Desafios e perspectivas no diagnóstico laboaratorial das rickettsioses
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Desafios e Perspectivas no Diagnóstico Laboratorial das
Rickettsioses
Laboratório de Referência Nacional para Rickettsioses Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses
Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ
Daniela Tupy de Godoy, DSc, MV.
Campinas, 11 de outubro de 2013
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Febre Maculosa Brasileira
1) Doença curável
Evolução terapêutica com excelente resposta tratamento, com a introdução da tetraciclina e posteriormente doxiciclina (considerada droga de 1a escolha)
2) Elevada letalidade
DesconhecimentoRetardo tratamentoDiagnóstico de Exclusão
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Febre Maculosa Brasileira
3) História epidemiológica
Contato com carrapatos
4) Sempre considerar:
Em caso de febre, cefaléia, mesmo sem exantema, desde que existam dados clínico-epidemiológicos compatíveis
5) Outras rickettsioses “sensu lato”
Bartoneloses, febre Q, ehrlichioses, rickettsioses do grupo do tifo e outras rickettsias.
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Desafios
1. Diagnóstico diferencial com dengue, leptospiroses, malária, entre outras doenças;
2. Falta de atenção e/ou inadequada utilização dos testes diagnósticos
3. Qualidade das amostras recebidas
4. Pacientes negros
5. Caracterização molecular (escassez)
6. Ecotourismo
7. Novos “agentes”
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Desafios
1. Diagnóstico diferencial com dengue, leptospiroses, malária, entre outras doenças;
2. Falta de atenção e/ou inadequada utilização dos testes diagnósticos
3. Qualidade das amostras recebidas
4. Pacientes negros
5. Caracterização molecular (escassez)
6. Ecotourismo
7. Novos “agentes”
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Diagnóstico Laboratorial Específico
Isolamento Técnica suspensa – necessidade de laboratório NB3
Testes sorológicos Detecção de anticorpos Diagnóstico retrospectivo - fase aguda sem anticorpo detectável Gênero específico
Histopatológico associado à imunohistoquímica
Testes moleculares PCR convencional, nested, touchdown PCR em tempo real
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Testes sorológicos
Padrão Ouro!!
Diagnóstico retrospectivo
• Amostras pareadas
• P - 1:64
• Aumento de 4x nos títulos de Ig
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR convencional
Alvos:
gltA – citrate synthase
ompA – outer membrane protein A
ompB – outer membrane protein B
17kDa – rickettsial genus–specific 17-kDa antigen gene
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR convencional
Alvos:
gltA – citrate synthase
ompA – outer membrane protein A
ompB – outer membrane protein B
17kDa – rickettsial genus–specific 17-kDa antigen gene
100% Sensibilidade
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Surto Itaipava – RJ2005
Laboratório A B C D E
Paciente F, 36 M, 41 M, 58 M, 61 F, 38
Leucócitos 5.700 SD 3.400 15.400 1.600
Plaquetas 66.000 36.000 20.000 98.000 32.000
RX tórax SD IIB IIB IIB IIB
Amostra 1 N (15/10) N (20/10) N (26/10) N (27/10) N (31/10)
Amostra 2 P (3/11) P (31/11) SD P N*
PCR Amostra esgotada
Amostra esgotada
P P P
Óbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostra
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Imunohistoquímica
Caso fatal de FMB
Mulher, 37 anos
Biópsia de pele e espécimes da autópsia.
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR convencional
Gênero Ehrlichia/Anaplasma
rrs (16S rRNA) e groESL (heat shock operon)
Gênero Bartonella
16S rRNA, região intergênica 16S -23S rRNA (ITS), gltA, riboflavina sintase (ribC), groEL, FtsZ, subunidade beta da RNA polimerase (rpoB). Nested – proteína 31-kDa (Pap31)
Coxiella burnetii
IS1111 transposase (também conhecido como htpAB)
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Multiplex PCR
Rickettsia sp + Ehrlichia sp + Anaplasma sp
Vigilância epidemiológica:
• Co-infecção
• Seres – humanos
• Animais
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR em Tempo Real
Kato et al., 2013
Febre Maculosa Brasileira
Rickettsia spPanR8_FPanR8_RPanR8_P
Rickettsia rickettsiiRRi6_FRRi6_RRRi6_P
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR em Tempo Real
Kato et al., 2013
Febre Maculosa Brasileira
Rickettsia spPanR8_FPanR8_RPanR8_P
Rickettsia rickettsiiRRi6_FRRi6_RRRi6_P
Sequenciamento
R. conorii conoriiR. parkeriR. felis
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR em Tempo Real
Kato et al., 2013
Febre Maculosa Brasileira
Rickettsia spPanR8_FPanR8_RPanR8_P
Rickettsia rickettsiiRRi6_FRRi6_RRRi6_P
Sequenciamento
R. conorii conoriiR. parkeriR. felis
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR em Tempo Real
Schneeberger et al., 2010/ Buss et al., 2012/ Diaz et al., 2012
Gênero Bartonella
Alvo gltABartGltAF
BartGltAR1/BartGltAR2 BartGltaP
Alvo ssrAssrA-F ssrA-RssrA-P
Coxiella burnetii
Cox_FCox_RCoxbur
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
PCR em Tempo Real
Plataforma de Desenvolvimento de Tecnologia e Insumos para Saúde – PDTIS
Fundação Oswaldo Cruz
Point of Care
➟ “Lab on a chip” - miniaturização.
- microfluídica.
Análise patentária
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Aptâmeros
Aptâmeros são pequenos oligonucleotídeos de cadeia simples (tipicamente 15 - 50 bases) que assumem conformações estáveis “in vivo” e se ligam fortemente aos alvos específicos de proteína ou não proteína.
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Aptâmeros
Tem sido demonstrado que aptâmeros possuem afinidade e especificidade de forma superior para o alvo pretendido do que outros ligantes.
Geralmente os aptâmeros proporcionam uma maior sensibilidade em reconhecer os seus alvos de proteína, oferecendo assim, potencial para a concepção de ensaios diagnósticos específicos mais sensíveis, capazes de proporcionar diagnóstico precoce
2013 – Projeto aprovado
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13
Obrigada
Dra Elba R S Lemos
[email protected] do Laboratório
Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses
Dra Daniela Tupy de Godoy
[email protected] Visitante
Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses
Quarta-feira, 16 de Outubro de 13