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Elementos de Microbiologia
Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 20152
Tópicos−Introdução à Microbiologia,
−Morfologia e Estrutura das células,
−Nutrição Microbiana,
−Meios de Cultura,
−Crescimento Microbiano,
−Controle Microbiano
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3Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-
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Microbiologia
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� Ciência que estuda os micro-organismos
� Um amplo e diverso grupo de organismos
com dimensões microscópicas
� Podem ser encontrados na natureza como
células únicas ou agrupamentos celulares
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Capazes de realizar seus processos vitais sem depender de outras células
Crescimento/Reprodução
Geração de energia
Características Importantes dos Micro-organismos
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Microbiologia como Ciência
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A microbiologia está associada ao estudo dasCÉLULAS VIVAS e ao seu funcionamento
Básica: Estuda a natureza fundamental e as propriedadesdos micro-organismos (fortemente influenciada pela necessidade deconhecimento sobre mos causadores de doenças)
Aplicada: Estudo da aplicação tecnológica dos micro-organismos de forma benéfica em diversas áreas(medica, agrícola e industrial).
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Ciência Básica
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−Características Morfológicas - forma e tamanho da célula; composição química e função de suas estruturas internas.
−Características Fisiológicas/Bioquímicas – condições ambientais e nutricionais necessárias ao crescimento e reprodução.
−Características Genéticas – genoma
−Características Ecológicas – ocorrência e relação com o ambiente
−Classificação - a relação taxonômica entre os grupos microbianos.
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Ciência Aplicada
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−Produção de uma variedade desubstâncias de interesse econômico(Ex:ácidos orgânicos,a ntibióticos, enzimas, vitaminas)
−Processos mais eficientes para otratamento de efluentes industriais
−Produção desuplemento alimentar(proteína de célula única - SCP)
−Produção debiocombustíveis(gás metano e etanol)
−Exploração da atividade química de micro-organismos emprocessos debiorremediação(reduzir ou remover poluentes no ambiente)
−Usados como "inseticidas biológicos", no lugar de produtos químicos
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MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS
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Célula: Unidade básica de todos os organismos vivos
�Parede celular
�Membrana
�Várias estruturas e componentes químicos internamente a membrana quepermitem o funcionamento celular. Ex: núcleo ou nucleóide onde abriga ainformação genética - DNA
Todos os organismos celulares correspondem aestruturasorganizadas, que apresentam alguma forma de metabolismo
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MICRO-ORGANISMOS COMO CÉLULAS
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Fungo unicelular (levedura) Bactéria
Fungo multicelular (bolor)
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Componentes Químicos das Células
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Célula
Proteínas
Ácidos Nucleicos
Lipídeos
Polissacarídeos
A natureza química e o arranjo destas macromoléculas é o que tornará um mo diferente do outro
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Componentes Químicos das Células
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Água (70 – 80%)
Proteína
Carboidrato;LipídeoÁc nucleico
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Componentes Químicos das Células
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Principais Características
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1683 - descoberta das bactérias por Antoni vanLeeuwenhoek
1864 – confirmação da existência de micro-organismos (fermentação) por Louis Pasteur
Como inserir estes seres vivos na classificaçãoexistente? (Reino ANIMAL ou VEGETAL)
1866 - E.H.Haeckel (Zoólogo) sugeriu a criação deum terceiro reino denominado de PROTISTA
Posição dos Micro-organismos no Mundo Vivo
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Bactérias
Algas
Fungos
Protozoários
Protistas
Classificação de Haeckel
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A classificação deHaeckel foi satisfatória até que os estudosmais avançados sobre a ultra-estrutura celular (MicroscopiaEletrônica) demonstraram a existência de dois tipos estruturaisbastante distintos:
• Geralmente maiores em tamanho e demaior complexidade estrutural
• Apresentam suas estruturas internas delimitadas por membrana (organelas). Ex: núcleo
• Geralmente maiores em tamanho e demaior complexidade estrutural
• Apresentam suas estruturas internas delimitadas por membrana (organelas). Ex: núcleo
Eucarióticas
•Material genético disperso no citoplasma (o material genético (DNA) concentra-se numa dada região chamada de nucleóide)
•Material genético disperso no citoplasma (o material genético (DNA) concentra-se numa dada região chamada de nucleóide)
Procarióticas
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R.H. Wittaker (1969) – Propôs a expansão daclassificação proposta por Haeckel, baseado não sóna organização celular, mas também paraacomodar os 3 modos principais de Nutrição.
�Fotossíntese – Utilização da luz para converterdióxido de carbono em água e açúcares
�Absorção – Captação de nutrientes químicosdissolvidos na água
�Ingestão - Entrada de partículas de alimentosnão dissolvidas
Classificação de Wittaker (5 Reinos)
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REINO PROTISTA
(foto; Abs e Ing)
REINO PLANTAE
Fotossintéticos
REINO FUNGI
Absorção
REINO ANIMALIA
Ingestão
REINO MONERA(absortivos)
Procariotos - Bactérias
Microalgas, protozoários e fungos limosos
Plantas e algas superiores
Fungos e Leveduras Animais
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Carl Woese e George Fox (1979) –estudando as similaridades e diferenças doRNA ribossômico dos micro-organismosdescobriu um novo tipo de procarioto(Archaea)
Propôs uma nova classificação dos seresvivos: Domínio ou Supra-Reino
Classificação de Woese e Fox (3 Domínios)
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� As arqueobactérias (archeo = antigo / primitivo)
� Representam um restrito grupo de organismos procariontesque sobrevivem sob condições ambientais extremas(metanogênicas; termoacidófilas e halófilas)
� Manifestam características que as diferenciam daseubactérias (eu = verdadeiro), de acordo com a estruturação dealgumas moléculas como: ácidos nucleicos (RNA ribossômico) eelementos integrantes da membrana plasmática e parede celular.
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Metanogênicas → caracterizadas pelo metabolismo anaeróbio utilizam oelemento químico hidrogênio como co-fator de reações que catabolizam o gáscarbônico (CO2) em metano (CH4).
Termófilas → são arqueobactérias que sobrevivem em temperaturas altíssimas,(atingindo cerca de 100° C) e acidez muito baixa, representando os ambientesaquáticos situados próximos à falhas na crosta oceânica (fendas vulcânicas). Essesorganismos realizam quimiossíntese, utilizando compostos inorgânicos (ácidosulfídrico – H2S) para sintetizar matéria orgânica e obter energia.
Halófitas → bactérias primitivas que vivem em locais com alta concentração desal, em que a solução do meio (ambiente aquático) é extremamente hipertônica,por exemplo, a salinidade do Mar Morto.
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Bactérias
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�São micro-organismos PROCARIOTOS
�A maioria UNICELULAR
�Forma simples (apesar dos 4 bilhões de anos que tem evoluído)
�Muitas possuem sistema de locomoção (flagelos)
�Reprodução assexuada (fissão binária)
�Variedade de tamanho e forma
�Utilização de nutrientes por absorção
�Diversidade (ocorre em todos ambientes do planeta onde exista
H2O)
�Grande importância industrial
Morfologia e Estrutura
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Tamanho:0,5 a 1,0 µm (visualizadas em microscópio em umamagnitude de 1000 X)
Forma:� Esféricas ou ovalada (cocos): 0,8µm� Cilíndricas (bacilos): 1 x 3 µm� Espiraladas (bacilos curvos) (espirilos):� Formas incomuns: espiroquetas,apendiculadas e filamentosas
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�Algumas das propriedades biológicas (taxasmetabólicas e de crescimento) são afetadas pelo seupequeno tamanho.
�Ex: A velocidade da entrada de nutrientes e saídade produtos de uma célula éinversamenteproporcional ao seu tamanho.
�Como a velocidade de transporte é uma função daárea superficial da membrana, e se comparadas aovolume; células pequenas apresentam maior relaçãoentre área superficial:volume (S/V).
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�As técnicas de microscopia revelaram quea célula tem uma diversidade de estruturasfuncionando juntas.
�Algumas, encontradas externamentefixadas a parede celular e outrasinternamente
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Estrutura Bacteriana
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Parede Celular
Membrana Celular
“Mesossoma”
Ribossoma
Genoma
Fundamentais
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Flagelo
Pili
Capsula
Grânulo de Inclusão
Endósporo
Auxiliares
Estrutura Bacteriana
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Flagelos
Estruturas Auxiliares
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Os flagelos são apêndices longos e sinuosos
�Função: responsáveis pela locomoção; Participa daQuimiotaxia e Fototaxia (movimento a estímulos)
�Constituição Química: proteínas (flagelina)
�Teoria da Locomoção: cadeias protéicas contraem e relaxamalternadamente, fazendo assim um movimento ondulatório quepuxa e empurra o mo.
* Em Archaea, os tipos de flagelina e estrutura do flagelo sãodiferentes das Bactérias.(incomuns em cocos)
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Pili ou Fimbrias
Estruturas Auxiliares
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Os pilis, são apêndices curtos e retilíneos, sem qualquerenvolvimento na locomoção; Comuns em bactérias Gramnegativas
�Função:Aderência
� Específica (Fatores de Colonização);
� Aderência para a Conjugação Bacteriana (transferência
de plasmideos). Ex.Pili Sexual
�Constituição Química: proteínas
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Glicocálice
Estruturas Auxiliares
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A glicocálice é uma camada de material viscoso queenvolvem as células bacterianas (polissacarideos oupeptídeos)
�Se a camada estiver bem organizada e rigidamenteacoplada a parede celular (Capsula)
�Se estiver desorganizada, sem forma e acopladofrouxamente à parede celular (Camada limosa)
A determinação dos constituintes da cápsula é normalmente um passoimportante na identificação de certas bactérias patogênicas.Ex: o Bacillusanthracis (antrax)possui material capsular de natureza polipeptídica formadopor ácido glutâmico.Os esporos desta bactéria podem ser usados em ataques bélicos
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� Aderência: é a principal delas (em pedras onde passa água emgrande movimento; em raízes de plantas; na superfície lisa dosdentes humanos provocando a cárie);
� Proteção (contra dessecamento temporário) devido ao grandenúmero que grupos polares na molécula que podem ligar a água.Evitar a adsorção e lise das células por bacteriófagos que sãovírus que atacam as células (protege da fagocitose)
� Reserva Nutritiva: Fonte de alimentos
*Sob o aspecto industrial podem ser uma praga. Elas são responsáveis peloacúmulo de lodo nos equipamentos, o que pode entupir filtros e tubosafetando a qualidade final do produto.
Função da glicocálice
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Grânulos de Inclusão
�Grânulos Lipídicos: formados de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) -material lipídico solúvel em clorofórmio.
�Grânulos Inorgânicos→ formados de polifosfato
�Grânulos Polissacarídicos→ (amido; glicogênio);
São substâncias químicas que se acumulamintracelularmente formando depósitos insolúveis.
Geralmente utilizados como material de reserva e fontede energia;.
Os grânulos de inclusão não são comuns a todas ascélulas bacterianas.
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�Esporos que se formam dentro da célula e são exclusivos dasbactérias (gram positivas). Sua principal função é a proteção.
�Durante o processo de esporulação ocorre desidrataçãocelular, o que também contribui para a sua elevada resistênciaao calor;
�Possuem parede celular espessa, brilham muito com a luz domicroscópico, e são altamente resistente às mudançasambientais - a maioria suportam ate 80oC/10min;
�São muito relevantes para áreas de Medicina e indústriaalimentícia, principalmente pelo fato de serem resistentes aocalor e à esterilização química, quando comparados comcélulas em estado vegetativo
Endósporo Bacteriano
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Endósporo Bacteriano
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Parede Celular
Estruturas Fundamentais
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O peptideoglicano é um heteropolissacarídeo composto peloácido N-acetil-murâmico e N-acetilglucosamina) comcadeias laterais tetrapeptidicas
Função: manutenção da forma bacteriana; proteçãoosmótica da bactéria.
Previne o rompimento das células devido à entrada de água;serve como uma barreira a algumas substâncias prevenindoa evasão de certas enzimas que poderiam causar danos àcélula
Composição da Parede celular:peptideoglicano oumureína:
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� As paredes celulares não são homogêneas(possuem camadas de diferentes substâncias quevariam de acordo com o tipo de bactéria envolvida,diferindo emespessura e composição).
� A composição da parede celular de bactérias permitea classificação de 2 grupos distintos de bactérias:Gram+ e Gram-;
� Método de coloração diferencial – Técnica de Gram:
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Características Gram-Positivas Gram-Negativas
Teor de Peptídeoglicano
(PPG)
Elevado(15-50% da parede)
Baixo( 5%)
ResistênciaMenor resistência (pode ser destruída completamente por
certas enzimas)
Maior resistência
Outros Componentes
Ácido teicóico(antígenos)
Membrana externa (lipopolissacarídeo)
cobrindo o PPGAcido teicóico - polímero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente podeajudar no transporte de íons para dentro e fora da célula; e noarmazenamento de fósforo.Se encontram ligados ao peptidioglicano ou à membrana citoplasmática.
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Mecanismo de Coloração de Gram
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�Composição:bicamada fosfolipídica (lipídeos formados por umamolécula de glicerol, duas cadeias de ácidos graxos (saturado einsaturado) e um grupo fosfato através de ligações do tipo éster,com proteínas entremeadas.
MEMBRANA CELULAR
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MEMBRANA CELULAR
Normalmente, as membranas de organismos procariotosapresentam maiores concentrações de proteínas que asmembranas eucarióticas, tendo em vista a ausência deorganelas citoplasmáticas nas bactérias.
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Funções:
�Permeabilidade Seletiva;
�Transporte Ativo;
�Respiração Celular
As membranas de muitas bactérias estendem-se no citoplasma para formar túbulos chamados MESOSSOMOS
Pode ser uma forma da bactéria de aumentar a superfície damembrana celular, potencializando as funções executadas por ela
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�Os ribossomos são partículas densas dispersas no citoplasmacomposto por RNA Ribossômico (RNAr);
�São encontrados em todas as células procarióticas eeucarióticas. Podem estar livres no citoplasma ou associados aMC;
�O citoplasma tem em torno de 80% de água, além de ácidosnúcléicos, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons inorgânicos,muitos compostos de baixo peso molecular, e partículas comvárias funções
�Sua principal função é a síntese proteica
Ribossomos
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Em bactérias consistem em 2 subunidades de tamanhos diferentes (50S e30S), que juntas formam o ribossomo bacteriano 70S (isto porque o ISdepende do tipo e tamanho).
Os ribossomos são alvos de antibióticos que inibem a síntese de proteínas(ex: estreptomicina e tetraciclina)
S= unidade de quão rápido apartícula sedimenta quandocentrifugada em alta velocidade
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Estrutura e Composição:
�DNA
�Pode ocupar até 20% da área do citoplasma
Função:
�Armazenamento das informações genéticas
Genoma Bacteriano
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�As arqueobactérias possuem umamembrana celularcom lipídeos compostos de uma associação deglicerol-éter, enquanto que os das eubactérias eeucariotos são compostos de glicerol-éster;
�Ao contrário das bactérias, os Archaea não possuemumaparede celulardepeptidoglicanos.
�Finalmente, oflagelo dos Archaea é diferente emcomposição e desenvolvimento do das bactérias.
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�Fungos Limosos�Fungos Inferiores Flagelados�Fungos Terrestres (espécies mais conhecidas)
São reconhecidos 3 principais grupos de fungos:
Bolores(Penicillium sp. Aspergillus sp)
Cogumelos(Agaricus sp, Pleurotus sp)
Leveduras(Saccharomyces sp, Candida sp)
Reino Fungi
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Fungo unicelular (levedura) Ex.Saccharomyces sp
Fungo multicelular (cogumelos)
Ex.Agaricus sp
Fungo multicelular (Bolores)
Ex.Aspergillus sp
Fungos
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CARACTERISTICAS GERAIS DOS FUNGOS
São micro-organismos Eucariontes
São heterotróficos e assimilam nutrientes por absorção
Não realizam a fotossíntese(não possuem clorofila)
Parede celular formada por quitina (com exceção aos Parede celular formada por quitina (com exceção aos fungos limosos)
Reprodução assexuada e sexuada
Multicelulares (maioria) e unicelulares
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Hifas = filamentos tubulares microscópicos (septadas ou nãoseptadas)Micélio = conjunto de hifas – frouxo (bolores) ou compactos(cogumelos); Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-
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Tipos de Hifas
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Reprodução de Fungos
Assexuada• Brotamento (leveduras)
• Esporos (formados em estruturas internas ou nas extremidades das hifas)
Sexuada• Esporos (fusão de núcleos e meiose)
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Reprodução de Fungos
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Reprodução assexuada
Brotamento de levedura(Saccharomyces cerevisiae)
Formação de esporos esféricos (conidiósporos) nas extremidades de uma hifa especializada, o conidióforo
(Penicillium sp)
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Reprodução Sexuada
Esquema da formação de ascósporosAula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-
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Esquema da formação de basidiósporos
Reprodução Sexuada
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Tabela 14.2 Classificação e principais propriedades dos fungos
Grupo Nome comum Hifas Representantes
típicos
Tipo de
esporo
sexual
Hábitat Doenças comuns
Ascomicetos Fungos com
estrutura em
forma de saco
Septadas Neurospora,
Saccharomyces,
Morchella
(“moráceas”)
Ascósporo Solo, matéria
vegetal em
decomposição
Doença do olmo
holandês, praga da
castanha, ferrugem das
gramíneas,
apodrecimento
Basidiomicetos Fungos com
estrutura em
forma de
clava,
cogumelos
Septadas Amanita (cogumelo
venenoso)
Agaricus (cogumelo
comestível)
Basidiósporo Solo, matéria
vegetal em
decomposição
Haste negra, ferrugem
do trigo, alforra do
milho
Zigomicetos Bolores de
pão
Cenocíticas Mucor, Rhizopus
(bolor comum de
pão)
Zigósporo Solo, matéria
vegetal em
decomposição
Deterioração de
alimentos; raramente
envolvido em doenças
parasitárias
Oomicetos Bolores de
água
Cenocíticas Allomyces Oósporo Aquático Praga da batata, certas
doenças em peixes
Deuteromicetos Fungos
imperfeitos
Septadas Penicillium,
Aspergillus,
Candida
Nenhum
conhecido
Solo, matéria
vegetal em
decomposição,
superfície de
corpos de
animais
Murchamento de
plantas, infecções de
animais como tínea, pé-
de-atleta, infecções
superficiais ou
sistêmicas (Candida)Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015
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Estrutura Fúngica
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� Confere resistência as pressões osmóticas e mecânicas
� Natureza: polissacarídica (80 a 90%) contendo tb proteínas,lipídeos, polifosfatos e íons inorganicos.
� Nos Boloreso polissacarídeo estrutural é aquitina (é umpolimero de N-acetilglicosamina, um derivado de glicose)
� Nas Leveduraso polissacarídeo estrutural é oglicano emanano.
Parede Celular
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� Estrutura lipoproteica: Constituída por uma camada dupla defosfolipídios e um arranjo de proteínas embebidas nabicamada lipídica (regula troca com o meio ambiente)
� A membrana plasmática dos fungos apresentam oergosterolcomo o principal esterol da membrana plasmática.
� Os esteróis da membrana conferem estrutura, modulação dafluidez e possivelmente controlam alguns eventosfisiológicos.
Membrana Citoplasmática
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� Mitocôndrias
� Retículo Endoplasmático (RE)
� Complexo de Golgi
� Peroxissomos
� Núcleo
Organelas Celulares
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Mitocôndrias
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7878
�As mitocôndrias são responsáveis pela conversãoaeróbica de energia (síntese de ATP)
�Diâmetro de 0,5 a 1µm e comprimento de até 3µm.
�A ME é desprovida de esteróis (menos rígida doque a MC). Apresenta numerosos canais que sãoresponsáveis pela passagem do ATP para ocitoplasma.
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7979
Retículo Endoplasmático (RE)
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8080
�O retículo endoplasmático constitui uma rede demembranas, próximas a membrana nuclear.
�RE liso (não possui ribossomas): síntese delipídeos, glicogênio e esteroides.
�RE rugoso (possui ribossomos): síntese deglicoproteinas e componentes de membrana que sãotransportados por toda a célula.
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8181
Complexo de Golgi
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82
�O CG consiste em um conjunto de membranas empilhadasque atuam juntamente com o RE.
�Empacotamento de certas enzimas sintetizadas pelo RErugoso (proteases, nucleases, lípases etc.). Proteção da célulaao ataque de suas próprias enzimas.
�Responsável pelo transporte seguro dos compostossintetizados para o exterior das células
�Contem enzimas glicosil transferases que unem moléculas decarboidratos com proteínas (glicoproteinas)
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8383
Peroxissomos
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8484
�Os peroxissomos são bolsas membranosasesféricas (0,5 a 1 µm de diâmetro) que contéminumeras enzimas;
�Função oxidativa/respiratória (não conservaenergia na forma de ATP)
�Oxidação de ácidos graxos e aminoácidos
�Possuem grandes quantidades da enzimacatalase - degradação do H2O2 (destoxificaçãocelular),
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8585
Núcleo
�Organela bem definida, circundada por umpar de unidades de membrana. Contem ogenoma celular;
�Contem um corpúsculo chamado denucléolo, rico em RNAr.
NUTRIÇÃO MICROBIANA
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8686
Mecanismo que fornece às células as ferramentasquímicas (NUTRIENTES) necessárias à síntesedos diversos monômeros.
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8787
�Macronutrientes: (C,N,P,S,K,Mg,Ca,Na) Uma célulatípica contem cerca de 50% de carbono e 12% denitrogênio (em peso seco)
�Micronutrientes (elementos traços), embora requeridosem pequenas quantidades, são de fundamental importânciapara as funções celulares como os macronutrientes Ex:Cr,Co,Cu,Mn,Mo,Ni,Fe,Zn
�Fatores de Crescimento: São definidos como compostosorgânicos que alguns tipos de mos necessitam dequantidades muito pequenas. Ex: vitaminas, amino ácidos,etc
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8888
Os 4 elementos mostram uma boaaproximação da composição dabiomassa
δβα NOCH
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8989
23,9 molecular Massa :
20,7 molecular Massa :
50,015,075,1
27,02,066,1
=
=
ONCHLevedura
ONCHBactéria
Célula
zyxw NOHC
Substrato
2aO
ihg NObH
Nitrogênio
δβα NOHcC
Biomassa
2dCO
OeH 2
mlkj NOHfC
Produto
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9090
Elemento Função ou constituinte
Bactérias Leveduras Fungos filamentosos
Carbono FC energia 46-52 45-50 40-63 Nitrogênio Proteínas,
ac.nuceicos, polímeros da
parede
10-14 5-9 3-7
Hidrogênio 8-12 8-12 8-12 Oxigênio 18-24 18-24 18-24 Fósforo Ac nucléicos,
fofolipídeos, polímeros da
parede
2-3 0,8-2,5 0,4-4,5
Enxofre Aa, biotina, coenz A
0,1-1,0 0,01-0,25 0,1-0,5
Potássio RNA, co-fator 1,0-4,5 1,0-4,0 0,2-2,5 Sódio 0,5-1,0 0,01-0,1 0,02-0,5 Cálcio Esporos bac,
co-fator 0,01-1,0 0,1-0,3 0,1-1,4
Magnésio Ribossomos, co-fator
0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5
Ferro Citrossomos, co-fator
0,02-0,2 0,01-0,5 0,1-0,2
Proteínas 50-60 35-45 25-40 Carboidratos 6-15 30-45 40-55
Lipídios 5-10 5-10 5-10 Ac. Nucléicos 15-25 5-15 2-10 Cinzas totais 4-10 4-10 4-10
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9191
Como são fornecidos estes elementos?
Meios de Cultura
Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada,
capazes de promover o crescimento de micro-organismos, em
condições de laboratório.
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9292
Constituintes Químicos
•Sintéticos (Definidos)
•Complexos (Naturais)
Estado Físico
• Líquidos
• Sólidos
Finalidade
• Seletivos
• Diferenciais
Classificação do Meios de Cultura
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9393
Meios de cultura sintéticos ou definidos –composição química é totalmente conhecida.
Meios de cultura complexos - composiçãoquímica não é totalmente definida, poisapresentam ingredientes cuja formulação não seconhece a exata composição (peptonas, extratode levedura).
Constituintes Químicos
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9494
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9595
Meios de cultura líquidos: Apresentam-se como caldos.(ativação de culturas)
Meios de cultura sólidos: Contém agentes solidificantes,como o ágar com cerca de 1.5-2% p/v.(conservação deculturas)
Estado FísicoTÉCNICA ASSEPTICA
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Seletivo
• contém substâncias que inibem o crescimento dedeterminados grupos de micro-organismos,permitindo o crescimento de outros.
Diferencial
• contém substâncias que permitem estabelecerdiferenças entre micro-organismos muitoparecidos
Seletivo/Diferenciall
Finalidade
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9898
Exemplo de meio seletivo: Agar verde brilhantepermite a identificação de Salmonella (G-) causadora deinfecções alimentares.O meio contendo o corante inibe as bactérias G+ que sãohabitantes comuns no trato intestinal (sem afetar G-).
Exemplo de meio diferencial: Agar de sanguePermite a distinção entre bactérias do gênero Streptococcusatraves do padrão de hemólise (α β γ)
Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia) lisaparcialmente os glóbulos vermelhos do sangue – padrão αααα
Streptococcus pyogenes (causadora da faringite) lisacompletamente os glóbulos vermelhos do sangue produzindohalos transparentes à volta das colônias – padrão β
Streptococcus mutans (causa cárie dentária), não éhemolítica – padrão γ.
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9999
Ágar MacConkey (seletivo e diferencial)
As bactérias fermentadoras de lactose, utilizam a lactose disponível no meio e produzem ácido como produto final. Este ácido diminui o pH do meio para valores inferiores a 6.8, resultando na observação de colônias rosa choque/vermelhas.
Destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose
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100
Um dos fatores mais importantes naotimização de um processo fermentativo(bioprocesso) é a composição do meio.
Considerações Importantes
Satisfazer as necessidades nutricionais (máximorendimento)
Minimizar os custos
Planejamento de Experimentos
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101101
É o conjunto de todas as reações catalisadasenzimaticamente que ocorrem dentro dascélulas.
METABOLISMO MICROBIANO
�Cada sequencia da reação é uma rotametabólica e os produtos destas reações são osmetabólitos.
�Do ponto de vista da EngenhariaBioquímica, as reações importantes sãoaquelas que produzem substâncias bioquímicasem quantidades superiores as necessidadesdas células.
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102102
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103103
Catabolismo é a fase de degradação dometabolismo, as moléculas orgânicas tais comocarboidratos, lipídeos e proteínas são degradadosaté produtos finais tais como: ácido lático, acético,CO2, etc . Liberação de energia ATP.
Anabolismo é a fase de construção dometabolismo, moléculas pequenas irão formarcomponentes moleculares relativamente grandestais como polissacarídeos, lipídeos e proteínas.Requer energia livre ATP.
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104
Opções metabólicas para obtenção de energia
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105105
Fototróficos: possuem pigmentos fotossintéticos quepermitem a utilização da luz como fonte de energia.Ex.: algas e bactérias fotossintetizantes.
Quimiolitotróficos: obtêm energia a partir daoxidação de um substrato inorgânico, geralmenteespecífico para o microrganismo em particular, comohidrogênio, enxôfre, amônia, nitritos e sais ferrosos.Ex.: bactérias dos gêneros Thiobacillus,Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas eDesulphovibrio.
Quimiorganotróficos: obtêm energia a partir docatabolismo de substratos orgânicos, açúcares emparticular. A este grupo pertence a grandemaioria dos microrganismos utilizadosindustrialmente. Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-
USP Profa. Ines Roberto - 2015106106
A energia obtida pela célula a partir de substânciasnutritivas do meio ou da luz solar é utilizada narealização de:
�Trabalho químico (biossíntese de proteínas,ácidos nucleicos, lipídeos, polissacarídeos e váriosoutros componentes celulares)
�Trabalho osmótico (transporte de substânciasnutritivas através da membrana celular)
�Trabalho mecânico (contração e locomoção)
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107107
Autotróficos: Utilizam CO2 como únicafonte de carbono
Heterotróficos: Utilizam substanciasorganicas como fonte de carbono (glicose)
FONTE DE CARBONO
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Classificação Nutricional dos Micro-organismos
Fonte de Energia
Quimiotróficos
(organotróficos ou litotróficos)
Fonte de Carbono
Quimio-heterotrófico
Quimio-autotrófico
Fototróficos
Fonte de Carbono
Foto-heterotrófico
Fotoautotrófico
Compostos químicos
Luz
Compostosorgânicos CO2
Compostosorgânicos
CO2
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109109
Requerimentos Ambientais
Para que ocorra o crescimento celular, além dofornecimento adequado das substâncias nutritivas(Meio de Cultivo), deve-se conduzir o processo sobcondições ambientais apropriadas
1.Temperatura2.pH3.[solutos]4.[O2]
Os valores ótimos para crescimento podem serdiferentes do ótimo para produção demetabólitos.
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110110
A atividade microbiana (crescimento) édependente de reações químicas que sãoafetadas pela temperatura.
Variações térmicas influenciam nosprocessos metabólicos e morfologia celular.
Classificação em 3 grandes grupos, no quese refere a temperatura ótima decrescimento.
Temperatura
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Psicrófilos
• Crescem na faixa de 0°C a 20°C, com um ótimo em torno de 10°C
• Se a temperatura é muito alta, certas enzimas e/ou a membrana citoplasmática podem ser danificadas.
Mesófilos
• Crescem na faixa de 5°C a 50°C, com um ótimo entre 25°C e 40°C.
• A maioria dos mos de interesse são mesófilos.
Termófilos
• Crescem na faixa de 35°C a 90°C, com um ótimo em torno de60°C.
• mos encontrados em áreas vulcânicas e em nascentes quentes.
• A maioria desses mos são procarióticos, não se conheceeucariótico que cresça acima de 60o C.
Classificação em resposta a temperatura
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114114
Os microrganismos também se diferenciam em funçãode suas exigências de oxigênio:
Estritamente aeróbios: desenvolvem-se unicamenteem presença de O2 (Streptomyces sp) e a maioria dosfungos filamentosos;
Estritamente anaeróbios: desenvolvem-seunicamente na ausência de O2 (Clostridios sp);
Facultativos: desenvolvem-se em situação deaerobiose e anaerobiose (leveduras industriais);
Microaerófilos: crescem na presença de diminutasconcentrações de oxigênio livre. Não resistem aos níveisde O2 atm (21%).
Classificação em resposta ao oxigênio
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Crescimento aeróbio (a); anaeróbio (b); facultativo(c); microaerófilo (d) e anaeróbios aerotolerantes (e).
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116116
A acidez ou alcalinidade de uma solução é expressa porseu pH, em uma escala na faixa de 0 a 14 onde aneutralidade corresponde ao pH = 7,0.
É importante lembrar que o pH é uma funçãologarítmica, ou seja: a alteração de 1 unidade de pHrepresenta uma variação de 10 vezes na concentraçãode íons hidrogênio.
Assim como para a temperatura, existe um valor ótimode pH para o crescimento dos micro-organismosdentro de limites mínimos e máximos.
pH
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117117
� As bactérias suportam variações de pH do meiona faixa de 4,0 a 9,0, com valores ótimos entre6,5 e 7,5.
� Os fungos suportam variações na faixa de 2,0 a8,0. No caso de bolores, o pH ótimo situa-seem 5,6, enquanto as leveduras tem ocrescimento favorecido em pH 4,0-4,5.
� Organismos que crescem em pHs baixos ouelevados são conhecidos como acidófilos (pH<1) e alcalifílicos (pH>9).
Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015
118118
Durante o cultivo de um micro-organismos, podemocorrer alterações no pH do meio, como resultadodas atividades metabólicas que consomem ouproduzem substâncias ácidas ou básicas. Asvariações de pH podem ser contornadas de duasmaneiras:
Considerações Importantes sobre o pH
1. Uso de soluções tampão apropriados:tampão fosfato KH2PO4/ K2HPO4
2. Adição de ácido ou base ao sistema:HCl ou NaOH
Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015
119119
� A água é o solvente universal da vida
� A disponibilidade de água é também função da concentraçãode solutos, como sais açúcares e outros
� A atividade de água é expressa em termos físicos comoatividade de água (Aw).
� Os valores de (Aw) variam de 0 a 1 (Ex: a água pura tem aw =1, Cereais, balas e frutas secas tem Aw = 0,70.
Efeitos Osmóticos no Crescimento Microbiano
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120120
Limite de Solubilidade para Solutos Comuns
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Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015
121121
� Os mos que suportam certo grau de redução na Aw são
chamados de HALOTOLERANTES
� Os mos que apresentam crescimento ótimo em meio com
baixa atividade de água (concentração de sal de 2 a 4 %) são
denominados HALÓFILOS (halófilos extremos podem
crescer em meios contendo de 15 a 30% de NaCl)
� Os mos capazes de sobreviver em ambientes ricos em
açúcar são denominados OSMÓFILOS
Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015
122122
Limite mínimo de Aw para os diferentes tipos microbianos
Micro-organismos Aw mínima
Maioria das bactérias 0,88 – 0,90
Maioria das leveduras 0,88
Maioria dos bolores 0,80
Bactérias halófilas 0,75
Leveduras osmófilas 0,60 – 0,62
Requerimentos Ambientais
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124124
As células microbianas quando cultivadas em sistemasfechados (reatores, frascos ou tubos) contendo meio decultura líquido onde nenhum nutriente é adicionado aosistema e nenhum produto é removido chamamos deCultura em Batelada.
As células inicialmente se dividem e o número de célulasaumenta por um período de tempo.
Este aumento cessa quando os nutrientes são esgotadosou quando os produtos formados se acumulam emquantidades suficientes para interromper o crescimento(intoxicação pelos produtos).
Crescimento Microbiano
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125125
Curva Típica do Crescimento Microbiano
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126126
Medidas do Crescimento Microbiano
1. Determinação da massa seca ou úmida
•Medida da massa das células •São necessárias amostras relativamente grandes•Não se aplica a baixas densidades celulares•Podem ocorrer perdas durante o processo de lavagem das células
•Não se aplica quando o meio contém partículas sólidas
2. Determinação Química dos componentes celulares
• Dosagem de proteínas e ácidos nucleicos
• Aplicáveis a pequenas amostras (sensíveis e precisos)
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127127
Medidas do Crescimento Microbiano
3. Turbidimetria
• Medida da turvação do meio (absorbância em espectrofotômetro)
• A turvação está relacionada com a massa seca das células( Lei de Lambert -Beer)
• Permite a construção de curvas de calibração para um conjunto de condiçõesexperimentais
• As equações de correlação são fundamentais para a determinação da massa decélulas através da medida de absorbância com o tempo
4. Determinação do Número de células em uma suspensão
• Contagem do número total (amostras são colocadas em câmaras de contagem“Neubauer” e leitura é feita em microscópio). Os resultados são expressos emNúmero de células por mL.
• Contagem do número de viáveis (semeadura das amostras através de seuespalhamento em meio sólido). As colônias formadas serão contadas e osresultados expressos em Unidade Formadora de Colônias por volume de amostra(UFC/mL)
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128128
Turbidimetria
As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. Elas são tratadassimultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por umadeterminada solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução (l).
Onde:A= absorbânciaα= absortividade molarl= distância que a luz atravessa pelo corpo -caminho óptico (1 cm)c = Concentração da solução
clA α=
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129129
Lei de Beer-Lambertt
Para os micro-organismos em geral o valor de λ máx é de 500 -600 nm.
(λ)
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Curva de calibração de massa seca
Relação entre a absorbância e a concentração celular de Pichia stipitis cultivada em hidrolisado hemicelulósico da palha de arroz in natura.
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131131
Câmara de Contagem
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Câmara de Contagem
Volume total do quadrante central da câmara deNeubauer é de 0,1 mm3
Volume de cada quadrado vermelho é de0,004mm3
Volume de 1 quadrado vermelho =4 x 10-6 mLVolume de 5 quadrados vermelhos = 2 x 10-5 mL
Como a contagem é feita em 5 quadradosvermelhos, os resultados expressos em Númerode Células/mL será dado pela equação:1 mL = 1cm3
1cm3 = 10x10x10 mm3 = 1000mm3
diluiçãodefatorxxxvermelhosquadradosnoscelulasmL
célulasdeNúmero 41055∑=
diluiçãodefatorxvermelhosquadradosdosVolume
vermelhosquadradosnoscelulas
mL
célulasdeNúmero
5
5∑=
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133133
Contagem de Células Viáveis
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134134
Contagem de Células Viáveis
O ideal é contar de 30 – 300 colônias
diluiçãodefatorxamostadaVolume
formadasdecoloniasNúmero
mL
UFC=
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135135
Contagem de Células Viáveis
O ideal é contar de 30 – 300 colônias
mL
UFCxxviáveisdeNúmero 7103000.10
1,0
300==
Água potável < 500 UFC/mL
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136136
Curva Típica do Crescimento Microbiano
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137137
Nesta fase as células estão fisiologicamenteativas e sintetizando novas enzimas para seadaptarem ao meio novo.
A contagem não revela aumento do número decélulas, mas a massa pode aumentar comoreflexo do aumento do tamanho da célula.
Esta fase ocorre quando as células do inóculoprovem de cultura velhas ou quando as célulasdo não são cultivadas em meios adequados.Nesta fase a velocidade de crescimento (dX/dt) ézero
Fase Lag
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138138
As células estão em condições de crescimento balanceado(aumento ordenado de todos os constituintes).
Não há limitação de nutrientes
As células são aproximadamente uniformes em termos decomposição química, atividades metabólicas e fisiológicas.
É a fase mais importante para estudos de fisiologia ecinética
Há um aumento exponencial do número de células com otempoA velocidade de crescimento (dX/dt) é proporcional aconcentração de micro-organismos
Fase Log
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139139
Fase Log
Tratando os micro-organismos como bactérias que se multiplicam por divisãobinária, temos:
nNN 2.0=N = número de micro-organismos ao final de n divisões (gerações)
N0 = número inicial de micro-organismos
2logloglog 0 nNN +=
2log
loglog 0NNn
−=
A velocidade exponencial de crescimento (R) pode ser expressa pelo número degerações na unidade de tempo:
0tt
nR
−= A recíproca de R é o tempo de geração
n
ttt
R G01 −
==
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140140
Nesta fase o número de células novas é igual ao número
de células que morrem.
Acúmulo de metabólicos tóxicos e/ou exaustão de
nutrientes e limitação de oxigênio.
A duração desta fase varia consideravelmente com as
condições do cultivo
A velocidade de crescimento (dX/dt) é zero
Fase Estacionária
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141141
Nesta fase, o número de organismos que morre torna-
se muito superior em relação aos que surgem. O
número de viáveis diminui de forma exponencial.
Completa exaustão de nutrientes e acúmulo de
metabólitos inibitórios.
A velocidade de crescimento (dX/dt) é negativa
Fase de Morte (ou declínio)
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142142
Taxonomia
Organização Classificação Nomenclatura
Baseada em 7 níveis descendentes•Reino•Divisão•Classe •Ordem Família•Gênero•Espécie
É o arranjo dos micro-organismos em grupos obedecendo relações evolutivas
É o processo de darnomes as espéciesexistentes. É latinobinomial combinando onome genérico(gênero) seguido daespécie
Ex: Saccharomyces cerevisiae
gênero espécie
Aula 2 e 3 - Eng. Bioquímica - EEL-USP Profa. Ines Roberto - 2015 143143
Biotecnologia Industrial. Willibaldo Schmidell; Urgel deAlmeida Lima; Eugenio Aquarone; Walter Borzani(Coordenadores). Volume 1. Engenharia Bioquímica. 2001.Editora Edgard Blucher.
Microbiologia de Brock - Michael T. Madigan; John M.Martinko & Jack Parker. 10ª Edição. 2004. Editora PearsonEducation, Inc.
Bibliografia