Introdução Bioquimica

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Unidade I – Engenharia Bioquímica

Bioquímica Industrial - Professora Cristina Fantini

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico e Evolução

• Desde tempos remotos o homem produz bebidas alcoólicas,queijos,

coalhada e vinagre

• Pão fermentado por leveduras encontrado em pirâmides egípcias

construídas há milênios.

• Vinho Grécia antiga

• Cerveja 2000 a.C.

• Até meados do séc. XIX, o homem não conhecia as causas da

fermentação

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Histórico e Evolução

• Em 1857 Pasteur demonstrou que a fermentação alcoólica era

produzida por leveduras e que várias doenças eram causadas por

microrganismos

• No início do séc. XX já se produzia levedura de panificação em

tanques abertos e aerados

• Em 1923 Pfizer inaugurou 1ª. fábrica para obtenção de ácido cítrico

por fermentação, utilizando Aspergillus niger

• Em 1928 Alexander Fleming descobriu a penicilina produzida por

bolor da família Penicilium

Bioquímica Industrial - Professora Cristina Fantini 2

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• Na 2ª. Guerra Mundial penicilina foi industrializada e nasce a

Engenharia Bioquímica

POR QUE????

• Grupo de profissionais (multidisciplinar) transformou em processo

industrial a técnica de laboratório, então conhecida, de produção de

penicilina por fermentação

• Condições estritamente assépticas, o que levou a:

Design de novos fermentadores

Técnicas de operação e equipamentos, de forma que perfeita

esterilidade fosse obtida

Bioquímica Industrial



Desenvolvimento de novas técnicas de filtração, extração, e

concentração origem a técnicas modernas de extração e

purificação de produtos de origem biológica.

Atualmente usadas para produção de diversos produtos

antibióticos, Vitaminas (B2, B12, C), enzimas, bioaromas, aas,

entre outros

• Equipamentos e operações empregados nos processos fermentativos

similares aos dos processos químicos


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Unidade I –Bioquímica Industrial

1.2 O que é Bioquímica Industrial?

• Ramo da eng. química combina microbiologia, bioquímica e eng.

química

• Processos biotecnológicos industriais = processos nos quais ocorre a

transformação de MP em produtos através da ação de material de

origem ou caráter biológico, ou seja, células (microbianas, animais ou

vegetais) ou enzimas.

• Eng. Bioquímico transforma conhecimentos obtidos por

microbiologistas e bioquímicos em processos industriais

aperfeiçoando para aumentar sua produtividade e rendimento


Importância e Perspectivas

• Necessário conhecimentos de operações unitárias, processos, cinética

de processos fermentativos, termodinâmica, transferência de calor e de

massa.

• Diversidade de produtos obtidos por processos biotecnológicos

1.3 Importância e Perspectivas

• Na indústria de alimentos Produção de bebidas alcoólicas (cerveja,

vinhos, sidra, cachaça), vinagre, leites fermentados, queijos, pão,

enzimas e microrganismos, fermentação lática de hortaliças e azeitonas

• Na indústria farmacêutica Produção de antibióticos, insulina,

vitaminas (riboflavina, ácido ascórbico), vacinas, medicamentos em

geral


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Importância e Perspectivas

• Na indústria química Produção de álcool combustível, solventes

orgânicos (butanol, acetona), ácidos orgânicos (acético, cítrico, lático e

glutâmico).

• Tratamento biológico de resíduos (lodo ativado)

Perspectivas

• Uso de subprodutos de baixo custo da agricultura e da pecuária como

matérias primas das indústrias de fermentação

• Com crescimento populacional e do poder aquisitivo, aumento de

consumo de alimentos e bebidas fermentados

• Produção de substâncias biológicas de grande complexidade

molecular e de novos produtos.


Unidade II – Tecnologia de Fermentação e Fermentadores

1. Introdução

• Em bioquímica define-se fermentação como às trocas ou

decomposições químicas produzidas nos substratos orgânicos

mediante a atividade de MO vivos.

• Existem várias classes de fermentações depende dos tipos de MO e

substratos envolvidos.

• Processo anaeróbico

• Uso de cepas selecionadas de mofos, leveduras e bactérias

• Processos fermentativos em escala industrial para produção de

diferentes produtos


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Unidade II – Tecnologia de Fermentação e Fermentadores

• O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito da

correta definição de 4 pontos básicos:

Micro-organismo;

meio de cultura;

forma de condução do processo fermentativo;

etapas de recuperação do produto.

• Para produtos de alto valor agregado as operações de recuperação

do produto podem ser responsáveis por 50 a 70% do custo do produto

final.


Processo Biotecnológico Genérico


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Processo Fermentativo


Micro-0rganismos de Interesse

2. Micro-organismos de Interesse

• Podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:

a) Isolamento a partir de recursos naturais solo, água, planta

Muito trabalho experimental alto custo

Isolamento de linhagens mais eficientes

Descoberta de novos produtos empresas de antibióticos e

enzimas

Foco inicial no que se quer produzir.


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Micro-organismos de Interesse

b) Compra em coleções de cultura coleções de cultura em vários

países

Contato facilitado internet

Limitação dos tipos de MO

Mais usado para obter células para estudo de melhoramento

genético

- NRRL Culture Collection (EUA)

- Coleção de culturas Tropical (Campinas/SP)



c) Obtenção de mutantes naturais quando uma célula prolifera, há

sempre uma pequena chance de surgimentos de mutantes naturais.

Isolar mutantes e fazer ensaios para verificar seu potencial de

produção

Alterações naturais não são interessante no processo

fermentativo

d) Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais

Esperar surgimento natural pode ser muito demorado

Utilizar métodos que forcem o aparecimento de células

mutantes radiações UV ou nitrosoguanidina.


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Micro-organismos de Interessee) Obtenção de MO recombinantes por técnicas de eng. genética DNA

recombinante

Importante técnica para produção de cél. mais produtivas ou

produtoras de produtos incomuns

Introdução de fragmentos de DNA de certas cél. em outras

Ex: sequência metabólica que leva ao acúmulo de um produto de interesse (P)

A B C D P

Determinar a reação limitante enzima responsável por esta reação

Identificar o gene responsável para síntese desta enzima

Introduzir este gene em plasmídios e voltá-los á cél, produtora aumentar o

n° de cópias do gene responsável pela síntese da enzima = aumentar a

velocidade da reação limitante.

a b c



3. Características desejáveis de micro-organismos e meios de

cultura para aplicação industrial

• “O desempenho de um MO depende muito da composição do meio de cultura

em que é colocado.”

3.1 Características desejáveis de MO

Para uma aplicação industrial MO apresentem as seguintes característicasgerais:

a) Apresentar elevada eficiência na conversão do S em P

principalmente devido ao custo da MP.

b) Permitir o acúmulo do P no meio obter elevada concentração do P

no caldo fermentado


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Microrganismos de Interesse

c) Não produzir substâncias incompatíveis com o P de interesse

produzir uma enzima de interesse utilizando MO que também produz

proteases extracelulares

d) Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico

utilizar material genético estável, para ter cél. competentes em termos de

acumulo de produtos

e) Não ser patogênico

f) Não exigir condições de processo muito complexas economia do

processo

g) Não exigir meios de cultura dispendiosos

h) Permitir rápida liberação do P para o meio


Meios de Cultura

3.2 Características desejáveis do meio de cultura

a) Ser o mais barato possível desde que atenda às necessidades do MO

selecionado.

b) Atender às necessidades nutricionais do MO

c) Auxiliar no controle do processo ser ligeiramente tamponado

(evitar variações drásticas de pH), ou evitar uma excessiva formação de

espuma

d) Não provocar problemas na recuperação do produto

e) Permitir algum tempo de armazenagem ter maior disponibilidade

f) Ter composição razoavelmente fixa

g) Não causar dificuldades no tratamento final do efluente


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Inóculo

3.3 Inóculo

• Inoculo = pé-de-cuba = pé-de-fermentação é um volume de suspensão de

MO de concentração adequada capaz de garantir, em condições econômicas, a

fermentação de um dado volume de mosto.

• Para se ter um inoculo com capacidade produtiva elevada deve-se dar

condições para que o MO desejado seja propagado

• Armazenamento de MO: conservar a cepa viável e com capacidade produtiva,

mantendo-a com o mínimo de divisões celulares quando estas ocorrem, há

possibilidade de haver mutações.

• Algumas técnicas usadas para armazenamento de MO secagem de MO, em

terra, areia, sílica ou outro material solido, conservação em agar inclinado ou

outras que limitem o metabolismo e respiração microbiana


Inóculo

• Também pode ser por congelamento em congeladores ou em nitrogênio

liquido, e remoção da água de células ou esporos por liofilização e manutenção

do material seco sob diferentes condições.

• A recuperação do MO é feita de diferentes maneiras o método depende da

técnica que se usou para preservá-lo.

• Durante a fase de propagação do inoculo ter cuidados especiais para

evitar contaminação, e não comprometer a produção industrial.

• Propagação em processos aeróbios o ar fornecido ao sistema é um foco

potencial de contaminação, assim deve ser esterelizado

• O volume de inoculo introduzido no fermentador está normalmente ao redor

de 10% da sua capacidade útil. No entanto pode variar de 0,5 a 50%.


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Inóculo

• A fase de preparo do inoculo (propagação) compreende duas fases: a de

laboratório e a industrial.

a) A partir da cultura estoque, propaga-se o MO por meio de metodologia conveniente.

Normalmente na fase inicial passa-se do meio sólido, em condições assépticas, para um

tubo de ensaio contendo meio líquido esterilizado, adequado para o desenvolvimento

microbiano.

b) Após incubação por um determinado tempo, que depende do tipo de MO cultivado,

transfere-se o conteúdo desse tubo para frascos apropriados com agitadores rotativos

ou recíprocos ("shakers") contendo meio esterilizado (erienmeyers lisos ou chanfrados).

c) Após incubação, transfere-se a suspensão microbiana para frascos maiores contendo

meio nutriente esterilizado.

d) O número de transferências vai depender do volume útil do pré-fermentador

(germinador).


Inóculo

• Todas as transferências devem ser feitas em condições assépticas e os frascos

devidamente fechados deve permitir a entrada de ar para MO aeróbios

• A cada passo, os MO devem crescer rapidamente, sendo as transferências

feitas na fase logarítmica de crescimento.

• Sugestões para relação entre volume que recebera a suspensão microbiana e o

volume desta nas varias etapas de propagação de inoculo são da ordem de 10

vezes, 20 vezes, mas há indicações para valores possíveis de 100 a 200 vezes.

• È muito importante, a indústria criar seu próprio protocolo de propagação do

inoculo.


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Inóculo


Mosto

3.4 Mosto

• Cada MO possui condições ótimas de crescimento pH, temperatura, nível de

oxigênio dissolvido, entre outras.

• O meio de cultivo tem influência marcante no crescimento dos MO.

• Em microbiologia é chamado de meio de cultura.

• Na área de fermentações industriais é chamado de mosto

• Deve possuir nutrientes requeridos para o crescimento celular, que são

classificados nos seguintes grupos:

Fontes dos elementos "principais" C, H, O e N

Fontes dos elementos "secundários" P, K, S, Mg

Vitaminas e hormônios

Fontes de "traços" de elementos elementos em quantidades mínimas para o

crescimento microbiano - Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn


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Mosto

• Na formação do mosto deve-se levar em conta a necessidade desses nutrientes

• O mosto além de propiciar o desenvolvimento microbiano, deve

favorecer a formação do produto que se deseja.

• A formação de um meio de cultivo deve levar em conta a composição celular, o

requerimento energético e a necessidade de substâncias específicas.

• A composição elementar de uma célula microbiana depende de muitos fatores,

como condições de cultivo, espécie do MO, e até mesmo do substrato utilizado para

seu crescimento.

• Um meio para crescimento microbiano deve, no mínimo, conter os elementos

presentes na célula na proporção correta.


Mosto

• As fontes de nitrogênio podem ser orgânicas ou inorgânicas e de modo algum

devem faltar na composição do meio de cultivo, sob pena de limitar o crescimento

celular.

• Quanto a substâncias orgânicas, tais como vitaminas e aminoácidos, devem fazer

parte da constituição do mosto se os MO não os sintetizarem.

• Os MO, para seu crescimento, coordenam o catabolismo (que tem como funções

principais fornecer energia) e o anabolismo (onde se dá a formação de

biomoléculas que farão parte da constituição do MO, tais como polissacarídeos,

lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos).

• Substrato limitante (S) para MO além de ser a fonte de energia para as vias

do metabolismo, devem suprir necessidades da célula de C, O e H , que integrarão

a composição celular e/ou o produto.


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Mosto

• A quantidade de S no mosto será uma função de quanto se deseja produzir de

MO, ou de produto

• No entanto, não se pode ter um mosto com [S] nestas condições, pode se

tomar inibitório para o crescimento microbiano.

• 2 tipos de mostos naturais e sintéticos

• Naturais obtidos a partir de extratos de plantas ou animais

Exemplos: extrato de levedura (autolisado de leveduras), extrato de carne,

extrato de malte, peptona (hidrolisado de ptns), suco de uva, leite, água de

maceração de milho, caldo de cana

meios quimicamente complexos meios bastante ricos e geralmente não

necessitam de complementação para sua utilização como mosto.

composição variável e indefinida durante estocagem e entres lotes


Mosto

• Sintéticos elaborados quimicamente

Composição química é bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer

instante.

São geralmente mais onerosos, porém podem permitir maior economia nas

etapas de recuperação do produto.

• Do ponto de vista industrial, vários fatores devem ser considerados na escolha do

mosto a ser utilizado

O custo do substrato pode ser crucial, devendo também ser levada em conta a

quantidade de carbono disponível, bem corno as exigências para sua fermentação

O custo é o fator limitante da utilização de meios sintéticos em escala industrial.

Suprimento do substrato


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Disponibilidade, variabilidade na composição da matéria-prima, condições de

armazenamento, dificuldades de esterilização do mosto, fermentescibilidade,

exigência de tratamentos para tornar o substrato presente na matéria-prima

fermentescível e comportamento do mosto durante e após a fermentação.

4. Características de uma unidade de fermentação

• Laboratório de microbiologia: fornece inóculos e acompanha a evolução

microbiológica do processo evitar contaminações

• Planta de fermentação fermentadores e controles

• Laboratório de controle análises químicas e bioquímicas (açúcares

redutores, N disponível, produtos, pH)

Unidade de Fermentação


Unidade de Fermentação• Serviços:

água limpa e tratada para preparação do meio e limpeza;

água fria para controle de temperatura

ar comprimido estéril para aeração

vapor alta pressão para esterilização

eletricidade para equipamentos

sistema adequado para disposição de resíduos

• Estoque insumos, embalagens

• Lab. de pesquisa e desenvolvimento

• Área de recuperação usa os mais diversos processos, como destilação,

cromatografia, precipitação, cristalização, etc.

• Vendas contato com clientes, assistência técnica


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Unidade de Fermentação


Tipos de Fermentação

5. Equipamentos e métodos empregados em fermentações

industriais

5.1 Tipos de fermentação

• Existem, de forma geral, 2 tipos de fermentação:

1) Fermentação semi-sólida

2) Fermentação submersa

1. Fermentação semi-sólida

• São “processos que referem-se à cultura de MO sobre ou dentro de partículas

em matriz sólida, onde o conteúdo de líquido ligado a ela está a um nível de Awque assegure o crescimento e metabolismo das células, porém não exceda àmáxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida”, segundo DURANTet al. (1988).


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Fermentação Semi-SólidaFermentador

• Usa-se o fermentador de bandejas (Método de Koji) é uma estufa

com temperatura e umidade controlável, onde são colocadas bandejas

contendo o meio de cultura e inoculado com o respectivo MO.

• Tambores rotativos

MO usados

• Fungos filamentosos: Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou

Aspergillus (ptns e enzimas), e Fusarium ou Giberella (ácido

giberélico)

• Bactérias: Bacillus thuringiensis (bioinseticidas), linhagens de

Bacillus (α-amilase), Zymomonas mobilis (álcool)


Fermentação Semi-Sólida

Substratos

• Quando o suporte sólido atua ele próprio como fonte de nutrientes;

• Nutrientes são solúveis em água e os MO estão aderidos a uma matriz sólida,

inerte ou não, que irá absorver o meio de cultura líquido.

Ex.:solução de glicose e de nutrientes umedecendo bagaço de cana para

produção de ácido lático.

• Os materiais utilizados são provenientes de MP, produtos e/ou resíduos

agroindustriais:

Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, farinha e resíduos

sólidos do processamento da mandioca, bagaço de cana (enzimas)

soja (“shoyu”) para elaboração de condimentos orientais, etc...

Exemplos de aplicação (cogumelos comestíveis, compostagem, enzimas)


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Fermentação Submersa

2. Fermentação submersa

• Processo em que o mosto é líquido e o MO desenvolve-se dentro deste meio.

Fermentadores

1) Para culturas aeróbicas

• É constituído por uma cuba ou dorna, fechada, que pode ser esterilizada,

aerada, agitada e com T(°C) e pH controlados.

• Pode ser equipado com defletores ou chicanas e com sistemas de agitação

através de pás.

• O ar estéril é introduzido na parte inferior do fermentador, de forma a ser

bem espalhado pelos agitadores.

2) Para culturas anaeróbicas ou micro-aeróbicas sem agitação e

aeração


Fermentação semi-sólida Fermentação submersa

Precisa de muito espaço Fermentadores compactos

Uso de muita mão de obra Mínima mão de obra

Ar a baixa pressão Ar a alta pressão

Pouco consumo de energia Alto consumo de energia

Requer pouco controle Requer controle rigoroso

Pouco problema decontaminação

Problemas de contaminação

Obtenção: extração, filtraçãoou centrifugação, evaporaçãoou precipitação

Obtenção: filtração oucentrifugação e evaporação ouprecipitação

Pouca aplicação industrial Muito usada industrialmente

COMPARAÇÃO ENTRE PROCESSOS


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Métodos de Extração

6. Métodos de Extração / Recuperação

• As diferentes fases de processos de recuperação podem envolver

várias operações unitárias, como filtração, centrifugação, destilação,

entre outras

1ª etapa Eliminação de insolúveis

A) Separação dos insolúveis

a.1) Filtros: Uso de filtros rotativos a vácuo, ou filtro prensa.

a.2) Decantadores

a.3) Centrífugas: permite eliminar ou separar MO que sejam bactérias,

leveduras ou fungos.

a.4) Outros métodos: floculação (formação de flocos de células)


Métodos de Extração

2ª etapa Extração por solvente

• Normalmente usam-se solventes orgânicos

• Ex.: penicilina, extraída em meio ácido (pH = 2), com acetato de amila ou

butila.

3ª e 4ª Etapas Concentração / Purificação

a) Extração por troca iônica

b) Precipitação

c) Filtração em géis

d) Extração de produtos intra-celulares

e) Secagem

f) Destilação


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