EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO EM PARÂMETROS … · no estilo de vida, como aumento da atividade...
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UNISALESIANO Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium Caio César Gonçalves Usmari Kelvin Anequini Santos EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO EM PARÂMETROS COGNITIVOS E IMUNOLÓGICOS EM RATOS DIABÉTICOS LINS-SP 2016
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UNISALESIANO
Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium
Caio César Gonçalves Usmari
Kelvin Anequini Santos
EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO EM
PARÂMETROS COGNITIVOS E IMUNOLÓGICOS
EM RATOS DIABÉTICOS
LINS-SP
2016
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CAIO CESAR GONÇALVES USMARI
KELVIN ANEQUINI SANTOS
EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO EM PARÂMETROS
COGNITIVOS E IMUNOLÓGICOS EM RATOS DIABÉTICOS
Trabalho de conclusão de curso Apresentado à Banca Examinadora do Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium, curso de Fisioterapia, sob a orientação do Profº Dr. José Alexandre Curiacos de Almeida Leme e orientação técnica da Profª Ma. Jovira Maria Sarraceni
LINS-SP
2016
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CAIO CESAR GONÇALVES USMARI
KELVIN ANEQUINI SANTOS
EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO EM PARÂMETROS
COGNITIVOS E IMUNOLÓGICOS EM RATOS DIABÉTICOS
Monografia apresentada ao Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium,
para obtenção do título de Bacharel em Fisioterapia.
Aprovada em: ____/____/____.
Banca Examinadora:
Prof(a) Orientador(a): José AlexandreCuriacos Almeida Leme
Titulação: Doutor em Ciências da Motricidade
Assinatura: ___________________________
1º Prof(a): _______________________________________________________
Titulação: _______________________________________________________
_______________________________________________________________
Assinatura: ___________________________
2º Prof(a): _______________________________________________________
Titulação: _______________________________________________________
_______________________________________________________________
Assinatura: ___________________________
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Dedico este trabalho a minha família que esteve ao meu lado desde o princípio,
pois nada disso estaria se concluindo sem a presença dos meus pais. Tudo
que sou e tenho na vida é graças a eles. Mãe, sеυ cuidado е dedicação fоram
que deram, еm alguns momentos, а esperança pаrа seguir. Pai, sυа presença
significou segurança е certeza dе qυе não estou sozinho nesta caminhada.
Amo muito vocês!
Caio César Gonçalves Usmari
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS por ter me dado saúde e força para superar os
obstáculos que vieram. Obrigado, Senhor, por mais uma etapa da minha vida
concluída.
A minha mãe Ana Maria e ao meu pai José Usmari, heróis que me deram
apoio, incentivo nas horas difíceis e que apesar de todas as dificuldades,
fortaleceram-me. Vocês são meus pilares de força, devo tudo que tenho a
vocês. Não tenho palavras para poder agradecer-lhes.
Ao nosso orientador José Alexandre, um paizão que me deu apoio, força,
ensinamentos, oportunidades e demonstrou a pessoa maravilhosa que é.
Sempre presente no meu processo de evolução acadêmica e profissional.
“cerejinha no bolo não tem nada a ver com mamão com açúcar”
Obrigado por tudo!
A nossa orientadora Jovira, muito obrigado por nos ajudar.
Ao meu parceiro de monografia, cursos, viagens, festas, churrascos..., Kelvin.
Nesta faculdade não ganhei um parceiro, ganhei um irmão. Só nós sabemos as
dificuldades que passamos e juntos conseguimos superá-las em uma
constante evolução.
Agradeço a todos os professores e, em especial, à coordenadora Aninha, que
me ajudaram no processo de formação, pela dedicação, carinho, não somente
por terem me ensinado, mas por terem me feito aprender. Cada um de vocês
está guardado no meu coração.
A todos os meus amigos e familiares, que estão presente na minha vida, não
tem como colocar todos os nomes aqui, mas tenho cada um no meu coração.
Caio César Gonçalves Usmari
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Dedico este trabalho a toda minha família, que esteve presente nessa
trajetória: a minha Mãe que sempre apoiou meus estudos e fez todas minhas
dificuldades serem pequenas, ao meu Pai por estar ao meu lado sempre e me
dar muita força quando precisei e ao meu grande Irmão, que foi um guerreiro
ao meu lado.
Amo muito vocês!
Kelvin Anequini Santos
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AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente, a Deus pоr tеr mе dado saúde е força pаrа superar
аs dificuldades. Obrigado, Senhor, por mais uma etapa concluída.
À minha família pоr sua capacidade dе acreditar еm mіm е investir еm mim.
À minha princesa Adriana Anequini pelo sеυ cuidado, dedicação e muita força,
еm alguns momentos, а esperança pаrа seguir.
Ao meu grande amigo Luiz Donizete por ser um grande Pai; sυа presença
significou segurança е certeza dе qυе não estou sozinho nesta caminhada.
Ao meu irmão Christopher por ajudar nas minhas quedas e conquistas, fazer-
me seguir sempre e sonhar cada vez mais, sendo um campeão.
Ao meu parceiro de monografia Caião. Obrigado por tudo, pelas festas e apoio
aos trabalhos, pelas manhãs nos laboratórios kkkkkk abraços irmão.
Ao mеυ orientador Alexandre. Obrigado pela paciência e sabedoria que nos
passou durante todos esses anos.
“cerejinha no bolo não tem nada a ver com mamão com açúcar”
À Universidade pela oportunidade dе fazer о curso e propor minha profissão,
através da qual vou ter várias conquistas em minha vida.
À galera da faculdade, pois foi uma honra estar com vocês. Obrigado a todos.
Kelvin Anequini Santos
RESUMO
Diabetes mellitus é hoje um dos maiores problemas de saúde em todo o
mundo. Um dos maiores problemas decorrentes da doença são os prejuízos
cognitivos e os efeitos deletérios ao sistema imunológico, porém, modificações
no estilo de vida, como aumento da atividade física, têm se apresentado como
uma forma de tratamento não medicamentosa e primordial para a manutenção
e possível tratamento para essa doença metabólica. O ambiente enriquecido é
um meio que oferece aos animais recursos como rodas de atividade,
brinquedos, aumento no espaço e interação social que promovem estímulos
complexos e diversificados para desenvolver o repertório comportamental.
Desta forma, o presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos do
ambiente enriquecido em parâmetros cognitivos e imunológicos em ratos
diabéticos. Para isso, os animais foram distribuídos em grupo controle, animais
diabéticos mantidos em gaiola convencional e diabéticos gaiola enriquecida,
animais mantidos em ambiente enriquecido. Após 8 semanas, no final do
experimento, através do teste de reconhecimento de novos objetos foram
coletados os dados cognitivos. Na análise de leucócitos foram coletados
amostras de sangue no pré e pós-experimento e ambos resultados foram
analisados estatisticamente utilizando o teste t de student. No resultado
cognitivo, o ambiente enriquecido parece promover melhoria na memória dos
animais, a longo prazo. Os valores de contagem total de leucócitos não
apresentaram alterações durante o estudo e foi possível observar alterações na
contagem diferencial de leucócitos apontando que a atividade voluntária,
promovida pelo ambiente enriquecido, é capaz de modular as concentrações
de leucócitos do sistema imunológicos em animais diabéticos.
Palavras-chave: Diabetes. Memória. Sistema imunológico.
9
ABSTRACT
Diabetes mellitus is today one of the greatest health problems in the world. The
main problems due to the disease are cognitive and effects in the immune
system. Changes in lifestyle, such as physical activity, have been presented as
a form of non-drug treatment and also vital for the maintenance and possible
treatment for this metabolic disease. The enriched environment provides for
animals features like the wheel of activity, toys, increase in space and social
interaction that promote complex behavioral stimuli. Therefore, the objective of
this study is to investigate the effects of enriched environment in cognitive and
immune parameters in diabetic rats. For this reason, the animals were divided
into a control group, the diabetic group kept in conventional cages and the
diabetic group kept in the enriched environment. After 8 weeks, at the end of
the experiment, it was applied the test of recognition of new objects and
collected the data of cognition. In the analysis of leukocytes were collected
blood samples in pre- and post-experiment and both results were statistically
analyzed using Student's t-test. In the cognitive test, the diabetic animals
showed impairment in the memory and it was not possible to observe an
improvement in it. The total leukocyte count values showed no changes during
the study and it was possible to observe changes in the differential count of
leukocytes indicating that the volunteer activity, promoted by the enriched
environment, was able to modulate the concentrations of leukocytes in the
diabetic animals immunological system.
Keywords: Diabetic. Memory. Immune System.
10
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 : Vista superior da gaiola enriquecida ................................................ 30
Figura 2 : Roda de atividade ............................................................................ 31
Figura 3 : Vista superior do teste de reconhecimento de novos objetos ........... 31
Figura 4 : Capilar com 25µL de sangue ........................................................... 32
Figura 5 : Eppendorf com liquido Turk e Eppendorf com Turk + amostra de
sangue ............................................................................................................. 32
Figura 6 : Câmara de Neubauer com ampliação dos quatro quadrantes visto no
microscópio ...................................................................................................... 33
Figura 7 : Gota de sangue dispensada em lâmina de vidro .............................. 33
Figura 8 : Esfregaço gota de sangue em lâmina de vidro ................................. 34
Figura 9 : Material observado no microscópio .................................................. 34
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 : Teste 1 ............................................................................................. 35
Tabela 2 : Teste 2 ............................................................................................. 35
Tabela 3 : Contagem Total ............................................................................... 36
Tabela 4 : Contagem Diferencial ....................................................................... 36
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AE – ambiente enriquecido
DA – doença de Alzheimer
DGC - diabetes gaiola convencional
DGE - diabetes gaiola enriquecida
DM – diabetes mellitus
DM1 – diabetes mellitus tipo 1
DM2 – diabetes mellitus tipo 2
DMG - diabetes mellitus gestacional
FP2ase - 6-bisfosfatase
G6Pase - glicose-6-fosfatase
G6P - glicose-6-fosfato
GE – gaiola enriquecida
IGF-1 - fator de crescimento semelhante à insulina
PEPCKPEPCK – fosfoenolpiruvatocarboxilase
PEP – fosfoenolpiruvato
SNC - sistema nervoso central
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CEUA - Comissão de Ética no Uso Animal
Aβ - proteina β-Amilóide
cm– centímetros
mg - miligrama
mL– mililitro
µl - microlitro
n° - numero
kg -quilograma
µm - milímetro
ºC– Celsius
12
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 14
1 CONCEITOS PRELIMINARES ...................................................................................... 16
1.1 Diabetes Mellitus .......................................................................................................... 16
1.1.1 Diabetes Tipo1 ................................................................................................................ 17
1.1.1.1 Fisiopatologiado Diabetes ......................................................................................... 18
1.1.1.2 Consequências do Diabetes ..................................................................................... 19
1.1.2 Tratamentose Prevenção .............................................................................................. 19
1.1.3 Diabetes e Atividade física............................................................................................ 19
1.2 Ambiente Enriquecido ....................................................................................................... 20
1.2.1 Atividade Física .............................................................................................................. 21
1.2.1.1 Atividade Física Voluntária ........................................................................................ 21
1.2.1.2 AtividadeFísica Voluntária em Animais: Roda de Atividade ................................ 22
1.2.1.3 Ambiente Enriquecido como Promotor da Atividade Física ................................. 23
1.3.1 Sistema Nervoso Central e Memória .......................................................................... 23
1.3.2 Plasticidade Neural ........................................................................................................ 25
1.3.3 Ambiente Enriquecido, Atividade Física e Memória ................................................. 26
1.4 Sistema Imunológico ......................................................................................................... 26
1.4.1 Fisiologia .......................................................................................................................... 26
1.4.2 Alterações Celulares ...................................................................................................... 27
1.4.3 Adaptação da Resposta Imune .................................................................................... 28
1.4.4 Ambiente Enriquecido, AtividadeFísica eSistema Imunológico .............................. 28
2 O EXPERIMENTO ................................................................................................................ 29
2.1 Procedimentos Éticos ....................................................................................................... 29
2.2 Amostra ............................................................................................................................... 29
2.3 Indução do Diabetes Experimental ................................................................................. 29
2.4 Gaiola Enriquecida ............................................................................................................ 30
2.5 Teste de Reconhecimento de Novos Objetos .............................................................. 31
2.6 Análise Global de Leucócitos .......................................................................................... 32
2.7 Análise Diferencial de Leucócitos ................................................................................... 33
2. 10 Análise Estatística .......................................................................................................... 34
2. 2 Resultados ......................................................................................................................... 34
2. 4. Discussão ......................................................................................................................... 37
13
3 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 39
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 40
APÊNDICES ............................................................................................................................. 48
ANEXOS .................................................................................................................................... 52
14
INTRODUÇÃO
Atualmente, na população mundial, o diabetes está estimado em 6% e
continua em constante crescimento, podendo até 2025 chegar à prevalência de
7,3%. No Brasil, mais de 7 milhões de pessoas têm diabetes Mellitus (DM) e é
causadora de mais de 80.000 mortes por ano (IDF, 2016). Caracterizada por
altos níveis de glicose no sangue, consequente de defeitos na ação ou
secreção da insulina, é uma síndrome de etiologia múltipla (AMERICAN
DIABETES ASSOCIATION, 2014).
O DM está geralmente dividido em duas categorias, diabetes mellitus
tipo 1 (DM1) e o diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Resumidamente, o DM1 é
caracterizado por um déficit na secreção de insulina, uma autoimunidade do
organismo contra as células β pancreáticas e o DM2 por resistência à insulina.
As consequências de um descontrole glicêmico podem levar a complicações
micro e macro vasculares, lesionando nervos, olhos, rins, coração e vasos
sanguíneos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2014; NETO, 2013).
Pacientes com DM podem apresentar complicações relacionadas às
funções metabólicas, endócrinas e do sistema nervoso central (SNC), tendo
maior risco de desenvolver a doença de Alzheimer ou outras formas de
demência (ALVAREZ et al., 2009; MOULTON et al., 2015). Hormônios como
insulina e o de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) são
encontrados em baixa concentração no SNC de diabéticos (ZHANG et al. 2008;
GOMES et al. 2009).
A atividade física, como forma de tratamento e controle da glicemia, tem
demonstrado grande importância em estudos, ativando no músculo esquelético
a via independente de insulina. Os benefícios que a atividade física proporciona
no SNC estão relacionados ao nível de atividade física regular, pois quanto
maior o nível, maior a prevenção de desenvolver demência (ERICKSON et al.
2012).
O sistema imunológico é um complexo que o corpo humano tem para
combater agentes infecciosos e tóxicos, sendo composto por leucócitos e
outras células, derivadas dele, produzidas na medula óssea, baço e partes do
tecido linfático e utilizando o sistema circulatório como meio de transporte para
áreas de inflamação (GUYTON; HALL, 2006). Por ser um sistema sensível às
15
mudanças no equilíbrio orgânico e agentes infecciosos, fatores genéticos e
ambientais podem influenciar de forma positiva ou negativa o sistema
imunológico (WOMACK et al., 2007; LEANDRO et al, 2007).
Estudos envolvendo a utilização do ambiente enriquecido (AE) e seus
efeitos no sistema imunológico em animais diabéticos são poucos encontrados.
Grande parte destes efeitos é creditada à atividade física realizada na gaiola
enriquecida, sendo considerado um promotor de atividade física (KOBILO et
al., 2010).
A informação sobre as alterações no tipo de leucócitos também é
relevante para compreender os efeitos do ambiente. Estudos anteriores
buscaram avaliar as consequências do ambiente em parâmetros como: peso
corporal, alimentação, hidratação e níveis de corticosterona (OLSSON;
DAHLBORN, 2002).
A manutenção em AE é responsável por favorecer aos animais praticar
seus repertórios sensoriais, motores, cognitivos, sociais e comportamentais
(SZTAINBERG; CHEN, 2010). Com relação ao comportamento motor, foi
demonstrado que o AE é promotor de atividade física suficientemente para
promover melhoria da capacidade aeróbica de animais (JORDÃO et al., 2015).
Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do
ambiente enriquecido em parâmetros cognitivos e imunológicos em ratos
diabéticos.
16
1 CONCEITOS PRELIMINARES
1.1 Diabetes Mellitus
O Brasil, apesar de seu tamanho territorial e populacional, possui parte
da população vivendo em pobreza e apresentando carência em condições de
habitação, nutrição e saúde. Desta forma, parte da população tem
complicações relacionadas à hipertensão arterial e mais de 7 milhões têm
diabetes mellitus (DM), sendo estimado que mais de 80.000 mortes por ano (10
a cada hora) são devidos ao diabetes. A prevalência atual do diabetes está
estimada em 6% da população mundial e tende a aumentar cada vez mais,
sendo que a possibilidade desse aumento em 2025 seja de 7,3%. No Brasil,
em 2030, sendo 6% da população, a estimativa é que o diabetes atinja em
torno de 7,7% da população (IDF, 2016).
O DM pertence a um grupo heterogêneo de doenças que têm que como
principal característica a elevação da glicemia. Tendo como ponto chave na
fisiopatologia, prejuízos relacionados ao hormônio insulina, secretado pelas
células beta do pâncreas (BELL; POLONSKY, 2001).
O diabetes, em longo prazo, caracterizado por hiperglicemia crônica,
produz disfunções ou deficiência em vários órgãos como coração, vasos
sanguíneos, nervos, olhos e rins. Perda de peso, poliúria, polidipsia, polifagia,
perda da clareza na visão, prejuízo no crescimento, susceptibilidade a
infecções e, posteriormente, cetoacidose são sintomas que, se não
controlados, pode resultar em retinopatia com perda crescente da visão,
nefropatia, neuropatia, amputações, disfunções gastrintestinais, geniturinárias,
cardiovasculares e sexuais. Pacientes com DM também apresentam aumento
na prevalência de doenças cerebrovasculares e cardiovasculares (ADA, 2006).
Existem alguns tipos de diabetes, dos quais dois são os de maior
prevalência: diabetes mellitus tipo1 e tipo 2. O diabetes tipo 1 (DM1) é
caracterizado pela deficiência na secreção de insulina produzida pelas células
17
beta do pâncreas, tornando o indivíduo dependente de insulina exógena. O
diabetes tipo 2 (DM2) é caracterizado por extensa resistência à insulina e,
posteriormente, pode haver aumento do estresse de retículo nas células beta e
falência dessas células, faz-se necessário o uso de insulina exógena (ZIMMET;
ALBERTI; SHAW, 2001). Importante salientar que pode ocorrer o diabetes
mellitus gestacional (DMG), que está dentro dos tipos menos comuns do
diabetes, sendo apresentado que as mulheres afetadas, nos próximos 5 a 10
anos seguintes, aumentam a chance de desenvolver DM2 em cerca de 40-60%
(COLBERG et al., 2010).
A classificação clínica do diabetes está além dos critérios diagnósticos
ligados à fisiopatologia. Tanto indivíduos magros, como indivíduos obesos são
propensos a desenvolver o DM1, enquanto o DM2 está caracterizado por
anormalidades metabólicas e está mais associado à obesidade (ADA, 2006).
Mudanças em comportamentos sociais, estilo de vida e no ambiente podem
alterar a prevalência de diabetes (ZIMMET; ALBERTI; SHAW, 2001).
A relação entre diabetes e funções do sistema nervoso central (SNC)
tem sido amplamente estudada, relacionando as complicações do diabetes
com neuropatias. Tem sido demonstrado que pacientes com DM têm tendência
39% maior de desenvolver a doença de Alzheimer (DA) e risco aumentado em
47% de demência em geral (MOULTON et al., 2015).
Fatores extrínsecos que podem ser eficientes em reduzir os riscos de
desenvolvere DM2, como atividade física, balanço nutricional e uma completa
mudança do estilo de vida, vêm apresentando redução de 58% depois de três
anos junto com manutenção de elevados níveis de atividade física, estando
associado com menor risco de desenvolver doenças cardiovasculares (ADA
2015; CHURCH, 2011).
1.1.1 Diabetes Tipo1
Tendo como característica principal a destruição autoimune das células
beta do pâncreas e necessitando receber insulina exógena para sobreviver e
para prevenir o desenvolvimento de cetoacidose, a prevalência de indivíduos
com DM1 é baixa em relação a DM2, sendo mais de 90% dos casos no mundo
(ZIMMET; ALBERTI; SHAW, 2001).
18
O DM1 pode ser associado à encefalopatia diabética, sendo os
principais sintomas observados os prejuízos cognitivos, hipersensibilidade ao
estresse e maior risco de demência, por conta da indução hiperglicêmica e
aumento dos níveis de glicocorticoides adrenais na circulação sanguínea
(PIAZZA et al., 2014).
1.1.1.1 Fisiopatologia do Diabetes
Diversos fatores podem estar envolvidos na destruição das células betas
durante o desenvolvimento do DM1. As principais características do diabetes
tipo 1 são: aumento da glicose sanguínea, aumento do consumo lipídico como
fonte energética, formação de colesterol pelo fígado e perda das proteínas no
organismo. A hiperglicemia pode causar desidratação, assim como a perda da
glicose na urina (glicosúria) causa diurese osmótica. O efeito global, causando
a desidratação do líquido extracelular, leva uma causa compensatória de
desidratação do líquido intracelular. O aumento da sede (polidipsia) é sintoma
clássico do diabetes. O DM crônico descontrolado provoca lesões em muitos
tecidos e também as disfunções do sistema nervoso autônomo podem resultar
em anormalidades, alterações dos reflexos cardiovasculares, deterioração do
controle vesical, diminuição da sensibilidade e sintomas de lesão de nervos
periféricos (GUYTON; HALL, 2011).
O aumento da liberação de glicose hepática, com aumento da taxa de
gliconeogênese controlada pelas enzimas, gera a hiperglicemia, tanto em jejum
quanto pós-prandial. As enzimas chave nesse processo são
fosfoenolpiruvatocarboxilase (PEPCK), frutose-1,6-bisfosfatase (FP2ase) e
glicose-6-fosfatase (G6Pase). PEPCK catalisa a conversão de oxaloacetato
para fosfoenolpiruvato (PEP), enquanto o G6Pase catalisa a etapa final da
gliconeogênese, a produção de glicose convertido de glicose-6-fosfato (G6P). A
insulina inibe a gliconeogênese, suprimindo a expressão de PEPCK e G6Pase,
enquanto glucagon e cortisol estimulam a produção hepática de glicose por
induzir esses genes que expressam essas proteínas (POSTIC; DENTIN;
GIRARD, 2004).
19
1.1.1.2 Consequências do Diabetes
O diabetes causa diversos prejuízos metabólicos, endócrinos e
cognitivos e aumenta o risco para o desenvolvimento de demências, podendo,
também, ser promotoras de neuropatias (ALVAREZ et al., 2009).
Um conjunto de evidências tem como um dos fatores a DA, está sendo
associado ao DM sendo, inclusive, cogitada a possibilidade do nome de
diabetes tipo 3 (DE LA MONTE, 2014). Características fisiopatológicas do DM
como estresse oxidativo, hiperglicemia e inflamação e sinalização defeituosa
da insulina no encéfalo são ligadas à DA (CHEN et al.,2012).
1.1.2 Tratamentos e Prevenção
Várias condições que ocorrem durante a vida de um indivíduo podem
provocar alterações na sensibilidade à insulina, como a puberdade, gravidez e
até mesmo o envelhecimento. Porém, modificações no estilo de vida como
aumento da atividade física e melhora na dieta podem contribuir para melhora
da sensibilidade (KAHN; HULL; UTZSCHNEIDER, 2006).
Os números apresentados em relação ao diabetes mostram a
necessidade de mais pesquisa e a dedicação de novos recursos para
compressão da fisiopatologia e mecanismo de tratamento (ADA, 2016)
Para controle do DM, são indicadas várias intervenções como forma de
prevenção e tratamento, injeção de insulina, balanço nutricional, medicamentos
orais e atividade física (ADA, 2005).
1.1.3 Diabetes e Atividade física
No mundo todo, a prevalência de diabetes mellitus tem aumentado de
forma acelerada, ao mesmo tempo a obesidade também teve prevalência
aumentada, inversamente ao nível de atividade física (INZUCCHI et al., 2015).
Como forma benéfica para pessoas que desenvolveram o diabetes, a atividade
física promove uma série de melhorias, como controle glicêmico, melhora no
perfil lipídico, disposição cardiorrespiratória, vigor, diminuição da resistência à
20
insulina e melhora na pressão arterial. Sabendo sobre esses benefícios, deve
ser aumentada a conscientização das pessoas para importância da atividade
física e expandir o exercício físico contínuo como elemento chave na luta
contra o DM (SIGAL et al., 2013).
Uma completa mudança do estilo de vida, através da atividade física e
balanço nutricional, tem se mostrado muito eficiente em indivíduos com alto
risco de desenvolver diabetes tipo 2 (ADA 2015; CHURCH, 2011; KAHN;
HULL; UTZSCHNEIDER, 2006).
Do ponto de vista do paciente, o diabetes é uma condição que exige
atenção diária à dieta, estilo de vida e monitoramento do nível de glicemia, e
está associada com aumento da incidência de ansiedade e múltiplas visitas aos
profissionais da área da saúde (PALMER,2006).
1.2 Ambiente Enriquecido
O AE é uma combinação de complexas estimulações sociais e
inanimadas como túneis, roda de atividade, objetos coloridos que podem ser
definidos como ambiente enriquecido, com o objetivo de favorecer aos animais
de exercerem seus repertórios sensoriais, motores, cognitivo, social e
comportamental (SZTAINBERG; CHEN, 2010).
A atividade física pode melhorar o controle glicêmico por aumentar
captação e sensibilidade de glicose estimulada pela insulina e,
consequentemente, diminuindo a hiperglicemia (LUCIANO et al., 2002). O AE
promove, dentre outros estímulos, a atividade física.
Em um estudo realizado em nosso laboratório, foi demonstrado que a
prática de atividade física realizada no AE foi suficiente para promover melhoria
da capacidade aeróbia dos animais, visto que os mesmos animais mantidos em
AE tiveram melhor resposta no teste de máxima fase estável do lactato que os
animais mantidos em gaiola convencional (JORDÃO et al., 2015).
Estímulos físicos e sociais extrínsecos no cérebro podem ter um papel
fundamental no tratamento e recuperação de desordens cerebrais, tais como
DA e doenças cerebrais associadas, em que o desuso possa danificar o
desenvolvimento cognitivo. Sugerindo que o AE possa administrar um maior
21
nível de reserva cognitiva, assim evitando tais condições cerebrais, como
envelhecimento e a demência (ZHAO et al., 2015; VIEIRA et al., 2015).
1.2.1 Atividade Física
A atividade física regular da população pode ser diferente da atividade
com caráter esportivo. Buscar a melhora no condicionamento físico é o que
determina o desempenho melhor, tendo um objetivo de manutenção e saúde,
fins estéticos e lazer. (NABIL; TURIBIO; 1999)
Em dados epidemiológicos, foi introduzido o conceito do exercício como
um promotor de melhoria da qualidade de vida. Portanto, uma caminhada que
sejam minutos, ou uma corrida de leve a moderado, poderão trazer benefícios
ao praticante.
O prejuízo econômico traduzido pelas doença preveníveis, através de um estilo de vida ativo, é de tal magnitude que faz com que a adoção de um programa governamental de promoção de atividade física possua uma relação custo/benefício altamente favorável. A atividade física regular permite o desenvolvimento e a manutenção de maior nível de aptidão física, representando um fator positivo no controle e prevenção de algumas doenças. (REZENDE, 1997)
Todos esses fatores fizeram com que, em 1994, muitas das instituições
científicas governamentais e privadas emitissem documentos oficiais,
reconhecendo o sedentarismo como um fator de risco para a saúde,
recomendando, formalmente, a atividade física para a saúde (NABIL; TURIBIO;
1999).
1.2.1.1 Atividade Física Voluntária
As atividades da vida diária são referidas com qualquer realização
dentro do lazer como: tomar banho, vestir, levantar e sentar, caminhar a uma
pequena distância; ou seja, atividades básicas e cotidianas; as atividades
instrumentais da vida diária também como: cozinhar, limpar a casa, fazer
compras, jardinagem; ou seja, atividades mais complexas da vida cotidiana.
Um estilo de vida fisicamente inerte pode ser causa de incapacidade para
realizar algum tipo destas atividades diárias, porém, um programa de
22
exercícios físicos regulares podem promover mudanças, como por exemplo,
alteração na forma de realização ou adaptação de movimento, aumento na
velocidade de execução da tarefa e adoção de medidas de segurança para
realizar a tarefa (ANDEOTTI,1999; MAZO,2007).
Para a promoção de saúde ou para adaptar-se ao meio ambiente é
importante realizar suas aspirações, de satisfazer suas necessidades ou de
mudar (OMS, 1999).
Benefícios da saúde e aptidão vêm aumentando e esses estudos
epidemiológicos prospectivos apoiam a noção de que tanto o estilo de vida
fisicamente ativo quanto um nível moderado a alto de aptidão
cardiorrespiratória reduzem independentemente o risco de várias doenças
crônicas, acreditando-se nas taxas mais baixas de incidência para hipertensão,
obesidade, câncer de cólon, diabetes e osteoporose (ACSM, 2009).
Simons-Mortonet al. (1987) sugerem que, modestos incrementos na participação das crianças em atividades físicas moderadas a vigorosas podem conduzir a mudanças nos hábitos para a idade adulta, e que a Educação Física é um importante veículo para encorajar a atividade física em crianças. Consoante a isto, crianças que têm atitudes positivas em relação à atividade física e conhecimento adequado sobre isso, provavelmente adotarão um estilo de vida ativo.
Bouchard et al. (1994) deixa claro que a prática de atividade física
influencia a aptidão física, tende a influenciar a qualidade e intensidade desta
prática. Pode ser observado que a aptidão física e a saúde estão
reciprocamente relacionadas. A relação entre atividade física, aptidão física e
saúde pode ser influenciada por vários fatores como estilo de vida, ambiente
físico e atributos pessoais.
1.2.1.2 Atividade Física Voluntária em Animais: Roda de Atividade
Alguns autores citam efeitos interessantes na inserção da roda de
atividades à gaiola, reforçando a necessidade de realizar atividade física de
forma intrínseca do animal. Porém, mesmo nesses modelos de atividade física
voluntária, poucos autores citam a investigação dos efeitos da roda de
atividade em animais diabéticos.
23
Nos estudos de atividade física voluntária, normalmente, a roda é
inserida na gaiola convencional e o animal vive isolado. Este fato pode
provocar a síndrome do isolamento social caracterizada por depressão
causada por alterações dopaminérgicas, enquanto a manutenção em AE
provoca efeitos de aumento de monoaminas corticais (BRENES et al, 2006).
1.2.1.3 Ambiente Enriquecido como Promotor da Atividade Física
Estudos envolvendo a utilização do AE, atividade física e animais
diabéticos são escassos. Assim AE contribui para os benefícios como a
atividade física, sendo um fator primordial. Kobilo e colaboradores (2010)
montaram quatro modelos de AE, sendo cada um quatro grupos. No ambiente
controle não havia nenhum dos objetos; no segundo, apenas objetos
inanimados; no terceiro, apenas rodas de atividades e no último grupo, todos
os objetos. Os grupos cujos ambientes havia rodas de atividade apresentaram
melhoria na neurogênese e fatores neurotróficos. Desta forma, os autores
concluíram que a atividade física tem papel importante nos benefícios do AE,
consequentemente, promovendo também a diminuição da adiposidade tendo
assim esses benefícios (DURING, 2015).
1.3.1 Sistema Nervoso Central e Memória
O sistema nervoso central (SNC) localizado no crânio e medula vertebral
é onde se localiza grande parte das células nervosas, com suas interligações.
O sistema nervoso periférico (SNP), distribuído no restante do corpo, possui
grande número de prolongamentos de fibras nervosas chamados de nervos e
número relativamente pequeno de células nervosas (LENT;2005).
O sistema nervoso central é composto por mais de 100 milhões de
neurônios e pode, segundo critérios anatômicos, ser dividido em grandes
partes. A porção do SNC interna ao crânio é denominada encéfalo, que fica
dentro da caixa craniana enquanto a medula espinhal, uma continuidade do
encéfalo, que se prolonga através do canal da coluna vertebral. A medula é
onde também guarda grande parte do armazenamento de informações
sensoriais para controle das atividades motoras e uso nos processos
24
cognitivos. Possui uma forma aparentemente cilíndrica ou tubular, contendo um
canal no centro cheio de líquido. A forma do encéfalo é irregular, cheia de
dobraduras e saliências, encontrando-se subdivisões. Essa forma vem de um
enorme crescimento sofrido pela porção cranial do tubo neural primitivo,
diferente da porção cauda que formará a medula, que é menor (GUYTON;
HALL, 2011; LENT, 2005).
O encéfalo pode ser reconhecido em três partes: o cérebro, formando
dois hemisférios separados por um sulco profundo, onde possui o córtex
cerebral, uma superfície enrugada cheia de giros e sulcos que é responsável
por funções neurais e psíquicas mais complexas; o cerebelo, também dividido
por dois hemisférios, porém, sem um nítido sulco separando-os; e o tronco
encefálico, estrutura que se estende a partir da medula espinhal, ficando logo
abaixo do cerebelo e através do cérebro (LENT, 2005).
Com um metabolismo muito ativo, o encéfalo é um órgão que, para um
funcionamento adequado, depende de um ininterrupto e regular suprimento de
sangue. Representando apenas 2% da massa corporal em um adulto humano,
consome 20% do oxigênio e da glicose disponíveis. A excitação neural
estimula, espantosamente, o aumento do fluxo sanguíneo cerebral, absorção
de oxigênio e glicose. Ação da insulina no encéfalo regula a sobrevivência dos
neurônios, manutenção sináptica, ploriferaçãodendritica, aprendizagem e
memória. Inúmeros pesquisadores encontraram que a insulina também
influencia na captação de glicose no hipocampo, mas as ações diretas da
insulina, na captação de glicose, permanecem obscuras e controversas, as
suas ações indiretas estão bem elucidadas. Apesar de questionável, alguns
estudos mostram que a insulina é produzida em neurônios de mamíferos
adultos, enquanto outros apresentam que deve ser recrutada da periferia para
o sistema nervoso central (MEHRAN et al., 2012; HUGHES, 2015).
O aprendizado e a memória permitem a aquisição, formação,
manutenção e, posteriormente, a evocação de informações e experiências
adquiridas requerendo processos de transcrição, translação e epigenéticos
(IZQUIERDO, 1989; PEIXOTO et al., 2015).
A memória é um processo de armazenamento de informação, que é
também exercida pelas sinapses. O processo chamado de facilitação é quando
as sinapses são responsáveis por transmitir sinais sensoriais. Cada vez que
25
esses perfis de sinais passam por ela, ficam mais capazes de transmitir em
outras oportunidades, gerando assim, uma facilidade depois de um
determinado tempo (GUYTON, 2011).
O impacto do diabetes sobre o sistema nervoso central, especificamente
sobre as estruturas límbicas, tem sido extensivamente estudado. Estes estudos
sugerem que alterações no hipocampo, incluindo prejuízos na neurogênese em
adultos, podem ser potencialmente associadas a distúrbios em funções
cognitivas e um aumento do risco de depressão e demência (BEAUQUIS et al.,
2010; ALVAREZ et al., 2009).
A síndrome de resistência à insulina, que está caracterizada por um
aumento crônico de insulina periférica, redução da sua atividade e redução do
nível de insulina no encéfalo, está associada à prejuízos na memória
relacionados à idade e à DA. O excesso de insulina pode provocar um aumento
no nível da proteina β-Amilóide (Aβ) e agentes inflamatórios, tendo efeito sobre
a memória (CRAFT, 2005).
1.3.2 Plasticidade Neural
Neuroplasticidade é a capacidade que o sistema nervoso, principalmente
os neurônios, tem de se adaptar às modificações que ocorrem na rotina de vida
das pessoas, compreendendo desde resposta à lesão traumática destrutiva até
alterações nos processos de aprendizagem e memória, ou seja, é uma função
neural, que adapta o sistema nervoso às mudanças do ambiente. A
sensibilidade de resposta que os axônios têm perante as ações indiretas do
ambiente, ou seja, a plasticidade que apresenta, depende da idade do animal e
em que fase de desenvolvimento o sistema nervoso se encontra (LENT;2005).
Embora os mecanismos responsáveis pelas alterações no encéfalo
adulto não sejam completamente compreendidas, é evidente no
desenvolvimento dos circuitos neurais a capacidade de possuir alguma
plasticidade para aprender novas tarefas, memórias e reação a lesões ao longo
da vida. A plasticidade sináptica no hipocampo tem chamado a atenção de
pesquisadores pelas suas particularidades, principalmente por algumas formas
de memória. Potenciais de ação são disparados em neurônios hipocampais de
roedores em determinadas regiões, codificando memórias espaciais.
26
Alterações no sistema nervoso adulto ocorrem quando há uma lesão de um
trauma ou doença, com o objetivo de regeneração de conexões no encéfalo e
medula, porém, apresentam limites muito precisos (PURVES et al, 2005).
1.3.3 Ambiente Enriquecido, Atividade Física e Memória
O AE induz alterações neuromorfológicas e várias alterações
neuroquímicas subjacentes levando a um melhor aprendizado e memória,
sendo o aumento da neurogênesehipocampal um dos mais proeminentes
(KEMPERMANN et al., 2010), tanto em ratos jovens quanto em ratos adultos
(GOES et al., 2015).
De forma recreativa, o AE promove melhorias no comportamento
cognitivo, estimula a criatividade e promove mudanças moleculares a nível
estrutural por melhorar funções cerebrais que não foram lesionadas (PAMIDI,
2014).
1.4 Sistema Imunológico
Nosso corpo é exposto continuamente a bactérias, vírus, fungos e
parasitas, todos encontrados, nas condições normais e em graus variáveis, na
pele, na boca, nas vias respiratórias, no trato intestinal, nas membranas de
revestimento dos olhos e mesmo no trato urinário. Assim invadindo os tecidos
profundos podem causar até mesmo a morte, causando doenças letais
(GUYTON; HALL, 2011).
Janeway (2007) cita que a imunologia é o estudo dos mecanismos
fisiológicos do nosso corpo e dos animais para a defesa de agentes infecciosos
e micro-organismos. As doenças infecciosas são causadas por micro-
organismos que conseguem se reproduzir e evoluir de forma rápida que o
corpo humano consegue combatê-los. No entanto, o corpo humano tende a ter
o crescimento e proliferação celular responsável pela defesa do organismo
criando o sistema imune.
1.4.1 Fisiologia
27
O corpo humano tem um sistema para combate de agentes infecciosos e
tóxicos. Esse sistema é denominado resposta imune e é composto por
Hemácias (Heritrócitos), ou seja, concentrações no sangue que tem o número
médio por milímetro cúbito 5.200.000 (± 300.000) no homem saudável; e, na
mulher, é de 4.700.000 (± 300.000). e também os leucócitos (glóbulos brancos)
e outras células derivadas dos leucócitos, unidades móveis do sistema protetor
do corpo, sendo a quantidade no sangue de 7.000 leucócitos por microlitro de
sangue (em comparação com 5 milhões de hemácias). Nascem na medula
óssea, baço e partes do tecido linfático, sendo transportados pelo sistema
circulatório para as áreas de inflamação.
Entre os tipos de leucócitos estão os neutrófilos polimorfonucleares
62,0%, eosinófilos polimorfonucleares 2,3%, basófilos polimorfonucleares
0,4%, monócitos 5,3%, linfócitos 30,0% e, ocasionalmente, plasmócitos.
A proteção do corpo contra os micro-organismos invasores ocorre, em
partes, pela ingestão, por fagocitose. Os linfócitos e também os plasmócitos
atuam em conexão com o restante do sistema imune (GUYTON; HALL, 2011).
1.4.2 Alterações Celulares
A resistência do corpo a infecções: (Imunidade e Imunidade Inata à
Alergia) vai responder ao tipo de patógeno que o corpo recebe, sendo que o
corpo humano tem a capacidade de resistir contra quase todos os tipos de
microrganismos ou toxinas que tendam a lesar os tecidos e órgãos. Os
linfócitos são responsáveis pela imunidade adquirida, mas algumas pessoas
são afetadas devido à destruição dos linfócitos pela radiação ou por produtos
químicos (GUYTON; HALL, 2011).
Esse sistema segue com o sangue sendo, principalmente, o meio de
transporte das células defensoras para a região infectada. Os leucócitos são
fagocitários e representam uma das primeiras barreiras contra a infecção,
percorrem todo o sistema sanguíneo do corpo e podem concentrar-se
rapidamente nos tecidos atingidos por infecção(CARNEIRO; JUNQUEIRA,
2008).
28
1.4.3 Adaptação da Resposta Imune
A modulação da resposta do sistema imunológico é realizada por vários
fatores, sejam esses genéticos ou ambientais. Dentre esses fatores ambientais
está, por exemplo, que pode alterar de forma positiva ou negativa no sistema
imunológico, isto porque o sistema imune é sensível tanto aos agentes
infecciosos quanto às mudanças na homeostase orgânica (WOMACK et al.,
2007; LEANDRO et al, 2007).
No tempo de vida dos leucócitos, após sua liberação pela medula óssea,
esses podem permanecer circulantes pelo sangue em torno de 4 a 8 horas e
nos tecidos entre 4 a 5 dias. Durante as infecções, essa duração diminui por
algumas horas, pois os leucócitos se dirigem com rapidez para a área infectada
para fazer suas funções e realizar o processo de destruição (GUYTON; HALL,
2011).
1.4.4 Ambiente Enriquecido, Atividade Física e Sistema Imunológico
O exercício físico induz diversas adaptações bioquímicas e traz diversos
benefícios ao organismo. O treinamento aeróbio provoca alterações que
favorecem a aerobiose, com aumento tanto no número quanto no tamanho das
mitocôndrias. No entanto, o exercício físico crônico resulta em adaptações do
organismo de acordo com a intensidade e o tipo de atividade (SNYDER,1998;
KUDELSKA et al,1996).
Quando os treinamentos são de alta intensidade para os atletas, alguns
sintomas de overtraining, como suscetibilidade à fadiga, alterações do sono,
perda de massa corporal, dores de cabeça, podem aparecer (WEINECK,1999).
A atividade física promove alterações na concentração, na proporção e nas
funções dos leucócitos, especialmente nos leucócitos polimorfonucleares, nas
células (natural killer) e nos linfócitos, tendo alterações também nas
imunoglobulinas e outros fatores (EICHNER,1995).
Segundo Weineck (1999), sob estimulação máxima, com aumento da
secreção dos hormônios do estresse, adrenalina, noradrenalina e cortisol de
até 10 vezes dos valores basais, por até uma hora depois da atividade, o
29
cortisol e as catecolaminas não são somente metabólitos, mas têm suas
características de promover efeito imunossupressor.
Estudos realizados com animais experimentais apresentam redução dos
prejuízos do diabetes pela realização crônica de exercício físico, principalmente
quanto aos aspectos hormonais com o metabolismo de substratos energéticos
(TANCRÈDE; ROUSSEAU-MIGNERON; NADEAU,1982; LUCIANO et al,1998).
2 O EXPERIMENTO
2.1 Procedimentos Éticos
Todos os procedimentos experimentais estão de acordo com as normas
do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram submetidos
e aprovadospela Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA) com cadastro pelo
protocolo (processo 08/2015 UniSalesiano).
2.2 Amostra
Foram utilizados ratos machos adultos da linhagem Wistar (Rattus
Norvegicus Albinus Wistar), mantidos em gaiolas coletivas, à temperatura de
25 ± 1º C e em ciclo claro/escuro de 12/12 horas, com acesso livre à água e ao
alimento.
2.3 Indução do Diabetes Experimental
Após jejum de 12 horas, os animais receberam estreptozotocina (50
mg/kg) dissolvida em tampão citrato (0,01 µM, pH 4,5) por via intraperitoneal
para a indução do diabetes experimental. Em seguida, foram recolocados nas
gaiolas recebendo solução de água com glicose (15%) e ração (LEME et al.,
2010). Para confirmação do estado diabético dos animais, após cinco dias da
administração da droga, foi realizado um teste de glicemia utilizando Monitor de
Glicose Sanguínea OptiumXceed®, sendo considerados diabéticos apenas
aqueles que apresentarem glicemia igual ou superior a 250 mg por 100 ml de
sangue.
30
Após estes procedimentos, os animais foram pesados e verificados os
valores glicêmicospara a distribuição dos grupos gaiola convencional ou
enriquecido, a fim de obter igual distribuição dos animais nos grupos, segundo
nesses parâmetros.
Desta forma, os animais foram distribuídos em:
Diabetes gaiola convencional (DGC) – animais diabéticos mantidos em
gaiola convencional.
Diabetes gaiola enriquecida (DGE) – animais diabéticos mantidos em
gaiola enriquecida.
2.4 Gaiola Enriquecida
A gaiola enriquecida (GE) é um ambiente onde são inseridos objetos
para estimular os diversos repertórios dos animais. Em nosso laboratório, a
gaiola enriquecida tem 1,5 m x 50 cm x 35 cm e nela há objetos inanimados,
brinquedos coloridos e a roda de atividade (figura 1). Os animais dos grupos
GEs foram mantidos durante todo o período experimental no AE, enquanto os
demais foram mantidos na gaiola convencional.
A roda, para a realização da atividade física do animal, tem 20 cm de
diâmetro e está acoplada em uma base com um pilar (figura 2). Os brinquedos
inseridos na gaiola enriquecida são trocados semanalmente com o intuito de
manter a intensidade dos estímulos.
Figura 1: Vista superior da gaiola enriquecida
Fonte: acervo pessoal, 2016
31
Figura 2. Roda de atividade
Fonte: acervo pessoal, 2016
2.5 Teste de Reconhecimento de Novos Objetos
Este teste foi realizado em uma caixa quadrangular (figura 3), medindo
30x19x11cm. Dois objetos (A e B) foram fixados à caixa com fita adesiva,
sendo observado o tempo de exploração de cada objeto, ou seja, quando os
animais cheiravam ou tocavam o objeto com o nariz ou com as patas
dianteiras. No primeiro teste, durante 1 minuto, foi registrado o tempo de
exploração a cada objeto. O teste foi repetido novamente, após 24 horas,
sendo substituído um dos objetos (A e C).
As posições dos objetos (familiar e novo) foram randomizadas e a caixa
foi limpa entre um teste e outro com álcool 90% (CRUZ, et al., 2010). Ao final,
foi realizada a razão de discriminação estabelecida pela proporção entre o
tempo de exploração do objeto novo em relação ao objeto familiar, sendo
apresentadas as respectivas porcentagens (LEGER,2013)
Figura 3. Vista superior do teste de reconhecimento de novos objetos
Fonte: acervo pessoal, 2016
32
2.6 Análise Global de Leucócitos
No inicio e ao final do período experimental, foram coletadas amostras
de 25µL de sangue da parte distal da cauda de cada rato utilizando capilar
heparinizado (figura 4), sem a utilização de anestesia. A coleta foi feita por
volta das 14 horas da tarde. A amostra de sangue coletada foi dispensada em
umeppendorf (Figura 5) de 1,5 mL e diluída em 500 µl de solução de Turk
(responsável pela lise de eritrócitos), dispensada na câmara de Neubauer
(Figura 6) sendo contadas as células presentes nos quatro quadrantes, para
ser visualizado em um microscópio. Após a contagem, o número total de
leucócitos foi dado pela fórmula: n° total de leucócitos = somatório do n° de
células nos quadrantes x 21 x 10 / 4 (10 fator de conversão para μl, 21 fator de
conversão da diluição, 4 fator de conversão para 1 μl. relacionado ao volume
da câmara) (OLIVEIRA et al., 2002).
Figura 4. Capilar com 25µL de sangue
Fonte: acervo pessoal, 2016
Figura 5. Eppendorf com líquido Turk e Eppendorf com Turk + amostra de
sangue
Fonte: acervo pessoal, 2016
33
Figura 6. Câmara de Neubauer com ampliação dos quatro quadrantes vistos no
microscópio
Fonte: acervo pessoal, 2016
2.7 Análise Diferencial de Leucócitos
No início e ao final do período experimental, foram coletadas amostras
de uma gota de sangue da parte distal da cauda de cada rato que foi
dispensada em lâmina de vidro (Figura 7) e, posteriormente, feito o esfregaço
desta lâmina (Figura 8). Após seca, a lâmina foi mergulhada nos corantes do
panótico rápido. Depois de secas, as lâminas serão analisadas em
microscópio, com a utilização de óleo de imersão entre a objetiva e o material
observado (Figura 9). Foram contadas 100 células em cada lamina, sendo
diferenciados os tipos de leucócitos entre essas células analisadas (OLIVEIRA
et al., 2002).
Figura 7. Gota de sangue dispensada em lâmina de vidro.
Fonte: acervo pessoal, 2016
34
Figura 8. Esfregaço gota de sangue em lâmina de vidro.
Fonte: acervo pessoal, 2016
Figura 9. Material observado no microscópio
Fonte: acervo pessoal, 2016
2. 10 Análise Estatística
Após o teste de normalidade, os resultados foram analisados
estatisticamente utilizando o teste t Student ou Mann-Whitney (para dados não
paramétricos) através do software SPSS®.
2. 2 Resultados
No presente estudo, foram investigados os efeitos do ambiente
enriquecido em parâmetros cognitivos através do teste de reconhecimento de
novos objetos e em parâmetros imunológicos onde foram investigadas as
35
possíveis alterações nas contagens totais e diferenciais de leucócitos
sanguíneos.
A Tabela 1 apresenta os resultados do primeiro teste, objeto A e B,
registrado durante 1 minuto em porcentagem por preferência de objetos,
porém, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos.
Tabela 1. Fase de treino do teste de reconhecimento de novos objetos
realizado pelos animais pertencentes ao grupo diabetes gaiola controle (DGC)
e diabetes gaiola enriquecida (DGE) ao final do período experimental. Os
valores estão expressos em média ± desvio padrão. P<0,05 n=7 ratos/ grupo.
Grupos Objeto A Objeto B
DGC (%) 58,8±19,4 41,2±19,4
DGE (%) 69,4±19,4 30,5±19,4
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016
A tabela 2 apresenta os resultados do teste repetido após 24 horas,
expressos em porcentagem por preferência de objeto familiar (A) e objeto novo
(C). Não houve diferença significativa entre os respectivos grupos.
Tabela 2. Fase de teste de reconhecimento de novos objetos realizados
pelos animais pertencentes ao grupo diabetes gaiola controle (DGC) e diabetes
gaiola enriquecida (DGE) ao final do período experimental. Os valores estão
expressos em média ± desvio padrão. p<0,05 n=7 ratos/ grupo.
Grupos Objeto A Objeto B
DGC (%) 58,3±21,8 41,7±21,8
DGE (%) 57,5±33,2 42,5±33,2
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016
O estudo da contagem total (global) de leucócitos, no início do
36
experimento, não apresentou diferenças entre os grupos. Na análise realizada
ao final do experimento, o DGC apresentou uma redução na contagem global
de leucócitos quando comparadado ao grupo DGE.
Tabela 3. Contagem total de leucócitos (n° de células x 103/mm3 de sangue)
dos animais dos grupos diabetes gaiola controle (DGC) e diabetes gaiola
enriquecida (DGE), mantidos em ambiente enriquecido prévia (1) e
posteriormente (2) ao período experimental (8 semanas). Os valores estão
expressos em média ± desvio padrão. a≠DGC; p<0,05 n=7 ratos/ grupo.
Grupos Pré Pós
DGC 10,1±5,7 4±1,1
DGE 13,1±7,4 8,3±4,6ª
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016
A tabela 4 apresenta os resultados da contagem diferencial de leucócitos nos
grupos estudados. O diabetes promoveu aumento nas concentrações de
monócitos nos animais. O AE amenizou este aumento dos monócitos e
provocou redução da concentração de neutrófilos e bastonetes e aumento do
número de linfócitos, basófilos e eosinófilos. Os demais tipos de leucócitos não
sofreram alterações.
Tabela 4. Contagem diferencial de leucócitos (%) e global (n° de células x
103/mm3 de sangue) realizada semanalmente, dos animais dos grupos diabetes
gaiola controle (DGC) e Diabético Gaiola Enriquecida (DGE) mantidos em
ambiente enriquecido prévia e posteriormente ao período experimental de 8
semanas. Os valores estão expressos em média ± desvio padrão. p<0,05 n=7
ratos/ grupo.
Grupos Leucócitos
DGC Pré
DGE Pré
DGC Pós
DGE Pós
Linfócitos T 55,3±9,3 55,6±10,3 64,7±8,7 67,8±5,4
Monócitos 4±3 8,8±4,7a 4,1±1,8 5,7±2,3
Neutrófilos 34,3±7,9 28,7±5,8 23,3±9,4 12±7,8 a
Eosinófilos 0,6±1 1,7±2,5 1,1±1,1 4,1±3 a
Basófilos 2±2,4 3±3,5 0,7±1,5 7,7±6,5 a
Bastonetes 3,8±3,8 2,1±1,5 6±3,4 0,4±0,8 a
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016
37
2. 4. Discussão
Doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson, estão
relacionadas ao DM, pois em estado crônico é capaz de prejudicar diversos
tipos de tecidos, entre eles o cérebro, levando ao surgimento de demências
(XU et al. 2009). As relações entre diabetes e neurodegeração envolvem
fatores de crescimento, como fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-
I) e fator de crescimento derivado no cérebro (BDNF), citocinas pró-
inflamatórias e geração de radicais livres que contribuem para aproximar o DM
das demências (KUGA et al., 2016).
Fatores que também podem estar relacionados à diminuição da memória
de animais diabéticos são a alteração na via de sinalização da insulina e do
IGF-1 no hipocampo. Estudos mostram que essa via, quando desregulada
estaria diretamente relacionada ao prejuízo na memória (TAKEDA et al. 2011;
TAKACH et al. 2015).
O exercício físico promove melhora no controle glicêmico por aumento
da captação e sensibilidade de glicose estimulada pela insulina prevenindo
uma série de outras complicações do diabetes como hipertensão, retinopatia,
nefropatia diabética ou pé diabético (LUCIANO et al., 2002).
A manutenção no AE proporciona estímulos cognitivos, motores,
sensoriais e sociais. Alguns desses estímulos provocam benefícios ao encéfalo
tendo um papel importante no tratamento, prevenção e desordens cerebrais,
tais como DA, onde o desuso pode danificar o desenvolvimento cognitivo
(ZHAO et al., 2015; VIEIRA et al., 2015). Além disso, o AE promove melhorias
no comportamento cognitivo, sendo encontradas mudanças moleculares que
trazem melhorias para as funções cerebrais não lesionadas (PAMIDI; NAYAK,
2014).
A atividade física promove preservação no encéfalo de organismos
diabéticos. Em seus estudos, Diegues e colaboradores (2014) mostraram que
animais diabéticos submetidos ao treinamento físico tiveram menores valores
de proteína precursora da β-amiloide e fosforilação da proteína tau e aumento
da expressão de proteínas da via insulina/IGF-I no hipocampo, além de trazer
melhora na aprendizagem e memória espacial.
38
Em teste de reconhecimento de objetos, o exercício físico agudo de
natação, com intensidade moderada, reduziu os danos causados pelo DM na
memória de curto prazo (BORGES, 2016). Na literatura, encontramos trabalhos
que realizaram e avaliaram efeitos do exercício físico prolongados na memória.
O AE é promotor de atividade física por fatores como aumento no
espaço da gaiola para locomoção e a presença de rodas de atividade. Em seus
estudos, Jordão e colaboradores (2015) apresentaram que a manutenção no
AE promove melhora no condicionamento aeróbio. Apesar disso, no presente
estudo, a atividade física proporcionada pelo AE não provocou mudanças
significativas entre os grupos DGE e DGC no teste de reconhecimento de
objetos novos.
Disfunções na resposta do sistema imunológico ocorrem por vários
fatores seguidos de alterações constantes. Dentre estes fatores está a
atividade física que pode estimular o sistema imunológico de forma benéfica ou
prejudicial, sendo dependente da intensidade e duração da atividade podendo,
desta forma, beneficiar o sistema imunológico ou agir como imunossupressor
(WOODS et al., 1999). Isto porque o sistema imune é sensível tanto aos
agentes infecciosos quanto às mudanças na homeostase orgânica (WOMACK
et al., 2007; LEANDRO, 2007).
Os quadros patológicos podem provocar variadas alterações no sistema
imunológico de forma que o diabetes, por exemplo, pode causar leucocitose,
leucopenia ou não alterar as concentrações de leucócitos, dependendo do tipo
do DM, duração da doença e controle glicemico (MACIEL et al., 2013; LEME et
al., 2010). No presente estudo, os animais mantidos no AE apresentaram maior
concentração de leucócitos ao final do período experimental.
As alterações no tipo de leucócitos também podem informar possíveis
modificações que provocam efeitos no organismo (WU et al., 2013; CURI et al.,
2001). O aumento nas concentrações de monócitos pode estar relacionado a
processos inflamatórios importantes no organismo como a inflamação da
aterosclerose que induz à doença arterial coronariana (AFIUNE, 2006). O
aumento das concentrações de monócitos provocado pelo diabetes e
amenizado pelo AE pode revelar uma proteção contra efeitos inflamatórios do
diabetes, relacionados às suas complicações como hipertensão e infarto do
miocárdio.
39
As demais alterações nos leucócitos podem ser decorrentes de
infecções, redução no cortisol promovido pelo AE ou atividade física realizada
nas rodas. Futuros estudos poderão contribuir na compreensão destas
alterações.
3 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos no presente estudo pode ser concluído
que a manutenção em ambiente enriquecido tende a promover melhorias na
memória de ratos diabéticos. Todavia, neste estudo, a manutenção no AE,
durante o período de 8 semanas, não promoveu diferença significativa.
Nos parâmetros imunológicos, a manutenção no AE foi capaz de
promover modificações na quantidade global de leucócitos, bem como,
neutrófilos, eosinófilos, basófilos e bastonetes, além de amenizar o aumento
dos monócitos, propiciando um ambiente com maior proteção sobre os efeitos
deletérios do diabetes crônico.
Esta linha de estudos necessita de mais pesquisas para compreender
melhor as relações entre DM, enriquecimento ambiental, memória e sistema
imunológico.
40
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48
APÊNDICES
49
APÊNDICE A - Gráfico dos valores obtidos nos testes dos grupos
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016.
Gráfico 1: Teste de reconhecimento de novos objetos realizado dia 1 pelos
animais pertencentes aos grupos. Os valores estão expressos em média ±
desvio padrão.
50
APÊNDICE B - Gráfico dos valores obtidos nos testes dos grupos
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016.
Gráfico 2: Teste de reconhecimento de novos objetos realizadoapós 24 horas
pelos animais pertencentes aos grupos. Os valores estão expressos em média
± desvio padrão.
51
APÊNDICE C - Gráfico dos valores obtidos nos testes dos grupos
Fonte: Elaborado pelos autores, 2016.
Gráfico 3 -Contagem total de leucócitos (n° de células x 103/mm3 de sangue)
dos animais dos grupos.Os valores estão expressos em média ± desvio
padrão.
0
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
Pré Pós
Contagem Total
DGC
DGE
52
ANEXOS
53
