Hansen. Int., 28(1): 19-30, 2003 19

NJOO, D., et. al. Detecção de determinantes antigênicos compartilhados entre a proteína de choque térmico 65 do Mycobacterium leprae e proteína de choque térmico 60 humana

RESUMO

Nestes estudos foram investigados se o Mycobacteriumleprae (M. leprae) e o homem compartilham deter-minantes antigênicos que podem estar localizados nasProteínas de Choque Térmico (HSPs) e que podem ser

responsáveis pela destruição tecidual. Usando-se técnicade coloração única pela imunoperoxidase em cortes feitoscom criostato, observaram-se três anticorpos que eramdirigidos contra HSP-60 (anticorpos policlonais SPA-804,SPA-805 e o anticorpo monoclonal SPA-807), queprovavelmente reagiam especificamente com macrófagose células epitelióides em biópsias cutâneas de pacientescom hanseníase. No Western Blot foi observado quetodos os anticorpos contra HSP-60 humana e anticorposmonoclonais (MoAbs) contra HSP-65 do M. leprae (F47-10, F67-18, F88-1) reagiam intensamente com asproteínas do M. leprae sonicado com peso molecular de65 kDa, indicando semelhança de alguns determinantesantigênicos entre HSP-60 humana e HSP-65 do M. leprae.Subseqüentemente, um estudo imunoistoquímicocomparativo dos padrões de coloração de anticorposcontra HSP-60 humana e anticorpos contra HSP-65 do M.leprae, usando cortes cutâneos feito em criostato dehanseníase paucibacilar (PB), multibacilar (MB) e outrasdoenças granulomatosas, revelaram que os MoAbs F47-10e F67-18 reagiam somente fracamente com osgranulomas em hanseníase PB e em outras doençasgranulomatosas cutâneas, mas coravam o granuloma dahanseníase MB intensamente. O MoAb F88-1 e osanticorpos policlonais SPA-804, SPA-805 e o MoAb SPA-807 coraram os granulomas dos pacientes PB e de outrasdoenças cutâneas granulomatosas com a mesma

Detecção de determinantes antigênicoscompartilhados entre a proteína de choque

térmico 65 do Mycobacterium leprae e proteínade choque térmico 60 humana

Detection of shared antigenic determinants betweenMycobacterium leprae heat shock protein 65 and

human heat shock protein 60

David Njoo1

Ricardo.V.P. Hu2

Bhupendra Tank3

Arend.H.J.Kolk4

Angela Kooy5

René Kant6

Bernard Naafs7

ARTIGO ORIGINAL

1 MD, PhD, Department of Dermatology and Venereology, DijkzigtHospital, Erasmus University Rotterdam, The Netherlands.Department of Dermatology and Venereology, AcademicMedical Centre University of Amsterdam, The Netherlands

2 MD, Dermatovenereologist, Department of Dermatology andVenereology, Dijkzigt Hospital, Erasmus University Rotterdam,The Netherlands. Department of Dermatology and Venereology,Academic Hospital Paramaribo, Surinam.

3 PhD, Department of Dermatology and Venereology, DijkzigtHospital, Erasmus University Rotterdam, The Netherlands.

4 PhD, N.H. Swellengrebel Laboratory of Tropical Hygiene, RoyalTropical Institute, Amsterdam, The Netherlands.

5 PhD, Department of Dermatology and Venereology, DijkzigtHospital, Erasmus University Rotterdam, The Netherlands.

6 MT, Department of Dermatology and Venereology, DijkzigtHospital, Erasmus University Rotterdam, The Netherlands.

7 M.D, Ph.D, Dermatovenereologist, Department of Dermatologyand Venereology, Dijkzigt Hospital, Erasmus UniversityRotterdam, The Netherlands. Department of Dermatology andVenereology, Academic Hospital Leiden, The Netherlands.Instituto Lauro de Souza Lima, Bauru,SP, Brasil. Address ofcorrespondence: B. Naafs, M.D. Ph.D. Gracht 15, 8485KNMunnekeburen, The Netherlands. e-mail: benaafs@dds.nl

intensidade daquela nos pacientes MB. Utilizando-se umatécnica de dupla coloração, observou-se que osdeterminantes antigênicos reconhecidos pelo MoAbcontra HSP-60 humana (SPA-807) e os MoAbs contra aHSP-65 do M. leprae (F67-18, F47-10, F88-1) estavam, namaioria das vezes, localizados nos macrófagos. Essesachados não contradizem nossa hipótese de quesemelhanças entre determinantes antigênicos nas HSPs noM. leprae e no hospedeiro humano podem ser, nomínimo em parte, responsáveis pela indução de umareação autoimune na hanseníase causando formação degranuloma com subseqüente dano tecidual. Osresultados deste estudo também indicaram que algunsdestes determinantes estão provavelmente localizados naHSP-60. Uma explicação similar possivelmente se apliqueaos achados em outras doenças granulomatosas, comopor exemplo, na sarcoidose provavelmente induzida pormicobactéria, e na necrobiose lipoídica relacionada aodiabete, nas quais considera-se que epítopos semelhantesexistam entre a HSP-65 bacteriana e a HSP-60 humana edesempenhem um papel importante.

Descritores: hanseníase, doenças granulomatosas,autoimunidade, proteínas de choque térmico, HSP-60,HSP-65, imunopatologia, Western blot.

INTRODUÇÃO

Ocompartilhamento de determinantes antigênicosentre parasita e hospedeiro foi primeiramentedescrito por Damian em 1964 (DAMIAN, 1964).

Este fenômeno chamado “mimetismo antigênico” foisugerido como uma possível explicação para asmanifestações clínicas e histopatológicas da hanseníase(NAAFS et al., 1990; VAN DEN AKKER et al., 1992;RAMBUKKANA et al., 1992).

Os determinantes antigênicos comuns do M. lepraee do hospedeiro podem levar ou a um estado detolerância ou a um estado de autoimunidade. Por umlado, o mimetismo antigênico permite que o parasitasobreviva nos tecidos humanos porque o sistema imunefalha em reconhecer os antígenos como “não próprios”.Uma tal situação pode ocorrer na hanseníase virchoviana(VV), na qual os tecidos do paciente ficam repletos demicobactérias, e uma imunidade específica mediada porcélulas (IMC) contra antígenos do M. leprae está ausente.Por outro lado, determinantes antigênicos compartilhadospelo M. leprae e o hospedeiro podem induzir uma reaçãoautoimune contra os antígenos do próprio hospedeiro.Isto poderia explicar as respostas imunes observadas nahanseníase tuberculóide (TT) e durante uma ReaçãoReversa (RR). Uma IMC alta contra os antígenos do M.leprae pode então ser observada e ocorre a formação de

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um granuloma destrutivo com edema na derme e nosnervos periféricos superficiais. Contudo, os antígenosresponsáveis ainda permanecem desconhecidos. Estudosanteriores relataram que o M. leprae, as micobactériasambientais e o tecido humano (pele e nervos) têmdeterminantes antigênicos em comum (NAAFS et al.,1990; VAN DEN AKKER et al., 1992). Estas observaçõesderam suporte à noção de que a autoimunidade podeestar envolvida no dano tecidual na hanseníase. Foiatravés de métodos imunoistoquímicos que, pela primeiravez, foi demonstrada a reação cruzada entre os MoAbsanti-M. leprae e a pele humana (NAAFS et al., 1990).Subseqüentemente, com a utilização de um sistemaimunoblot foi descrita semelhança entre antígenosmicobacterianos e determinantes na epiderme humananormal (VAN DEN AKKER et al., 1992). Parecia quemuitos dos MoAbs anti M. leprae utilizados naquelesestudos eram dirigidos contra determinantes antigênicospertencentes a proteínas conservadas durante a evoluçãoe denominadas de “Proteínas de Choque Térmico” (HeatShock Proteins-HSPs). As Proteínas de Choque Térmicoou “proteínas de estresse” são sintetizadas por organismoseucariotas e procariotas como uma resposta fisiológica aeventos estressantes. Acredita-se que essas proteínasrealizam funções autoprotetoras que são essenciais para asobrevida da célula (POLLA, 1991; 1991). As HSPspodem ser classificadas em cinco famílias principais,baseando-se em seu aparente peso molecular: HSP-100,HSP-90, HSP-70, HSP-60 e HSP-27 (MAYTIN, 1995). Aseqüência de genes das HSPs entre o homem emicroorganismos (patogênicos) parece mostrar notáveissemelhanças (DUDANI et al., 1989; GARSIA et al., 1989).Além do mais, antígenos altamente imunodominantes doM. leprae foram reconhecidos como homólogos dasproteínas de estresse (YOUNG et al., 1987).

O objetivo do presente trabalho foi ampliar osestudos mencionados previamente (NAAFS et al., 1990;VAN DEN AKKER et al., 1992) a fim de verificar se algunsdos determinantes antigênicos compartilhados pelo M.leprae e o hospedeiro humano podem estar localizadosnas Proteínas do Choque Térmico. Usando-se umconjunto de anticorpos comerciais disponíveis contra HSPde quatro famílias diferentes e um conjunto de anticorposcontra determinantes antigênicos do M. leprae, osseguintes trabalhos foram realizados:A- Estudou-se a reatividade específica dos anticorpos anti-

HSP humano com determinantes antigênicos do M.leprae pela técnica de coloração por imunoperoxidaseem cortes de pele de hanseníase multibacilar, feitos nocriostato e pela técnica de Western Blot usando-secomo antígeno M. leprae sonicado;

B- Compararam-se os padrões de reatividade dessesanticorpos com granuloma de hanseníase PB e MB e

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outras doenças granulo-matosas cutâneas;C- A detecção in situ de determinantes antigênicos da

HSP-60 humano e HSP-65 do M. leprae emmacrófagos cutâneos em hanseníase PB e MB e outrasdoenças granulomatosas cutâneas, usando-se a técnicada dupla coloração.

Os resultados desses estudos mostraram que algunsdos determinantes antigênicos compartilhados pelo M.leprae e o hospedeiro humano e que podem ser em parteresponsáveis pela patologia da hanseníase estãolocalizados na HSP-60.

MATERIAL E MÉTODOS

Fragmentos de biópsias

Biópsias de pele de nove pacientes com hanseníasee cinco pacientes com doenças granulomatosas cutâneasforam obtidas nos departamentos de Dermatologia eVenereologia do Hospital Acadêmico Dijkzigt emRotterdam (Holanda) e Hospital Acadêmico emParamaribo (Suriname). A pele humana normal foi obtidade duas pacientes que sofreram redução de mama nodepartamento de Cirurgia Plástica Reconstrutiva doHospital de Rotterdam. Os espécimes foram congeladosem nitrogênio líquido e armazenados a -70oC até o uso.

O diagnóstico histológico foi confirmado em cortescorados pela hematoxilina-eosina (HE). A coloração deFite-Faraco-Wade foi usada para detectar a presença debacilos álcool-ácido resistentes e a determinação doíndice baciloscópico (IB) em fragmentos de pele depacientes hansenianos.

Imunoistoquímica

Método de coloração única

Cortes congelados foram corados usando-se ométodo do complexo Avidina-Biotina como descrito porCATTORETTI et al., 1988.

Resumidamente: seções de 5μm cortadas emcriostato foram colocadas em lâminas de vidro, secas ao are fixadas em acetona durante 10 minutos à temperaturaambiente. As seções foram lavadas em tampão fosfato(PBS, pH 7,4) contendo 0,05% de Tween e pré-incubadascom 5% de soro albumina bovino em PBS durante 10minutos para minimizar a coloração inespecíficaSubseqüentemente, as seções foram incubadas durante60 minutos com uma diluição ótima do anticorpoprimário. Depois foram lavadas duas vezes com PBS,contendo 0,05% de Tween e, incubadas durante 30minutos com anticorpos secundários biotinilados;anticorpo de cabra anticamundongo na diluição 1:200

contendo 3% de soro de cabra normal (SCN) e 3% sorohumano normal (SHN). As seções foram lavadasnovamente, duas vezes, em PBS contendo Tween (0.05%)e incubadas durante 30 minutos com o complexoAvidina-Biotina diluído a 1:1.200 (kits-DAKO, DAKO A/S-Dinamarca). Logo após, as lâminas foram lavadas, duasvezes, com PBS (sem Tween). A reação de peroxidase foidesenvolvida incubando-se os cortes com umaconcentração de 0,75 mg/ml de 3,3-diaminobenzidina(DAB) e peróxido de hidrogênio a 0,25%, durante 7minutos em campo escuro. As secções foram lavadas emágua corrente e contra-corada, durante 60 segundos, comhematoxilina de Mayer e novamente lavadas em águacorrente durante 5 minutos. A seguir, foram montadas emMalinol após a desidratação por passagens consecutivasem banhos de álcool e xilol.

Controles negativos consistiram na omissão deanticorpo primário.

Método da dupla coloração

Seções de 5μm cortadas em criostato foram fixadasdurante 10 minutos em acetona, secas ao ar e lavadas emPBS. Elas foram incubadas durante 1 hora com o primeiroanticorpo monoclonal. Depois de lavadas com PBS, foramincubadas com anticorpos biotinilados de cabraanticamundongo na diluição 1:200 contendo 3% de SHNe 3% de SCN, durante 30 minutos. A seguir foram lavadasem PBS e incubadas com estreptavidina—Galactosidasediluída 1:2 (Laboratórios Biogenex, San Ramon, E.U.A.)durante 30 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadascom PBS. A reação de -Galactosidase foi desenvolvidacom o substrato -Galactosidase (0.72% cyanideFerry/Ferro, 2.5% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -galacoside,0.11% mgCl2 em PBS) durante 30-45 minutos a 37oC. Asseções foram lavadas em PBS durante 15 minutos eincubadas com o segundo anticorpo monoclonal durante1 hora. Após nova lavagem com PBS, foram incubadascom anticorpos de coelho anticamundongo na diluição1:50, contendo SHN a 1:50 e SCN diluído a 1:50, durante30 minutos. Foram lavadas com PBS e incubadas comfosfatase alcalina antifosfatase alcalina na diluição 1:100(APAAP), durante 45 minutos. Após lavagem com PBS assecções foram incubadas em 0,2M Tris-HCl pH 8,0durante pelo menos 5 minutos. A reação de fosfatasealcalina foi desenvolvida incubando-se as secções emsubstrato AP (150 μl fucsina nova, 150 μl NaNO3, 18mgNaftol AS-MX fosfato e 15 mg Levamisol em 70 ml 0.2MTris-HCl, pH 8,0) durante 30 minutos em temperaturaambiente e câmara escura. As seções foram lavadas emPBS e montadas em gelatina-glicerina de Kaiser.

Controles negativos consistiram na omissão deanticorpos primários e secundários. A porcentagem de

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células coradas pela dupla-coloração no granuloma foimicroscopicamente calculada por dois observadoresindependentes.

Anticorpos primários

Anticorpos mono e policlonais contra HSP humanoforam comprados de StressGen, Victoria, Canadá. As suascaracterísticas estão listadas na Tabela 1.

A diluição ótima para cada MoAbs anti-HSPhumano foi estabelecida usando-se granuloma depacientes hansenianos MB, porque determinantes

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antigênicos do M. leprae provavelmente estão presentesem grande quantidade neste espectro da hanseníase. Peloaumento gradual das diluições de cada anticorpo, essesanticorpos que marcaram o granuloma positivamente,mas não marcaram a epiderme, foram considerados úteispara os estudos B e C.

Foram obtidos três anticorpos monoclonais decamundongos contra três diferentes epítopos da proteína de65 kDa do M. leprae (KOLK et al.,1984) (Tabela 2). Oanticorpo monoclonal contra o marcador de macrófagoCD68 (KP1) era da marca DAKO, Dinamarca (PULFORD etal., 1989).

Tabela 1. Anticorpos contra proteínas de choque térmico (StressGen) .

Tabela 2. Especificidade dos anticorpos monoclonais contra diferentes epítopos da HSP-65 do M. leprae (KOLK et al., 1984)

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A especificidade do anticorpo monoclonalcontra o marcador de macrófago CD68 (KP1) foiconfirmada através de titulação usando a epiderme depacientes hansenianos multibacilares. A diluição ótima era1:8000.

As colorações dos granulomas e a epiderme foramgraduadas como segue:-: Negativo+ / -: Duvidoso+: Positivo fraco++: Moderadamente positivo+++: Fortemente positivo++++: Muito fortemente positivo

M. leprae sonicado

O M.leprae purificado, originário de fígado de tatuinfectado (DAS et al., 1982), foi macerado em umtriturador de tecidos e sonicado a 4oC. O M. lepraesonicado (10mg/ml) foi cedido pelo Dr. P. R. Klatser, N. H.Swellengrebel Laboratório de Higiene Tropical, InstitutoTropical Real, Amsterdã, Holanda.

Eletroforese em gel de poliacrilamida- Duodecil Sulfatode Sódio (SDS-PAGE)

M.leprae sonicado (10 mg/ml) na diluição de 1:4 foisubmetido ao SDS-PAGE usando-se 12% de gel separadorcom 0,1% de SDS em um sistema descontínuo de tampãoTris como descrito por Laemmli et al. (LAEMMLI, 1970). OM. leprae sonicado diluído foi tratado com 5% de 2α-mercaptoetanol e 2% de SDS e aquecido em banho deágua a 100oC durante 4 minutos.

Uma mistura de proteínas pré-coradas consistindode fosforilase B (94 kDa), soro albumina bovino (67 kDa),ovoalbumina (43 kDa), anidrase carbônico (30.1 kDa),inibidor de tripsina de feijão-soja (20.1 kDa) e -lactolbumina (14.4 kDa) foi usado como marcador(Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia).

Western Blot

As proteínas de M. leprae separadas no gel forammarcadas eletroforeticamente (TOWBIN et al., 1979)sobre uma membrana de nitrocelulose usando um MiniTrans-Blot Electrophoretic Transfer Cell System (BioRadLaboratories, Venendaal, Holanda). Depois de marcadas,as tiras de nitrocelulose foram bloqueadas durante 30minutos com PBS contendo Tween (0.3%) a 37oC. As tirasforam lavadas três vezes por 5 minutos cada com PBS eTween (0.05%) em temperatura ambiente. A coloraçãopor imunoistoquímica foi executada de acordo com as

instruções do fabricante, usando-se o métodoImmunoGold Silver, (Amersham Life Science, Amersham,Reino Unido). As tiras foram incubadas com anticorpoprimário e 1% SCN diluído a 1:200 em PBS contendoTween (0.05%) durante 2 horas. A seguir, foram lavadastrês vezes por 5 minutos cada com PBS e Tween (0.05%).Subseqüentemente, as tiras foram incubadas em umasolução contendo anticorpo de cabra anticamundongoligado em ouro e anticorpo monoclonal anticoelho ligadoem ouro (AuroProbe BL plus, Janssen Life Science, Geel,Bélgica) diluído a 1:100, Gelatina (1:20) e PBS comTween 0.05% durante 2 horas. As tiras foram novamentelavadas três vezes por 5 minutos cada com PBS e Tween(0.05%). A seguir, foram lavadas durante 2 minutos emágua destilada. Finalmente, volumes iguais de realçadores(Amersham Life Science, Amersham, Reino Unido) einiciadores (Amersham, Life Science, Amersham, ReinoUnido) foram misturados e adicionados às tiras paraaumentar o sinal do ouro. Reações ocorreram, entre 15-20 minutos. A seguir, as tiras foram lavadas três vezes por10 minutos cada, em água destilada, e foram secas compapel de filtro.

RESULTADOS

A. Especificidade dos anticorpos anti-HSPs

Imunoistoquímica

A reatividade no granuloma e na epiderme embiópsias de pele dos cinco pacientes hansenianos MB queusaram as diluições ótimas dos anticorpos são mostradosna Tabela 3.

Nenhuma coloração específica dos granulomas foiobservada usando-se os MoAbs SPA-820, SPA-815, SPA-810, SPA-800, SPA-830. A intensidade das colorações naepiderme com todos os MoAbs variou de fraca a muitoforte.

Anticorpos policlonais com SPA-804, SPA-805 eanticorpos monoclonais com SPA-807 reagiram,especificamente, com determinantes presentes nogranuloma. Além disso, as colorações-padrão destes trêsanticorpos eram idênticas. A epiderme não estava coradacom quaisquer destes anticorpos.

Western Blot

A especificidade dos anticorpos anti-HSP humanopara reagir com determinantes antigênicos do M. lepraeforam confirmados pelo Western Blot usando-se M. lepraesonicado como antígeno.

Como controle, foram incluídos três MoAbs (F 47-10; F 67-18; F 88-1) que criaram reações contra o HSP-

NJOO, D., et. al. Detecção de determinantes antigênicos compartilhados entre a proteína de choque térmico 65 do Mycobacterium leprae e proteína de choque térmico 60 humana

65 anti-M. leprae, (KOLK et al., 1984) e que reagiramespecificamente com o granuloma e não com a epiderme.

Análise do imunoblot demonstrou que anticorpospoliclonais SPA-804, SPA-805 e os MoAbs SPA-807, F 47-10, F 67-18 e F 88-1 reconheciam proteínas do M. lepraecom uma massa molecular de 65 kDa. Os resultadostambém indicaram que os MoAbs F 47-10 e F-67-18tiveram uma reação maior com estas proteínas de 65 kDado que os MoAbs F 88-1, 807 e os anticorpos policlonaisSPA-804 e SPA-805 (Figura 1).

Os MoAbs SPA-820, SPA-815, SPA-810, SPA-800 eSPA-830 não mostraram nenhuma reatividade comproteínas do M. leprae no blot (resultado não mostrado).

Baseado nestes achados, os MoAbs SPA-820, SPA-815, SPA-810, SPA-800 e SPA-830 foram excluídos dasinvestigações adicionais.

B. Uma comparação da reatividade dos anticorpos comgranulomas de pacientes PB, MB e outras alteraçõesgranulomatosas cutâneas.

Imunoistoquímica

Neste estudo dois anticorpos policlonais, anticorpomonoclonal contra HSP-60 e três anticorpos monoclonaiscontra HSP-65 do M. leprae foram selecionados. Oobjetivo era investigar se granulomas de outras alteraçõescutâneas como sarcoidose e granuloma anular mostravampadrões semelhantes aos granulomas T e V.

Os resultados estão demonstrados na Tabela 4. Podeser visto que as colorações específicas dos granulomasforam observadas em todas as seções de pele comhanseníase, com todos os anticorpos usados.

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Nos quatro casos PB, todos os anticorpos marcaramcélulas, especialmente no centro do granuloma. Acoloração com o MoAb contra o marcador CD68 demacrófago também foi limitada às células localizadas namesma área (Figura 2).

A coloração dos granulomas de pacientes PB e MBnas cortes de pele com MoAb anti-HSP 60, anticorpospoliclonais e com MoAb F 88-1 era semelhante (demoderada a fortemente positiva) (Figura 3).

Reatividade para os MoAbs F 47-10 e F 67-18 emlesões de PB resultaram entre duvidosas e positiva fraca.Em contraste, o mesmo MoAb reagiu com intensidadeforte até fortemente positiva nas lesões dos pacientes MB.

Os resultados, como resumidos na Tabela 5,demonstram que granulomas de outras alteraçõescutâneas apresentam reações semelhantes aos padrõesobservados na hanseníase. Um padrão representativo émostrado na Figura 4.

C. Detecção in situ de determinantes antigênicos daHSP-60 em macrófagos de PB e MB e outros alteraçõescutâneas granulomatosas.

Imunoistoquímica – dupla coloração

A dupla coloração foi feita para demonstrar que osantígenos reconhecidos por ambos os MoAbs anti-HSP-60humano, anti-HSP-65 do M. leprae e anticorpospoliclonais estão (principalmente) localizados nosmacrófagos e demonstraram que estes MoAbs anti-HSP-60 humano, anti-HSP-65 do M. leprae e os anticorpospoliclonais podem reagir com os mesmos antígenos.

Tabela 3. Reatividade dos anticorpos em granulomas e epiderme na pele de pacientes hansenianos multibacilares (N=5)

Intensidade da coloração: (-) negativo; (+/-) suspeito, (+) fracamente positivo; (++) moderadamente positivo; (+++) fortemente positivo;(++++) muito fortemente positivo

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Tabela 4. Coloração simples do granuloma em cortes de pele de pacientes hansenianos paucibacilares (N=4) e multibacilares(N=5) usando anticorpos contra HSP 60 e anticorpos monoclonais contra a HSP-65 do M. leprae.

Tabela 5. Coloração simples em cortes de pele de outras doenças granulomatosas (N=5) usando anticorpos contra a HSP 60 eanticorpos monoclonais contra a HSP-65 do M. leprae.

NJOO, D., et. al. Detecção de determinantes antigênicos compartilhados entre a proteína de choque térmico 65 do Mycobacterium leprae e proteína de choque térmico 60 humana

A combinação de MoAbs usada na dupla coloraçãofoi a seguinte: F 88-1/anti-CD68, F 47-10/anti-CD68, F67-18/anti-CD68, SPA-807/anti-CD68 e F 88-1/SPA 807.

Uma biópsia de granuloma anular, duas dehanseníase PB e duas de MB, apresentavam duplacoloração. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Os MoAbs F 88-1, F 47-10 e SPA-807 combinadoscom o MoAb anti-CD68 mostraram muitas células comdupla coloração no granuloma em todas as seções de pelede pacientes com hanseníase e outras alteraçõesgranulomatosas.

Com o MoAbs F 67-18 e anti-CD68, as células comdupla coloração foram vistas somente nos MB. Nospacientes PB e nos cortes com granuloma anular nãohavia nenhum coloração com MoAb F 67-18. Estesresultados eram compatíveis com os resultados obtidos nasimples coloração com o mesmo MoAb.

Em todas as secções de pacientes PB e MB coradascom a combinação F 88-1 e SPA-807, foram observadascélulas coradas pela dupla coloração (Figura 5). Usando-se a mesma combinação de MoAbs, no método da duplacoloração foram vistos padrões similares ao da hanseníasePB no granuloma anular.

DISCUSSÃO

Há mais de duas décadas os imunologistascomeçaram a investigar o papel das Proteínas do ChoqueTérmico na patogênese da hanseníase. Antígenosaltamente imunodominantes do M. leprae foramreconhecidos como homólogos das proteínas de estresse(COHEN et al., 1991; KAUFMANN, 1990 YOUNG et al.,1987). Mais importante é que, as HSPs do M. lepraemostraram até 50% de identidade na seqüência de genescom seus análogos humanos (DUDANI et al., 1989;GARSIA et al., 1989). O soro dos pacientes infectadosreage intensamente, especialmente contra osdeterminantes antigênicos da HSP-60 (YOUNG et al.,1987). Uma subclasse de linfócito T, as células T γ/δ sãocapazes de reconhecer especificamente os determinantesantigênicos da molécula HSP-65 do M. leprae. A ativaçãode tais células resulta na liberação de citocinas erecrutamento de linfócitos mais específicos e macrófagospara a área infectada (HAREGEWOIN et al., 1991;MODLIN et al., 1989). Sabe-se que a agregação demacrófagos infectados e ativados e células T levam àformação de um, assim chamado, “granuloma” que causadano tecidual (pele e nervo), quadro histopatológico

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Tabela 6. Dupla coloração, imunohistoquímica.

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característico da hanseníase. Contudo, os exatosmecanismos que levam a ativação e agregação dessascélulas em áreas com lesão não são bem compreendidos.Além do mais, os antígenos envolvidos nesses processosainda permanecem desconhecidos especialmentequando o próprio M. leprae muitas vezes pode não serdetectado. Visto que as seqüências de genes das HSPs doM. leprae e do homem são tão semelhantes, é tentadorpostular que a autoimunidade contra as HSPs humanasestá envolvida na formação de granuloma e osubseqüente dano tecidual na hanseníase.

Continuando o trabalho anterior para demonstrar aexistência de semelhanças entre o M. leprae e osantígenos cutâneos humanos, este estudo foi realizadousando-se técnicas imunoistoquímicas com uma e duplacoloração e a técnica de Western Blot para obter maissuporte para essa opinião de que pode haversemelhanças entre os determinantes antigênicos da HSP-60 humana e a HSP-65 do M. leprae.

Na primeira parte deste estudo, foi investigado sedeterminantes antigênicos das HSPs poderiam serdetectadas no granuloma da pele da hanseníasemultibacilar, usando-se anticorpos mono e policlonaiscontra HSPs. Foi sugerido (COLSTON et al., 1989;POLLA, 1991; 1991) que o processo de infecção“estressa” não somente o bacilo invasor, mas também ascélulas do hospedeiro infectado (isto é, macrófagos,células de Schwann). Isso leva a uma super produção deHSPs nessas células durante a infecção. Por isso pode-seesperar que as HSPs ou produzidas pelos macrófagos oupelo M. leprae ou por ambos são expressas nosmacrófagos. Focalizou-se a atenção, especificamente nosmacrófagos porque, ao lado de sua função como célulasapresentadoras de antígeno, os macrófagos ativadosparecem realizar importantes funções “efetoras” levandoà lise celular. Além do mais, os macrófagos representam amaioria da população celular dentro de um granuloma,ou como células epitelióides ou como células gigantes nahanseníase paucibacilar ou como “células espumosas”histiocíticas na hanseníase multibacilar.

No presente estudo, o achado de coloração positivacom os anticorpos monoclonais anti-HSP 70 (SPA-820,SPA-815 e SPA-810) na epiderme foi relatadoanteriormente por vários investigadores (BOEHNCKE etal., 1994; EDWARDS et al., 1991; TRAUTINGER et al.,1993). Khanolkar-Young et al., 1994, relataram que aHSP-70 estava expressa mais significativamente nogranuloma na pele e no tecido nervoso de pacientes comhanseníase sofrendo uma RR do que naqueles pacientessem uma RR. Usando, contudo, os mesmos MoAbs (SPA-810 e SPA-820), nós não conseguimos observar qualquer

diferença na coloração do granuloma na pele nem nahanseníase PB e MB e nem na RR. Recentemente,utilizando imunoistoquímica, Aroni et al.(1996)observaram uma expressão de HSP-70 significativamentemais alta no granuloma da pele da hanseníase virchovianaque no granuloma na pele da hanseníase tuberculóide.Contudo, o anticorpo policlonal contra HSP-70 usado emseu estudo também reagiu com a epiderme, por isso acapacidade deste anticorpo policlonal de reagirespecificamente com determinante da HSP-70 é umponto de discussão.

Os MoAbs anti HSP-27 e anti HSP-90 tambémfalharam em corar, especificamente, o granuloma. Issopode indicar que HSP-27 e HSP-90 não são expressos emcélulas dentro do granuloma. Há necessidade ainda deser estabelecido se este achado também indica que aHSP-27 e/ou HSP-90 não tem importância imunológicaem hanseníase.

Por outro lado, os três anticorpos mono epoliclonais contra HSP-60 (SPA-804, SPA-805 e SPA-807)coraram o granuloma de maneira intensa, enquanto quea epiderme era negativa indicando que os determinantesantigênicos presentes dentro do granuloma tinhamreagido especificamente com esses anticorpos.

Com o Western Blot foi observado que o SPA-804,SPA-805 e SPA-807 reagiam com as proteínas do M.leprae de peso molecular 65 kDa. Foram incluídos comocontrole, três MoAbs (F47-10, F67-18 e F88-1) cada umreagindo com um diferente determinante antigênico noantígeno de 65 kDa do M. leprae. Nesses blots esses trêsMoAbs também reagiam com uma proteína de 65 kDa doM. leprae em um padrão que era semelhante aquelerelatado anteriormente por vários outros pesquisadores(BUCHANAN et al., 1987; THOLE et al., 1987). Osanticorpos monoclonais contra HSP-70, HSP-27 e HSP-90humanos não mostraram nenhuma reação significativanos blots, confirmando os achados da imunoistoquímica.Isto sugeriu que a proteína 65 kDa do M. leprae pertenceà família da HSP-60 (DUDANI et al., 1989). Por isso, nãoé surpreendente que os anticorpos contra a HSP-60 e osanticorpos contra a proteína HSP-65 do M. lepraeproduzam uma banda de padrão semelhante no WesternBlot. Contudo, notou-se que as bandas no nível de 65kDa produzidas pelo MoAb SPA-804 e os MoAbs SPA-807e F88-1 eram menos proeminentes do que aquelas queeram produzidas pelos MoAbs F47-10 e F67-18 quepareciam ser mais específicas do M. leprae.

No segundo estudo os padrões de coloração dosanticorpos anti HSP-60 foram comparados com aquelesdos anticorpos anti HSP-65 do M. leprae usando cortesem criostato de pacientes com hanseníase PB e MB e

NJOO, D., et. al. Detecção de determinantes antigênicos compartilhados entre a proteína de choque térmico 65 do Mycobacterium leprae e proteína de choque térmico 60 humana

outras doenças cutâneas granulomatosas. Este estudotambém demonstrou semelhanças entre HSP-60 humanoe HSP-65 do M. leprae. Os anticorpos policlonais SPA-804 e SPA-805 e o MoAbs SPA-807 e F88-1 mostraramcoloração muito semelhantes do granuloma, com relaçãoà intensidade da coloração e à localização das célulaspositivas, na hanseníase PB e MB, bem como em outrasdoenças cutâneas granulomatosas. Colorações positivaspela imunoperoxidase do granuloma em lesões desarcoidose, na pele e em tecidos pulmonares, usandoanticorpo anti HSP-60 foram demonstradas anteriormente(STATON et al., 1995). O nosso achado de que osanticorpos anti-HSP também coravam o granuloma emcortes de pele de granuloma anular, necrobiose lipoídicae leishmaniose cutânea pode indicar que a alta expressãode HSPs poderia representar um aspecto característico dequalquer doença inflamatória granulomatosa (infecciosa enão infecciosa).

Ao contrário, os MoAbs F47-10 e F67-18 coraram osgranuloma de hanseníase MB intensamente, mas nãocoraram ou só coraram fracamente o granuloma dehanseníase PB e de outras doenças granulomatosascutâneas.

Por um lado, esses achados junto com as diferençasna intensidade da reatividade dos MoAbs no blotmostraram que o MoAb F88-1 provavelmente tinhareagido cruzadamente com determinantes antigênicosque não eram específicos para o M. leprae, mas sãocomuns aos determinantes na HSP-60 humana. Por outrolado, os resultados do Western Blot também indicaramque os MoAbs F47-10 e F67-18 reagiram com regiões naproteína 65 kDa do M. leprae que são provavelmenteespécie-específicas para o M. leprae (resultando em umareatividade mais intensa) e que, por isso, compartilhammenos semelhanças com HSP-60. Desta maneira, seriainteressante realizar estudos de absorção utilizando-seproteína HSP-60 recombinante ou purificada e seuspeptídeos individuais para definir exatamente osdeterminantes antigênicos reagentes (ANDERSON et al.,1988; MEHRA et al., 1986; THOLE et al., 1988).

Os métodos de dupla coloração revelaram não

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somente que era muito provável que o MoAb da HSP-60humano (SPA-807) e os anticorpos monoclonais HSP-65do M. leprae (F88-1) reagiam com as mesmas “estruturas”,mas que essas “estruturas” eram na maior parte das vezesexpressas em macrófagos. Entretanto, mais, estudos, sãonecessários para elucidar a ligação entre as HSPs e osmacrófagos e o possível papel dos determinantesantigênicos compartilhados pelas HSPs de diferentesorigens em gerar uma resposta (auto)imune levando àformação de granulomas na hanseníase e outras doençasgranulomatosas. A sarcoidose, por exemplo, é vista poralguns como a forma tuberculóide da tuberculose (ROOKet al., 1992; STANFORD, 1994). A necrobiose lipoídica éfreqüentemente relacionada à diabete, uma condição emque uma semelhança antigênica entre HSP-65 bacterianae HSP-60 humana parece desempenhar um papelimportante (HORVATH et al., 2002). O interessante énotar os recentes progressos no entendimento daarteriosclerose na qual a autoimunidade contra HSP-60humana, induzida pela infecção parece tambémdesempenhar uma parte importante (PERSCHINSKA etal., 2003).

Contudo, os resultados deste estudo mostraram queo conceito de autoimunidade em hanseníase que podeser desencadeado com base nas semelhanças em HSPsentre o M. leprae e o homem é atraente e merecedor demais investigações.

AGRADECIMENTOS

Nós agradecemos ao Prof. Dr. R. Lai a Fat, doHospital Acadêmico Paramaribo do Suriname porprovidenciar biópsias de pele de hanseníase; Dr. P.RKlatser, do N.H. Swellengrebel Laboratório de HigieneTropical, Instituto Tropical Real, Amsterdã porprovidenciar os M. leprae sonicados e Sr. J. v.d. Stek, doHospital de Dijkzigt Rotterdam, por preparar as figuras.Este estudo foi apoiado financeiramente pela NetherlandsLeprosy Relief Association, Bethesda Foundation e QMGastmann Wichers Stichting.

Hansen. Int., 28(1): 19-30, 2003 29

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