Estudo da Formao de Poros na Membrana Durante a Eletroporao de Clulas Biolgicas

Lucenara S. Pereira1*, Guilherme B. Pintarelli1** e Daniela O. H. Suzuki1***

1. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC, Brasil*lucenarapereira@gmail.com, ** guipintarelli@gmail.com , ***suzuki@eel.ufsc.br

Resumo: Este artigo tem o intuito de estudar a

formao de poros na membrana plasmtica de

uma clula biolgica isolada durante o processo

de eletroporao. Neste intuito, esto sendo

estudados modelos matemticos de eletroporao

e caractersticas do pulso eltrico aplicado, a fim

de analisar a influncia das variaes da

amplitude e da durao do mesmo. Essa anlise

feita a partir de simulaes no software

COMSOL Multiphysics, que fornece resultados em termos de potencial

transmembrana e condutividade eltrica. O

potencial transmembrana serve como um

indicador de eletroporao, pois as faixas de

tenso em que ele se encontra apontam se ocorre

ou no eletroporao, e se esse processo vai ser

reversvel ou irreversvel.

Palvras-chave: eletroporao, clula biolgica,

potencial transmembrana, condutividade, pulso

eltrico.

1. Introduo e Teoria

Este trabalho tem como objetivo o estudo do fenmeno da eletroporao, que a aplicao de um campo eltrico em uma clula biolgica, provocando alteraes transitrias na permeabilidade e condutividade das membranas plasmtica e das organelas. Dessa forma, tem-se a formao de poros, que permitem a troca de material entre os meios interno e externo da clula.

A eletroporao composta por uma srie de processos com fases distintas. Inicialmente, um pulso com um dado valor de tenso aplicado na membrana por um determinado tempo, provocando um acmulo de cargas devido migrao de ons. Quando essa carga atinge um ponto crtico, a membrana lipdica sofre um rearranjo em sua morfologia, formando pr-poros, e na sequncia poros propriamente ditos. Alguns estudos sugerem que esses pr-poros so pequenas

deformaes, de cerca de 3 (0,3 nanmetro) de dimetro. Logo, a transio de um estado no condutor (pr-poros) para um condutor (poros) depende do rearranjo da extremidade do poro. Ao encerrar o pulso, os poros podem se fechar, e a estrutura retornar ao seu estado inicial, no caso da eletroporao ser reversvel. Ou ainda, para

eletroporao irreversvel, manterem-se abertos ou expandirem-se, levando eventualmente a ruptura da clula [1].

O que define o destino final do poro a tenso transmembrana (Vm), que a diferena depotencial induzida entre as camadas externa e interna da membrana. Quando esse potencial fica em torno de 0.2V < Vm < 1V, os poros gerados sefecham ao final do estmulo, restabelecendo a membrana. J para o caso de Vm ultrapassar 1V, osporos permanecero abertos, provocando desequilbrio inico, rompimento da membrana e morte celular [2].

A tcnica da eletroporao pode ser utilizada em diversas aplicaes em variadas reas, como biotecnologia e medicina. Por se tratar de uma ferramenta no qumica e no txica, ela pode ser utilizada para inserir ou retirar molculas de uma clula. E uma forma promissora para tratamento de cncer.

O tratamento de cncer aliando eletroporao e quimioterapia (eletroquimioterapia) uma das principais motivaes dos estudos atuais em eletroporao, devido a melhora na eficincia das drogas utilizadas, por meio do aumento da permeabilidade celular e facilitao da entrada das drogas, devido abertura de poros em uma regio. Isso provoca a reduo dos efeitos colaterais da quimioterapia, como nuseas, fadiga e queda de cabelo.

A Figura 1 mostra possveis respostas de uma clula entre dois eletrodos, exposta a um pulso eltrico, e sugere mltiplos aproveitamentos da eletroporao, como: a fuso celular, a insero de molculas grandes ou pequenas, que podem ser protenas, ons, drogas, DNA ou substncias impermeveis e at mesmo a destruio da clula. No entanto, o sucesso das aplicaes depende, sobretudo, das propriedades do pulso eltrico, esse deve ser controlado com preciso para a obteno de um dado resultado. De modo geral, os parmetros de controle de um pulso DC est na sua intensidade e durao, enquanto que de um pulso AC est na amplitude e frequncia. Alm desses fatores, tambm possvel controlar o nmero de pulsos aplicados e a distncia entre eletrodos.

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mailto:lucenarapereira@gmail.comfile:///C:/Users/Guilherme/Downloads/guipintarelli@gmail.commailto:suzuki@eel.ufsc.br

Figura 1. Aplicaes da eletroporao.

Uma vez que a abertura dos poros durante a

eletroporao ocorre em ordem nano mtrica e em

escala de nano segundos, torna-se fundamental o

uso de modelos matemticos e simulaes como

auxlio no estudo desse processo.

Dessa forma, esse trabalho tem como objetivo

o estudo da formao de poros na membrana

plasmtica, a fim de identificar previamente a

influncia de cada varivel ao longo do processo,

buscando configuraes que proporcionem

melhores resultados.

2. Modelo Numrico e Equaes

Governantes

No estgio atual desta pesquisa, adotou-se um modelo matemtico no-linear para o estudo dos parmetros da eletroporao. Ele baseado na equao diferencial parcial de Smoluchowski, que descreve a formao e expanso dos poros com diferentes raios, durante o processo de eletroporao. No entanto, para pulsos AC ou DC de curta durao ( ou ), esse modelo pode ser simplificado para uma equao diferencial ordinria, de menor custo computacional.

As simplificaes do modelo so feitas considerando-se que os poros no se expandem significativamente aps a sua criao. Essa considerao vlida quando os campos eltricos aplicados so de curta durao e alta intensidade. Os resultados obtidos em [3] e [4], usando a equao de Smoluchowski, demonstraram esse fato, pois os poros foram criados com tamanho mnimo de 0.8nm [3] e 0.5nm e expandiram-se lentamente at 0.83nm [3] e 0.75nm [4], equilibrando-se e assim permanecendo at a fase de fechamento.

De acordo com o modelo assinttico da eletroporao, a densidade de poros, (), dada por [5]:

()

=

(()

)

2

(1 ()

0

(()

)

2

) ,

onde () o potencial transmembrana, atenso caracterstica da eletroporao, 0 adensidade de poros de equilbrio quando = 0,e e so constantes.

A condutividade mdia da membrana nas regies onde os poros so formados [6]:

() = 0 + ()2,

onde 0 a condutividade da membrana antes daeletroporao, a condutividade do meiodentro do poro. O raio do poro e :

=1

00

0

00++

0+

,

em que 0 a barreira de energia dentro do poro, dado pela relao entre o raio do poro e a

espessura da membrana e =

o potencial

transmembrana adimensional.

3. Mtodos

Tendo como objetivo estudar a formao de poros na membrana plasmtica, definiu-se uma geometria celular conforme Figura 2. A partir de um eixo 2D axissimtrico, uma clula esfrica isolada recebe um campo eltrico uniforme aplicado por duas placas paralelas. Nesta configurao, o modelo matemtico aplicado na membrana plasmtica, a fim de se obter o potencial transmembrana (Vm) e a condutividade(c) nessa regio.

Como definies de parmetros, tem-se a condutividade inicial da membrana plasmtica (0), condutividade do citoplasma () econdutividade do meio extra-celular (). Almdos parmetros de condutividade, tm-se os parmetros geomtricos, como raio da clula ()e espessura da membrana plasmtica (). Osvalores destes parmetros e dos demais envolvidos no processo de modelagem esto descritos na Tabela 1.

As simulaes esto sendo realizadas utilizando o mdulo AC/DC do software COMSOL Multiphysics . A interface fsica

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empregada a Electric Currents (), que contm as equaes relacionadas a campo eltrico e densidade de corrente. Os estudos esto sendo feitos no domnio do tempo.

Para a composio da malha, foi definido elementos extremamente finos para as membranas e finos para o restante da clula e meio extra celular. Um Ground e um Terminal foram adicionados a fim de descrever os eletrodos que aplicam o pulso eltrico, a uma dada amplitude e durao.

Com a geometria e o modelo implementados no COMSOL, fez-se o estudo da formao de poros na membrana plasmtica, aplicando-se pulsos eltricos quadrticos com variaes em termos de amplitude e durao. Os efeitos foram analisados atravs do potencial transmembrana e condutividade celular.

Alm disso, foi verificada a distribuio de campo eltrico neste sistema, e encontra-se descrito na Figura 3.

Figura 2. Geometria celular.

4. Resultados Experimentais

Foi realizada uma srie de testes, com

variaes na amplitude e durao do pulso

eltrico, mantendo-se a distncia entre os

eletrodos. Logo, o campo eltrico aplicado varia

de acordo com a amplitude do pulso.

Tabela 1: Parmetros utilizados.

Parmetro Smbolo Valor

Condutividade

do meio extra-

celular 1.2 S/m

Raio celular 10

Espessura da

membrana

plasmtica 5

Condutividade

do citoplasma 0.3 S/m

Condutividade

inicial da

membrana

plasmtica

0 9.5 109 /

Condutividade

da soluo

dentro do poro

1.2 /

Raio do poro 0.8

Densidade da

taxa de criao

dos poros 1 10921

Tenso

caracterstica da

eletroporao

224

Densidade dos

poros de

equilbrio 0 3.3 10

62

Constante de

eletroporao 1

Barreira de

energia do poro 0 3.2

Relao entre o

raio do poro e a

espessura da

membrana

0.15

Carga eltrica

de um eltron 1.65 10

19

Constante de

Boltzmamn 1.38 1023 /

Temperatura 295

H

Vt

Isolamento

GND Referncia

Vt

Eixo de simetria

Ground

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Figura 3. Distribuio de campo eltrico.

Inicialmente, mantendo-se a amplitude do

pulso eltrico em 200V, variou-se a durao do pulso em 100, 100 e 15. As curvas para o potencial transmembrana nos trs casos encontram-se nas Figuras 4, 5 e 6, respectivamente. As condutividades correspondentes esto nas Figuras 7, 8 e 9, respectivamente.

Num segundo momento, tendo como foco a anlise da influncia da amplitude do pulso, manteve-se a durao do pulso em 100, e variou-se para amplitudes de 100V e 400V, valores abaixo e acima dos 200V analisados. O potencial transmembrana para ambos os casos encontra-se nas Figuras 10 e 11, respectivamente.

Os grficos que representam a tenso transmembrana foram plotados em relao ao ngulo de varredura da membrana celular, sendo que em cada figura esto as curvas para os tempos inicial e final do pulso eltrico. Por sua vez, os grficos de condutividade foram plotados ao longo do tempo, a fim de demonstrar o aumento causado neste parmetro, no intervalo de durao do pulso.

Analisando os resultados, observa-se o quanto o pulso eltrico perturba a membrana celular, em maior ou menor intensidade. No primeiro caso, para uma amplitude de 200V e duraes de 100, 100 e 15, observa-se trs fenmenos distintos: para 100 tem-se > 1, para 100 tem-se 0.2 < < 1 e para 15 tem-se < 0.2. Logo, pode-se dizer que no primeiro caso ocorreria apoptose celular, no segundo caso eletroporao reversvel e no ltimo caso no ocorreria eletroporao.

No segundo experimento, mantendo-se a durao do pulso em 100, pode-se analisar as

amplitudes de 100, 200 e 300. Observa-se que para 100V, os valores de atingiram um potencial mximo de 0.65. Esse valor suficiente para transformar poros hidrofbicos em hidroflicos, conforme a teoria da permeabilizao da membrana, permitindo que determinadas substncias ou plasmdeos do meio extra-celular penetrem no citoplasma. Porm, como foi inferior a 1V, no ocorre apoptose da clula, como foi verificado no primeiro experimento com mesma durao porm amplitude superior. Por fim, tem-se um pulso com durao de 100 e amplitude ainda mais elevada: 300V. Com isso, pode-se verificar que o potencial transmembrana eleva-se ainda mais, atingindo valores da ordem de 1.6V, que certamente romperiam a estrutura celular.

Alm dessas observaes, de modo geral pode-se verificar a queda do potencial transmembrana a medida que se afasta do ponto central da membrana plasmtica ( = 00). Esse fato ocorre porque a predominncia de abertura dos poros est na regio dos polos da clula, que so os pontos onde a membrana celular est mais prxima dos eletrodos. Inclusive pode-se definir que existe uma linha do equador na clula, formada por uma linha imaginria traada em torno da clula igualmente distante de ambos os polos, dividindo-a em hemisfrios norte e sul. Assim, pode-se dizer que o nmero de nanoporos criados diminui a medida que o ngulo de anlise se movimenta dos polos para o equador, ou seja, de 0 para 90, no caso do intervalo das curvas analisadas neste trabalho.

Em relao a condutividade, nota-se que ela aumenta ao longo do tempo, atingindo mximos ao final do pulso que acompanham o potencial transmembrana. No primeiro experimento, para uma amplitude de 200, no pulso de durao de 100, a condutividade mxima ficou em torno de 70 107. J para uma durao de 100, a condutividade foi reduzida para um mximo em torno de 22 1010. Quando o pulso aplicado foi configurado para 15, a condutividade ficou em torno de 32 1010. Observa-se que a curva para o terceiro caso difere das demais, uma vez que no ocorre eletroporao, e no h troca de ons atravs dos poros. No segundo experimento, para um pulso de 100, nos pulsos de 300, 200 e 100, as condutividades mximas ficaram em 45 106, 70 107 e 12 107, respectivamente, reduzindo-se de forma proporcional a .

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Figura 4. Potencial transmembrana para um pulso

de 200V e 100.

Figura 5. Potencial transmembrana para um pulso

de 200V e 100.

Figura 6. Potencial transmembrana para um pulso

de 200V e 15.

Figura 7. Condutividade da membrana para um

pulso de 200V e 100.

Figura 8. Condutividade da membrana para um

pulso de 200V e 100.

Figura 9. Condutividade da membrana para um

pulso de 200V e 15.

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Figura 10. Potencial transmembrana para um

pulso de 100V e 100.

Figura 11. Potencial transmembrana para um

pulso de 300V e 100.

5. Discusso

Os resultados demonstram que os pulsos

podem ser configurados em uma determinada faixa de acordo com a aplicao do processo de eletroporao. Se o objetivo for a abertura dos poros de forma reversvel, os pulsos devem ter duraes maiores e amplitudes mdias. Enquanto que para se obter a apoptose da clula os pulsos devem ser de amplitudes elevadas e duraes na faixa de microssegundos.

Um fato que merece destaque a ausncia da

eletroporao em pulsos de poucos nano segundos

e amplitudes elevadas, onde no ocorre a

eletroporao na membrana plasmtica, pois o

tempo de carregamento da membrana superior a

durao do pulso.

Figura 12. Condutividade da membrana para um

pulso de 100V e 100.

Figura 13. Condutividade da membrana para um

pulso de 300V e 100.

Essa caracterstica ser estudada em trabalhos

futuros, a fim de analisar a viabilidade da

aplicao de pulsos de nano segundos para

eletroporar o ncleo e as organelas de uma clula,

cujos tempos de carregamento so

significativamente menores do que o da

membrana plasmtica. Uma aplicao

interessante nesse caso a transferncia gentica,

onde necessria a abertura de poros no ncleo

celular.

6. Concluses

A eletroporao uma tcnica que vem sendo

estudada em inmeras aplicaes na rea da sade, tanto em nvel celular quanto em suspenso em tecidos. Este trabalho aborda o nvel celular, estudando a formao de poros na membrana

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plasmtica, a partir de modelos matemticos que so resolvidos utilizando o software COMSOL.

Tendo em vista que essa dinmica de abertura de poros extremamente dependente das caractersticas do pulso eltrico aplicado, analisou-se a influncia da durao e amplitude de um pulso DC, dado por uma onda quadrada com largura variante.

Assim sendo, inicialmente manteve-se a amplitude do pulso em 200V e variou-se a durao para 100, 100 e 15, verificando-se que a medida que a durao do pulso era reduzida, o potencial transmembrana e a condutividade eltrica tambm eram reduzidos, desde o nvel de apoptose at no ocorrncia da eletroporao no ltimo caso.

A seguir, analisou-se a influncia da amplitude do pulso para uma mesma durao. Logo, mantendo-se o pulso em 100, que havia sido analisado para uma amplitude de 200V, fez-se duas novas anlises: para 100V e para 300V. Os resultados demonstraram que medida que a amplitude foi reduzida, o potencial transmembrana e a condutividade tambm se reduziram.

Esse estudo indica que o pulso pode ser controlado para qualquer tipo de aplicao, seja ela reversvel ou irreversvel. Alm disso, de acordo com as caractersticas de potncia e chaveamento do dispositivo eletrnico utilizado para a aplicao do pulso eltrico, esse controle pode ser tanto em nvel de amplitude quanto de durao.

Como continuao deste trabalho, pretende-se

analisar a viabilidade da aplicao de pulsos de

nano segundos para eletroporar as organelas e o

ncleo de uma clula biolgica, com foco em

aplicaes de transferncia gentica.

7. Referncias

1. Miklavi and Towhidi, Numerical study of

the electroporation pulse shape effect on

molecular uptake of biological cells, Radiology

and Oncology, vol. 1, pp. 34-41, 2010.

2. Suzuki, Estudo da Condutividade Eltrica de

Suspenses de Eritrcitos de Ratos Durante

Aplicao de Campos Eltricos Intensos: Teoria,

Modelagem e Experimentao. Tese

(Doutorado) Universidade Federal de Santa

Catarina, 2009.

3. Vasilkoski, Esser, Gowrishankar, Weaver, "Membrane electroporation: The absolute rate

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4. Joshi, Hu, Schoenbach, "Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric

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5. Neu and Krassowska, "Asymptotic model of electroporation," Physical Review, vol. 59, pp.

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6. Pucihar, Miklavcic, Kotnik, "A Time-Dependent Numerical Model of Transmembrane

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