Clulas somticas no leite

Jos Renaldi Feitosa Brito Pesquisador - Embrapa Gado de Leite/CNPq

Rua Eugnio do Nascimento, 610, Dom Bosco, 36038-330 Juiz de Fora, MG

1. Introduo

Nos anos recentes, vem aumentando a demanda pelos consumidores por produtos lcteos de alta qualidade. Essa demanda sentida pela indstria que, por sua vez, necessita de matria prima (leite cru) de qualidade. Tal demanda, juntamente com a presso do mercado internacional por alimentos com reconhecida qualidade e segurana do ponto-de-vista da sade pblica, so os principais fatores que direcionam o uso disseminado da contagem de clulas somticas (CCS) no leite. Atualmente, todos os pases que possuem uma indstria leiteira desenvolvida usam a CCS como medida da qualidade do leite. A CCS no leite um sinal de inflamao da glndula mamria da vaca e a maior parte dos pesquisadores e especialistas concordam que a causa primria dessa inflamao so as infeces causadas por bactrias. Dessa forma, a manuteno da sade da glndula mamria das vacas a melhor garantia para a produo de leite de qualidade. Consequentemente, a CCS tem sido usada como indicadora do status de qualidade do leite em todos os nveis: vacas, rebanhos, cooperativas, regies e pases.

A principal razo com a preocupao em manter baixos os nveis de CCS nos rebanhos econmica. H uma perda crescente de produo de leite medida que aumenta a CCS do leite total do rebanho (Tabela 1). Outras razes para a necessidade de reduo da CCS nos rebanhos so: a interferncia direta de altas CCS com a composio qumica do leite e a relao entre altas CCS e as taxas de infeco dos quartos mamrios.

2. Definio, origem e funo das clulas somticas no leite

As clulas somticas (do grego somatiks, que significa referente ao corpo) encontradas no leite tm esse nome porque se originam do corpo da vaca. Elas so constitudas principalmente pelos leuccitos (ou clulas brancas do sangue), cuja funo a defesa do organismo. Os leuccitos so constitudos por vrios tipos de clulas. Os encontrados no leite da glndula mamria sadia so (aproximadamente): macrfagos (60%), neutrfilos (15%) e linfcitos (25%). Alm dos leuccitos, as clulas epiteliais podem estar presentes em pequeno nmero (1 a 2%), embora alguns autores tenham registrado percentuais de 10 e at 20% destas clulas no leite normal. A maioria dos leuccitos atrada do sangue para a glndula mamria, em resposta a uma agresso fsica, qumica ou infecciosa (principalmente de origem bacteriana) sofrida pela glndula mamria. O processo inflamatrio resultante dessa agresso atrai os leuccitos e quando a agresso muito intensa, os mecanismos de defesa do animal so requeridos a agir com maior intensidade, o que resulta no aumento exagerado de clulas e de outras substncias que so tambm transferidas do sangue para o interior da glndula mamria e, por extenso, para o leite.

O leite da glndula mamria sadia da vaca tem entre 20.000 (ou menos) e 50.000 clulas/mL, mas considera-se como um valor limite para a definio de normal contagens de at 100.000 clulas/mL (com base em estudos onde foram consideradas a mdia de 20.000

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clulas e dois desvios padro). Considera-se que vacas com CCS menor que 200.000/mL tm maior probabilidade de no estarem infectadas com os chamados patgenos principais da mastite, enquanto vacas com CCS acima de 300.000 tm maior probabilidade de estarem infectadas. Dependendo do estudo, o limite usado como indicativo de inflamao ou mastite tem sido estipulado como 200.000/mL, 250.000/mL ou 283.000/mL. A contagem de clulas de 250.000/mL tem sido recomendada como valor limiar para indicar a presena ou ausncia de inflamao ou mastite. Deve-se registrar, entretanto, que um pequeno percentual de vacas comprovadamente infectadas com os patgenos principais pode apresentar contagens celulares de menos de 250.000/mL, enquanto que algumas vacas infectadas com os chamados patgenos secundrios, como os estafilococos coagulase negativos, podem ter CCS acima de 250.000/mL. Os microrganismos classificados como patgenos principais (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, outros estreptococos e coliformes) causam, em mdia, aumentos da CCS alm de 1.000.000/mL, enquanto os patgenos secundrios (Corynebacterium bovis e estafilococos coagulase negativos) so responsveis, em mdia, por contagens de 370.000/mL.

importante, ainda considerar que o nmero de clulas no leite no esttico, mas parte de um processo dinmico, independente do status infeccioso da glndula mamria (Harmon 1994). Dessa forma, considerando-se a natureza dinmica da CCS na glndula mamria, a interpretao de dados baseada em uma nica amostra arriscada porque pode levar a falhas no diagnstico ou na interpretao dos resultados laboratoriais.

3. Fatores que influenciam a contagem de clulas somticas

Alm do papel preponderante dos patgenos da glndula mamria na elevao da CCS, deve-se considerar a influncia de outros fatores, entre eles, a extenso e a durao da infeco, a prvia exposio da vaca aos patgenos, a individualidade da resposta imunolgica de cada animal, etc. Observa-se, ainda, variao entre os microrganismos do mesmo grupo. Os estafilococos coagulase negativos, por exemplo, podem induzir uma resposta celular mais alta que os demais patgenos secundrios.

A CCS alta imediatamente aps o parto, mas em vacas sadias o nmero de clulas vai sendo reduzido medida que decresce a quantidade de colostro no leite, chegando a menos de 200.000/mL dentro de quatro a cinco dias aps o parto. Na segunda semana, a CCS reduzida para menos de 100.000/mL.

Em vacas de alta produo, a CCS aumenta ligeiramente quando a produo de leite cai para menos de 4 kg/dia. Considera-se que a CCS do leite de vacas no infectadas maior logo aps o parto, baixa durante a lactao e volta a aumentar no perodo prximo secagem. Essa variao pode ser devida ao fator diluio (nmero de clulas por maior ou menor volume de leite produzido). Entretanto, o aumento observado em quartos mamrios no infectados no significativo a ponto de alterar a interpretao diagnstica (por exemplo, a reao observada no California Mastitis Test [CMT]). J se observou um aumento de 80.000 clulas entre 35 dias e 265 dias de lactao. Aps o parto, a CCS de vacas com mastite subclnica diminui mais lentamente do que a de vacas sadias e o aumento significativo medida que elas chegam ao final da lactao. Nas vacas sadias, ao contrrio, essas diferenas no so to evidentes.

A idade da vaca no afeta a CCS se a glndula mamria livre de infeco. Entretanto, a reao celular contra agentes infecciosos em vacas que tenham tido mastite aumenta com a idade. Muitas vezes, a mastite subclnica e passa despercebida. Dessa forma, comum que as vacas mais velhas apresentem CCS mais alta, mesmo quando o bere aparentemente sadio. Aps uma infeco, a CCS desses animais demora mais tempo a voltar ao normal.

Ocorrem variaes dirias na CCS de vacas individuais, mas essa variao maior em animais infectados e pode ser causada pelas diferenas dos intervalos de ordenha e por

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problemas de diluio do leite. Quando se examinam amostras composta da produo diria, por exemplo, essa variao desaparece. Isso justifica a necessidade de se realizar o exame de amostras representativas do leite total da ordenha diria e de reunir vrios exames do mesmo animal e do mesmo rebanho, em determinado espao de tempo. Recomenda-se, no mnimo, trs exames consecutivos dos rebanhos (a intervalos semanais, quinzenais ou mensais) para se fazer um diagnstico ou para se formular programas (por exemplo, de pagamento por qualidade, de controle da mastite, etc.) que incluam a CCS como parmetro.

A CCS mais alta imediatamente aps a ordenha e se mantm assim por trs a quatro horas. Quando a produo de leite do animal aumenta, a CCS diminui e atinge o mnimo imediatamente antes da ordenha. Essas variaes so menores nos animais sadios que em animais infectados.

Alguns estudos demonstram que CCS pode ser influenciada pela raa do animal. A mdia de CCS no leite de vacas Ayrshire menor que a de vacas da raa Holandesa, sendo essas diferenas evidentes quando se compararam vacas sadias e tambm vacas com infeco subclnica. Considera-se que aproximadamente 10% das diferenas entre a CCS de vacas devida gentica, mas elas no so suficientes para influenciar significativamente o diagnstico de mastite subclnica. Em um estudo realizado com cerca de 290.000 vacas Ayrshire e Holandesa, em que se comparou a relao de CCS entre essas raas e a produo anual de leite, as diferenas entre raas variaram de menos de 50.000 a menos de 100.000 clulas/mL.

Outros estudos mostram que vacas com mastite subclnica quando estressadas (mudana das condies atmosfricas, agitao, estresse trmico) apresentam um aumento significativo da CCS no leite, quando comparadas a vacas sadias submetidas s mesmas condies de estresse.

4. Mtodos de aferio da CCS

Pode-se avaliar a CCS a partir de amostras de leite provenientes de: (a) quartos mamrios individuais, (b) produo total diria do animal e (c) leite total do rebanho.

Em alguns pases essa amostra do leite total analisada separadamente, considerando-se as vacas de primeira cria em um grupo e as demais em outro grupo. Isso porque as primeiras tm CCS mais baixa.

Vrios testes podem ser usados para avaliar a CCS. O mtodo padro adotado internacionalmente e referendado pelo IDF o microscpico, em que esfregaos de leite preparados em lminas so corados e examinados ao microscpio. um mtodo laborioso e cansativo e, por isso, sujeito a erros de contagem, tornando-se inadequado para o exame de grande nmero de amostras. Outro mtodo usado emprega um equipamento eletrnico (Coulter counter) que pode ser calibrado para reconhecer e contar determinados tipos de clulas. Nos ltimos anos ganhou grande aceitao o sistema que usa o princpio da fluorescncia tica (equipamento Fossomatic, fabricado na Dinamarca). Mais recentemente, sistemas que usam como princpio para contagem a citometria de fluxo foram colocados no mercado. Eles so: Somascope (fabricado na Holanda), Somacount (Estados Unidos) e ANADIS (Frana). Esses sistemas foram analisados e considerados apropriados pelo IDF/FIL, (Federao Internacional de Laticnios) (Reichmuth, 1996).

As vantagens e as limitaes, assim como o fundamento dos principais mtodos usados para aferio da CCS no leite so apresentados na Tabela 3. Uma das caractersticas da

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maioria dos equipamentos usados em laboratrio a dificuldade de diferenciarem contagens abaixo de 50.000 clulas. Em um estudo recente em que se compararam quatro equipamentos, o Somacount e o ANADIS diferenciaram melhor as contagens abaixo de 50.000. Um dos mtodos mais simples, prticos e mais usados em todo mundo o CMT, em que cerca de 2 mL de leite misturado com igual volume de soluo de detergente (lauril sulfato de sdio a 3%). Isso suficiente para coagular o DNA das clulas presentes no leite. O teste pode ser feito ao lado do animal, no prprio local da ordenha, usando-se uma raquete com quatro compartimentos. A interpretao mais comum do CMT considera cinco escores: negativo (normal), reao suspeita ou traos (T), reao positiva fraca (+), reao positiva (++) e reao fortemente positiva (+++). Em alguns pases adota-se o critrio numrico, que varia de 1 (negativo) a 5 (fortemente positivo). As reaes 3, 4 e 5 ou +, ++ e +++ indicam maior probabilidade de infeco. Apesar de o CMT ser um teste subjetivo (no conta as clulas, apenas faz uma estimativa), existe uma correlao entre os escores (1 a 5) e a CCS (Tabela 2). importante observar os cuidados na coleta das amostras (para que sejam representativas dos animais ou do leite total do rebanho), o acondicionamento e o transporte para o laboratrio (sob refrigerao, dentro do prazo, em recipientes e com conservantes apropriados, etc.) No laboratrio importante que sejam usadas metodologias padronizadas e que os equipamentos sejam calibrados e revisados periodicamente, com superviso externa. No se deve esquecer que mesmo mtodos e equipamentos altamente sofisticados no podem corrigir os erros cometidos por ocasio da coleta e manuseio das amostras.

5. Aplicaes dos diferentes mtodos de CCS

Os dados individuais do animal so usados para determinar se a vaca ou o quarto mamrio tm mastite ou com a probabilidade de estarem infectados. Tem-se demonstrado que em 80% dos casos, a CCS acima de 250.000/mL relacionada com a presena de infeco. A CCS do leite total do rebanho tem trs usos principais:

a) monitoramento da prevalncia de mastite no rebanho (Tabela 2); b) indicador da qualidade do leite cru e c) indicador das condies higinicas da produo de leite na fazenda.

Alm desses, a CCS tem sido usada em esquemas de pagamento de leite por qualidade e como um padro internacional de monitoramento da produo higinica e de segurana do leite.

6. Emprego da CCS como exigncia de qualidade e sua influncia no comrcio internacional

Na Unio Europia h um limite de 400.000 clulas/mL para o leite total do rebanho poder ser entregue para consumo ou industrializao (a partir de 1998, mesmo o leite destinado produo industrial teve de obedecer a este limite). Nos Estados Unidos, o limite de 750.000 clulas, mas alguns estados estabelecem limites mais rgidos. Em pases como Austrlia, frica do Sul, Japo e Nova Zelndia, as exigncias variam entre 250.000 e 500.000 clulas.

No momento no existem exigncias internacionais para o limite de CCS do leite, mas existem exigncias nacionais (ou, no caso da Comunidade Europia, de vrios pases em conjunto) que podero ou devero influenciar o comrcio internacional. No caso da Comunidade Europia, por exemplo, o limite de 400.000 clulas/mL estabelecido para os produtos lcteos dos pases membros tambm aplicado para os produtos exportados para a Comunidade por outros pases.

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possvel que com o incremento do comrcio internacional de leite e derivados haja necessidade de se estabelecer um padro internacional para CCS. Sabe-se que a mastite no pode ser erradicada dos rebanhos leiteiros, mas a reduo das infeces nos rebanhos um alvo atingvel, e j se dispe de tecnologia para a produo econmica de leite (do rebanho) com CCS abaixo de 400.000 clulas/mL. A relao entre a CCS do leite total do rebanho e o percentual de quartos mamrios infectados apresentada na Tabela 1 justificam essa poltica. De acordo com os dados apresentados, observa-se que mesmo rebanhos que atendem o limite de 400.000 clulas ainda apresentam um percentual elevado de animais infectados. Rebanhos com CCS acima de 400.000/mL tm claramente um srio problema de mastite que resulta em perdas econmicas considerveis para o produtor.

7. Influncia da CCS na qualidade do leite

Verifica-se perda da qualidade do leite quando a contagem de clulas do leite total do rebanho de 400.000/mL. H um aumento indesejvel de alguns componentes do leite (sdio, cloretos, protenas do soro, soroalbumina, lactoferrina, imunoglobulinas) e um decrscimo (indesejvel) de outros componentes (gordura, lactose, casena, clcio, potssio, etc.). Como resultado, a produo de vrios derivados do leite, incluindo queijos, leite em p e produtos fermentados, prejudicada. Alm disso, a estocagem do leite pasteurizado com alta CCS prejudicada porque seu tempo de prateleira menor. A poltica de melhoria da qualidade do leite pela reduo da CCS afeta a todos, desde o produtor de leite (aumento de produo e ao melhor preo do leite, quando h programas de incentivo pela qualidade) at a indstria processadora (melhor rendimento, melhor qualidade e estabilidade dos derivados e maior tempo de prateleira), com reflexos positivos no mercado, pela maior aceitao dos produtos pelo consumidor.

8. Uso dos dados de CCS no gerenciamento dos rebanhos

Os resultados laboratoriais da CCS dos rebanhos e de animais individuais devem ser analisados e as informaes resultantes so teis para orientar o gerenciamento da sade dos rebanhos. Essas informaes podem ser usadas para:

a) monitorar a sade do rebanho, ou, mais apropriadamente, a sade do bere dos animais, tanto quanto a efetividade das medidas de preveno e tratamento das infeces; b) estabelecer polticas de controle da qualidade do leite, em bases objetivas; c) ampliar o conhecimento da epidemiologia (medidas de prevalncia, incidncia, e anlise dos padres da mastite no rebanho no decorrer do tempo) que contribuir para a implementao e acompanhamento de programas de controle das infeces causadas pelos patgenos contagiosos, principais responsveis pelas mastites subclnicas; d) monitorar a eficcia dos esquemas de tratamento da mastite, especialmente a terapia secagem; e) identificar deficincias de manejo e possibilitar a recomendao de procedimentos especficos e efetivos; f) demonstrar a importncia da mastite subclnica e funcionar como um motivador dos programas de controle da mastite e da melhoria da qualidade do leite.

Entretanto, no se deve superestimar o alcance dessas informaes. Os dados de CCS no servem, por exemplo, para:

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a) selecionar animais para tratamento (antibitico) da mastite subclnica durante a lactao. Tem sido demonstrado que o tratamento realizado com base na CCS no traz benefcio econmico ao produtor e as taxas de cura das infeces so muito baixas. b) ser usada como diagnstico da mastite, se usada isoladamente. um mtodo excelente de triagem, que deve ser associado ao exame microbiolgico. c) monitorar as mastites causadas por patgenos do ambiente. A prevalncia da infeco por esses microrganismos tende a ser baixa e rebanhos com predominncia de problemas de mastite ambiental podem ter CCS abaixo de 300.000 clulas/mL. As excees que ocorrem se devem ao aumento da incidncia de mastite clnica, em determinados perodos.

Alm disso, os dados de CCS so teis se usados e analisados em srie (dados mensais e reunidos a intervalos trimestrais ou semestrais, por exemplo). necessrio o resultado de vrios exames, em seqncia, para estimar os nveis de infeco do rebanho e determinar as tendncias de ocorrncia de novas infeces. Isso permitir avaliar a necessidade de implementao de medidas corretivas ou simplesmente acompanhar as medidas recomendadas. Deve-se considerar, tambm, a necessidade de se trabalhar com as mdias das contagens, sendo a mdia geomtrica a mais recomendada.

9. Medidas para reduzir a CCS dos rebanhos

O fundamental a preveno de novas infeces da glndula mamria, principalmente por meio de medidas higinico-sanitrias. Estas incluem: a) medidas gerais: reduo da prevalncia de mastite; ateno ao manejo e instalaes (condies de estabulao, umidade, ventilao, cuidados durante o parto, etc.)

b) intervalo entre as ordenhas: qualidade da cama e do ambiente de circulao dos animais (limpos e secos), ateno aos animais no perodo da secagem (aplicao de antibiticos especficos); c) durante a ordenha: condies de tetas (limpas e secas antes da ordenha); desinfeco de tetas (depois da ordenha, sempre, e antes, em casos especficos); procedimentos adequados antes e durante a ordenha (preveno de estresse, conforto do animal, ordenha rpida e completa); higienizao e manuteno adequada dos equipamentos de ordenha; fornecimento de rao aos animais aps a ordenha (para evitar que se deitem).

10. Bibliografia consultada

Brito, J. F. F.; Caldeira, G. A. V.; Verneque, R. S.; Brito, M. A. V. p. Sensibilidade e especificidade do California Mastitis Test como recurso diagnstico da mastite subclnica em relao contagem de clulas somticas. Pesquisa Veterinria Brasileira, v. 17, p. 49-53, 1997.

Bramley, A. J. et al. Current concepts of bovine mastitis. 4. ed. Madison: National Mastitis Council, 1996. 64 p.

Hamman, J. Somatic cells: factors of influence and practical measures to keep a physiological level. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 9-11.

Harmon, R. J. Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. Journal of Dairy Science, v. 77, p. 2103-2108, 1994.

Heeschen, W. & Reichmuth, J. Mastitis: influence on qualitative and hygienic properties of milk. In: INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, INTERNATIONAL MASTITIS SEMINAR, 3 Tel Aviv, 1995. Proceedings... p. 3.3-3.13.

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Munro, G. L.; Grieve, p. A.; Kitchen, B. J. Effects of mastitis on milk yield, milk composition, processing properties and yield and quality of milk products. The Australian Journal of Dairy Technology, v. 39, p. 7-16, 1984.

Reichmuth, J. New systems for somatic cell counts. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 16-19.

Smith, K. L. Standards for somatic cells in milk: physiological and regulatory. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 7-9.

Tabela 1. Relao entre contagem de clulas somticas (CCS) e percentual de perda de produo de leite.

CCS do leite total do rebanho

Quartos mamrios infectados (%) Decrscimo da produo (%)

200.000 6 0* 500.000 16 6

1.000.000 32 18 1.500.000 48 29

*Perda calculada como um percentual da produo esperada a 200.000 clulas/mL. Fonte: Bramley et al. (1996).

Tabela 2. Contagem de clulas somticas (CCS) de 3.012 amostras de leite, distribudas entre diferentes classes de escores do California Mastitis Test (CMT).

Escore do CMT Interpretao do CMT N de amostras CCS (x1.000/mL) 1 (-) negativo 2.029 80 2 (T) reao suspeita 313 334 3 (+) fracamente positivo 311 670 4 (++) positivo 237 1.354 5 (+++) fortemente positivo 122 4.456

Fonte: Brito et al. (1997).

Tabela 3. Fundamentos, vantagens e limitaes dos testes de contagem de clulas somticas no leite. Teste Fundamento Vantagens e limitaes Contagem microscpica direta As clulas so fixadas e

coradas em lmina de vidro e contadas, usando-se microscpio tico comum.

o teste padro, reconhecido pelo IDF (FIL). laborioso, cansativo (induz a erros de contagens); no apropriado para grande nmero de amostras.

Contador tipo Coulter Usa um contador eletrnico que pode ser calibrado para reconhecer e contar clulas.

Mtodo amplamente usado. Apresenta limitaes para o teste de grande nmero de

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amostras e por no ser informatizado.

tico-fluorescente (equipamento Fossomatic)

Conta clulas que tm intensidade mnima de fluorescncia, devido colorao do DNA nuclico.

Mtodo automtico, barato, de fcil processamento e muito usado na maioria dos pases desenvolvidos. Os vrios modelos se adaptam a diferentes exigncias dos laboratrios. Limitaes: preo do equipamento e manuteno (dependendo da regio).

Citometria de fluxo (equipamentos: Somascope, Somacount e ANADIS)

Usa um sistema tico (laser) para detectar e contar clulas, cujos ncleos so corados com uma substncia qumica (colorao do DNA).

Praticamente as mesmas do equipamento Fossomatic.

Wisconsin Mastitis Test (WMT); Viscosmetro

O leite misturado com um detergente e o DNA das clulas se torna viscoso. Quanto mais clulas, mais DNA e mais viscosidade. A velocidade de passagem da mistura leite+detergente pelo orifcio de um tubo a medida do nmero e clulas.

Mtodo indireto. No apropriado para grande nmero de amostras. No permite automao. No diferencia contagens baixas de clulas.

California Mastitis Test (CMT) uma adaptao do WMT em que o detergente misturado com o leite em uma raquete e o grau de formao do gel (viscosidade) estimado visualmente.

prtico, barato e pode ser aplicado ao lado do animal, com resultado imediato. A interpretao subjetiva e pode variar entre pessoas. Permite estimar o nmero de clulas, geralmente em cinco categorias, com enorme variao entre categorias.

Fonte: diversos autores.

Literatura

Esses textos, infelizmente, no esto publicados, mas abaixo envio algumas referncias de livros e artigos sobre o assunto e o endereo de um site (do National Mastitis Council. dos Estados Unidos) onde voc pode ampliar sua pesquisa.

1. Existe um livro (The bovine udder and mastitis), editado por Markus Sandholm e outros, que aborda em vrios captulos aspectos relativos imunologia da glndula mamria. O livro foi publicado pela Universidade de Helsinque, em 1995.

2. No livro "Bovine Medicine. Diseases and husbandry of cattle", editado por Andrews, A. H. e outros, da editora Blackwell Scientific Publications, de Oxford, Inglaterra, h alguns captulos que abordam o tema.

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3. Existe um artigo de reviso muito bom (Sordillo, L. M.; Shafer-Weaver, K. and DeRosa, D. Immunobiology of the mammary gland. Journal of Dairy Science, v. 80, p. 1851-1865, 1997. Nesse artigo voc encontrar vrias referncias teis.

4. Outro artigo (em espanhol), mas um pouco mais antigo: Diaz Otero, F. & Santiago Cruz, J. R. Mecanismos de defensa de la glndula mamria bovina en las fases de involucin y lactacin. Veterinaria Mexico, v. 23, n. 4, p. 357-365.

5. Em alguns sites na Internet podero ser encontrados trabalhos ou referncias: www.nmconline.org A partir desse site, existem numerosos outros em que podem ser encontradas informaes (a maioria em ingls, infelizmente).

\\c\Sac - Pastas\Cartas Padro\Qualidade do Leite\1 - CCS\Ccs.doc