Declaração de Conflitos de Interesse -...

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA LABORATÓRIO DE VIROLOGIA -- LIM 52LIM 52

Declaração de Conflitos de Interesse

• Nada a declarar.


Sala 2 Sala 2 -- Mesa redondaMesa redondaA biologia viral na indução A biologia viral na indução

do câncer por HPVdo câncer por HPV

Diagnóstico laboratorial e Diagnóstico laboratorial e monitorização monitorização dos pacientes com HPV dos pacientes com HPV -- José Eduardo Levi (SP) José Eduardo Levi (SP)


HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO POR HPVHISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO POR HPV

ALTERAÇÕES TRANSIENTESALTERAÇÕES TRANSIENTES

RESOLUÇÃORESOLUÇÃO

HPVHPVPERSISTÊNCIAPERSISTÊNCIA

LIE DE BAIXO GRAULIE DE BAIXO GRAU

INÍCIO DAINÍCIO DAATIV. SEXUALATIV. SEXUAL

LIE DE ALTO GRAULIE DE ALTO GRAU

C.A. “IN SITU”C.A. “IN SITU”

C.A.. INVASIVOC.A.. INVASIVO


FATORES INFLUENCIANDO A PROGRESSÃO DE LIE

1. TIPO DE HPV1. TIPO DE HPV

ONCOGÊNICOS X NÃO-ONCOGÊNICOS

2. PERSISTÊNCIA

3. CARGA VIRAL

4. FATORES AMBIENTAIS/COMPORTAMENTAIS DO HOSPEDEIROIMUNOSUPRESSÃO, CIGARRO, ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS

5. FATORES GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO

6. CO-INFECÇÕESCHLAMYDIA, TRICHOMONAS, HERPES


1. TIPO DE HPV1. TIPO DE HPV

ONCOGÊNICOS X NÃO-ONCOGÊNICOS


2. PERSISTÊNCIA

JAMA,2001;286:3106JAMA,2001;286:3106--31143114


2. PERSISTÊNCIA

Type-Specific Persistence of Human Papillomavirus DNAbefore the Development of Invasive Cervical Cancer. NEJM NEJM 1999;341:16331999;341:1633--8.8. Wallin, Keng-Ling; Wiklund, Fredrik; Angstrom, Tord;Bergman, Frank; Stendahl, Ulf; Wadell, Goran; Hallmans, Goran; Dillner,Joakim.


2. PERSISTÊNCIA

Estes trabalhos demonstraram que o aparecimentoEstes trabalhos demonstraram que o aparecimentodas lesões é precedido de infecção persistente por um tipo de HPdas lesões é precedido de infecção persistente por um tipo de HPVV

A A negativação negativação do HPVdo HPV--DNA indica DNA indica clareamento clareamento da lesãoda lesão

Os tipos Os tipos oncogênicos oncogênicos tem uma tendência muito maior de persistirtem uma tendência muito maior de persistirque os nãoque os não--oncogênicosoncogênicos


3. CARGA VIRAL

A carga de HPVA carga de HPV--16 aumenta de acordo com o grau de neoplasia16 aumenta de acordo com o grau de neoplasiamas a de HPVmas a de HPV--18 não!!??18 não!!??


3. CARGA VIRAL

Quanto maior a carga de HPV-16 maior o OR para CIS mas HPV-18 e HPV-31 não seguem esta regra!!??


VANTAGENSVANTAGENS DO USO DO PCR SOBRE DO USO DO PCR SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES

NO DIAGNÓSTICO DE HPVNO DIAGNÓSTICO DE HPV1.1. SENSIBILIDADESENSIBILIDADEPCR É A TÉCNICA DE MAIOR SENSIBILIDADE NA PCR É A TÉCNICA DE MAIOR SENSIBILIDADE NA DETECÇÃO DE DNA DE HPV .MAIOR VALOR PREDITIVO NEG.DETECÇÃO DE DNA DE HPV .MAIOR VALOR PREDITIVO NEG.

2.2. TIPAGEMTIPAGEMA PCR permite o conhecimento do tipo específico de HPV, seja A PCR permite o conhecimento do tipo específico de HPV, seja através de PCR tipoatravés de PCR tipo--específico, genérico + RFLP, hibridização específico, genérico + RFLP, hibridização reversa ou reversa ou sequenciamentosequenciamento..

3.3. VERSATILIDADE QUANTO AO TIPO DE VERSATILIDADE QUANTO AO TIPO DE AMOSTRA BIOLÓGICAAMOSTRA BIOLÓGICAPodePode--se trabalhar com células esfoliadas de mucosa, biópsias, materiase trabalhar com células esfoliadas de mucosa, biópsias, materiallparafinado, esfregaços corados, sangue, etc. parafinado, esfregaços corados, sangue, etc.


DESVANTAGENSDESVANTAGENS DO USO DO PCR DO USO DO PCR SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES

NO DIAGNÓSTICO DE HPVNO DIAGNÓSTICO DE HPV1.1. SENSIBILIDADESENSIBILIDADEPOUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA. A GRANDE MAIORIA DASPOUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA. A GRANDE MAIORIA DASMUHERES PCR+ SÃO ASSINTOMÁTICAS E IRÃO CLAREAR AMUHERES PCR+ SÃO ASSINTOMÁTICAS E IRÃO CLAREAR AINFECÇÃO NOS PRÓXIMOS MESES. BAIXO VALOR PREDITIVOINFECÇÃO NOS PRÓXIMOS MESES. BAIXO VALOR PREDITIVOPOSITIVO. POSITIVO. CONTAMINAÇÃO!CONTAMINAÇÃO!2.2. REPRODUTIBILIDADE E CONTROLE DE QUALIDADEREPRODUTIBILIDADE E CONTROLE DE QUALIDADESistemas de PCR “inSistemas de PCR “in--househouse” tem menor padronização levando” tem menor padronização levandoa variação intera variação inter--laboratorial. O controle de qualidade dos reagentes élaboratorial. O controle de qualidade dos reagentes émais complicado e menos rigoroso. mais complicado e menos rigoroso. 3. EXECUÇÃO3. EXECUÇÃOMais complexa e com mais etapas que CH, demanda maior Mais complexa e com mais etapas que CH, demanda maior capacitação laboratorial (equipamentos).capacitação laboratorial (equipamentos).


PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU”



Aprox. 8000pb

E5E2

E4

E1

E7

E6

L1

L2

URR

Aprox. 8000pb

E5E2

E4

E1

E7

E6

L1

L2

URR



PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs.TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

268 pbda ß-globina humana

450 pbdo gene L1dos HPVs



PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs.TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

HPV 16HPV 16 HPV 58HPV 58



LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test37 genótipos. ROCHE “RUO”



PCR TIPOPCR TIPO--ESPECÍFICO ESPECÍFICO –– EMPREGA PRIMERS QUE AMPLIFICAMEMPREGA PRIMERS QUE AMPLIFICAMAPENAS UM TIPO DE HPV, UTILIZANDO COMO ALVO APENAS UM TIPO DE HPV, UTILIZANDO COMO ALVO UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA, EM GERAL DOS UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA, EM GERAL DOS GENES E6 E/OU E7GENES E6 E/OU E7

ESTE SISTEMA DE PCR TEM MAIOR SENSIBILIDADE QUE OESTE SISTEMA DE PCR TEM MAIOR SENSIBILIDADE QUE OGENÉRICO, E É O IDEAL QUANDO SE QUER INVESTIGARGENÉRICO, E É O IDEAL QUANDO SE QUER INVESTIGARAPENAS 1 TIPO DE HPV.APENAS 1 TIPO DE HPV.



PCR TEMPOPCR TEMPO--REAL : EMPREGADO QUANDO SE QUERREAL : EMPREGADO QUANDO SE QUERDETERMINAR A DETERMINAR A CARGA VIRALCARGA VIRAL (QUANTIFICAÇÃO).(QUANTIFICAÇÃO).

SABESABE--SE QUE QUANTO MAIOR A CARGA VIRAL MAIOR É SE QUE QUANTO MAIOR A CARGA VIRAL MAIOR É O RISCO DE LESÃO FUTURA >NIC2 E DA PRESENÇA DE O RISCO DE LESÃO FUTURA >NIC2 E DA PRESENÇA DE LESÃO NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO.LESÃO NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO.


LABORATÓRIO DE VIROLOGIA --

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6

Concentration log 10

Th

resh

old

Cycl

e

0.5

1.5

2.5

0 10 20 30 40 50 60 70

Ce

F2

/F1

Test Sample

Threshold

Threshold Cycle

Threshold Cycle = 35Load = 103.8 copies/ml


Teste em Microarray

PapilloCheck®

Teste em Microarray

PapilloCheck®


Teste em Microarray PapilloCheck®

3,8 mm

Canal Verde (532 nm) Canal vermelho (635 nm)

orientation control

hybridization control

printing -controlprinting -control

PCR-control

sample -control

HPV-type specific probes



RTRT--PCR (REVERSEPCR (REVERSE--TRANSCRIPTION PCR)TRANSCRIPTION PCR)

O ALVO É UMA MOLÉCULA DE O ALVO É UMA MOLÉCULA DE mRNAmRNA, CUJA DETECÇÃO, CUJA DETECÇÃOIMPLICA NA EXPRESSÃO DE DETERMINADO GENE.IMPLICA NA EXPRESSÃO DE DETERMINADO GENE.NECESSITA DE UMA ETAPA PRÉVIA AO PCR, DE NECESSITA DE UMA ETAPA PRÉVIA AO PCR, DE TRANSCRIÇÃO REVERSA, SÍNTESE DE TRANSCRIÇÃO REVERSA, SÍNTESE DE cDNAcDNAPODE SER REALIZADA SIMULTANEAMENTE POR PODE SER REALIZADA SIMULTANEAMENTE POR ENZIMA BIENZIMA BI--FUNCIONAL (FUNCIONAL (TthTth))TERIA MAIOR CORRELAÇÃO COM LESÕES E DOENÇATERIA MAIOR CORRELAÇÃO COM LESÕES E DOENÇA

PreTect PreTect HPV HPV Proofer Proofer (NORCHIP AS, (NORCHIP AS, KlokkarstuaKlokkarstua, Noruega), Noruega)


Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests

NOYESMinimum of false negativeresults (related to cervical cancer) (1)

YESNODistresses a high number of women unnecessary (3,4)

YESNOIdentifies all sexually activewomen as positive once ormore during their lifetime (5)

YESNODetects a very commoninfection (1,5)

NOYESIdentifies the primary cause of cervical cancer (E6/E7 onco-proteins) (5,6)

DNA-testsPreTectHPV-Proofer

Statement (ref. no.)



YESYESHigh Positive Predictive Value(4,8)

NOYESMinimum of false positive results (related to healthywomen) (1, 6)

DNA-testsPreTectHPV-Proofer

Statement (ref. no.)



1. Lie AK et. al. (2005) DNA VERSUS RNA BASED METHODS FOR HUMAN PAPILLOMAVIRUS DETECTION IN CERVICAL NEOPLASIA. Gynecologic Oncology, Volume 97, Issue 3 , June 2005, Pages 908-915

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liquid based cytology medium. J Virol Methods. 2005 Mar;124(1-2):211-58. Hovland S, Lie AK, Risberg B, Ryd W, Borge B, Berle E, Skomedal H, Kadima T, Batumbola L, Kyembwa ML, Bilayi E,

Mukwege D, Chirimwami B, Kashongwe JP, Mvula M, Falang BM, and Karlsen F: Calculations from a High Risk Populationstudy.


DR. JOSÉ EDUARDO LEVIINSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOLABORATÓRIO DE VIROLOGIA

E-MAIL: [email protected]

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