PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS

EDINEI ROCHA DE ALMEIDA BOCARDI

Cuiabá 2017

EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO

ESTRESSE CRÔNICO

EDINEI ROCHA DE ALMEIDA BOCARDI

EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO

ESTRESSE CRÔNICO

Cuiabá 2017

Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Orientadora: Profa. Dra. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff. Co-orientador: Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo.

FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Ficha catalográfica Valéria Oliveira dos Anjos Bibliotecária - CRB1-1713

B664e Bocardi, Edinei Rocha de Almeida.

Efeito protetor da sinvastatina na progressão da doença periodontal induzida em ratos submetidos ao estresse crônico / Edinei Rocha de Almeida Bocardi – Cuiabá, 2017.

59 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá.

Orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff. Co-Orientador: Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo. 1. Odontologia. 2. Periodontite. 3. Compostos Químicos e Drogas. 4. Sinvastatina I. Título.

CDU 616.314

Porque Eu, o SENHOR teu Deus, te seguro pela mão

direita e te declaro: Não temas, Eu te ajudarei.

Isaías 41;13

Dedico esse trabalho a minha família, em especial ao

meu esposo Antônio Bocardi Junior, pela paciência,

doação, compreensão, que muitas vezes renunciou aos

seus sonhos, para que eu pudesse realizar os meus, aos

meus filhos: Camila, João Vitor e Antônio Neto, que me

incentivaram, me ajudando a todo momento. Quero

dizer que essa conquista não é só minha, mas nossa.

Obrigada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus que me deu sabedoria, coragem, discernimento, paciência e

pessoas maravilhosas que me ajudaram a concluir esse trabalho.

Ao meu esposo Antônio Bocardi Junior, esposo exemplar em todos os momentos e

aos meus filhos Camila, João Vitor e Antônio Neto, pela compreensão por uma mãe

ausente quando tanto precisaram de um carinho de mãe. Tudo que consegui só foi

possível graças ao amor, apoio e dedicação que vocês sempre tiveram por mim.

Agradeço pela paciência e compreensão com minha ausência durante essa longa

jornada.

A minha família em especial, meus pais Pedro Cruz de Almeida e Evaldina Cardoso

Rocha, mesmo distante intercederam em oração por mim, incentivando a não

desanimar, meus irmãos Selson Rocha de Almeida, Gilsom Rocha de Almeida e

minha irmã Marinei Almeida de Azevedo sempre com o pensamento confiante que

serei capaz, minhas cunhadas e meu cunhado, Luciene Souza Cunha, Lucilé Ferreira

de Almeida e Wilson Azevedo de Oliveira, a família do meu esposo minhas cunhadas

Adele Maria Miglioli Bocardi, Vânia Maria Bocardi Patrão, Larissa de Oliveira Bocardi,

Fabiana Cristina Azevedo Bocardi, um círculo de amor onde a realização de um sonho

de uma é a felicidade de todas; aos meus cunhados; Sergio Luís Bocardi , Ricardo

bocardi, Renato Bocardi, Junior, obrigado pelo carinho que sempre tiveram por mim;

A todos os meus sobrinhos, sinto no dever de ser um exemplo de nunca desistir diante

das dificuldades; A minha sogra Maria Aparecida Jobim Bocardi, que esteve presente

nas minha decisões, meu muito obrigado.

Aos meus amigos(as); Cláudia da Fonseca Granjeiro, Cleiner Neves Ribeiro,

Christiane Marques Nogueira de Lima, Edinei Rocha de Almeida Bocardi, Elaine

Patrícia Alves de Araújo Gomes, Everton José da Silva, Gilberto Siebert Filho, Gislaine

Figueiredo Zarza Arguello Gonçalves, Joana Guimarães Freitas Silva, Kellin Pivatto,

Leniéser Fajardo Nunes, Leticia Lazzari Fantin, Natalino Francisco da Silva, Panmella

Furlan Alegria Zaffari, Thaise Ayres Bezerra Zuli, sinto privilegiada em fazer parte

dessa turma, agradeço a Deus pela amizade de cada um de vocês.

A todo o corpo docente do programa de mestrado, pela dedicação, educação e

atenção com que exercem seu ofício de ensinar.

Ao Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo, pelo seu comprometimento e dedicação como

professor de pesquisa, demostrando seu conhecimento com toda gentileza, auxiliando

quando mais precisei, minha eterna admiração.

A minha querida orientadora Profa. Dra. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff,

que Deus colocou no meu caminho, pessoa maravilhosa que transmite humildade,

sabedoria, agradeço pela paciência em receber-me, em sua casa em finais de semana

e com muita tranquilidade e respeito orientando e ensinando nas minhas inúmeras

duvidas, minha profunda gratidão e admiração.

À Universidade de Cuiabá – UNIC nas pessoas do Reitor Fernando Ciriaco Dias Neto,

do Pró Reitor Acadêmico José Cláudio Perecin, e, sobretudo, ao Diretor da Faculdade

de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fábio Luís Miranda Pedro pelo

apoio irrestrito em oferecer todo apoio necessário para a realização deste trabalho.

Ao Programa de Mestrado da Universidade de Cuiabá – UNIC nas pessoas do Diretor

de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Hélio Suguimoto e à Coordenadora de

Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC,

Lucélia de Oliveira Santos pelo esforço em conduzir o processo educativo e de

construção do conhecimento científico nesta Instituição.

À secretaria do Programa de Pós-Graduação da Universidade de Cuiabá nas pessoas

do José Bohnenberger e Jonielson Dias pela atenção e prontidão ao atendimento,

solucionando nossos pedidos e esclarecendo sempre as nossas dúvidas. A vocês

todo meu carinho.

E finalmente, agradeço profundamente o Coordenador do Programa de Mestrado em

Ciências Odontológicas Integradas, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges pelo seu

incentivo, determinação, orientações e preocupação com cada aluno, o meu muito

obrigado.

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

Cels/mm2 Células por milímetros quadrados

TNF-α Fatores de necrose tumoral alfa

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

HO-1 Heme oxigenase1

PDGF Platelet-derived growth factor

PLGA Poli-lático-co-ácido glicólico

LC3-II Phosphatidylethanolamine conjugate - marcador de autofagia

MC3T3E1 Linhagem de células pré osteoblásticas da calvária de ratos

PARP Poly (ADP-ribose) Polymerase

SVT Sinvastatina

RANKL Receptor ativador de fator nuclear kappa-β ligante

AST Aspartato aminotransferase

ALT Alanina aminotransferase

ATV Atorvastatina

RAR Raspagem e alisamento radicular

ISG Índice de sangramento gengival

IP Índice de placa

PS Profundidade de sondagem

NIC Nível de inserção clínica

SS Sangramento à sondagem

PRP Plasma rico em plaquetas

PRGF Plasma rico em fatores de crescimento

LPS Lipopolissacarídeo

SM Síndrome metabólica

DP Doença periodontal

OVX Ovariectomizado

Ti-6Al-4V Mini implante de titânio

MEV Microscopia eletrônica de varredura

BMP-2 Expressão de proteína morfogenética óssea 2

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VEGFR-2 Receptor de VEGF 2

Vwf Fator de von Willebrand

CD31 Cluster de diferenciação 31

PLGA Ácido co lactic- -glycolic

TC Tetraciclina

NPs Net Promoter Score

HA Hidroxiapatita

Βtcp β-fosfato tricálcico

GP Grupo Periodontite

GPE Grupo Periodontite e Estresse

GPES Grupo Periodontite, Estresse e Sinvastatina

GPS Grupo Periodontite e Sinvastatina

GC Grupo Controle

HPA Hipotálamo- pituitário-adrenal

PVC Poli cloreto de polivinila

JCE-PIH Perda de Inserção Histológica

JCE-PO Perda Óssea Histológica

ANOVA Análise de variância univariada

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 –

Demonstra as mensurações para: Perda de Inserção Histológica (JCE - PIH); Perda Óssea (JCE-PO) e as estruturas analisadas: PC - Polpa Coronária; PR - Polpa Radicular. JCE - Junção Cemento Esmalte; LP - Ligamento Periodontal; CO - Crista Óssea.

45

FIGURA 2 – Demostra médias e desvio padrão para perda de inserção histológica(JCE-PIH) nos grupos analisados

47

FIGURA 3 – Demonstra médias e desvios padrão para perda óssea histológica (JCE-PO) nos grupos analisados

47

–

SUMÁRIO

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

1.1 REFERÊNCIA DA INTRODUÇÃO 21

2 REVISÃO DE LITERATURA 24

2.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA 35

3 EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO

DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS

SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO

38

3.1 PÁGINA TÍTULO 39

3.2 RESUMO 40

3.3 ABSTRACT 41

3.4 INTRODUÇÃO 42

3.5 MATERIAIS E MÉTODOS 43

3.6 RESULTADOS 46

3.7 DISCUSSÃO 48

3.8 CONCLUSÃO 49

3.9 REFERÊNCIAS 50

4 ANEXOS 55

1 INTRODUÇÃO

19

1 INTRODUÇÃO

O estresse crônico tem sido investigado como um fator de risco para a

progressão da doença periodontal por gerar uma série de reações orgânicas. Inclusive

no eixo hipotálamo-pituitário-adrenal1, conduzindo a diversas alterações nos sistemas

de defesa do organismo, aumentando sua suscetibilidade a infecções virais como

gripe2 e herpes3, além de estar relacionado com aumento da pressão arterial4 e infarto

do miocárdio5.

As estatinas têm sido amplamente utilizadas na prática médica para

controle dos níveis de colesterol6,7. Com o aprofundamento das pesquisas científicas

sobre os efeitos deste fármaco, percebeu-se que além de sua função hipolipemiante8,

apresentam também efeitos antioxidantes9, anti-inflamatórios10 e imunomodulatório11.

De igual modo, estas substâncias têm sido relacionadas a indução de angiogênese12,

estímulo na diferenciação dos osteoblastos13 e formação óssea14-16.

Na odontologia, vários estudos têm buscado relacionar a sinvastatina ao

reparo e à regeneração óssea14,15. A partir destes achados, é plausível que essa

estatina possa influenciar o curso de doenças inflamatórias crônicas que acometam

tecido ósseo, como é o caso das periodontites crônicas17.

De modo que, o presente trabalho foi elaborado com o objetivo de verificar

se a sinvastatina é capaz de modular o processo de doença periodontal induzida em

ratos submetidos ou não ao estresse crônico.

20

1.1 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO

21

1.1 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO

1. Hueston CM, Deak T. The inflamed axis: the interaction between stress, hormones and the expression of inflammatory-related genes within key structures comprising the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Physiol Behav. 2014 Jan 30;124:77-91.

2. Segerstrom SC, Miller GE. Psychological stress and the human immune system: a meta-analytic study of 30 years of inquiry. Psychol Bull. 2004 Jul;130(4):601-30.

3. Cohen S, Janicki-Deverts D, Miller GE. Psychological stress and disease. JAMA 2007; 298(14): 1685-7.

4. Carrive P. Orexin, Stress and central cardiovascular control. A Link with Hypertension? Neurosci Biobehav Rev. 2016 Jul 29. pii: S0149-7634(16)30159-2.

5. Edmondson D, Newman JD, Whang W, Davidson KW. Emotional triggers in myocardial infarction: do they matter? Eur Heart J. 2013 Jan; 34(4):300-6.

6. Liu M, Jin YH, Li TH, Shi LH, Zhu BQ. Effect of simvastatin on atherosclerosis and central aortic pressure in ApoE gene knockout mice. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2014 May; 43(3):293-7.

7. Delahoy PJ, Magliano DJ, Webb K, Grobler M, Liew D. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes: an updated meta-analysis. Clin Ther. 2009 Feb;31(2):236-44.

8. Hörl G, Froehlich H, Ferstl U, Ledinski G, Binder J, Cvirn G et al. Simvastatin efficiently lowers small LDL-IgG immune complex levels: A therapeutic quality beyond the lipid-lowering effect. PLoS One. 2016 Feb 3;11(2):e0148210.

9. Mhaidat NM, Ali RM, Shotar AM, Alkaraki AK. Antioxidant activity of simvastatin prevents ifosfamide-induced nephrotoxicity. Pak J Pharm Sci. 2016 Mar;29(2):433-7.

10. Fu CH, Tsai WC, Lee TJ, Huang CC, Chang PH, Su Pang JH. Simvastatin inhibits IL-5-induced chemotaxis and CCR3 expression of HL-60-derived and human primary eosinophils. PLoSOne. 2016 Jun 8;11(6):e0157186.

11. Alam S, Ueki, K, Nakagawa K, Marukawa K, Hashiba Y, Yamamoto E et al. Statin induced bone morphogenetic protein (BMP)-2 expression during bone regeneration. An immunohistochemical study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009 Jan;107(1):22-9.

12. Tan J, Yang N, Fu X, Cui Y, Guo Q, Ma T et al. Single-dose local simvastatin injection improves implant fixation via increased angiogenesis and bone formation in an ovariectomized rat model. Med Sci Monit. 2015 May 18;21:1428-39.

13. Chuang SC, Liao HJ, Li CJ, Wang GJ, Chang JK, Ho ML. Simvastatin enhances human osteoblast proliferation involved in mitochondrial energy generation. Eur J Pharmacol. 2013 Aug 15;714(1-3):74-82.

22

14. Du Z, Chen J, Yan F, Xiao Y. Effects of Simvastatin on bone healing around titanium implants in osteoporotic rats. Clin Oral Implants Res. 2009 Feb;20(2):145-50.

15. Faraco-Schwed FN, Mangueira LM, Ribeiro JV, Antao Ada S, Shibli JA. Removal torque analysis of implants in rabbit tibia after topical application of simvastatin gel. J Oral Implantol. 2014 Feb; 40(1):53-9.

16. Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999 Dec 3;286(5446):1946-9.

17. Dalcico R, de Menezes AM, Deocleciano OB, Oriá RB, Vale ML, Ribeiro RA, et al. Protective mechanisms of simvastatin in experimental periodontal disease. J Periodontol. 2013 Aug;84(8):1145-57.

23

2 REVISÃO DE LITERATURA

24

2 REVISÃO DE LITERATURA

Nas últimas décadas a população mundial tem apresentado maiores

índices de hipercolesterolemia, (MacDonald e Morant, 2008; Al Rasadi et al., 2016)1,2

fato que tem sido relacionado com o aumento das doenças cardiovasculares e óbitos

em diferentes países (Delahoy et al., 2009)3.

Diversas opções terapêuticas têm sido propostas com o intuito de sanar

este problema de saúde. Neste sentido, a sinvastatina, fármaco da classe das

estatinas, promove a inibição da enzima 3-hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA redutase

(HMG-CoA redutase) que é responsável pela síntese do colesterol em células

humanas, tem sido amplamente utilizada (Mundy et al., 1999)4.

A partir de estudos in vivo que tentam avaliar os efeitos colaterais,

secundários e interações medicamentosas deste medicamento, percebeu-se uma

associação entre a administração da sinvastatina e estímulo de formação e

regeneração óssea (Bradley, 2007; Park, 2009)5,6. Destaca-se ainda, nos mesmos

trabalhos, a descrição do aumento da atividade da fosfatase alcalina e seu

consequente efeito mineralizador, bem como, aumento de alguns componentes da

matriz óssea como a sialoproteína óssea, a osteocalcina e o colágeno tipo I. Além

disso, constatou-se efeitos anti-inflamatórios, provavelmente por reduzir a produção

de interleucina-6 e interleucina-8 e capacidade de estímulo na angiogênese.

Por essa razão, Junqueira et al. (2002)7 buscaram avaliar os efeitos da

sinvastatina sobre a regeneração óssea guiada em mandíbulas de ratas

ovariectomizadas e observar o nível de colesterol no sangue. Nos resultados

observaram que os animais ovariectomizados tinham níveis de colesterol mais

elevados do que os animais normais tratados com sinvastatina. Nas análises

densitométrica, histológica e morfométrica notaram que os animais ovariectomizados

tratados desenvolveram mais tecido ósseo do que os ratos ovariectomizados do grupo

controle, mas não foi observada diferença significativa entre os períodos de

tratamento. Com isso concluíram que a deficiência de estrogênio aumentou o nível de

colesterol no sangue e que a sinvastatina auxiliou a formação de tecido ósseo nos

animais ovariectomizados.

Com o intuito de analisar a neoformação óssea induzida por sinvastatina,

Wu et al. (2006)8 realizaram a extração de dentes de ratos e inseriram a sinvastatina

25

associada a um dispositivo de liberação lenta denominado poli-lático-co-ácido glicólico

(lactic-co-glycolic acid - PLGA) no interior do alvéolo dental, o que possibilitou a

avaliação do processo de reparo em diferentes tempos experimentais. Os resultados

demonstram o potencial biológico deste produto no estímulo da formação inicial das

fibrinas, bem como, a ação osteoindutiva e de antirreabsorção, minimizando-se a

cascata inflamatória ligada à destruição óssea ou ao atraso em caso de presença de

doenças como a diabetes e o uso do tabaco.

Marcondes et al. (2008)8, avaliaram o efeito da sinvastatina na perda óssea

causada por periodontite induzida por ligadura nos primeiros molares inferiores. Os

animais do grupo tratado receberam, por via oral, 30 mg/kg de sinvastatina e os

animais do grupo controle receberam o mesmo volume de água filtrada, diariamente

por quatro semanas. Para a demarcação da junção cemento-esmalte, as

hemimandíbulas direitas permaneceram durante 30 minutos em solução de azul de

metileno a 1% e em seguida foram posicionadas sobre lâminas de vidro com cera

utilidade. As imagens captadas por lupa estereoscópica, em aumento de 20 vezes,

foram digitalizadas, e desse modo, permitiu-se realizar a demarcação das áreas entre

a junção amelo-cementária e o topo da crista alveolar lingual do primeiro molar inferior.

Após análise estatística, não foi observada diferença entre os grupos. Com isso os

autores concluíram que a sinvastatina não foi eficiente para a redução da perda óssea

relacionada à periodontite.

Lin et al. (2009)10 buscaram avaliar o efeito da sinvastatina em células

osteoblásticas humanas e na periodontite apical em ratos. Para tanto, uma linha

celular de osteossarcoma humano, com um fenótipo osteoblástico foi incubada em

meio adequado e semeadas a uma densidade de 5.105cels/mm2 em placas de cultura

de 10cm de diâmetro, tratadas com 20Ng/mL de fator de necrose tumoral alfa (TNF-

α). Após esse procedimento, as células foram avaliadas em 0, 4, 8, 12, e 24 horas.

Para análise da periodontite apical, os animais foram submetidos à abertura coronária

e às injeções subcutâneas de 20 miligramas de sinvastatina por cada quilograma de

peso corporal (Grupo experimental com 10 animais) ou a solução salina normal

(Grupo controle com 10 animais) diariamente até o sacrifício. Os animais foram

sacrificados 20 dias após a indução da lesão apical. As peças foram submetidas ao

sistema de análise de imagens Digora. As mandíbulas foram fixadas em

paraformaldeído a 4% em 4ºC durante 48 horas, descalcificadas com ácido

26

etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 14% e incorporados em cera de parafina. Foi

possível observar que a sinvastatina atenuou os níveis de TNF-α e atenuou

significativamente a reabsorção óssea periapical em comparação com o grupo

controle.

Min et al. (2010)11 investigaram o efeito da sinvastatina adicionada na polpa

dentária de células humanas na estimulação odontogênica, na diferenciação

odontoblástica e no mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos,

angiogênico. Após 14 dias de cultura celular na presença de sinvastatina, as células

foram fixadas em etanol a 70% arrefecido com gelo durante 1 hora e lavadas com

água destilada. As células foram coradas com 40 mmol/L de vermelho de alizarina sal

sódica. As amostras foram separadas e transferidas para membranas de nitrocelulose

e foi utilizado um estojo de quimiluminescência aumentada. As imagens foram então

captadas por uma câmera digital. A intensidade da cor vermelha de alizarina e cada

expressão de proteínas após normalização com β-actina foram quantificadas

utilizando um densitômetro. Este estudo demonstra que a sinvastatina é capaz de

induzir angiogênese e odontogênese e estes efeitos são mediados através da via de

Heme oxigenase1 (HO-1). Os dados ressaltam fortemente os efeitos da sinvastatina

na regeneração de polpas dentárias danificadas e na estimulação no reparo

dentinário.

Apesar dos fatores positivos, alguns trabalhos apontam alguns insucessos

nas tentativas de osteoindução por sinvastatina na superfície de implantes dentários,

e algumas repostas negativas ao associar a sinvastatina com matriz óssea bovina em

defeitos críticos realizados em calota craniana (Lima, Calixto e Anbinder, 2011)12.

Em 2012, Chang et al.13 associaram a sinvastatina ao fator de crescimento

de plaquetas (PDGF -platelet-derived growth factor) e inseriram esta mistura em

alvéolos dentários de ratos, recém-submetidos à exodontia, utilizando-se também o

mecanismo de liberação lenta de PLGA. Ao observar os diferentes tempos

experimentais, percebeu-se que aos 28 dias, tempo protocolar para verificação de

reparo ósseo alveolar, a osteoblastogênesis e a maturação óssea estavam mais

completas que nos outros grupos de análise - grupo controle negativo, grupos onde

somente a sinvastatina ou o PDGF foram utilizados.

Lai et al. (2012)14 desenvolveram um estudo com intuito de observar o

efeito de sinvastatina em autofagia/apoptose em osteoblastose e também o

27

significado desta ação sobre a progressão da periodontite apical induzida em rato. Os

autores examinaram a expressão do marcador proteolítico de cadeia leve - Light

ChainLC3-II (um marcador de autofagia) e de uma cultura de osteoblastos

provenientes de calvária de ratos MC3T3E1 (um marcador de apoptose) por análise

de Western Blott. A Sinvastatina causou o aumento da formação LC3-II induzida por

água oxigenada e simultaneamente diminuiu a fragmentação da enzima denominada

poly-ADP-ribose polymerase (PARP). Radiografia e exames imunopatológicos

demonstraram que a sinvastatina reduziu o número de osteoblastos apoptóticos e a

extensão das lesões periapicais em ratos. O número de osteoblastos sintetizados

também aumentou acentuadamente após tratamento com sinvastatina. Os autores

puderam concluir que há uma relação negativa entre a autofagia e apoptose em

células osteoblásticas.

Com objetivo de avaliar o efeito da sinvastatina (SVT) em ratos submetidos

à indução de periodontite induzida através de ligadura, Dalcico et al. (2013)15,

administraram doses de SVT em diferentes concentrações através de gavagem. Para

avaliação da perda óssea foram utilizadas mensurações de perda óssea morfológica

e histológica. Além disso, realizou-se a análise das metaloproteinases 1 e 8; do

receptor ativador de fator nuclear kappa-β ligante (RANKL), de proteínas ósseas

morfogenéticas e osteoprotegerin. Os resultados da pesquisa demonstram que o uso

de SVT melhorou os indicadores de perda óssea alveolar nos parâmetros histológicos

e histométricos, além de todos os parâmetros imunoinflamatórios estudados

demonstrarem atividade anti-inflamatória e antioxidante. Um fator relevante, é que

apenas na maior concentração, de 30 miligramas por quilograma (mg/kg) houve um

aumento no tempo de atividade de protombina comparado com o grupo controle. Para

os indicadores de atividade do fígado, com importante papel na resposta inflamatória,

não houve diferenças nos níveis de aminotransferase aspartato (AST) e alcalino

fosfatase (ALT). As conclusões dos autores clarificam o potencial da SVT em

promover uma resposta anti-inflamatória local e sistêmica com repercussões

significativas de periodonto de ratos com indução de periodontite.

Lin et al., (2013)16 estudaram se a sinvastatina era capaz de modular

anticorpos e proteínas policlonais em osteoclastos cultivados em ratos, além de

verificar o efeito da sinvastatina sobre a quimiotaxia de macrófagos. Estes marcadores

foram analisados na progressão da doença em um modelo de rato com periodontite

28

apical. Injeções subcutâneas de sinvastatina (20mg/kg de peso corporal) ou solução

salina normal (como controle) foram ministradas entre o primeiro e o vigésimo primeiro

dia, quando os animais foram eutanasiados. Os maxilares foram dissecados e

radiografados. As radiografias obtidas foram colhidas e analisadas pelo sistema de

análise de imagem Digora. Os resultados deste estudo demonstram que a sinvastatina

pode diminuir lesões periapicais por ativar a os anticorpos analisados e suprimir a

síntese de osteoblastos. Tomando o conjunto de dados in vitro e in vivo, observou que

a sinvastatina pode retardar a progressão de lesões periapicais.

Pradeep et al., (2013)17 buscaram investigar a efetividade de 1,2% de

atorvastatina (ATV) como adjuvante do tratamento periodontal convencional de

raspagem e alisamento radicular (RAR) em dentes com bolsas intraósseas. Para

tanto, sessenta indivíduos foram randomicamente divididos em dois grupos de

tratamento: RAR associado a 1,2% de ATV ou RAR associado a placebo gel. No início

do estudo, aos 3, 6 e 9 meses, os parâmetros clínicos, que incluíam índice de

sangramento gengival (ISG), índice de placa (IP), profundidade de sondagem (PS) e

nível de inserção clínica (NIC), foram registrados nas fichas clínicas. A avaliação

radiográfica para a análise dos defeitos intraósseos foi feita usando software

computadorizado no início do estudo em 6 e 9 meses. Os autores verificaram que a

redução média da PS e o ganho médio de NIC foram maiores no grupo ATV do que

no grupo placebo aos 3, 6 e 9 meses. Uma média significativamente maior de

preenchimento ósseo radiográfico foi encontrada no grupo ATV (35,49% ± 5,50%) em

comparação com o grupo placebo (1,82% ± 1,32%) após 9 meses. Fato que levou os

autores a concluírem que a ATV pode oferecer novas perspectivas de tratamento para

os defeitos intraósseos.

Rao et al. (2013)18 realizaram um ensaio clínico, em humanos, com o uso da

sinvastatina como coadjuvante ao tratamento da periodontite. Para esta finalidade, os

autores avaliaram pacientes portadores de periodontite e fumantes distribuídos em

dois grupos: Grupo teste - 20 participantes foram submetidos a raspagem e

alisamento radicular, instrução de higiene bucal através de duas escovações dentais

diárias pela técnica e uso tópico de gel de sinvastatina a 1,2%. Grupo Controle – 20

participantes foram submetidos aos mesmos procedimentos clínicos e aplicação

tópica de gel placebo. Os pacientes foram avaliados por exame clínico periodontal

através de: profundidade de sondagem (PS), do sangramento à sondagem (SS), nível

29

de inserção clínica (NIC) e exame radiográfico um dia após o tratamento, aos três,

seis e nove meses. Nenhum anti-inflamatório ou antibiótico pode ser ingerido pelos

pacientes seis meses antes ou durante o tempo experimental nem qualquer

complemento de higiene. Os resultados demonstram que 35 dos 40 pacientes

completaram o estudo e estes não apresentaram qualquer reação à droga ou ao

placebo. O grupo teste apresentou redução significativa da PS, do SS e ganho no NIC

comparado ao grupo placebo. Radiograficamente o grupo que usou sinvastatina

demonstrou maior frequência de preenchimento de defeitos ósseos vertical aos 6 e 9

meses se comparado ao placebo nos períodos de seis e nove meses.

Rivera et al. (2013)19 avaliaram os efeitos de tratamento da combinação da

sinvastatina, com plasma rico em plaquetas (PRP) ou plasma rico em fatores de

crescimento (PRGF), na regeneração e reparação de osso alveolar. Os animais foram

divididos em seis grupos de três ratos cada, em dois Grupos: Água (placebo) e Água

associada a sinvastatina. Após anestesia foi induzida uma lesão de dois milímetros

na distal do incisivo inferior. No dia seguinte da indução da lesão óssea, iniciou a

dosagem de 20 mg/kg/dia de sinvastatina diluída em água destilada, administrada por

via oral durante 6 semanas. Para análise, os maxilares dos ratos foram

hemiseccionados, fixados com formalina a 10%, descalcificados em ácido nítrico a 5%

durante sete dias e submetidos a coloração com hematoxilina e eosina. Após análise

histológica as imagens foram capturadas através de uma câmera digital conectada ao

microscópio e, em seguida, conectado a um computador para mensuração e

tabulação dos dados. Os autores puderam observar que não houve nenhuma

diferenciação entre os dois tratamentos, não dando para determinar qual preparação

foi mais produtiva em seus processos de regeneração do osso.

Jin et al. (2014a)20 ultilizaram um modelo de indução da doença periodontal

por meio de lipopolissacarídeo (LPS) em ratos, associando o efeito da sinvastatina

uma estatina comumente prescritos em problemas de inflamação gengival e perda de

osso alveolar. Foram selecionados 28 ratos e divididos em 3 grupos; grupo 1 (PBS) -

n= 7, grupo 2 (LPS) n= 8; grupo 3 (LPS + Sinvastatina) - n= 13. Nos grupos 2 e 3

foram injetados na gengiva 20 µg/ml de (LPS) entre o 1º e 2º molar superior três vezes

por semana por um período de 8 semanas, no grupo 3, foram administrados 20ml de

sinvastatina diariamente por 8 semanas por meio de gavagem. Após este período de

tratamento, a perda óssea alveolar foi analisada com tomografia computadorizada. Os

30

resultados deste estudo mostrou que a indução LPS aumenta acentuadamente a

perda óssea, estimulando as citoquinas inflamatórias, mas a administração de

sinvastatina diminui significativamente a perda óssea, inibindo significativamente o

efeito de LPS, dificultando assim a progressão da doença periodontal.

Jin et al. (2014b)21 estudaram a relação entre a síndrome metabólica (SM)

e doença periodontal (DP). Para tanto, 20 ratas fêmeas obesas Zucker e 22 ratas

fêmeas magras de 12 semanas de idade foram selecionadas. As ratas fêmeas obesas

apresentavam a SM incluindo a obesidade, resistência à insulina, a dislipidemia e a

hiperinsulinemia. A DP foi induzida nas ratas obesas e nas ratas magras por injeção

Actinobacillus Aggregatibacter e de lipopolissacarídeo (LPS) no periodonto. Para

metade dos animais de cada grupo, a sinvastatina foi administrada por meio de

gavagem. Após 4 semanas de tratamento, foram feitas tomografias e a perda óssea

alveolar foi calculada. Os resultados mostraram que a perda de osso alveolar foi

aumentada nos grupos que usou LPS, e foi significantemente maior no grupo de ratas

obesas com SM. Os resultados também mostraram que a sinvastatina foi capaz de

diminuir a osteoclastogênese em comparação aos grupos que não fizeram uso do

medicamento.

Montero et al. (2014)22 desenvolveram uma revisão sistemática sobre o uso

tópico da sinvastatina na regeneração óssea. O objetivo foi resumir os artigos bem

delineados sobre o uso da sinvastatina na promoção da regeneração óssea, além de

evidenciar o que suporta estas descobertas. Diante dos achados, percebe-se que

76,2% dos artigos são dos últimos 5 anos e envolveram estudos em animais, sendo

estes 66,6% com ratos ou coelhos, utilizando regiões extra orais. Os autores ainda

informam que apenas quatro ensaios clínicos randomizados demonstraram que a

administração tópica da SVT no local de análise obteve sucesso nos achados clínicos.

Os referenciados autores22 relatam que a sinvastatina parece contribuir

efetivamente para a formação óssea e para regeneração periodontal no local da

liberação de SVT; existem ainda vários estudos sobre a associação de fórmulas

poliméricas biodegradáveis e sinvastatina. Este fator ocorre pelo fato da sinvastatina

ser insolúvel em água, tal como um hidrogel gelatinoso ou microesferas de PLGA, que

ao lado de outros transportadores, mostraram-se capazes de liberar biomoléculas

formadoras de osso. Os autores destacam que os resultados da aplicação tópica de

SVT são favoráveis, quer seja ela introduzida sozinha ou combinada com biomateriais.

31

Xu et al. (2014)23 estudaram o efeito local e sistêmico da sinvastatina no

maxilar em ratos com osteoporose e periodontite. Foram usados 36 ratas Sprague

Dawley de 4 meses de idade e divididos em seis grupos: 1-grupo Sham; 2-grupo

ligadura; 3-grupo ovariectomizado (OVX) + ligadura; 4-sinvastatina local + OVX +

ligadura; 5-sinvastatina oral + OVX + ligadura; 6-sinvastatina oral e local em ratos OVX

+ ligaduras. Foi realizada a ovariectomia bilateral nos grupos 3, 4, 5 e 6. Após um

mês, realizou-se indução de periodontite por inserção de ligaduras nos sulcos

gengivais dos primeiros e segundos molares superiores dos animais dos grupos de 2,

3, 4, 5 e 6. Foi administrado a sinvastatina (25 mg/kg) ou placebo oral e/ou local por

um período de dois meses. Foram colhidos os resultados através da Tomografia

computadorizada para avaliação do osso alveolar. Os resultados mostraram que

através da administração de sinvastatina local houve aumento na altura da crista

alveolar e impediu a perda óssea alveolar em locais sem alteração da perda óssea

sistêmica. A administração oral preveniu a perda óssea local e sistêmica, sem efeito

na altura da crista alveolar. Com este estudo os autores concluíram que a sinvastatina

tem o potencial de promover a formação óssea e reduzir a perda óssea alveolar.

Fang et al. (2015)24 utilizaram um processo eletroquímico para depositar

sinvastatina como revestimento da superfície de implantes porosos para avaliar a

formação e integração do implante com o tecido ósseo de ratos com osteoporose.

Foram utilizados 72 implantes em 36 ratos divididos em três grupos: Grupo controle,

Grupo de ratos com osteoporose e Grupo de ratos sadios. Após 12 semanas da

ovariectomia bilateral dois implantes diferentes foram inseridos na tíbia de cada

animal. Após 2, 4 e 12 semanas, os animais foram sacrificados e o tecido em torno

dos implantes foram submetidos a avaliação histomorfométrica. A porcentagem de

contato osso-implante ao longo das espiras dos implantes e a percentagem da área

óssea no interior das mesmas foram medidas. Após análise dos resultados, os autores

concluíram que as superfícies de implantes com sinvastatina melhoram a

osseointegração de implantes em ratos com osteoporose.

Tan et al. (2015)25 avaliaram o efeito da sinvastatina utilizada como uma

única injeção local quanto à formação e reparação óssea, promovendo

osseointegração e melhorando assim a fixação dos implantes. Para essa pesquisa

foram utilizadas 48 ratas fêmeas, com 3 meses de idade e aproximadamente

260,68±16,85 gramas de peso. Após um período de 2 semanas de adaptação ao

32

ambiente, os animais foram submetidos a ovariectomia bilateral para induzir a

osteoporose por doze semanas, após esse período, os animais foram divididos em

três grupos com 16 ratas em cada grupo: 1) implante com 5 mg sinvastatina; 2)

implante com 10 mg de sinvastatina; 3) implante sem sinvastatina. Com uma broca de

baixa velocidade e irrigação salina fria, foi realizada um orifício no osso cortical

contralateral, perfurado perpendicular ao eixo longo do fêmur esquerdo, em seguida

foi inserido um mini implante de titânio Ti-6 Al-4V na perfuração, e a pele foi suturada.

Após quatro semanas, quatro ratos foram separados aleatoriamente de cada grupo e

eutanasiados para a análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (MEV).

Com o presente estudo os autores concluíram que a injeção única de sinvastatina

tanto em 5mg como em 10mg aumenta a formação óssea e evidencia a regeneração

e osseointegração dos implantes em ratas ovariectomizadas.

Wang et al. (2015)26 utilizaram nano partículas para elaboração de PLGA e

tetraciclina (TC-PLGA). Foi escolhido a Sinvastatina (SVT) para induzir o aumento da

osteogênese. Foi enxertada - SVT carregado de TC PLGA PN (SVT / TC- PLGA PN)

para aumentar a quantidade de SVT no osso, tendo um melhor efeito de regeneração

do osso com osteoporose. Todos os ratos, foram submetidos a cirurgia de

ovariectomia bilateralmente sob anestesia com pentobarbital de sódio (40 mg/kg),

exceto os ratos do grupo 1 que foram submetidos a uma operação simulada a

ovariectomia sob as mesmas condições de anestesia e invasão abdominal. Após um

mês da cirurgia começou a injeção de SVT, percorrendo por 2 meses. Após os 2

meses de injeção, todos os animais foram eutanasiados e feita a remoção dos fêmures

para análise radiográfica. Os autores concluíram que as NPs de direcionamento do

osso, com base na conjugação de TC para os copolímeros de PLGA, teve a

capacidade de segmentar osso, e a sua utilização para o tratamento da osteoporose

com a SVT foi conseguida com sucesso.

Bradley et al. (2016)27 avaliaram o efeito da sinvastatina na perda óssea e na

inflamação da periodontite experimental. 50 ratas Sprague Dawley fêmeas foram

divididas igualmente em cinco grupos: 1) apenas sinvastatina; 2) 0,5 mg de

sinvastatina e ligadura; 3) 1,0 mg de sinvastatina e ligadura; 4) 1,5 mg de sinvastatina

e ligadura; 5) apenas ligadura. Os animais dos grupos 2, 3, 4, e 5 foram submetidos à

indução de periodontite experimental por ligadura entre o primeiro e segundo molares

superiores. Quatro semanas após o início do experimento os animais foram

33

eutanasiados, e os molares superiores foram avaliados histopatologicamente e com

tomografia micro computadorizada. Os autores perceberam que o grupo submetido à

ligadura, sem sinvastatina, teve uma perda óssea média de 1,01 ± 0,06 mm. Todas

as doses de sinvastatina reduziram a perda óssea, especialmente 1,5 mg que levou a

uma perda óssea de 0,68 ± 0,05 mm, que, inclusive, não foi estatisticamente diferente

do controle contralateral (0,47 ± 0,06 mm). A dose de 1,5 mg de sinvastatina também

reduziu a percentagem de neutrófilos em comparação com os animais que tiveram

apenas indução por ligadura. Os autores concluíram que múltiplas doses locais de 1,5

mg de sinvastatina diminuem a quantidade de perda óssea e de células inflamatórias

na periodontite experimental em ratos.

Encarnação et al. (2016)28 avaliaram a resposta tecidual da calvaria de ratos à

implantação de sinvastatina associada a hidroxiapatita e β-fosfato tricálcico inseridos

em um dispositivo de liberação lenta (PLGA + SVT + HA + βTCP). Para tanto, foram

realizados dois defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos, que foram

distribuídos nos grupos experimentais e no controle. As amostras de tecido foram

colhidas nos dias 1, 7, 15, 30 e 60 após a cirurgia. A inflamação foi avaliada pela

quantificação da interleucina-1β e do fator de necrose tumoral alfa e por um

hemograma, enquanto a reparação óssea foi avaliada por densitometria e microscopia

eletrônica de varredura. Os autores verificaram que houve aumento da expressão de

citocinas nos grupos que usaram sinvastatina no dia 1 após a cirurgia, porém não

foram observadas alterações no hemograma. Aos 60 dias após a cirurgia todos os

grupos apresentaram valores de densitometria e características morfológicas

semelhantes, apesar da ocorrência de atraso na formação óssea no grupo

sinvastatina.

34

2.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA

35

2.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA

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38

3 EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA

NA PROGRESSÃO DA DOENÇA

PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS

SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO.

39

3.1 PÁGINA DE APRESENTAÇÃO - TITLE PAGE

EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO

Edinei Rocha de Almeida Bocardi*

Alex Semenoff Segundo**

Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff**

*Pós-Graduanda do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – MT, Brasil. **Professores do Programa de Pós-Graduação da Universidade de Cuiabá – UNIC. Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas. CORRESPONDING AUTHOR

Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff Avenida Manoel José de Arruda, 3100. Bairro Jardim Europa. CEP 78065-900. Cuiabá – MT, Brasil.Telefone:+ 55 065981131377. E-mail: t.semenoff@uol.com.br

40

3.2 RESUMO

Objetivou-se avaliar histologicamente o efeito do uso da sinvastatina na modulação

da periodontite induzida por ligadura em ratos submetidos ao estresse crônico.

Cinquenta ratos Wistar foram divididos em cinco grupos (N=10): grupo periodontite

(GP), grupo periodontite e estresse (GPE), grupo periodontite, estresse e sinvastatina

(GPES), grupo periodontite e sinvastatina (GPS) e grupo controle (GC). Entre o

primeiro e o trigésimo dia experimental, os animais dos grupos GPS e GPES foram

submetidos à ingestão oral diária de sinvastatina (6mg/dia). No segundo dia,

procedeu-se a indução da periodontite nos GP, GPE, GPES e GPS, através da

inserção de um fio de sutura em torno do segundo molar superior direito. Entre o

terceiro e o trigésimo dia o GPE e o GPES foram submetidos ao modelo de estresse

crônico - imobilização por 12 horas. Não houve intervenção no GC, apesar deste grupo

permanecer no mesmo local e sob as mesmas condições climáticas e de nutrição que

os outros animais. Após 30 dias foi realizada a eutanásia de todos os animais. As

maxilas foram coletadas e processadas para análise histológica. As imagens

histopatológicas foram capturadas por uma câmera acoplada ao microscópio de luz

branca binocular e transferidas para um televisor. A histometria foi realizada através

da mensuração, em centímetros, das perdas de inserção histológica e de osso

alveolar, (Anova – Post Hoc, Tuckey). Os resultados do trabalho demonstram que o

GPE obteve a maior destruição comparado aos outros grupos, tanto para o nível de

inserção periodontal como para osso alveolar (p<0,05). O GPES e GP não tiveram

diferenças estatísticas entre si (p<0,05), entretanto tiveram diferenças estatísticas

comparado aos GPE e GC (p<0,05). O GC obteve os menores resultados de perda

de inserção, sendo similar apenas com o GPS (p>0,05). Concluindo, a sinvastatina é

capaz de diminuir a progressão da periodontite induzida por ligadura em ratos

submetidos ao estresse crônico.

Palavras-chave: Sinvastatina, Periodontite induzida, Estresse, Ratos.

41

3.3 ABSTRACT

This article aimed to evaluate histologically the effect of simvastatin use on the

modulation of ligature induced periodontitis in rats submitted to chronic stress. Fifty

Wistar rats were divided into five groups (N=10): Periodontitis Group (PG),

Periodontitis and Stress Group (PSG), Periodontitis, Stress and Simvastatin Group

(PSSiG), Periodontitis and Simvastatin Group (PSiG) and Control Group (CG).

Between first and thirtieth experimental day, animals from PSiG and PESiG groups

were submitted to daily intake of simvastatin (6mg/day) via gavage. On the second

day, PG, PSG, PSSiG and PSiG were submitted to periodontitis induction by insertion

of a suture wire around the second right upper molar. Between third and thirtieth day,

PSG and PSSiG were submitted to the chronic physical stress - immobilization model

for 12 hours. Nothing was done in the CG, although the animals in this group remained

in the same place and under same climatic and nutritional conditions as the other

animals. After 30 days, all animals were euthanized. Jaws were collected and

processed for histological analysis. The histopathological images were captured by a

camera coupled to the binocular optical microscope and transferred to a television set.

Histometry was performed by measuring, in centimeters, the losses of fiber and

alveolar bone insertion (Anova - Post Hoc, Tuckey). The results showed that PSG

obtained the highest destruction of all groups for both periodontal insertion and alveolar

bone (p<0.05). GPSSi and PG did not have statistical differences among themselves

(p<0.05), however they had statistical differences compared to PSG and GC (p<0.05).

The CG obtained the lowest results of insertion loss, being similar only with GPS

(p>0.05). In conclusion, simvastatin is able to decrease the progression of ligature-

induced periodontitis in rats subjected to chronic stress.

Keywords: Simvastatin, Induced periodontitis, Stress, Rats.

42

3.4 INTRODUÇÃO

O estresse é biologicamente descrito como uma ativação do eixo

hipotálamo-pituitário-adrenal (HPA), parte do sistema nervoso autônomo (Marques-

Deak, 2004)1.

Apesar de ainda não se conhecer amplamente a magnitude das alterações

provocadas por um evento estressante, sabe-se que tal acontecimento tem a

capacidade de induzir modificações no sistema imunológico e no comportamento do

indivíduo. A intensidade dessas alterações pode variar, consideravelmente, entre as

pessoas. Uma das possíveis explicações para isto é a forma como cada indivíduo lida

ou interpreta diferentes estímulos (Ayub et al., 2010)2.

Atualmente, esta situação fisiológica tem grande importância nas diversas

áreas de pesquisa, por estar relacionada com a piora nos fatores preditores das

doenças autoimunes como o lúpus eritematoso (Williams et al., 2014)3 e a artrite

reumatoide (Marcenaro et al., 1999)4 quanto as de ordem emocionais como a

depressão, a ansiedade, a síndrome bipolar, entre outras, que desestabilizam o

organismo e proporcionam grandes malefícios para a humanidade (Marques-Deak,

2004, Hamester et al., 2016)2,5.

Na odontologia há estudos epidemiológicos que descrevem a relação de

doenças de origem emocionais com piora em indicadores de saúde periodontal

(Genco et al., 1999; Ng 2006)6,7. Com a liberação elevada de cortisol (hormônio do

estresse) na saliva e no fluído crevicular ligam-se a maior presença de periodontite

agressiva (Cakmak et al., 2016)8.

O estudo da biologia do estresse, sobretudo, trabalhos experimentais em

animais submetidos a protocolo de estresse oriundo de 12 horas de contenção física

por um período mínimo de 30 dias têm produzido evidências de que o estresse é

capaz de acelerar a progressão da doença periodontal (Takada et al., 2004; Semenoff-

Segundo et al., 2012; Siqueira et al., 2015)9-11.

Breivik et al. (2014)12 observaram que o eixo hipotálamo-pituitário-adrenal

(HPA), poderia ser modulado, tanto para uma maior destruição, como para evitar uma

destruição do periodonto (Breivik et al., 2011)13. Em uma revisão da literatura Breivik

et al. (1996)14 descreve a neurobiologia do eixo HPA e levanta uma hipótese

neurofisiológica, que o sistema nervoso, o sistema endócrino e o sistema imunológico

retroalimentam-se em relação à progressão da periodontite.

A partir da modulação do estresse sobre a periodontite já apresentada

43

(Semenoff et al., 2014)15 observa-se que outros fármacos como a sinvastatina poderia

interferir na progressão da doença. Na odontologia observa-se uma série de

evidências demonstrando que este fármaco foi capaz de contribuir na diminuição e

regeneração da periodontite (Xu et al., 2014; Bradley et al., 2016)16,17.

O desfecho no periodonto com o uso oral através de gavagem pode ser

importante, visto que, a sinvastatina é indicada no tratamento da hipercolesterolemia,

nos níveis de colesterol ligados a doenças cardiorrespiratórias (Delahoy et al., 2009)18.

Além de trabalhar na hipercolesterolemia, o agente atua na resposta

imunoinflamatória e no tecido conjuntivo (Kumari et al., 2016)19 e desta forma espera-

se que seu efeito em uso sistêmico, seja capaz de diminuir o efeito deletério da

indução de periodontite associado a estresse físico.

Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar histologicamente o efeito

do uso da sinvastatina na modulação da periodontite induzida por ligadura em ratos

submetidos ao estresse crônico.

3.5 MATERIAIS E MÉTODOS

Inicialmente, 50 ratos adultos, machos, com 2 meses de idade, da espécie

Rattus Novergicus da linhagem Wistar, com peso inicial de aproximadamente 220

gramas, foram selecionados no biotério da Universidade de Cuiabá, Cuiabá-MT. Os

mesmos passaram por uma adaptação ao novo ambiente durante duas semanas e

foram mantidos em dez caixas moradia (polietileno 60x40x35) em número de 5

animais por caixa, com ração padronizada e água ad libitum, sob ciclo claro/escuro de

12 horas, temperatura controlada a 23°C e umidade ± 60%. (Ceua – UNIC protocolo

003/2014).

Os animais foram randomicamente divididos, por um auxiliar técnico que

desconhecia os objetivos da pesquisa em cinco grupos experimentais (N=10): grupo

periodontite (GP), grupo periodontite e estresse (GPE), grupo periodontite, estresse e

sinvastatina (GPES), grupo periodontite e sinvastatina (GPS), e grupo controle (GC).

Entre o primeiro e o trigésimo dia de experimento, os animais dos grupos:

PES e PS foram submetidos à ingestão diária de seis miligramas de sinvastatina

(Cápsulas com 6 mg, Natupharma – Farmácia de Manipulação, Cuiabá–MT), através

de gavagem – realizada através de seringa de 10 ml (BD do Brasil, Curitiba-PR)

acoplada a 10 cm de cânula para injeção (Scalp vein 18G, Venescalp, Feira de

Santana – BA, Brasil).

44

No segundo dia do experimento, procedeu-se a indução da periodontite em

todos os grupos, com exceção do GC. Para isto, os animais receberam anestesia,

através da administração intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de cetamina (Dopalen,

Agribrands, Saúde Animal, Paulínia, SP, Brasil) associado a 0,05 mL de cloridrato de

xilazina (Rompun, Bayer. Saúde Animal, São Paulo, SP. Brasil), para cada 100

gramas de peso corporal e um fio de sutura de seda estéril (número 4, ETHICON,

Johnson e Johnson, São Paulo – SP, Brasil), foi colocado envolvendo o segundo molar

superior direito de cada rato20. Após o ato operatório, uma dose de dipirona sódica

(2,5 mg para cada 100 g de peso corporal) foi injetada intramuscularmente em cada

animal.

Entre o terceiro e o trigésimo dia experimental os animais do GPE e do

GPES foram submetidos ao modelo de estresse crônico por imobilização física

durante 12 horas46. Para tanto, os animais foram acondicionados em tubos de poli

cloreto de polivinila (PVC), compatíveis com seu tamanho e, posteriormente,

interrompeu-se a passagem de ambos os lados com fio metálico, de forma a

possibilitar a respiração. O GC não recebeu nenhum tipo de intervenção, porém foi

mantido no mesmo ambiente dos demais grupos9.

Após 30 dias experimentais foi realizada a eutanásia dos animais por

excesso de anestésico. Em seguida, as hemimaxilas direitas e esquerdas foram

removidas e fixadas em formol a 10% por 48 horas. Os espécimes foram então

descalcificados em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por um período de cinco

semanas (totalizando seis trocas) e em ato contínuo, foram lavadas, desidratadas,

diafanizadas e incluídas em parafina para que fossem realizados os cortes

histológicos de 6 μm de espessura ao longo eixo dos dentes no sentido mésio–distal.

As lâminas foram coradas com hematoxilina de Harris e eosina alcoólica e analisadas

em microscópio de luz.

Para análise histológica, foram selecionadas dez lâminas seriadas, nas

quais necessariamente deveriam ser observados o 1° e 2° molares superiores D e E,

e as seguintes estruturas: a) polpa coronária (PC), b) polpa radicular (PR), c) junção

cemento esmalte (JCE) na face mesial do segundo molar, d) crista óssea interproximal

(CO) e) inserção conjuntiva histológica do ligamento periodontal (LP).

O parâmetro da análise histométrica foi definido ao mensurar em

centímetros a distância entre a junção cemento esmalte na face mesial do segundo

molar e a porção mais coronal da inserção conjuntiva histológica do ligamento

45

periodontal. Este parâmetro foi estabelecido como Perda de Inserção Histológica

(JCE-PIH). Para a distância, também em centímetros, entre a junção cemento esmalte

e a crista óssea foi estabelecido como Perda Óssea Histológica (JCE-PO) (Figura -1).

A histometria foi realizada através da mensuração das imagens com uma

régua escolar de 60 cm em um televisor de 29 polegadas (Semp Toshiba, Santo

Amaro, SP, Brasil), após as imagens serem captadas por uma câmera Samsung SDC

– 415 (Manaus, AM, Brasil) acoplada em um Microscópio Binocular E200, Nikon (São

Paulo, SP, Brasil) (Figura - 1).

O pesquisador estava calibrado em relação às análises realizadas e

desconhecia os grupos analisados.

Figura 1 - Demonstra as mensurações para: Perda de Inserção Histológica (JCE - PIH); Perda Óssea (JCE-PO) e as estruturas analisadas: PC - Polpa Coronária; PR - Polpa Radicular. JCE - Junção Cemento Esmalte; LP - Ligamento Periodontal; CO - Crista Óssea.

46

Para análise estatística dos resultados, os dados originais foram

submetidos a testes preliminares (Shapiro–Wilk), visando verificar a normalidade da

amostra, e, em seguida, procedeu-se as comparações entre as médias de Perda de

Inserção Histológica e de Perda Óssea Histológica obtidas nas imagens

microscópicas com o uso da análise de variância univariada (ANOVA) e teste Post

Hoc de Tuckey. Para verificação da calibragem do examinador, utilizou-se o teste t de

Student. O intervalo de confiança escolhido no estudo foi de 95% e a significância

estatística de 5%.

3.6 RESULTADOS

Os resultados em relação à perda de inserção histológica (JCE-PIH)

demonstram que o GP (18,16±8,28) e o GPES (16,77±8,08) se diferenciaram de todos

os grupos (p<0,05), porém não apresentaram diferenças entre si (p>0,05). O GPE

(29,11±7,72) foi o que apresentou maior destruição com significância estatística

comparado com os demais grupos (p<0,05). O GPS (7,00±6,39) e o GC (5,15±4,65)

foram os que obtiveram os menores resultados comparado com todos os grupos

(p<0,05), entretanto sem diferenças entre si (p>0,05) (Figura 2).

Para perda óssea histológica (JCE-PO), o GP (36,88±9,66), o GPSE

(36,66±8,06) e o GPS (32,25±9,16) foram semelhantes p>0,05. O GPE (51,00±10,28)

foi o grupo com maior destruição da crista óssea histológica, diferenciando-se dos

demais grupos (p<0,05). Além disso, o GPS foi estatisticamente semelhante ao GC

(22,27±9,99) (p>0,05) (Figura 2).

47

Figura 2 – Gráfico demonstra médias e desvios padrão para perda de inserção

histológica (JCE-PIH) nos grupos analisados.

Figura 3 – Gráfico demonstra médias e desvios padrão para perda óssea histológica

(JCE-PO) nos grupos analisados.

48

3.7 DISCUSSÃO

Os resultados demonstram que em ambas as mensurações, tanto para

perda de inserção histológica, quanto para perda óssea histológica, o estresse foi um

fator de modulação no aumento da progressão da doença periodontal induzida.

Todavia, quando os animais foram submetidos à ingestão de sinvastatina foi possível

perceber que a progressão da doença periodontal foi minimizada. Ao se observar a

associação no uso de sinvastatina, indução de periodontite e estresse crônico notou-

se que a sinvastatina agiu como fator protetor na periodontite induzida.

É estabelecido na literatura que o estresse crônico em ratos é capaz de

modular a periodontite para uma maior destruição periodontal (Nakajima et al., 2006;

Semenoff-Segundo et al., 2010; Semenoff-Segundo et al., 2012)10,20,21. Os resultados

do trabalho demonstram inicialmente o que já foi descrito, o estresse foi capaz de

proporcionar maior destruição nas estruturas periodontais comparado com o grupo

com apenas indução de doença.

O estresse crônico é uma das causas de grandes malefícios para o

organismo. Atua direta ou indiretamente como um fator de progressão de doenças

(Lin et al., 2016; Clapes et al., 2016)22,23 e, inclusive, tem sido relacionado com

maiores taxas de mortalidade (Sumner et al., 2016)24. Buscar maiores informações

sobre este tema em animais pode ser uma interessante ferramenta para futuros

ensaios clínicos. Os resultados deste estudo demonstram que os animais que usaram

sinvastatina e foram submetidos a doença periodontal e ao estresse, tiveram menores

destruições nas estruturas periodontais comparado com o grupo que foi submetido a

doença periodontal e estresse. Dessa forma, foi possível inferir que a sinvastatina

interferiu na progressão da periodontite marginal protegendo o periodonto.

É conhecido que a aterosclerose é um processo inflamatório no interior das

artérias. A hipercolesterolemia tem sido enfrentada pelos médicos como um problema

sério de saúde pública. Quando o colesterol LDL (Low density lipoprotein) e as

triglicérides estão em altos níveis no sangue, podem conduzir a arteriosclerose (Libby,

2002)25 e até a um colapso do sistema cardiorrespiratório (Galve et al., 2016; Quero

et al., 2016)26,27. Neste sentido, o uso contínuo e em larga escala do fármaco

sinvastatina, cujo propósito é minimizar a quantidade dos colesteróis e triglicérides do

interior das artérias, proporcionou inúmeras investigações e descobertas de outras

49

indicações além da sua proposição inicial (Jain, 2005; Schönbeck, 2005; Miner et al.,

2008; de Oliveira et al., 2015; Ishihara et al., 2016)28-32.

Na odontologia intensifica-se sua utilização como um agente de atuação

capaz de modular as respostas do tecido conjuntivo. No caso da implantodontia, há

diversos trabalhos (Rivera et al., 2013; Fang et al., 2015; Tan et al., 2015, Wang et al.,

2015; Encarnação et al., 2016)33-37 que demonstram sua ação aumentando a

angiogênese, o número de osteoblastos e diminuindo a quantidade de osteoclastos.

Fato que impacta diretamente em maior formação óssea (Papadimitriou et al., 2015;

Yue et al., 2016)38,39.

Na periodontia tem-se analisado sua capacidade anti-inflamatória e,

portanto, protetora em relação à progressão da periodontite apical e marginal (Bradley

et al., 2016; Xu et al., 2014; Kumari et al., 2016; Nassar et al., 2014; Jung et al.,

2016)16,17,19,40,41.

Os mecanismos de ação do estresse são complexos. Inicialmente há um

estímulo químico e/ou físico capaz de produzir de impulsos elétricos e hormonais

capazes de determinar a produção de cortisol e de adrenalina (Breivik et al., 1996)14

atuantes nas respostas imunológicas inata e específica, proporcionando respostas

inflamatórias capazes de serem determinantes na progressão da periodontite (Breivik

et al., 2014; Breivik et al., 2011)13,14.

Na atualidade sabe-se que o estresse interfere no sistema nervoso central

e por consequência nas respostas de defesa, dentre elas as células T Helper 1 (TH1)

e T Helper 2 (TH2) (Leff-Gelman et al., 2016)42. Estes dois padrões de resposta

adaptam-se em estabelecer uma apropriada resposta de defesa para diversas

necessidades, dentre elas contra as infecções (Heinzel, 1995)43 como a periodontite

(Semenoff-Segundo et al., 2014)15 proporcionando uma mudança no perfil

imunoinflamatório determinando uma menor progressão de doença.

3.8 CONCLUSÃO

O uso de sinvastatina foi capaz de agir como fator protetor para a

periodontite induzida em ratos submetidos ou não ao estresse cônico.

50

3.9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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nervoso central e o sistema imunológico. Rev. Bras. Psiquiatr. 2004;26(3): 143-144

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ANEXOS

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ANEXOS

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Examples: Reference to an article: Shiloah J, Patters MR and Waring MB. The prevalence of pathogenic periodontal microflora in healthy young adult smokers. Journal of Periodontology 2000; 71:562-567. Reference to a book: Schuster GS. Oral Microbiology and Infectious Diseases, 3rd ed. Philadelphia: B. C. Decker, 1990; 516–522. Reference to a chapter in a book: Chesney J, Patters MR and Budreau-Patters A. Oral infections. In Long S, Prober C and Pickering L (Eds): Principles and Practice of Pediatric Infectious Disease. New York. John Wiley and Sons, 1996. Reference to a dissertation or thesis: James A. On the Immune Response to GTR Membranes in Periodontics. PhD, Liverpool, UK. 1994; 15–25. Reference to a report: Committee on Mercury Hazards in Dentistry. Code of Practice for Dental Mercury Hygiene. London: Department of Health and Social Security, 1979; Publication No. DHSS 79-F372. Reference to an abstract: Patters, MR., Shiloah, J, Dean, JW, Bland, P and Toledo, G. The consequence of infection of treated periodontal pockets by microbial pathogens. Journal of Dental Research 1997; 76 (special issue), 111 (Abst)

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require that clinical photographs and stained histologic specimens be submitted and published in color. Figures should be submitted electronically in jpeg format as separate files and not pasted into the Microsoft Word document. Figure legends All illustrations should be listed by legend on a separate page, double-spaced, and numbered to correspond with the numbering in the text. Permissions Direct quotations, tables, and illustrations that have appeared in copyrighted material must be accompanied by written permission for their use from the copyright owner, along with complete information as to the source. Photographs of identifiable persons must be accompanied by signed releases showing informed consent. If an illustration is taken from previously published material, the legend must give full credit to the original source. Statements and opinions expressed in the articles and communications herein are those of the author(s) and not necessarily those of the Editor(s) or publisher, and the Editor(s) and publisher disclaim any responsibility or liability for such material. Authors must disclose to the Editor any financial interest they may have in products mentioned in their article. The Journal will endeavor to provide a decision to the authors within 16 weeks of arrival of a properly formatted paper at the editorial office. Again, authors should read and follow the reference format required by the Journal. Manuscripts submitted for review that do not follow these instructions may be delayed until corrected or returned without review. Membership and subscriptions Questions regarding membership in IAP or a subscription to the Journal should be addressed to the IAP Business Office in Boston by contacting Alecha Pantaleon at apantaleon@forsyth.org.