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GRACIELLE TELES PÁDUA ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) MULTIRRESISTENTE EM CARCAÇAS DE BOVINOS JATAÍ – GO
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GRACIELLE TELES PÁDUA
ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)
MULTIRRESISTENTE EM CARCAÇAS DE BOVINOS
JATAÍ – GO
ii
GRACIELLE TELES PÁDUA
ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) MULTIRRESISTENTE EM
CARCAÇAS DE BOVINOS
ARIEL EURIDES STELLA
Dissertação apresentada ao Programa de Biociência Animal da Universidade Federal de Goiás, Regional Jataí, como pré-requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Biociência Animal.
JATAÍ – GO
2018
iii
iv
“Dedico esse trabalho ao meu amado esposo
Eduardo Siqueira Martins, que durante todo
esse tempo esteve ao meu lado me
incentivando, guiando, apoiando e que não
mediu esforços para que meu sonho se tornasse
realidade.
Dedico à minha amada família Solange Gomes
Silva Pádua, Marcos Teodoro Pádua (in
memória) e Francielle Teles Pádua, que no
decorrer da minha vida me proporcionaram,
além de extenso carinho e amor, princípios de
integridade, perseverança e de procurar sempre
em Deus a força maior para meu
desenvolvimento como ser humano.”
v
Agradeço primeiramente à Deus, sem ele nada disso seria possível, agradeço
pelos momentos felizes, mas também pelos momentos de dificuldade que me fizeram
engrandecer.
Agradeço o apoio de todos os colegas, que durante esses anos estiveram ao
meu lado. Em especial as minhas queridas amigas Vanessa de Freitas Ferreira e
Olívia Basso que se tornaram companheiras de jornada; e ao médico Veterinário
Maurício Costa Montes, pela ajuda durante todas as fases do projeto, sem o qual este
não seria possível de se realizar.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ariel Eurides Stella, que aceitou com toda gentileza
o desafio de me orientar e, sem ele nada disso seria possível. Obrigada pela
paciência, mesmo com meu desespero no decorrer desses anos.
Aos meus colegas de trabalho, que sempre tiveram compreensão e me
ajudaram no decorrer deste processo. Em especial ao meu querido amigo José Tiago
das Neves Neto que me deu apoio desde o princípio e que sempre acreditou no meu
sucesso.
Aos colegas de Laboratório Angélica Franco Oliveira, Gisele Fonseca Ventura
e Jefferson Fernando Naves Pinto, que além de me ajudarem, me ensinaram com
muita paciência.
E, por fim agradeço a todos aqueles que mesmo não estando presente,
torceram, me incentivaram e rezaram por mim.
vi
“O único lugar onde o sucesso vem antes do trabalho é no dicionário.”
(Albert Einstein)
vii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 2
2. CAPÍTULO: ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)
MULTIRRESISTENTE EM CARCAÇAS DE BOVINOS ......................................... 3
2.1. Resumo ........................................................................................................... 3
2.2. Introdução........................................................................................................ 4
2.3. Materiais e Métodos ........................................................................................ 7
2.4. Resultados ....................................................................................................... 9
2.5. Discussão ...................................................................................................... 12
2.6. Conclusões .................................................................................................... 15
Referências ................................................................................................... 16
3. CONCLUSÕES .................................................................................................... 19
ANEXO ................................................................................................................ 20
1.INTRODUÇÃO
Uma crescente preocupação é a contaminação dos alimentos de origem
animal. As doenças veiculadas por alimentos (DVA’s) são caracterizadas por
provocarem anorexia, náuseas, vômitos e/ou diarreia, acompanhada ou não de febre,
relacionada à ingestão de alimentos e/ou água contaminados. As taxas de DVA’s,
causadas por agentes patogênicos gastrointestinais, continuam a ser uma
preocupação tanto nos países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento.
Estima-se que a cada ano as DVA’s atinjam 1 em cada 10 pessoas no mundo
e provocam mais de 420.000 mortes. Essas doenças podem ser fatais principalmente
em crianças menores de cinco anos. No continente americano os dados são
alarmantes, onde a cada ano, 77 milhões de pessoas adoecem e mais de 9.000
morrem por DVA’s. A situação no Brasil não é diferente, onde têm sido relatadas altas
taxas de DVA’s ao longo dos anos. A região sudeste é onde tem-se relatado as
maiores incidências.
As bactérias da família Enterobacteriaceae, têm importância relativamente
grande nessas contaminações, uma vez que estão mundialmente distribuídas e
habitam o trato intestinal de animais e de humanos. Um dos principais patógenos
pertencentes a essa família é a Escherichia coli (E. coli). Ela ocupa o 2° lugar entre os
microrganismos envolvidos em surtos de DVA’s no Brasil e está entre os 4 mais
importantes a nível mundial.
Muitas linhagens de E. coli são de baixa virulência, mas podem causar
infecções oportunistas, além disso, as linhagens patogênicas possuem fatores de
virulência como cápsula, endotoxina, adesinas, enterotoxinas, que provocam doenças
no homem. Alguns fatores relacionados ao hospedeiro como idade, estado
imunológico e natureza da dieta são predisponentes à colonização pelo
microrganismo.
As E. coli diarreiogênicas podem ser classificadas em grupos, de acordo com
as características individuais de patogenicidade: ETEC (enterotoxigênica), EPEC
(enteropatogênica), EHEC (enterohemorrágica), STEC (shigatoxigênica), EIEC
(enteroinvasiva), EAEC (enteroagregativa) e DAEC (difusamente aderente).
Entre essas várias categorias, podemos destacar a STEC, que é caracterizada
pela produção de potentes citotoxinas que apresentam a capacidade de inibir a
síntese protéica das células. Em seu subgrupo encontra-se a E. coli O157:H7,
2
identificada pela primeira vez em 1982, envolvida em surtos de DVA’s e pode provocar
colite hemorrágica (CH) e síndrome urêmica hemolítica (SHU), que é caracterizada
por anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiência renal aguda. Essa categoria
têm como principal reservatório natural o trato gastrointestinal dos bovinos e ovinos.
Outra categoria de relevância são as EPEC, o primeiro grupo relacionado a
casos de diarreia em lactentes, sendo a aderência, por meio de fímbrias, seu principal
fator de patogenicidade. Ocorre um adesão íntima entre a bactéria e a membrana das
células do epitélio intestinal, seguido pela destruição das microvilosidades, com a
polimerização dos filamentos de actina, com isso têm-se a formação de uma lesão
característica conhecida como adesão e esfacelamento (A/E).
A importância da E. coli se dá pelo fato de serem naturalmente resistentes a
vários antibióticos e adquirirem resistência a praticamente todos eles, pelo do uso
inadequado dos mesmos. Além de serem capazes de produzir a enzima beta-
lactamase de espectro estendido (ESBL), que atua hidrolisando o anel beta-lactâmico,
pela quebra da ligação amida, de importantes antibióticos como, penicilinas,
cefalosporina, carbapenêmicos e monobactâmicos, fazendo com que eles percam a
capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana.
Sendo assim, a prevenção e controle da disseminação global de DVA’s
causadas por microrganismos patogênicos, requer contínuos esforços internacionais
integrados para rastrear a propagação desses agentes e antecipar o surgimento de
patógenos resistentes, além de conceber estratégias que diminuam o risco de
contaminação dos alimentos distribuídos, atendendo a demanda internacional cada
vez mais complexa e exigente.
Com o intuito de verificar a qualidade microbiológica frente a presença de E.
coli nos produtos de origem animal, o objetivo deste trabalho foi isolar e identificar
cepas de E. coli presentes em carcaças de bovinos abatidos no município de Mineiros-
GO, além de avaliar a frequência dos patotipos STEC e EPEC nas amostras, e
determinar a suscetibilidade das cepas isoladas frente a diferentes antimicrobianos,
bem como a possível presença de E. coli produtora de ESBL.
3
2.CAPÍTULO
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) multirresistente em carcaças de
bovinos.
[Escherichia coli enteropathogenic (EPEC) multiresistant in bovine carcasses]
Gracielle Teles Pádua¹; Ariel Eurides Stella¹, Angélica Franco Oliveira¹, Gisele Fonseca
Ventura¹, Jefferson Fernando Naves Pinto², Cecília Nunes Moreira³, Maurício Costa
Montes⁴, Paula Siqueira Martins⁴
1 - Laboratório de Microbiologia Veterinária da Universidade Federal de Goiás, Regional
Jataí – Jataí, GO.
2 - Laboratório de Recursos Genéticos da Universidade Federal de Goiás, Regional Jataí
– Jataí, GO.
3 – Laboratório de Práticas Veterinárias da Universidade Federal de Goiás, Regional Jataí
– Jataí, GO.
4 – Médico(a) Veterinário(a).
RESUMO: A Escherichia coli (E. coli) ocupa o 2° lugar entre os microrganismos
envolvidos em surtos de DVA’s no Brasil e está entre os 4 mais importantes a nível
mundial, devido a sua importância o intuito do trabalho foi de verificar a qualidade
microbiológica frente a presença de E. coli nos produtos de origem animal. Um total de
365 cepas foram isoladas por meio de suabes de arrasto de 154 carcaças de bovinos,
abatidos no município de Mineiros – GO. A incidência de E. coli nas amostras coletadas
foi de 81,65%. Das cepas isoladas, 16 possuíam o gene (eae), e nenhuma apresentou os
genes (stx1, stx2). Portanto, a frequência destas nas carcaças foi de 9,74% (15/154). As
16 cepas foram testadas para os genes de adesão (ToxB, efa1), porém nenhuma apresentou
os referidos genes. Também foram testadas para motilidade onde 100% (16/16) foram
positivas, e para hemólise onde se obteve incidência de 37,5% (6/16). Quanto ao perfil de
resistência a antimicrobianos foram testadas 50 cepas, e os antibióticos com maiores
porcentagens de resistência entre as bactérias foram a Cefalotina com 82% (41/50),
seguido pela Gentamicina e Amicacina com 26% (13/50) cada. Nenhuma das amostras
apresentou a produção da enzima beta-lactamase de espectro estendido. Os resultados
4
demonstram a presença de EPEC multirresistentes em carcaças de bovinos abatidos no
município de Mineiros –GO.
Palavras-chave: antimicrobiano, patogenicidade, PCR
ABSTRACT: Escherichia coli (E. coli) occupies the 2nd place among microorganisms
involved in outbreaks of DVA’s in Brazil and is among the 4 most important worldwide,
due to its importance the purpose of the work was to verify the microbiological quality
the presence of E. coli in products of animal origin. A total of 365 strains were isolated
by means of trailing swabs of 154 carcasses of cattle, slaughtered in the municipality of
Mineiros - GO. The incidence of E. coli in the samples collected was 81,65%.Of the
isolates, 16 had the gene (eae), and none had genes (stx1, stx2). Therefore, their frequency
in the carcasses was 9,74% (15/154). All 16 strains were tested for adhesion genes (ToxB,
efa1), but none has these genes. They were also tested for motility where 100% (16/16)
were positive and for hemolysis where a frequency of 37,5% (6/16) was obtained. Fifty
strains were tested for antimicrobial resistance, and the antibiotics with the highest
percentages of resistance among bacteria were Cephalotin with 82% (41/50), followed by
Gentamicin and Amicacin with 26% (13/50) each. None of the samples showed
production of the extended spectrum beta-lactamase enzyme. These results demonstrate
the presence of EPEC multiresistant in bovine carcasses slaughtered in the municipality
of Mineiros-GO.
Keywords: antimicrobial, pathogenicity, PCR
INTRODUÇÃO
As doenças veiculadas por alimentos (DVA’s) têm se tornado cada vez mais
importantes, visto que representam problemas de saúde pública. A ocorrência destas
doenças vêm aumentando mundialmente, ocasionada pelo aumento das populações,
grupos populacionais vulneráveis, processo de urbanização desordenado e a produção de
alimentos em grande escala (Brasil, 2010). Elas são causadas por agentes que penetram o
organismo humano através da ingestão de água ou alimentos contaminados e podem ser
provocadas por bactérias, vírus, parasitas, toxinas, príons, agrotóxicos, substâncias
químicas e metais pesados (Brasil, 2018).
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De acordo com os dados do Ministério da Saúde (2018), em relação as DVA’s no
Brasil nos últimos 10 anos foram relatados 7.589 surtos, produzindo 133.791 doentes e
124 mortes. Dentre as regiões do Brasil, o Centro Oeste ocupa o 4° lugar em relação a
distribuição dos surtos. Já as residências o 1° lugar em relação aos locais de ocorrências,
seguido pelos restaurantes e padarias. Entre os alimentos relacionados aos surtos a carne
bovina in natura, processados e miúdos ocupam o 8° lugar, enquanto os produtos cárneos
embutidos o 13° lugar. A E. coli está em 2° lugar em relação aos microrganismos
presentes nas DVA’s, representando 26,9% dos surtos (Brasil, 2018).
A E. coli têm papel relevante na qualidade da produção industrial de alimentos,
pois faz parte de um grupo de bactérias que podem provocar infecções no trato
gastrointestinal de seres humanos, além de ser o principal indicador de contaminação
fecal durante o processamento de alimentos. A progressão da doença em seres humanos
têm relação direta com a capacidade da E. coli de aderir ao epitélio intestinal, o que é
crucial para sua colonização intestinal (Rigobelo et al., 2011).
Pissetti et al. (2016) cita que a contaminação das carcaças com a microbiota
intestinal pode ocorrer durante o abate, principalmente durante os processos de esfola e
evisceração, no entanto é possível reduzir o número de bactérias até níveis considerados
higienicamente aceitáveis, através de práticas como jejum pré abate, separação entre as
áreas limpa e suja no frigorífico, inspeção rigorosa e higienização das carcaças,
possibilitando que um baixo número de bactérias multirresistentes entre na cadeia de
elaboração de alimentos e chegue ao consumidor Alguns fatores a serem considerados
em relação a E. coli é a capacidade de serem móveis, pois confere a possibilidade da
bactéria se deslocar dentro do microambiente e de que algumas estirpes são capazes de
provocar hemólise, que embora não seja um marcador de virulência, está ligada a
expressão de outros fatores de virulência, além de aumentar a disponibilidade de ferro
através da lise de hemácias, para a bactéria. Entre as várias categorias desse gênero
podemos destacar as E. coli produtoras da toxina shiga (STEC) e as E. coli
enteropatogênicas (EPEC).
De acordo com Coura et al. (2014) os ruminantes são considerados os principais
reservatórios de STEC. Elas são caracterizadas pela produção de potente citotoxina, que
apresenta a capacidade de inibir a síntese proteica das células. A patogênese das infecções
6
por STEC é complexa e multifatorial, e é evidente que a atuação sinérgica de diversos
fatores de virulência geralmente contribui para um prognóstico desfavorável das doenças
causadas por ela. A E. coli enterohemorrágica (EHEC), é um subgrupo dessa categoria e
é responsável por provocar graves doenças nos seres humanos, sendo o sorotipo O157:H7
a principal cepa associada a grandes surtos de colite hemorrágica (CH) e a síndrome
urêmica hemolítica (SHU), que são potencialmente fatais (Karmali et al., 2010).
A EPEC foi o primeiro grupo identificado e associado a casos de diarreia em
lactantes, sendo o seu principal fator de patogenicidade, a aderência. Ela possui o gene
eae, que é responsável por codificar a proteína intimina, que ocasiona uma inserção íntima
entre a E. coli e as células intestinais, provocando uma característica forma de lesão
denominada attaching and effacing (A/E). Vários genes estão relacionados a adesão às
células epiteliais, entre eles os ToxB e efa1. O gene efa1 codifica um fator de aderência,
que é uma adesina que foi originalmente descrita em algumas cepas de EHEC, ele
contribui para a aderência da EPEC às células epiteliais, o que é fundamental para
colonização intestinal e está fortemente relacionado com a virulência e a gravidade da
doença (Viera et al., 2010). Enquanto o gene ToxB, contribui para adesão às células,
através da produção e/ou secreção de proteínas tipo III (Michelacci et al., 2014).
Além dos fatores de virulência característicos dos patotipos, a entrada de bactérias
resistentes aos antimicrobianos na cadeia de produção de alimentos, têm merecido
destaque, principalmente no que diz respeito à capacidade dos isolados de ultrapassar as
barreiras representadas pelo processamento dos produtos de origem animal e chegar ao
consumidor. Altas taxas de resistência à antibióticos vêm sendo encontradas, o que
demonstra uma tendência mundial de isolamento de bactérias multirresistentes. Estudos
de efeitos de antibióticos em populações de E. coli, revelam que o aumento da resistência
pode estar associado com tensões sistêmicas do hospedeiro e pode ser um indicador de
distúrbios do ecossistema da microbiota intestinal, além de provocar efeitos adicionais
sobre a microbiota do intestino, como o estimulo da transferência de genes entre as
bactérias do intestino e a redução de repostas imunes em órgãos periféricos (Looft e Allen,
2012).
Enzimas beta-lactamase de espectro ampliado (ESBLs) produzidas por certas
bactérias, são importantes pois são capazes de inativar antimicrobianos muito utilizados
7
no tratamento de infecções provocadas por enterobactérias, como penicilinas,
cefalosporina e monobactâmicos. A não identificação de ESBL e o uso inadequado de
antibióticos, pode selecionar isolados multirresistentes ocasionando surtos e aumentando
a incidência de mortalidade (Nagai et al., 2016).
Com intuito de verificar a qualidade microbiológica frente a presença de E. coli
nos produtos de origem animal, o objetivo deste trabalho foi isolar e identificar cepas de
E. coli presentes em carcaças de bovinos abatidos no município de Mineiros-GO, além
de avaliar a frequência dos patotipos STEC e EPEC nas amostras, e determinar a
suscetibilidade das cepas isoladas frente a diferentes antimicrobianos, bem como a
possível presença de E. coli produtora de ESBL.
MATERIAIS E MÉTODOS
Os isolados de E. coli utilizados foram obtidos a partir de amostras de suabes de
arrasto de carcaças de bovinos abatidos em frigorífico, no município de Mineiros – GO,
no período compreendido entre fevereiro e junho de 2017. Os suabes foram molhados na
solução de Butterfield’s contendo 0,1% de Tween 20 (Elder et al., 2000) e posteriormente
colocados em caldo nutriente e acondicionados em estufa. Foram realizadas 6 coletas
totalizando 154 amostras (154 carcaças), sendo estas coletadas no pós processamento,
antes da entrada na câmara fria.
Foi utilizado um suabe por carcaça e foram determinados três pontos de coleta em
cada carcaça: garupa, linha média e próximo ao coxão duro. A área coletada foi de
aproximadamente 100cm² em cada ponto, totalizando uma área de 300cm² por carcaça
(Matos et al., 2013). O processamento das amostras foi realizado no Laboratório de
Microbiologia Veterinária da Universidade Federal de Goiás (UFG) – Regional Jataí. Os
isolados foram obtidos através de semeadura dos suabes em agar MacConkey, totalizando
690 cepas, pois de cada amostra foi retirada de 4 à 5 cepas, que após incubação por
24horas à 37°C, foram identificadas bioquimicamente como pertencentes à espécie E.
coli pelos testes de fermentação da lactose, sacarose e glicose, produção de indol, reações
de vermelho de metila e Voges-Proskauer, utilização de citrato, produção de urease e
produção de gás sulfídrico.
Os 365 isolados identificados bioquimicamente como E. coli foram testados no
Laboratório de Recursos Genéticos da UFG - Regional Jataí, através de PCR Multiplex
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realizada em volume final de 25µl, contendo 2,5µl de DNA extraído através de lise
térmica; 12,5µl de Promega Mix (Promega Corporation, USA); 1,5µl de primer forward
(0,5µl de cada) e 1,5µl de primer reverse (0,5µl de cada) (Síntese Biotecnologia) e 7µl de
água milique ultrapura, em relação a presença dos genes stx1, stx2 e eae (Tab. 1). As
amostras foram amplificadas em 35 ciclos, cada ciclo consistindo de 1:30 min. à 94°C
para desnaturação, 1:30 min. à 60°C para anelamento e 1:30 min. à 72°C para extensão
conforme descrito por Vidal et al (2005). Para controle positivo destes genes foi usada a
cepa O157:H7 (stx1+, stx2+, eae+) e para controle negativo foi adicionada uma reação
sem DNA.
Tabela 1. Primers usados na PCR multiplex para amplificação dos genes stx1, stx2 e eae
de Escherichia coli isoladas de carcaças de bovinos. Laboratório de Genética UFG -Jataí
Gene Sequência dos Primers (5'-3') PB Referência
stx1 CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG
348 Vidal et al., 2005
CACCAGACAATGTAACCGCTG
stx2 ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG
584 Vidal et al., 2005
GCGTCATCGTATACACAGGAGC
eae TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT
482 Vidal et al., 2005
GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG
Os isolados EPEC foram testados por PCR simples em volume final de 25µl,
12,5µl de Promega Mix (Promega Corporation, USA); 0,5µl de primer forward e 0,5µl
de primer reverse (Síntese Biotecnologia) e 11,5µl de água milique ultrapura além de uma
colônia isolada de cada amostra, para identificar a presença dos genes de adesão, ToxB e
efa1 (Tab. 2). As amostras foram amplificadas em 35 ciclos, cada ciclo consistindo de
0:30 min. à 92°C para desnaturação, 0:30 min. à 55°C para anelamento, 0:45 min. à 72°C
para extensão, para o gene ToxB (Tarr et al., 2002) e 1:00 min. à 94° C para desnaturação,
1:00 min. à 51°C para anelamento, 1:00 min. à 72°C para extensão, para o gene
efa1(Nicholls et al., 2000). Para controle positivo destes genes foi usada a cepa O157:H7
(efa1+, ToxB+) e para controle negativo foi adicionada uma reação sem DNA.
Tabela 2. Primers usados na PCR simples para amplificação dos genes ToxB e efa1 de
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) isoladas de carcaças de bovinos. Laboratório
de Genética UFG - Jataí
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Gene Sequência dos Primers (5'-3') PB Referência
ToxB ATACCTACCTGCTCTGGATTGA
602 Tarr et al., 2002
TTCTTACCTGATCTGATGCAGC
efa1
AAGGTGTTACAGAGATTA
479
TGAGGCGGCAGGATAGTT
GAGACTGCCAGAGAAAG Nicholls et al., 2000
GGTATTGTTGCATGTTCAG
As cepas de EPEC também foram testadas em relação a motilidade, neste caso foi
utilizado o meio semissólido Rappaport-Vassiliadis (MSRV) como indicado pela ISO
6579 -1:2017, e para hemólise, foi utilizado o meio ágar sangue de carneiro.
Para o perfil de resistência antimicrobiana, a técnica utilizada foi a Difusão em
Disco de Kirby e Bauer, que determina a sensibilidade bacteriana in vitro frente aos
agentes antimicrobianos, conforme o manual da Laborclin Produtos para Laboratório
Ltda. Os antimicrobianos testados foram: ampicilina 10µg, imipenem 10µg e meropenem
10µg (beta-lactâmicos, carbapenêmicos); amicacina 30µg e gentamicina 10µg
(aminoglicosídeos); tetraciclina 30µg (tetraciclinas); sulfazotrim 1,25/23,75µg
(sulfonamidas + trimetoprim); ciprofloxacina 5µg (quinolonas); cefalotina 30µg
(cefalosporina 1°geração); cefoxitina 30µg (cefalosporina 2° geração); cefepime 30µg
(cefalosporina de 4° geração). Para a detecção de cepas produtoras de ESBL foi utilizada
a técnica de disco aproximação com os seguintes antibióticos: ceftriaxona 30µg,
cefotaxima 30µg e ceftazidima 30µg, aztreonam 30µg, e amoxacilina-clavulanato
20/10µg (CLSI: M100-S20). Os resultados foram estatisticamente analisados através do
teste exato de Fisher.
RESULTADOS
No presente estudo, do total de 6 coletas, foram obtidas 154 amostras referentes à
154 carcaças, que geraram 690 isolados, destes, 365 cepas foram identificadas como E.
coli. Sendo a incidência de E. coli nas amostras coletadas de 81,65%.
Das 365 cepas de E. coli, 16/365 (4,38%) possuíam o gene eae e 0/365 (0%) os
genes stx1 e/ou stx2, portanto, 16 cepas foram identificadas como EPEC, e a frequência
de amostras positivas para STEC foi zero. Das 154 carcaças coletadas, 15 (9,74%)
apresentaram cepas EPEC.
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As 16 amostras também foram testadas para a presença dos genes de adesão ToxB
e efa1, nenhuma cepa foi positiva para os referidos genes. Em relação ao teste de
motilidade, todas se mostraram positivas, enquanto para o teste de hemólise apenas 6/16
(37,5%) tiveram resultado positivo, sendo estas classificadas como α hemólise, por
apresentarem hemólise parcial, associada com a perda parcial de hemoglobina pelas
hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esverdeada no meio de cultura ao redor da colônia.
Foi realizado o perfil de resistência antimicrobiana, assim como a presença de E.
coli ESBL em 50 cepas, sendo que dessas, 16 eram EPEC e 34 não EPEC, representando
10% de cepas não EPEC. As cepas se mostraram mais resistentes aos antimicrobianos
cefalotina, amicacina e gentamicina. Não foi detectada a presença de nenhuma cepa
produtora de ESBL (Tab. 3).
Tabela 3. Fenótipos de resistência de Escherichia coli isoladas de carcaças de bovinos
obtidas em frigorífico no município de Mineiros – GO. Laboratório de Microbiologia
Veterinária UFG - Jataí
Antimicrobiano Número de isolados
resistentes
Porcentagem de isolados
resistentes
AMI 13 26%
AMP 4 8%
CFL 41 82%
CFO 1 2%
CIP 1 2%
CPM 1 2%
GEN 13 26%
IPM 1 2%
MER 1 2%
SUT 2 4%
TET 3 6%
ESBL 0 0%
*AMI: amicacina; AMP: ampicilina; CFL: cefalotina; CFO: cefoxitina; CIP:
ciprofloxacino; CPM: cefepime; GEN: gentamicina; IPM: imipenem; MER: meropenem;
SUT: sulfazotrim; TET: tetraciclina; ESBL: E. coli produtora de beta-lactamase de
espectro estendido.
11
Foi verificado também o número e a porcentagem de cepas de EPEC e não EPEC
com fenótipos de resistência múltipla. Mesmo as EPEC apresentando maior porcentagem
de resistência múltipla dentre os isolados testados, não houve diferença significativa pelo
teste exato de Fisher, e nenhuma dessas apresentou-se sem resistência (Tab. 4).
Tabela 4. Número e porcentagem de isolados com fenótipo de resistência múltipla de
Escherichia coli isoladas de carcaças de bovinos obtidas em frigorífico no município de
Mineiros – GO. Laboratório de Microbiologia Veterinária UFG - Jataí
N° cepas SRM1 RUM2 RMM3
EPEC 16 0=0% 9=56,25% 7=43,75%
Não EPEC
P value*
34 2=5,88%
(1,00)
18=52,94%
(1,00)
14=41,18%
(1,00) 1SRM: sem resistência à medicamentos; 2RUM: resistência única à medicamentos; 3RMM: resistência múltipla à medicamentos. *Teste exato de Fisher.
Todas as cepas de EPEC apresentaram motilidade e 6 apresentaram alfa hemólise.
Também foi observado que 100% dessas apresentaram resistência única ou múltipla a
antimicrobianos, o que torna ainda mais relevante os estudo deste patógeno, visto que se
revelam como problema de saúde pública (Tab. 5).
Tabela 5. Patotipos, genes de virulência e fenótipos de resistência de Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC) isoladas de carcaças de bovinos obtidas em frigorífico no
município de Mineiros – GO. Laboratório de Microbiologia Veterinária UFG - Jataí
Isolados Hemólise Fenótipos de
Resistência*
9.5 - CFL
3.2 B - CFL
16.3 B + AMP
20.2B - AMI-CFL-GEN
7.1C - CFL
7.2C - CFL
10.2C + AMP-CFL-TET
15.5C + AMI-CFL-GEN
14.1D + CFL
16.2D + CFL-TET
22.2D - GEN
27.1D - AMI-CFL-GEN
12
30.1D + CFL
8.4E - AMP-CFL-CFO-
CPM-IPM-MER-
SUT-TET
18.3E - AMI
18.5E - AMI-CFL-TET
*AMI: amicacina; AMP: ampicilina; CFL: cefalotina; CFO: cefoxitina; CPM: cefepime;
GEN: gentamicina; IPM: imipenem; MER: meropenem; SUT: sulfazotrim; TET:
tetraciclina.
DISCUSSÃO
Neste trabalho, a frequência de EPEC nas carcaças de bovinos foi de 9,74% e de
STEC de 0%. Em relação a presença de E. coli nas amostras obteve-se uma frequência de
contaminação de 81,65%. No trabalho realizado por Tanih et al. (2015), em carcaças de
abatedouros de bovinos na África do Sul, a contaminação destas por E. coli foi de 48,21%,
e estas foram testadas para presença de E. coli diarreiogênica, entre elas EPEC e STEC,
onde foram encontradas 3,70% de EPEC e 0% de STEC, confirmando os resultados do
presente trabalho. No trabalho realizado por Filho et al. (2014) no Centro Oeste do Brasil
com 52 bovinos saudáveis, 48,46% dos isolados foram caracterizados como STEC e
destes, 1,58% foram identificados como O157:H7, este achado é de grande relevância
visto o potencial patogênico desta cepa e porque representa risco para saúde pública.
No trabalho realizado por Matos et al. (2013), em amostras coletadas de 100
carcaças de um frigorífico exportador, o ponto pós lavagem foi onde houve menor
incidência de contaminação, entretanto no presente trabalho o local de escolha para as
coletas foi no referido local, visto que este é o ponto final do processamento da carcaça,
onde posteriormente ela será apenas armazenada, e encaminhada para os locais de
distribuição.
Roman et al. (2013), em seu estudo realizado no México, pôde observar a
prevalência do gênero E. coli em 7,92% das amostras e destas 13,6% eram E. coli
diarreogênicas. Entre os alimentos analisados, os produtos cárneos ocuparam o segundo
lugar representando 17% das contaminações. O gênero EPEC foi o mais prevalente nas
amostras, representando 78,57%, e destes 83,33% foram encontradas em produtos
cárneos enquanto o gênero STEC foi encontrado em apenas 8,92% das amostras e 0% em
13
produtos cárneos, a avaliação dos gêneros foram realizadas através de PCR multiplex. No
presente trabalho não foram encontradas nenhuma cepa STEC entretanto foram
encontradas 16 cepas (4,38%) EPEC.
Não foram encontradas cepas de E. coli com a presença dos genes da toxina shiga
stx1 e/ou stx2, porém 4,38% das cepas apresentaram o gene eae, na PCR multiplex no
presente estudo. Enquanto no estudo realizado por Carvalho et al. (2012), foram
encontradas em 26,8% das estirpes isoladas dos suabes de carcaças, em matadouros do
estado de São Paulo, a presença dos genes stx1 e stx2 através do mesmo meio de
avaliação. Já no estudo realizado por Ojo et al. (2010), com carcaça de carneiro, bovinos
e suínos, realizado na Nigéria, 41,6% das amostras tiveram resultado positivo para os
genes stx1 e stx2 e 56,5% para o gene eae. Nenhum dos genes foi detectado nas carcaças
de carneiros, isso pode ter ocorrido devido a forma de processo de abate destes animais,
onde o couro é removido antes da evisceração, e porque o processamento das carcaças foi
realizado de forma adequada.
No trabalho realizado por Rigobelo et al. (2011) em 600 amostras de carcaças de
bovinos, coletadas em um abatedouro no estado de São Paulo, testadas para E. coli, 8%
das amostras possuíam o gene eae e 20% os genes stx1 e/ou stx2. Enquanto no trabalho
realizado por Pizarro et al. (2013), para avaliação de transferência de material fecal
durante o processo de abate em 108 carcaças, em um matadouro na Argentina, 2,77% das
amostras apresentaram os genes stx1 e stx2 e 1,85%, o gene eae.
Várias proteínas são importantes para a aderência e para a colonização das células
intestinais como, Efa1 (E. coli fator for adherence 1) e ToxB (Toxin B) (Bardiau et al.,
2010). No presente estudo as cepas EPEC foram testadas posteriormente para os genes
de adesão ToxB e efa1, porém nenhuma das cepas, mostrou resultado positivo para os
referidos genes, o que está de acordo com os trabalhos realizado por Monaghan et al.
(2012), na Irlanda, onde das amostras de carcaças, apenas 0,7% apresentaram resultado
positivo para EPEC e destas, nenhuma apresentou o gene ToxB, e com o trabalho de
Cundon et al. (2018), realizado na Argentina, onde das 33 amostras testadas de animais
e alimentos, nenhuma apresentou o gene ToxB. Enquanto no trabalho realizado por Pradel
et al. (2015) em relação as propriedades de adesão da E. coli, em amostras isoladas de
bovinos, produtos alimentícios e humanos, realizado na França, foram verificados a
14
presença dos genes de aderência ToxB e efa1. Sendo que o gene efa1, associado ao gene
eae foi detectado em 28 (11%) e o gene ToxB, em 27 (10%) das 256 cepas. Podemos
observar que diferentes métodos de análises podem interferir no resultado dos trabalhos,
demostrando assim diferença entre eles e o resultado do presente estudo.
Em seu trabalho sobre as tendências globais no uso de antimicrobianos na
alimentação de animais de produção, Boeckel et al. (2015), estima que o consumo de
antimicrobianos aumentará em 67% até 2030 e que no Brasil, Rússia, Índia, China e Sul
da África, esse aumento será de 99%, visto a tendência para manter a saúde animal e
aumentar a produtividade. Isso acarretará uma pressão de seleção das bactérias, tornando-
as mais resistentes. No presente trabalho podemos observar essa tendência, onde 100%
das amostras apresentaram resistência única ou múltipla aos antimicrobianos. A cepa
EPEC 8.4 E foi à que apresentou fenótipo de resistência mais estendido, sendo este para
8 antibióticos, de 4 classes diferentes, representando um alto risco à saúde pública.
No trabalho realizado por Ferreira et al. (2015) em Goiás, com ovinos, 83,3% das
cepas apresentaram resistência à pelo menos um dos antibióticos testados, 12,2%
apresentaram resistência à 2 antibióticos e 6,7% apresentaram resistência à múltiplas
drogas. O antibiótico ao qual as bactérias apresentaram maior sensibilidade foi a
ceftriaxona (100%), seguido pela amicacina; cefoxitina; sulfa + trimetoprim e cefotaxime
(98%). Enquanto no estudo de Rigobelo et al. (2010) onde foi determinado o perfil de
resistência antimicrobiana de cepas presentes em carcaças de bovinos, o antibiótico ao
qual as bactérias foram mais resistentes foi a cefalotina (84%), seguida estreptomicina
(45%), ácido nalidíxico (42%) e tetraciclina (20%). Em 38,3% dos isolados de E. coli
apresentaram resistência à múltiplas drogas.
Ainda se tratando do perfil de susceptibilidade antimicrobiana de E. coli
diarreiogênica, no trabalho realizado por Faúla et al. (2017) com alimentos, entre eles
produtos cárneos, realizado em Minas Gerais, das 220 amostras coletadas 27,3%
apresentaram resistência a pelo menos 1 antibiótico e destas 13,3% apresentaram
resistência múltipla. Os fármacos amicacina e gentamicina foram os mais eficazes,
enquanto a ampicilina foi o que apresentou maior resistência entre as bactérias. No
presente estudo das 50 amostras testadas os antimicrobianos mais eficazes foram a
cefoxitina, ciprofloxacino, cefepime, imipenem e meropenem com apenas 2% de
15
resistência entre as bactérias e os medicamentos cefalotina com 82%, seguido pela
amicacina e gentamicina, ambos com 26%, foram os que apresentaram maiores
resistência entre as bactérias. Em relação aos dados apresentados não houve diferença no
perfil de resistência entre as populações de EPEC e não EPEC, portanto o perfil de
resistência se mostrou homogêneo entre as cepas potencialmente patogênicas e
comensais.
Os resultados obtidos através do presente trabalho se mostram relevantes em
termos de saúde pública, demonstrando que a carne bovina pode veicular EPEC
multirresistentes, o que condiz com o descrito por Arias et al. (2012) onde relata que em
vários estudos a resistência antimicrobiana em humanos pode estar relacionada com a
utilização de antimicrobianos em animais, visto que as classes de medicamentos utilizada
nos dois casos são as mesmas, provocando assim falha terapêutica, devido a transferência
de bactérias multirresistentes através da cadeia alimentar.
CONCLUSÕES
Nesta pesquisa, foram identificadas cepas de E. coli eae+ stx-, o que as caracteriza
como EPEC, demostrando que em algum momento do processo de produção houve
contaminação das carcaças dos bovinos, o que chama atenção para problemas
relacionados à saúde pública, com risco de transmissão para o ser humano. Os humanos
são portadores de EPEC, o que leva a crer que no estabelecimento as Boas Práticas de
Fabricação são falhas. Não foram identificadas cepas de STEC, apesar dos ruminantes
serem considerados os principais reservatórios deste patotipo. Provavelmente isso foi
decorrente as coletas terem sido realizadas no pós processamento, posterior à lavagem
das carcaças, ou pela baixa contaminação das carcaças pelas fezes bovinas durante o
processo de abate, o que evidencia que o estabelecimento toma os cuidados necessários
durante o processamento da carcaça através de uma evisceração eficiente. Também
podemos observar que houve um padrão de resistência aos antimicrobianos entre as
populações EPEC e não EPEC e que não foram encontradas E. coli produtora de ESBL.
O resultado obtido é de extrema importância para demonstrar a relevância das condições
higiênico sanitárias dos estabelecimentos produtores de alimentos, para evitar a
possibilidade de contaminação de carcaças por microrganismos patogênicos oriundos de
16
uma possível contaminação humana, visto que esses são importantes reservatórios de
EPEC.
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20
3.CONCLUSÕES
Atualmente têm-se observado um aumento crescente no consumo de carne, o
que leva à uma preocupação relacionada a qualidade deste produto. A
caracterização fenotípica e genotípica de microrganismos patogênicos é de
extrema importância prática para os aspectos clínicos, fitopatológicos, de
biotecnologia e para estudos ambientais, além de ser pré-condição essencial
para a abordagem de novos métodos de controle, à futura seleção de cepas para
definição de modelos vacinais, probióticos, entre outros. Na presente pesquisa,
através desses modelos de identificação foi possível detectar a presença de
EPEC em carcaças de bovinos abatidos em frigorífico no município de Mineiros
-GO, o que é relevante quando se trata de saúde pública, podendo esses serem
transmitidos aos seres humanos. Sendo assim é importante que os
estabelecimentos invistam em boas práticas de controle higiênico sanitária dos
locais e equipamentos de produção e treinamento dos colaboradores, e que a
fiscalização cumpra sua função de verificar se os programas de autocontrole
funcionam dentro do estabelecimento. Outro fator relevante foram as altas taxas
de bactérias multirresistentes à antimicrobianos detectadas na cadeia de
produção, pois essas cepas ultrapassaram as barreiras representadas pelo
processamento dos produtos, podendo assim chegar ao consumidor.
21
ANEXOS – NORMAS DE PUBLICAÇÃO DA REVISTA
