentaram picos máximos na atividade enzimática e

logo após os picos a redução das mesmas. Durante o processo fermentativo as

endoglucanases hidrolisam preferencialmente as ligações internas no polímero da

celulose, produzindo oligossacarídeos de menor peso molecular. Após 120 horas houve

uma redução na produção de endoglucanase, fato possivelmente atribuído ao

esgotamento de nutrientes, ou por acúmulo de produtos inibidores da síntese enzimática

ou do crescimento celular. Um ponto importante a ser notado foi o fato dos valores de

endoglucanases terem sido menores do que as atividades encontradas para as celulases

totais, o que pode constituir que a atuação desta enzima é importante para a posterior

atuação das celulases totais.

Os resíduos da agricultura contêm de 20 a 30% de material hemicelulítico. Esses

resíduos, na forma natural, são fonte de xilana e xilo-oligômeros (Kulkarni et al., 1999)

favorecendo a atividade de xilanase. De acordo com o valor da hemicelulose do bagaço

do coco obtido que foi de 23,79% as Xilanases que são as enzimas responsáveis pela

hidrólise da xilana, o principal polissacarídeo constituinte das hemiceluloses, atuaram

de maneira bem expressiva. Os resultados obtidos, sugerem que a ação destas enzimas

ao hidrolisar a fração celulósica provocaram uma bertura das fibras, facilitando o acesso

das endoxilanases e consequentemente, uma maior conversão da fração

hemicelulosósica a açúcares, como a xilose, por exemplo.

A atividade máxima da Avicelase foi atingida no tempo de 96 horas de

incubação da cultura, com níveis de 0,397 UI/mL com posterior declíneo da atividade.

Isto sugere que a produção da Avicelase está diretamente ligada à cultura

metabolicamente ativa. Outra hipótese é a presença de glicose e outras fontes de

carbono, facilmente metabolizáveis, possam reprimir a síntese Avicelase (Castro, 2006).

Os produtos finais de uma dada via metabólica são frequentemente inibidores

das enzimas que catalisam os primeiros passos da via. Esse mecanismo é conhecido

como feedback negativo ou autoalimentação (Whitaker, 1994). As enzimas



normalmente têm um mecanismo de controle de expressão que pode ser estimulado ou

inibido por produtos do meio. Os produtos finais de uma dada via metabólica são

frequentemente inibidores de enzimas que catalisam os primeiros passos da via. Este

mecanismo é conhecido como a realimentação negativa (Santana et al., 2012). A

produção de enzimas no início é lento, em seguida, acelera até atingir o seu valor

máximo; depois disso, a concentração de produtos gerados são inibidos e as atividades

enzimáticas são reduzidas, o que também foi observado no presente estudo para o

resíduo testado.

CAPÍTULO V

CONCLUSÕES

Capítulo 5 – Conclusões


5. Conclusões

A caracterização química e físico-química dos resíduos bagaço do coco e

pedúnculo de caju indicaram seu potencial como substrato para produção de

enzimas.

O fungo isolado (Aspergillus fumigatus) apresentou potencial na produção da

enzima CMCase, e enzima Avicelase usando apenas o bagaço do coco como

substrato.

O fungo Penicillium chrysogenum apresentou atividades enzimáticas CMCase;

FPase; Avicelase e Xilanase usando uma mistura de bagaço do coco e o

pedúnculo de caju, bem como utilizando apenas o bagaco de coco como

substratos.

CAPÍTULO VI

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Capítulo 6 – Referências Bibliográficas


6. Referências Bibliográficas

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