CROMATOGRAFIA

5/12/2018 CROMATOGRAFIA - slidepdf.com

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CROMATOGRAFIA

Marilena Meira



1. HistóricoEm 1903, o botânico russoMikhail Tswett conseguiu separarpigmentos vegetais passando,através de uma coluna contendo

CaCO3, uma solução depigmentos dissolvidos em umhidrocarboneto.

Obteve um registro colorido doprocesso de separaçãocromatos: cor ; grafia: registro =CROMATOGRAFIA.



2. Definição de Cromatografia:

• Fase móvel: solvente (gás ou líquido)

Método físico-químico de separação baseado namigração diferencial dos componentes de uma

mistura devido a diferentes graus de interaçãoentre duas fases imiscíveis, uma móvel e outra fixa.

que se move através do sistema(coluna ou placa), carregando ossolutos.

• Fase Estacionária: sólido (ou líquidoimpregnado em um sólido) quepermanece fixo no sistema (coluna ouplaca).



3. CLASSIFICAÇÃO1. PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO:• CROMATOGRAFIA PLANAR• CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2. PELA FASE MÓVEL EMPREGADA:• LÍQUIDA• GASOSA• SUPERCRÍTICA

3. PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA:• SÓLIDA• LÍQUIDA• QUIMICAMENTE LIGADA

4. PELO MODO DE SEPARAÇÃO:• ADSORÇÃO• PARTIÇÃO• TROCA IÔNICA

• EXCLUSÃO



CROMATOGRAFIA

COLUNAPLANARTÉCNICA

LÍQUIDA GASOSAFASEMÓVEL LÍQUIDA

FASEESTACIONÁRIA LÍQUIDA LÍQUIDALÍQUIDASÓLIDA SÓLIDA SÓLIDA

CGLCP CCD CLL CLS; CE CGS



4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDO-

LÍQUIDO (CLL)2. CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE)

4. CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO OULÍQUIDO-SÓLIDO (CLS)

CL

CTI CE

CLL CLS



4.1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU

LÍQUIDO-LÍQUIDO (CLL)• A separação é baseada nos

diferentes coeficientes de

partição (solubilidade) doscomponentes da misturaentre dois solventes

m sc ve s, um xo aseestacionária) imobilizadona superfície de umsuporte sólido e o outro

móvel.

FASE MÓVEL F. ESTACIONÁRIA



EXEMPLO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-

LÍQUIDO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP)• A celulose do papel forma pontes

de hidrogênio com a água, que fica

retida formando a fase estacionária.• A separação da mistura é baseadanas diferentes solubilidades

re a vas os componen es na asemóvel e estacionária.• A fase móvel sobe por ação capilar.

• Os componentes mais solúveis nafase estacionária serãoseletivamente retidos, tendo umamovimentação mais lenta.



FATOR DE RETENÇÃO (Rf)

Distância percorrida pela fase móvelRf = Distância percorrida pela substância

= sdm

ds2

dmds1



SUBSTÂNCIAS SEPARADAS PORCROMATOGRAFIA EM PAPEL

• COMPOSTOS HIDRÓFILOS(HIDROSSOLÚVEIS) COMO ÁCIDOSORGÂNICOS E ÍONS METÁLICOS.



4.2.CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• A fase estacionária éconstituída por uma

matriz com gruposfuncionais ionizáveis.

• Trocadores catiônicos ,

+

-

+

Trocador catiônico

negativamenteadsorvendo cátions.

• Trocadores aniônicos têm

sítios ativos carregadospositivamenteadsorvendo ânions.

+

-

-

Trocador aniônico



TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS NA

CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• Derivados sulfônicos de copolímeros do estireno e

divinilbenzeno. Fortemente catiônica.• Amina quaternária de copolímeros do estireno e

divinilbenzeno. Fortemente aniônica. • es nas com o grupo c o car ox co. racamen e

catiônicas.• Resina com o grupo funcional amina primária.

Fracamente aniônicas.• Derivada da celulose: por tratamento químico, em

geral sulfonação.• Sílica-gel impregnada com trocadores iônicos

líquidos (ex: triisoctilamina)



TROCADOR CATIÔNICO: ESTIRENO-

DIVINILBENZENO SULFONADO.CH

SO3-H+

CH2

CH

CH

CH2

CH2

CHCH2

CH CH2

CH2

CH

SO3-H+

CH2

CH

C

H2

CH

CH

CH C

H2

CH C

H2

CH

SO3-H+

SO3-H+

SO3-H+

C

H2

CH



TROCADOR ANIÔNICO: AMINA TERCIÁRIA

ESTIRENO-DIVINILBENZENO.CH

CH2NR

3+OH-

CH2

CH

CH

CH2

CH

CHCH2

CH CH

CH2

CH

CH2NR

3+OH-

CH2

CH

C

H2

CH

CH

CH C

H2

CH C

H2

CH

CH2NR

3+OH-

CH2NR

3+OH-

CH2NR

3+OH-

C

H2

CH



TIPOS DE FASES MÓVEIS NA

CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• Soluções tampões (pH 3,0 – 8,0):Tampão de Fosfato de pH = 8,0.Tampão de Fosfato de sódio de pH =

• Soluções de sal: 0,1 – 0,2 M de LiCl ouNaCl.

• Água destilada.• Qualquer solvente orgânico.



4.3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):

Cromatografia de permeação ou filtração por gel

• Baseia-se em um processo puramente

mecânico. A fase estacionária é uma matriz decomposição inerte, com partículas de forma,tamanho e porosidade uniformes.

• As moléculas menores são capazes depenetrar em todos os poros da faseestacionária, ficando mais tempo retidas,enquanto as maiores são excluídas de todosos poros, passando entre os grânulos,arrastadas pela fase móvel.



CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):

A fase estacionária mais usada é um gel dedextrano (um polissacarídeo com unidades deglicose), conhecido comercialmente comoSephadex.



4.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO:

CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO

• Baseia-se na adsorção seletiva doscomponentes da mistura pela faseestacionária por ação de forças eletrostáticas

componentes têm na fase móvel.

• São exemplos: Cromatografia em coluna

(CC) e Cromatografia em camada delgadacomparativa e preparativa (CCDC e CCDP).



Adsorção e Absorção

• Absorção: penetração de um material na

massa de outro por ação molecular ouquímica. A substância absorvida infiltra-se

na substância ue a absorve.

• Adsorção: adesão das moléculas de ummaterial sobre a superfície de um sólido ou

líquido em que estas estão em contato.

Quanto maior a superfície do adsorventesmais forte a adsorção.



Escolha do adsorvente e eluente naCromatografia por Adsorção

• Pontos a considerar:1. Características da amostra2. O Adsorvente ou fase estacionária

3. O eluente ou fase móvel



Características da amostra:

1. Acidez, basicidade, caráter iônico, solubilidade,reatividade com o adsorvente e solventes,

2. Constituição química:• ligações duplas, particularmente conjugadas

aumentam adsorção. • ompos os com pon es e n ramo ecu ares

são menos adsorvidos que seus isômeros.• Grupos funcionais aumentam afinidade de

adsorção. Este efeito decresce na ordem: -

COOH, -CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, -OCOCH3, -COCH3, -NO2, -OCH3, -H, -Cl.



Pontes de hidrogênio intramoleculares fazem com que

o composto seja menos adsorvido que seu isômero:

OHH

O

OH

O

COOH1 2

1 2

Com a formação das pontes de Hintramoleculares, menos moléculas docomposto orto (1), relativamente ao para(2) , estarão formando pontes de H com asílica, daí maior rapidez na eluição.



Escolha do Adsorvente

COMPOSTOS ADSORVENTES

LIPOFÍLICOS ÓXIDO DE ALUMÍNIOSÍLICA-GEL

HIDROFÍLICOSCELULOSECELULOSE COMTROCADORES DE ÍONS

KIESELGURPOLIAMIDA



Principais adsorventes

• Sílica-gel: Separa bem aldeídos, cetonas,alcalóides, açúcares, fenóis, esteróides,

terpenóides, ácidos graxos e aminoácidos.• Alumina ou óxido de alumínio: Útil naseparação de hidrocarbonetos policíclicos,

alcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis ealgumas cetonas. Inadequado paraflavonóides e cetonas insaturadas.

• Kieselgur (Terras diatomáceas ou diatomita). Ácido silícico de origem fóssil. É utilizadocomo suporte nas separações por partição.



Principais adsorventes

• Óxido de magnésio: Usado para

compostos aromáticos e substânciascom várias ligações duplas conjugadas(Ex: carotenóides).

• Celulose e celulose modificada: Paracompostos hidrofílicos (aminoácidos,ácidos nucléicos, açúcares, glicosídeos.

• Poliamida: Separa flavonóides, fenóis,nitroanilinas, benzofenonas e derivadosde aminoácidos.



Escolha da Fase móvel

• Sua escolha depende do adsorventeutilizado, sua atividade e da classe decompostos da amostra.

• Misturas equieluotrópicas: Misturas desolventes distintas que originam iguaisdeslocamentos de uma mesma

amostra.



Ordem crescente da capacidade eluotrópica do

solvente• Éter de petróleo• Hexano• Tetracloreto de carbono

• Dissulfeto de carbono• Benzeno• Diclorometano•

• Éter dietílico• Acetato de etila• Éter dipropílico• Propanol

• MeOH• Piridina• Água• Ácido Orgânico diluído

• Fenol



4.4.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA

DELGADA (CCD)

Aplicações:

1. Para determinar o número de componentes deuma mistura.2. Para determinar a identidade de duas

.

3. Para monitorar o progresso de uma reação4. Para determinar a eficiência de uma

purificação.

5. Para determinar o melhor sistema de solventepara uma separação em coluna cromatográfica.6. Para monitorar uma coluna cromatográfica.



CCD

UV 254 nm: detecta compostos aromáticos, compostos comduplas conjugadas e alguns compostos insaturados.



REVELADORES EM CCD

Triterpenos e esteróides Reagente de Liebermann-Burchard

Flavonóides Solução de cloreto de alumínio

CLASSE REVELADOR

Alcalóides Reagente de Dragendorff

Vapores de iodoCompostos insaturados



DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA DE

SOLVENTES PARA SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA.

• Deve-se fazer uma série de placas porCCD em sistemas de diferentespolaridades com a mistura a ser

separa a.• O melhor sistema é aquele que dê umvalor de Rf na faixa de 0,25-0,35 para o

componente mais rápido na placa.



CALCULANDO O Rf



solvente 1 solvente 2 solvente3 solvente 4 solvente 5 solvente6 solvente 7

solvente 3.95 3.9 4.0 4.1 4.0 4.0 4.05

Maislento(álcool)

0.6 0.35 0.35 0.25 0.1 0.1 0.1

Mais

rápido(cetona)

1.45 1.0 1.0 0.8 0.65 0.6 0.45

Rf álcool 0.15 0.09 0.088 0.061 0.025 0.025 0.025

Rf cetona 0.37 0.26 0.25 0.20 0.16 0.15 0.11

O Rf do componente mais rápido deve estar na faixa de 0.25-0.35. Os solventes1, 2 e 3 estão nesta faixa. Para uma melhor resolução a diferença de Rf de cadacomponente deve ser no mínimo 0,1:

solvente 1: Rf cetone - Rf álcool = 0.37 - 0.15 = 0.22solvente 2: Rf cetone - Rf álcool = 0.26 - 0.09 = 0.17solvente 3: Rf cetone - Rf álcool = 0.25 - 0.088 = 0.16

Os sistemas 1, 2 e 3 dão diferença de Rf superior a 0,1. Escolhe-se o sistema 3 porser o menos polar.



CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)



CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Pré-eluição

Empacotamento Carregamento



ELUIÇÃO: EXEMPLO DE MONITORAÇÃO

POR CCD

• A amostra foi eluída

com o sistema desolventesr vi m n

escolhido por CCD.Recolheu-se 6frações que foram

testadas por CCD.Eluição



CCD DAS SEIS PRIMEIRA FRAÇÕES

•Frações 1 e 2 não têm nenhum componente.•Nas Frações 3, 4 e 5 saiu o primeiro componente, deve-sejuntar estas frações.•Pode-se agora aumentar a polaridade do sistema desolvente para sair o segundo componente.



CCD DAS FRAÇÕES 7 a 12

Nas frações 7, 8 e 9 saiu o segundo componenteNas frações 10 a 12 não saiu mais nadaPode-se encerrar a coluna e juntar 7, 8 e 9.



BIBLIOGRAFIA

• COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Bonato, Pierina S. -Introdução a Métodos Cromatográficos . 7ª ed. Editora da

Unicamp. 1997.• Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia , um

breve ensaio. Química Nova na Escola, 07, 21-25, 1988.

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