CARREADOR LIPÍDICO NANOESTRUTURADO À BASE DE CERA DE ... · Aos meus primos e primas em especial...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CARREADOR LIPÍDICO NANOESTRUTURADO À BASE DE

CERA DE CARNAÚBA: DESENVOLVIMENTO,

CARACTERIZAÇÃO E USO NA ENCAPSULAÇÃO DE

BENZOFENONA-3.

SUÊNIA DE PAIVA LACERDA

RECIFE-2009

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CARREADOR LIPÍDICO NANOESTRUTURADO À BASE DE

CERA DE CARNAÚBA: DESENVOLVIMENTO,

CARACTERIZAÇÃO E USO NA ENCAPSULAÇÃO DE

BENZOFENONA-3.

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação

do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências de

Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, em cumprimento às

exigências para a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Área de Concentração: Produção e Controle de Qualidade de

Medicamentos.

SUÊNIA DE PAIVA LACERDA

ORIENTADOR (a): Profª. Drª. Maria Inês Ré

RECIFE-2009

2

Lacerda, Suênia de Paiva Carreador lipídico nanoestruturado à base de cera de carnaúba: desenvolvimento, caracterização e uso na encapsulação de benzofenona-3 / Suênia de Paiva Lacerda. – Recife : O Autor, 2009.

188 folhas : Il.; tab.; graf. fig.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2009.

Inclui bibliografia e anexo 1. Benzofenonas. 2. Carreadores lipídicos nanoestruturados 3. Nanopartículas lipídicas sólidas. I.Título.

615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.19 CDD (22.ed.) CCS2009-113

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Reitor:

Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-reitor:

Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró- Reitoria para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação:

Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Diretor do Centro de Ciências da Saúde:

Prof. José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde:

Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas:

Prof. Dalci José Brondani

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas:

Prof. Antônio Rodolfo de Faria

Coordenador da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas:

Prof. Pedro Rolim Neto

Vice-Coordenador da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas:

Profª. Beate Saegesser Santos

4





Recife, 22 de Maio de 2009

Dissertação de Mestrado defendida e APROVADA, por decisão unânime, em 22 de

maio de 2009 e cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes

professores:

PRESIDENTE E EXAMINADOR INTERNO: Profª. Drª Maria Inês Ré

(Deptº de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco-UFPE)

EXAMINADOR INTERNO: Profª. Drª. Beate Saegesser Santos

(Deptº de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco)

EXAMINADOR EXTERNO: Profª. Drª. Maria Helena Ambrósio Zanin

(Centro de Tecnologia de Processos e Produtos do Instituto de Pesquisas Tecnológicas

do Estado de São Paulo)

5

DEDICO ESTE TRABALHO:

...Aos meus pais,

que foram o alicerce para a

construção dos meus sonhos, me dando muito amor e força.

...Aos meus irmãos e sobrinhos,

pelo amor e a força que nos une.

...Aos meus avós e familiares

que sempre me deram total apoio e me fizeram seguir em frente com

mais segurança, confiança e perseverança.

... Aos meus amigos,

pela amizade, carinho, amor, e apoio acima de tudo.

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―O degrau de uma escada não serve simplesmente para que permaneçamos em cima

dele. Destina-se a sustentar os nossos pés o tempo suficiente para que coloquemos o

outro um pouco mais alto‖.

(Thomas Huxley)

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AGRADECIMENTOS

A Deus que me concedeu essa oportunidade e me deu a vida, saúde e força para

a realização desse trabalho.

À Profª Drª Maria Inês Ré pela orientação, dedicação para a execução desse

trabalho, pelo apoio, paciência e confiança. Sobretudo pelos ensinamentos e

oportunidades concedidas.

Aos meus pais que nunca deixaram de me dar apoio e incentivar cada escolha

que fiz durante toda a minha vida, por todo carinho e educação que me proporcionaram.

Aos meus irmãos: Samara, Milena e Servulu pelo incentivo e principalmente

pela amizade. Aos meus sobrinhos Sávio e Luan, que são as grandes alegrias em nossas

vidas.

À minha comadre e irmã Solange, que sempre se fez presente em minha vida.

À Christianny por sua amizade, carinho e confiança em mim depositada.

Aos meus avós Justo, Teresa, José Inácio (in memorian) e Maurina, pela

educação e pelos ensinamentos.

Aos meus tios e tias, em especial à minha tia Sônia Lacerda, à minha prima- tia

Silvana pela torcida e pela alegria que elas compartilharam comigo em cada conquista

durante o mestrado.

Aos meus primos e primas em especial às minhas primas Cynthia, Patrícia,

Bruna pela grande amizade e incentivo durante essa trajetória.

Aos meus padrinhos, Mário e Lu pelo incentivo que sempre me deram.

À Minéia por ter sido minha grande companheira, amiga e irmã durante o tempo

que estive em São Paulo, e espero que seja por toda vida.

Aos meus pais adotivos Geraldo e Jurema que me acolheram em sua família com

muito carinho.

À Alex ,uma pessoa muito especial, que sempre me deu força para enfrentar

meus medos e angústias.

Aos amigos e companheiros de trabalho que me acolheram no IPT: Adriano,

Adriana, Shirley, Marcelo, Kleber, David, Bento, Maria Helena, Izabela, Pierre,

Roseane, Lecsi, Ana Letícia, Vivianne, Natália, Isilda, Lúcia, Luciana, que em todos os

momentos foram prestativos, voluntários, compreensivos, mas acima de tudo,

companheiros. Além disso, gostaria de agradecer a eles também os momentos de

aprendizado e os momentos de descontração: os ―cafés filosóficos‖, as tardes com

brigadeiro e bolo de cenoura.

8

Um agradecimento muito especial à Natália, pela dedicação, incentivo para a

realização deste trabalho e, sobretudo por sua amizade.

Às grandes responsáveis pelo início de tudo isso, minhas amigas: Flávia e Zênia,

com as quais dei meus primeiros passos na pesquisa.

Aos amigos que a vida me presenteou: Luciana, Vannessa, Thaís Porto, Thaís

Souza, Thaíz, Naiana, Andréia, Fabiane, Lívia, Jacqueline, Fabíola, Júnior, Zay,

Tatiana, Eduardo, Giovanna, Luanna, Gerliene, Aline, Luciana Lima, Rodrigo, Diego,

que sempre torceram pela minha felicidade e meu sucesso e é claro não poderia deixar

de agradecer pelos momentos em que me ouviram, que me deram conselhos e por todos

os momentos divertidos que tivemos juntos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade

Federal de Pernambuco.

À Rede Nacional de Nanocosméticos pelo apoio financeiro fornecido.

Ao Instituto de Pesquisa Tecnológica do Estado de São Paulo, pelo suporte para

o desenvolvimento do projeto.

Ao Laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan pelas análises de

microscopia varredura a laser confocal.

Ao CNPQ, órgão financiador da minha bolsa de estudos.

A conclusão dessa etapa não seria possível sem a ajuda de cada um de vocês!

Muito Obrigada!

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tipos de sistemas de encapsulação (adaptado de Fialho e Júnior, 2007). ............... 31

Figura 2. Representação esquemática dos diferentes modos de liberação de sistemas

encapsulados (matriz e reservatório) e perfis cinéticos típicos. (adaptado de

Guery, 2006). ....................................................................................................... 32

Figura 3. A-NLS: Matriz lipídica cristalina perfeita com uma capacidade de encapsulação

limitada. B-CLN: Matriz lipídica cristalina com algumas imperfeições, podendo

induzir um aumento da capacidade de encapsulação (Adaptado de Müler et al,

2007). ...................................................................................................................... 36

Figura 4. Processo de cremeação (Adaptado de Pinheiro, 2008)........................................... 41

Figura 5. Processo de sedimentação (Adaptado de Pinheiro, 2008). .................................... 41

Figura 6. Processo de floculação (adaptado de Pinheiro, 2008). ......................................... 42

Figura 7. Processo de coalescência (adaptado de Pinheiro, 2008). ....................................... 42

Figura 8. Processo de Ostwald ripening (adaptado de Pinheiro, 2008). ............................... 43

Figura 9. Representação esquemática do funcionamento do Turbiscan Lab ® (Adaptado

de Pinheiro, 2008). .............................................................................................. 47

Figura 10. Esquema de produção de NLS pelo método emulsificação-evaporação de

solvente (adaptado de Sjöström e Bergenståhl, 1992). ........................................ 48

Figura 11. Processo de produção de nanopartículas lipídicas usando Homogeneização a

alta pressão a frio (Cinza Claro) e Homogeneização a alta pressão a quente

(Cinza Escuro) (Adaptado de MEHNERT E MÄDER, 2001). ........................... 51

Figura 12. Estrutura da benzofenona.-3 (SHAATH, 1997). ................................................. 54

Figura 13. Processo de homogeneização a alta pressão. ..................................................... 60

Figura 14. Esquema de funcionamento do equipamento Turbiscan Lab® cujo princípio de

operação é a turbidimetria dinâmica (transmissão e retro-espalhamento da luz). 64

Figura 15. Esquema representativo da Célula Franz. ............................................................ 69

Figura 16. Esquema de preparação dos cortes. ..................................................................... 70

10

Figura 17. Espectro no Infravermelho da BZ-3, região de 4000 a 400 cm-1

. ....................... 73

Figura 18. Curvas TG da BZ-3 obtidas sob atmosfera dinâmica de nitrogênio na razão de

aquecimento 5°C/min. .......................................................................................... 74

Figura 19. Curvas DSC da BZ-3 obtida sob atmosfera dinâmica de nitrogênio na razão de

aquecimento 5°C/min. .......................................................................................... 75

Figura 20. Espectro no Infravermelho de cera de carnaúba (região de 4000 – 400 cm-1

). ... 76

Figura 21. Curvas DSC dos três tipos de carnaúba. .............................................................. 77

Figura 22. Difratogramas dos três tipos de carnaúba. ........................................................... 79

Figura 23. Curvas DSC da cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e

oleato de isodecila (2:1 e 1:1). .............................................................................................. 80

Figura 24. Difratogramas da mistura de cera de carnaúba e oleato de isodecila (2:1 e

1:1). ...................................................................................................................... 81

Figura 25. Curvas DSC da cera e da BZ-3 e da mistura física entre elas. ............................ 82

Figura 26. Monitoramento do tamanho médio (d50) de partículas de cera da carnaúba

(tipos 1, 3 e 4) decorridos 1, 15 e 20 dias da preparação. .................................... 85

Figura 27. Distribuição granulométrica das formulações de partículas de cera de carnaúba

e oleato de isodecila (PCS). ................................................................................. 87

Figura 28. Diâmetro hidrodinâmico das formulações de partículas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila (PCS).................................................................................... 87

Figura 29. Gráfico de Pareto para a SÉRIE 1 para as variáveis respostas: diâmetro (A) e

índice de polidispersão (B). ................................................................................. 90

Figura 30. Superfície de resposta: variação do diâmetro de partícula (A) e do índice de

polidispersão (B) em função do tipo de emulsificante e da proporção cera: óleo

na formulação das partículas lipídicas. ................................................................ 91

Figura 31. Gráfico de Pareto para a SÉRIE 2 para as variáveis resposta: diâmetro (A) e

índice de polidispersão (B). ................................................................................. 95

Figura 32. Gráfico de Superfície de resposta: variações do diâmetro de partícula (A) e do

índice de polidispersão (B) em função da pressão e do nº de ciclos. .................. 96

Figura 33. Representação ilustrativa de um gráfico do aparelho Turbiscan Lab®. .............. 98

11

Figura 34. Variação de retroespalhamento no estudo da estabilidade das suspensões de

nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas a 900 bar (A)

e 400 bar (B). ....................................................................................................... 99

Figura 35. Evolução no tempo do retroespalhamento ao longo de toda amostra

(deltaTbackscatering) medido nas amostras de nanopartículas de cera de

carnaúba e oleato de isodecila obtidas em diferentes pressões de

homogeneização. Ensaio realizado à temperatura ambiente, amostra em

repouso................................................................................................ 100


nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas em pressão de

900 bar e com diferentes números de ciclos no homogeneizador: 8 ciclos (A) e

2 ciclos (B). .......................................................................................................... 102



carnaúba e oleato de isodecila obtidas em pressão de 900 bar e com diferentes

números de ciclos no homogeneizador. Ensaio realizado à temperatura

ambiente amostra em repouso.................................................................

103

Figura 38. Gráfico representativo do Fator oclusivo para formulações com diferentes

proporções de oleato de isodecila. ....................................................................... 105

Figura 39. Efeito da redução do tamanho das partículas se depositando na superfície do

papel (fenômeno similar ao esperado sobre a pele). ............................................ 105


nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas a 900 bar e 8

ciclos de passagem, antes (A) e após (B) estresse térmico. ................................. 107



carnaúba e oleato de isodecila obtidas antes e após o estresse

térmico.................................................................................................. 108

Figura 42. Eficiência de encapsulação de BZ-3 em nanoparticulas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila em função do teor inicial de BZ-3 e do tempo de

estocagem. ............................................................................................................ 111

Figura 43. Relação entre teor de BZ-3 na formulação inicial e Bz3 encapsulado nos CLN. 111

12

Figura 44. Representação esquemática do efeito da nanoestrutura sobre a encapsulação do

ativo (na produção e evolução ao longo do tempo). ............................................ 112


nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila com diferentes teores

iniciais de BZ-3:0 (A); 4,8 (B); 9,1 (C); 23,1 (D); 33,3 (E) % BZ-3. .................. 114

Figura 46. Evolução no tempo do retroespalhamento (deltaTbackscatering) medido nas

amostras de nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila contendo

BZ-3. .................................................................................................................... 115

Figura 47. Perfil de liberação de BZ-3 a partir de nanopartículas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila (48 µg de BZ-3/mg de lipídios). Meio receptor = tampão

fosfato 7,4 (n=4). .................................................................................................. 116

Figura 48. Cortes de pele do estudo de penetração in vitro. ................................................. 118

Figura 49. Cortes de pele do estudo de penetração in vitro. ................................................. 118

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Dois níveis reais e codificados das variáveis de entrada (estudo de formulação). 61

Tabela 2. Matriz do planejamento fatorial 24 (estudo de formulação). ................................. 61

Tabela 3. Dois níveis reais e codificados das variáveis entrada (estudo de processo). ......... 62

Tabela 4. Matriz do planejamento fatorial 24 (estudo de formulação). ................................. 62

Tabela 5. Condições de formulação de carreadores lipídicos nanoestruturados à base de

cera de carnaúba e oleato de isodecila. ................................................................... 66

Tabela 6. Comparação das principais bandas de absorção do espectro infravermelho da

BZ-3. .................................................................................................................... 73

Tabela 7. Valores de ponto de fusão de BZ-3. ...................................................................... 74

Tabela 8. Principais absorções características (ceras de carnaúba 1, 3 e 4). ......................... 76

Tabela 9. Valores da transição térmica dos três tipos de cera de carnaúba. .......................... 78

Tabela 10. Valores da transição térmica da mistura de cera de carnaúba e oleato de

isodecila. .............................................................................................................. 81

Tabela 11. Formulação de nanopartículas lipídicas sólidas de cera de carnaúba. ................ 83

Tabela 12. Granulometria das partículas lipídicas a base de ceras de carnaúba (DL). ......... 84

Tabela 13. Condições de formulação de correadores de lipídicos nanoestruturados à base

de cera de carnaúba e oleato de isodecila. ............................................................ 86

Tabela 14. Granulometria dos carreadores lipídicos nanoestruturados à base de cera de

carnaúba e oleato de isodecila. ............................................................................. 87

Tabela 15. Resultados do planejamento experimental estatístico. ........................................ 89

Tabela 16. Tamanho das partículas lipídicas (imediatamente e após 10 dias). ..................... 92

14

Tabela 17. Resultados do planejamento experimental estatístico. ........................................ 94

Tabela 18. Variação das características físicas das nano-suspensões em 10 dias. ................ 98

Tabela 19. Granulometria dos carreadores lipídicos nanestruturados à base de cera de


Tabela 20. Condições de formulação de nanopartículas lipídicas sólidas à base de cera de

carnaúba e oleato de isodecila na proporção 1:1 e 2:1. .......................................... 104



Tabela 22. Caracterização físico-química das partículas antes e depois do ciclo congela -

descongela. .................................................................................................. 106

Tabela 23. Caracterização físico-química das nanoparticulas lipídicas de cera de carnaúba

e oleato de isodecila 1:1 contendo BZ-3. ............................................................. 110

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BZ-3-Benzofenona -3

CLAE- Cromatografia liquida de alta eficiência

CLN- Carreador lipídico nanoestruturado

CLSM- Microscópio de varredura à laser confocal

DCE- Dupla camada elétrica

DRX- Difratometria de raios-x

DSC- Calorimetria exploratória diferencial

FPS- Fator de proteção solar

h- Hora

HLB- Equilíbrio lipofílico hidrofílico

HPH- Homogeneizador de alta presão

IPT- Instituto de Pesquisas Tecnológicas

IR- Infra- vermelho

LD- Difração à laser

min- Minuto

NLS- Nanopartícula lipídica sólida

PCS-Espectroscopia de correlação de fótons

rpm- Rotações por minuto

16

Tf- Temperatura de fusão

TGA- Termogravimetria

UFRGS- Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UV – Ultravioleta

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LISTA DE SÍMBOLOS

µm – Micrômetro

nm – Nanômetro

Km/h- Quilômetros por hora

°C – Graus Celsius

%- Porcentagem

±- Mais ou menos

d10- Distribuição de tamanho de 10 % das partículas

d50- Distribuição de tamanho de 50% das partículas

d90- Distribuição de tamanho de 90% das partículas

µ l- Microlitros

m L- Mililitros

m/m- Massa por massa

cm2- Centímetro quadrado

q.s.p- Quantidade suficiente para

mg- Miligrama

v/v- volume por volume

Δm- Variação de massa

pH- Potencial hidrogeniônico

µ g-microgramas

18

mV- Milivolts

cPs- Centipois

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RESUMO

Nanopartículas lipídicas sólidas constituídas de lipídios puros (NLS) ou mistura de

lipídios sólidos e líquidos (CLN) têm sido propostas como uma categoria de carreadores

para ingredientes cosméticos de atual e crescente interesse devido a uma série de

vantagens quando comparadas a formulações convencionais. As ceras naturais são

consideradas matrizes lipídicas de grande potencial para a produção de NLS de

administração tópica, em função da baixa toxicidade e biocompatibilidade, além de

melhorar a aparência da pele, aumentar a elasticidade e ainda possuir uma função de

barreira física. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver um nanocarreador do

tipo CLN baseado no uso de cera de carnaúba, veiculando benzofenona-3 (BZ-3) como

um ativo modelo lipofílico. Inicialmente as principais matérias primas utilizadas (cera

de carnaúba e benzofenona-3) foram caracterizadas fisicoquimicamente (calorimetria

exploratória diferencial, espectrometria no infra-vermelho, difratometria de raios-x).

Prosseguindo a etapa de caracterização, caracterizou-se a mistura de cera de carnaúba e

oleato de isodecila verificando-se o efeito da associação do óleo à cera de carnaúba

(redução do ponto de fusão). CLN constituídas de cera de carnaúba e oleato de isodecila

foram primeiramente desenvolvidos sem ativo, investigando-se, com o auxílio de um

planejamento estatístico de experimentos o efeito de variáveis de formulação (24

fatorial, 16 experimentos) e de processo (24 fatorial, 16 experimentos) sobre as

características dos produtos como tamanho de partículas e índice de polidispersão.

Verificou-se que o tipo de emulsificante, a proporção cera:óleo, a pressão de

homogeneização e o número de ciclos foram os fatores que influenciaram

significativamente estas características dos CLN. Por fim, investigou-se o efeito da

incorporação de BZ-3 em CLNs formulados e preparados em condições assegurando as

melhores características dos sistemas como faixa de tamanho (200-300nm) e índice de

polidispersão (< 0,2). O parâmetro de estudo foi o teor de BZ-3 nas nanopartículas

constituídas da mistura cera de carnaúba-oleato de isodecila (1:1) que correspondeu à 0,

4,8; 9,1; 23,1 e 33,3 µgBZ-3/mg fase lipídica. Foram determinados os seguintes parâmetros:

eficiência de encapsulação, estabilidade física das nano-suspensões, pH, viscosidade,

potencial zeta, capacidade de liberação e de penetração in vitro. De acordo com os

resultados obtidos, a matriz lipídica composta de cera de carnaúba e oleato de isodecila

na proporção mássica de 1:1 possui uma capacidade máxima de incorporação de BZ-3

de cerca de 4-5 % BZ-3 (massa BZ-3/massa nanopartículas). Por fim, o conjunto de resultados

obtidos demonstra que os CLN de cera de carnaúba e oleato de isodecila são sistemas

promissores para a veiculação de filtros UV (efeito oclusivo, baixa penetração na pele,

capacidade de encapsular um filtro solar como BZ-3).

Palavras chave: Nanopartículas lipídicas sólidas, benzofenona-3, cera de carnaúba,

carreadores lipídicos nanoestruturados.

20

ABSTRACT

Solid lipid nanoparticles made of pure lipids (SLN) or a mixture of solid and liquid

lipids (NLC) have been proposed as a category of carriers for cosmetic ingredients of

current and growing interest due to a number of advantages compared to conventional

formulations. Natural waxes are considered lipid matrices of great potential for the

production of topical administration of SLN because of low toxicity and

biocompatibility, as well as improve the appearance of the skin, increase elasticity and

also has a function of physical barrier. This study aimed to develop a type of NLC

nanocarrier based on the use of carnauba wax, loading benzophenone-3 (BZ-3) as a

lipophilic active. Initially was performed a physico-chemical characterization of the

main materials (carnauba wax and BZ-3) by using differential scanning calorimetry, the

infra-red spectrometry, X-ray Difratometry. Following the characterization, binary

mixtures of carnauba wax and isodecyl oleate were investigated and was showed the

effect of the oil in the wax properties (i.e., reduction of the melting point). NLC formed

by carnauba wax and of isodecyl oleate were first developed without active, to

investigate (using a statistical design of experiments) the effect of variables of

formulation (24 factorial, 16 experiments) and process (2

4 factorial, 16 experiments) on

the characteristics of products such as particle size and polydispersity index. It was

found that the type of emulsifier, the proportion wax: oil, the pressure of

homogenization and the number of cycles were the factors that significantly influence

the characteristics of the NLC. Finally, it was investigated the effect of the addition of

BZ- 3 in NLC formulated and prepared in conditions ensuring the best features of

systems such as range size (200-300 nm) and polydispersity index (<0.2). The

parameter of the study was the level of BZ- 3 in nanoparticles consisting of carnauba

wax-mixture of isodecyl oleate (1:1) which corresponded to 0, 4.8, 9.1, 23.1 and 33.3-

μgBZ 3/mg lipid phase. The following parameters were determined: the encapsulation

efficiency, physical stability of nano-suspensions, pH, viscosity, zeta potential, ability to

release and penetration in vitro. According to the results obtained from lipid matrix

composed of carnauba wax and of isodecyl oleate in the ratio of 1:1 (wt) has a

maximum capacity of incorporation of BZ-3 of about 4-5% BZ-3 (mass BZ-3 / mass

nanoparticles). Finally, the set of results shows that NLC of carnauba wax and of isodecyl

oleate are promising systems for the presence of UV filters (occlusive effect, low

penetration of the skin, ability to encapsulate a solar filter and BZ-3).

Keywords: Solid Lipid Nanoparticles, benzophenone-3, carnauba wax, isodecyl oleate,

nanostructured lipid carrier .

21

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................ 26

2. REVISÃO DA LITERATURA....................................................................................... 29

2.1. Encapsulação : tecnologia de interesse industrial....................................................... 29

2.2. Micro e nanopartículas para liberação de um principio ativo encapsulado............ 30

2.3. Sistemas nanoestruturados para administração de ativos cosméticos...................... 33

2.3.1. Aplicações tópicas .................................................................................................. 33

2.3.2. Sistemas nanolipídicos sólidos............................................................................... 34

2.3.2.1. Definições.......................................................................................................... 34

2.3.2.2. Estabilidade física............................................................................................. 37

2.3.2.2.1. Modificações dos lipídios............................................................................... 37

2.3.2.2.1.1. Cristalização-polimorfismo...................................................................... 37

2.3.2.2.1.2. Gelificação............................................................................................... 40

2.3.2.2.2. Modificações das nanodispersões.................................................................... 40

2.3.2.2.2.1. Cremeação................................................................................................ 41

2.3.2.2.2.2. Sedimentação........................................................................................... 41

2.3.2.2.2.3. Floculação................................................................................................ 42

2.3.2.2.2.4. Coalescência............................................................................................. 42

3.2.2.2.5. Ostwald ripening ........................................................................................ 43

2.3.2.2.3. Técnicas de caracterização............................................................................... 43

2.3.2.2.3.1. Tamanho de partículas............................................................................. 43

2.3.2.2.3.2. Calorimetria exploratória diferencial....................................................... 44

2.3.2.2.3.3. Difratometria de Raios-X......................................................................... 45

2.3.2.2.3.4. Potencial zeta............................................................................................ 45

2.3.2.2.3.5. Turbidimetria dinâmica............................................................................ 46

2.3.2.2.3.6. Viscosidade.............................................................................................. 47

2.3.2.3. Processos de preparação de nanopartículas lipídicas sólidas....................... 47

2.3.2.3.1. Emulsificação – evaporação de solvente..................................................... 47

2.3.2.3.2. Homogeneização em alta pressão (HPH).................................................... 48

2.3.2.3.2.1. Homogeneização a quente................................................................... 49

2.3.2.3.2.2. Homogeneização a frio........................................................................ 50

22

2.3.3. Materiais de trabalho.......................................................................................... 51

2.3.3.1. Cera de carnaúba................................................................................................. 51

2.3.3.2. Benzofenona-3.................................................................................................... 53

3 OBJETIVOS....................................................................................................................... 56

4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................ 58

4.1. MATERIAIS................................................................................................................... 58

4.2. MÉTODOS..................................................................................................................... 59

4.2.1. CARACTERIZAÇÃO DAS PRINCIPAIS MATÉRIAS-PRIMAS.................. 59

4.2.1.1. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IR) 59

4.2.1.2. Análise Termogravimétrica (TGA)................................................................. 59

4.2.1.3. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)................................................ 59

4.2.1.4. Difratometria de Raios-X (DRX)..................................................................... 59

4.2.2. NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS: PROCESSO E PRÉ-

FORMULAÇÃO................................................................................................................... 60

4.2.2.1. Preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas......................................... 60

4.2.2.2. Caracterização das Nanopartículas Lipídicas Sólidas (nano-suspensões).......... 63

4.2.2.2.1. Granulometria.............................................................................................. 63

4.2.2.2.2. Estabilidade Física....................................................................................... 63

4.2.2.2.3. Efeito Oclusivo............................................................................................ 65

4.2.3. CLN: VEÍCULO PARA APLICAÇÃO COSMÉTICA DE BENZOFENONA-

3............................................................................................................................................... 65

4.2.3.1. Preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas contendo BZ-3...................... 65

4.2.3.2. Caracterização das nano-suspensões contendo BZ-3.................................... 66

4.2.3.2.1 Granulometria............................................................................................... 66

4.2.3.2.2. Potencial Zeta.............................................................................................. 66

4.2.3.2.3. Viscosidade................................................................................................. 67

4.2.3.2.4. Determinação de pH.................................................................................... 67

4.2.3.2.5. Eficiência de Encapsulação......................................................................... 67

4.2.3.2.6. Estabilidade física....................................................................................... 68

4.2.3.2.7. Liberação de BZ-3 in vitro.......................................................................... 68

4.2.3.2.8. Estudo de Penetração cutânea in vitro......................................................... 69

4.2.3.2.8.1. Preparação das nano-suspensões contendo corante Nile Red................ 69

4.2.3.2.8.2. Preparação dos Cortes para estudo in vitro............................................ 69

23

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 72

5.1. CARACTERIZAÇÃO DAS PRINCIPAIS MATÉRIAS-PRIMAS..................... 72

5.1.1. Caracterização da Benzofenona-3 (BZ-3).......................................................... 72

5.1.1.1. Espectro da BZ-3 na região do infra-vermelho.............................................. 72

5.1.1.2. Análise termogravimétrica (TGA)................................................................. 73

5.1.1.3. Determinação do ponto de fusão.................................................................... 74

5.1.2. Caracterização das amostras de cera de carnaúba (1, 3 e 4)........................... 75

5.1.2.1. Espectro na região do infra-vermelho (IR).................................................... 75

5.1.2.2. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)................................................ 77

5.1.2.3. Difratometria de raios-X (DRX).................................................................... 78

5.1.3. Misturas de cera de carnaúba (1, 3 e 4) com oleato de isodecila..................... 79

5.1.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)............................................... 80

5.1.3.2. Difratometria de raios-X (DRX).................................................................... 81

5.1.4. Estudos de compatibilidade ou pré-formulação utilizando análise térmica... 82

5.2. NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS: PROCESSO E PRÉ-

FORMULAÇÃO................................................................................................................... 83

5.2.1. NLS: estudo preliminar de formulação com cera de carnaúba....................... 83

5.2.2. CLN: incorporação de oleato de isodecila à cera de carnaúba........................ 85

5.2.2.1. Análise Granulométrica.................................................................................. 86

5.2.3. Planejamento experimental estatístico............................................................... 88

5.2.3.1. Análise de formulação.................................................................................... 89

5.2.3.1.1. Monitoramento da granulometria no tempo............................................. 92

5.2.3.2. Análise de processo........................................................................................ 94

5.2.3.2.1. Monitoramento da granulometria no tempo............................................. 96

5.2.3.2.2. Acompanhamento da estabilidade por turbidimetria dinâmica................ 97

5.2.4. Teste de oclusão e de estabilidade de nano-suspensões preparadas nas melhores

condições de processo selecionadas do planejamento estatístico de

experimentos..........................................................................................................................

103

5.2.4.1. Fator de Oclusão............................................................................................. 104

5.2.4.2. Ciclo Congela-descongela (freeze-thaw cycling).......................................... 106

5.3. CLN: VEÍCULO PARA APLICAÇÃO COSMÉTICA DE BENZOFENONA-

3............................................................................................................................................... 109

5.3.1. Características das nanopartículas lipídicas nanoestruturadas contendo BZ-

3............................................................................................................................................... 109

5.3.1.1. Tamanho......................................................................................................... 109

24

5.3.1.2. Potencial zeta.................................................................................................. 109

5.3.1.3. Eficiência de Encapsulação............................................................................ 110

5.3.2. Características das nano-suspensões.................................................................. 112

5.3.2.1. pH e viscosidade............................................................................................. 112

5.3.2.2. Estabilidade física (turbidimetria dinâmica).................................................. 113

5.3.2.3. Estudo de Liberação in vitro.......................................................................... 115

5.3.2.4. Estudo de Penetração in vitro......................................................................... 117

6. CONCLUSÕES FINAIS 120

7. PERSPECTIVAS 122

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 124

9. ANEXOS 141

25

1. INTRODUÇÃO

26

1. INTRODUÇÃO

Cosméticos são definidos genericamente como produtos comerciais usados para

melhorar a aparência da pele. No entanto, desde o final da década de 80, a demanda do

consumidor por produtos substancialmente mais efetivos para a pele desencadeou um

aumento da pesquisa e o desenvolvimento de novos produtos na indústria cosmética (LI,

2004). Como resultado, tem-se hoje ingredientes cosméticos que não só melhoram a

aparência da pele, mas também cuidam de sua saúde: são produtos que renovam,

restauram e rejuvenescem e não apenas limpam, protegem e hidratam.

O interesse no uso de matrizes lipídicas como carreadores de ativos para

aplicação tópica tem aumentado consideravelmente nestes últimos anos. Podemos citar

os lipossomas e as macro (micro) emulsões (SINGH et al.; 2005; TEICHMANN et

al.,2005; PARK et al., 2005; KREILGAARD, 2002 e GALLATARE et al., 1999). Na

base da nova geração de carreadores cosméticos estão também as nanopartículas

lipídicas sólidas (NLS- Solid Lipid Nanoparticle) e os carreadores lipídicos

nanoestruturados (CLN- Nanostructured Lipid Carriers) que constituem,

respectivamente, sistemas nanoestruturados em matrizes lipídicas sólidas de lipídio puro

e em mistura com lipídios líquidos. Essas partículas são desenvolvidas com a finalidade

de aumentar a estabilidade química de alguns ativos cosméticos como os retinóides,

palmitato de ascorbil e co-enzima Q-10 (SOUTO e MÜLLER, 2008) ou para agir como

bloqueadores físicos de UV, podendo estar ou não, associadas a moléculas com ação

bloqueadora-UV (proteção química).

Em paralelo a estas características positivas, transformações químicas são

susceptíveis de ocorrer com os lipídios podendo alterar a estrutura dos sistemas

nanoestruturados, a capacidade de encapsular e as propriedades de liberação do

encapsulado, modificações físicas como alterações do tamanho de partículas podem

afetar a estabilidade física das nano-suspensões geradas (HEURTAULT et al., 2003), o

que demanda um estudo de processo e formulação específico para cada proposta de

lipídio/mistura de lipídios a serem usados no desenvolvimento de novos sistemas para

uso em aplicações cosméticas.

Este projeto pretende contribuir para o desenvolvimento de sistemas

nanoestruturados à base de cera de carnaúba para veiculação de ativos de interesse

27

cosmético. O trabalho avalia o efeito de variáveis de formulação e de processo nas

características das nanopartículas produzidas como: tamanho médio e dispersão de

tamanho, estabilidade física e capacidade de encapsular a benzofenona-3, um filtro solar

de ação química, usada como ativo modelo.

28

2. REVISÃO DA LITERATURA

29

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Encapsulação: tecnologia de interesse industrial

Encapsular traduz uma vontade e um desafio permanente seja de proteger uma

substância ativa frente a um meio agressivo seja controlar sua liberação no tempo

segundo uma cinética específica. A tecnologia de encapsulação é atualmente bem aceita

nas áreas farmacêutica, química, cosmética, alimentícia (AUGUSTIN et al., 2001;

HEINZEN, 2002).

Historicamente, uma das primeiras aplicações da microencapsulação foi o papel

auto-copiante (papel carbono). A comercialização deste produto começou em 1968: 110

mil toneladas de microcápsulas foram utilizadas para esta aplicação nos Estados Unidos

(GREEN e SCHEICHER, 1955). Estes papéis químicos são ainda utilizados no

comércio em formulários comerciais de páginas múltiplas.

A seguir, nos anos 80, a comunicação olfativa se desenvolveu, aparecendo no

mercado os encartes perfumados nas lojas para apresentar um perfume, um produto

detergente ou um amaciante perfumado para lavagem de roupas. A maior parte destas

propagandas é realizada com microcápsulas que encapsulam tintas ou perfumes e que

liberam seu conteúdo por ruptura sob ação mecânica (pressão externa).

Na indústria de alimentos, a encapsulação é uma ferramenta ideal para mascarar

sabores de certas substâncias, como vitaminas. Ela evita também a interação entre

diferentes ingredientes compondo um alimento complexo e protege as substâncias

ativas da oxidação (proteção de aromas) ou ainda da umidade (proteção de sais ou

açúcares) (MADENE et al., 2006), por exemplo, limoneno, presente no óleo essencial

da laranja (BERTOLINI e GROSSO, 2001; BOUTBOL et al., 2002; REINECCIUS et

al., 2002; CHO e PARK, 2002) ou ainda protegendo microorganismos probióticos

(GARDINER et al., 2000 ; FITZGERALD e STANTON, 2002; ANAL e SINGH,

2007).

Na indústria têxtil, a aplicação comercial da microencapsulação data do início

dos anos 90. Os fabricantes de produtos têxteis demonstram interesse por tecidos com

perfume ou um ativo cosmético se depositando sobre a pele. Outras aplicações são

estudadas, dentre elas: repulsivos para insetos, corantes, vitaminas, antimicrobianos e

30

materiais com modificação de fase ou de cor, por exemplo, por ação da temperatura (G.

NELSON, 2002; MONLLOR et al., 2009).

Em produtos agroquímicos, sistemas particulados podem veicular pesticidas e

inseticidas em forma ultra-dispersa. Isto permite reduzir a quantidade de produtos

químicos utilizados para uma ação inseticida ou pesticida e contribuir para melhor

proteção do meio ambiente (DAILEY et al., 1990; BOH e KORNHAUSER, 2003;

BINGHAM et al., 2007).

Na área farmacêutica, o grande interesse é a liberação programada e controlada

do material ativo encapsulado em condições ou meios específicos no tempo e no espaço

(sítio específico de ação). As pesquisas nesta área estão focadas em desenvolvimento de

sistemas de liberação da droga que atinjam somente o tecido lesado incluindo uma

melhor eficácia, reduzindo a toxicidade de fármacos e conveniência do tratamento por

parte do paciente. Alguns estudos vêm sendo desenvolvidos com grandes possibilidades

de sucesso para aplicações futuras em quimioterapia, antimicrobiana, anticancerígena e

antiinflamatória injetável, tópica e oftálmica (KIM e LEE, 1992).

Na área cosmética, micro e nanopartículas são empregadas como reservatórios

de substâncias cosmeticamente ativas e que são susceptíveis de serem degradadas muito

rapidamente na formulação cosmética, por exemplo, vitamina E, di-hidroxiacetona,

cafeína (BRANNON-PEPPAS, 1993), vitamina A (JENNING et al., 2000), palmitato de

ascorbil e co-enzima Q-10 (TEERANACHAIDEEKUL et al., 2007a;

TEERANACHAIDEEKUL et al., 2007b ), dentre outros.

2.2. Micro e nanopartículas para liberação de um princípio ativo encapsulado

Como veículos de encapsulação de substâncias ativas micro e nanopartículas são

estruturas classificadas pelo tamanho, sendo que uma classificação normalmente

empregada é a de que micropartículas apresentam tamanho entre 1 e 1000 µm e as

nanopartículas tamanho inferior a 1 µm. Dependendo da estrutura interna estes sistemas

podem ainda ser de dois tipos: matriciais (ou monolíticos) e reservatórios (Figura 1)

(DASH, 1998; KIMURA e OGURA, 2001; FIALHO e JÚNIOR, 2007).

31

(A) Sistema reservatório (B) Sistema matricial

Figura 1. Tipos de sistemas de encapsulação (adaptado de Fialho e Júnior,

2007).

Os materiais (agentes encapsulantes) utilizados para a obtenção destas diversas

estruturas (reservatórios e matrizes) são variados, geralmente polímeros e lipídios, por

exemplo (GUERY, 2006):

Polímeros de origem natural: gelatina, alginato de sódio, quitosana, amidos;

Polímeros celulósicos: etilcelulose, hidroxipropilcelulose;

Polímeros de síntese: copolímeros acrílicos e metacrílicos, poliolefinas,

copolímeros (acrilo) vinilícos, policaprolactona, polímeros de ácido lático e glicólico;

Lipídios e ceras minerais: glicerídeos, ceras (abelha, carnaúba), ceras minerais.

A escolha do agente encapsulante depende de uma série de fatores, entre eles: a

não reatividade com o material a ser encapsulado, o processo utilizado para a formação

do veículo de encapsulação e o mecanismo de liberação desejado.

A liberação da substância ativa encapsulada (ativo) pode ser programada para

ocorrer de maneira contínua (liberação sustentada) ou de maneira abrupta (imediata),

como ilustrado na Figura 2.

32

Figura 2. Representação esquemática dos diferentes modos de liberação de

sistemas encapsulados (matriz e reservatório) e perfis cinéticos típicos. (adaptado de

Guery, 2006)

Os sistemas de liberação imediata são geralmente sistemas do tipo reservatório

(micro ou nanocápsulas) formadas de uma membrana pouco permeável, que vai liberar

abruptamente seu conteúdo após o rompimento da membrana. Esta ruptura pode ser

provocada por uma pressão mecânica ou osmótica, uma variação de temperatura e/ou

pH ou ainda uma degradação enzimática da membrana.

Os sistemas de liberação contínua são majoritariamente sistemas matriciais. A

liberação é feita por difusão da substância através da matriz por erosão, degradação,

dissolução ou permeabilidade seletiva da matriz ou ainda uma associação destes

mecanismos (BAKAN, 1973; BRANNON-PEPPAS, 1993).

33

Os principais fatores que governam as propriedades de liberação destes sistemas

são:

Os parâmetros externos como: a temperatura (GAO et al., 2005), o pH (SAUER

et al., 2001;LAMPRECHT et al., 2004), umidade ou ainda a presença de

enzimas no meio que podem degradar as partículas;

Os parâmetros intrínsecos à fase interna como a solubilidade da substância

encapsulada no meio de dissolução;

Os parâmetros intrínsecos à matriz ou à membrana como: tamanho da partícula

(SANSDRAP et al.1993; SIEPMANN et al., 2004), espessura da membrana,

estrutura química da matriz encapsulante, sua massa molar (CAPAN et al.,

1999), cristalinidade e porosidade (KLOSE et al., 2006).

Dependendo de suas características físico-químicas e da natureza química da

substância ativa, micro e nanopartículas podem ser utilizadas como vetores em

dermatologia ou em cosmetologia. Nestas áreas, micro e nanopartículas são

geralmente estudadas como alternativas às formulações tópicas como as emulsões

contendo promotores de absorção cutânea (LOPES, 2005)

Como já mencionado, micro e nanopartículas podem ser preparadas a partir de

materiais diversos, geralmente poliméricos ou lipídicos. Neste trabalho, nós nos

interessamos pelos sistemas lipídicos e os tópicos da revisão subseqüente abordarão

propriedades específicas de nanopartículas formadas à base de lipídios.

2.3. Sistemas nanoestruturados para administração de ativos cosméticos

2.3.1. Aplicações tópicas

Carreadores coloidais de fármacos, incluindo as nanoemulsões, nanoesferas,

nanocápsulas, lipossomas e complexos lipídicos, têm atraído um crescente interesse nos

últimos 20 anos no uso como veículos para a administração tópica de fármacos

(SCHAFFAZIK et al., 2003; VERMA et al.; 2003; SHIM et al.; 2004). Pesquisas

relatadas na literatura indicam a eficácia da via cutânea como alternativa terapêutica

para a administração de ativos encapsulados como: progesterona (YUAN et al., 2007),

34

ácido 5-aminolevuliníco (TSAI et al., 2008), isotretinoína (LIU et al., 2006),

nimodipino (HU et al., 2008). Adicionalmente os sistemas nanoestruturados possuem

um tamanho reduzido o que facilita sua incorporação em produtos dermatológicos e

torna a aplicação na pele mais agradável (PERUGINI et al., 2002).

Os sistemas nanoestruturados já investigados são as nanoesferas (SHIM et al.,

2004) as nanocápsulas (MILAO et al., 2003; MIYAZAKI et al., 2003) as nanoemulsões

(CALVO et al., 1996; MÜLLER- GOYMANN, 2004), as nanopartículas lipídicas

sólidas (NLS-Solid Lipid Nanoparticle) (JENNING et al., 2000; MEHNERT e

MADER, 2001), os lipossomas (VERMA et al., 2003) e os niossomas (SHAHIWALA e

MISRA, 2002). Suspensões coloidais aplicadas epicutaneamente modulam a difusão

transdérmica, alterando a atividade da substância e/ou a partição e a difusão da mesma,

influenciando a farmacocinética e a biodistribuição dos ativos permeantes através da

pele (CEVC, 2004).

A encapsulação de ingredientes cosméticos abrange uma grande variedade de

ingredientes ativos com diferentes aplicações (BOH, 2003), por exemplo, filtros UV são

destinados a permanecer mais tempo sobre a superfície da pele. Nanocápsulas

poliméricas contendo filtros lipofílicos, como o Octil metoxicinamato (Parsol MCX –

OMC) vem sendo estudadas (ALVAREZ-ROMÁN et al., 2001). A liberação in vitro

das nanocápsulas com OMC é governada pela hidrofobicidade e cristalinidade do

polímero e pela lipofilicidade do componente ativo. As nanocápsulas com OMC

fornecem uma proteção significativamente maior contra eritema induzido por UV em

comparação com a formulação em gel convencional devido à formação de um filme na

superfície da pele.

2.3.2. Sistemas nanolipídicos sólidos

2.3.2.1. Definições

As NLS são compostas por excipientes bem tolerados pela pele, podendo ser

empregados em formulações farmacêuticas e cosméticas (MÜLLER et al., 2000). As

substâncias utilizadas nesses sistemas incluem triglicerídeos, glicerídeos, ácidos graxos

como, por exemplo, o ácido esteárico (YUAN et al., 2007), palmitato de cetila

(KUMAR et al., 2006; TEERANACHAIDEEKUL et al., 2008) e ceras naturais como:

35

cera de carnaúba (HERNÁNDEZ e GOYMANN 2005, 2006a, 2006b, 2007; MÜLLER

et al., 2007), manteiga de cacau (KIM et al., 2005) e cera de abelha (JENNING e

GOHLA 2000).

NLS representam uma categoria de carreadores para ingredientes cosméticos de

atual e crescente interesse devido a uma série de vantagens quando comparadas a

formulações convencionais (WISSING, A.S. 2002), tais como:

Proteção de compostos lábeis contra degradação química, por exemplo, retinol e

tocoferol (DINGLER, 1998; JENNING e GOHLA, 2000); retinol e coenzima

Q10 (MÜLLER et al., 2000). O efeito da formulação sobre as características

físico-químicas da substância associada deve ser investigado individualmente,

propiciando desta forma, o desenvolvimento de formulações adequadas para

cada caso (LIM e KIM, 2002);

NLS agem como agentes oclusivos, isto é, essas partículas podem ser usadas

para aumentar o conteúdo de teor de água da pele (WISSING et al., 2001).

Wissing e Müller (2003) mostraram que o grau de oclusão que NLS podem

proporcionar pode ser controlado pelo tamanho das partículas. Esses autores

também demonstraram in vivo que elas são um excelente veículo de hidratação.

NLS podem então representar um efetivo carreador para cremes cosméticos com

ação hidratante;

Bloqueadores solares devem agir na superfície da pele, ter pouca penetração na

epiderme, derme e no sistema circulatório (POTARD et al., 2000). Também a

presença de protetor solar no estrato córneo previne reações fototóxicas e

fotoalérgicas já observadas com vários bloqueadores químicos de UV

(WISSING, A.S. 2002). O grau de penetração depende das propriedades físico-

químicas do composto ativo e da natureza do veículo no qual o protetor é

aplicado, tipo de veículo, etc. Portanto, o desenvolvimento de produtos

adequados para prevenir penetração do protetor solar na pele é um desafio para

fabricantes de produtos cosméticos. NLS estão sendo introduzidas como

carreadores de filtros solares, de ação física ou química (WISSING e MÜLLER,

2003; SAUPE, 2004).

36

Após o surgimento das NLS uma segunda geração de nanocarreadores foi

desenvolvida: os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN- Nanostructured

Lipid Carriers), considerado um novo tipo de nanopartícula lipídica utilizando misturas

de lipídios sólidos e líquidos. A partícula lipídica resultante apresenta uma estrutura

nanoparticulada sólida com imperfeições na estrutura cristalina, causadas pela presença

do lipídio líquido (óleo), como mostra a Figura 3 (MÜLLER et al., 2002).

Os CLN apresentam vantagens como as observadas nas NLS como a capacidade

de proteção química de componentes lábeis contra decomposição, a possibilidade de

liberação controlada de substâncias, de formação de um filme sobre a pele e

propriedades oclusivas (MÜLLER et al., 2002). No entanto, apresentam outras

vantagens quando comparadas com as NLS como, por exemplo, uma maior capacidade

de encapsulação e maior estabilidade em função das imperfeições na estrutura cristalina

e por isso o desenvolvimento de muitas formulações de aplicação cosmética com CLN

vem aumentando gradualmente (MÜLLER et al., 2007).

Figura 3. A- NLS: Matriz lipídica cristalina perfeita com uma capacidade de

encapsulação limitada. B- CLN: Matriz lipídica cristalina com algumas imperfeições,

podendo induzir um aumento da capacidade de encapsulação (Adaptado de Müller et al,

2007).

Finalmente, partículas do tipo NLS e CLN apresentam certas vantagens com

relação a outros sistemas (LIU et al 2006): combinam as vantagens dos lipossomas

(inocuidade dos constituintes) e vantagens das partículas poliméricas (matriz sólida)

evitando seus inconvenientes (MÜLLER et al., 2007). Outras vantagens destes

carreadores são a composição (matérias-primas biocompatíveis), o processo rápido e

37

efetivo de produção, a possibilidade de evitar o uso de solventes orgânicos e a produção

de suspensões com altas concentrações lipídicas (MULLER et al., 2002; LIM e KIM,

2002). No entanto, transformações químicas susceptíveis de ocorrer com os lipídios

podem alterar a estrutura destes sistemas nanoestruturados, a capacidade de encapsular e

as propriedades de liberação do encapsulado e modificações físicas podem também

ocorrer (HEURTAULT et al, 2003). Estas características serão abordadas a seguir,

ligadas à estabilidade destes sistemas.

2.3.2.2. Estabilidade física

2.3.2.2.1. Modificações dos lipídios

2.3.2.2.1.1. Cristalização-polimorfismo

O estado sólido de matrizes lipídicas reduz a mobilidade molecular e permite a

prolongação da liberação de uma substância ativa no meio externo (MÜLLER et al.,

2000). No entanto, a natureza lipídica da matriz é também fonte de problemas de

instabilidade devido à etapa de cristalização e também a problemas associados de

polimorfismo. O polimorfismo cristalino é certamente um dos principais parâmetros que

afetam a estabilidade coloidal destes sistemas e sua capacidade de encapsulação.

O polimorfismo cristalino é definido como a capacidade de uma substância

orgânica ou mineral de existir sob diferentes estruturas cristalinas. Estas estruturas

provêm de uma variedade de conformações e arranjos moleculares possíveis (SATO e

GARTI, 1988a, 1988b). O polimorfismo é uma das mais importantes vias de

degradação física que afeta a estabilidade de um material cristalino porque, mesmo se

eles são quimicamente idênticos, diferentes polimorfos apresentam geralmente

propriedades termodinâmicas diferentes como a temperatura de fusão ou a solubilidade.

Partículas lipídicas são constituídas de lipídios que são geralmente sólidos à

temperatura ambiente. A maior parte destas partículas é formada a partir de glicerídeos.

As principais formas polimorfas de glicerídeos são as formas , e ’ (SATO e

GARTI, 1998a, 1988b). Após um resfriamento rápido, uma dispersão fundida de

glicerídeos se recristaliza sob a forma instável . Esta estrutura pouco organizada evolui

ao longo do tempo (durante um período de estocagem, por exemplo) para uma forma

38

cristalina estável apresentando uma melhor organização, a forma , passando para a

forma ’. Este rearranjo cristalino pode, por exemplo, levar a uma perda da esfericidade

inicial de uma partícula lipídica e a aparição de cristais sob a forma de plaquetas na sua

superfície (SATO e GARTI, 1988a, 1988b; SIEKMAM et al. ,1992; SIEKMAM e

WESTESEN, 1994).

O polimorfismo dos glicerídeos tem por conseqüência direta um aumento do

ponto de fusão da substância, onde os constituintes passam mais ou menos rapidamente

da forma cristalina instável à forma cristalina estável . A velocidade de transição

está diretamente relacionada à temperatura de estocagem e esta velocidade será maior se

a estocagem do material for realizada a uma temperatura inferior, mas próxima do ponto

de fusão. Por exemplo, a cristalização da trimiristina (triglicerídeo cuja cadeia carbônica

de ácido graxo é em C14) conduzindo à forma instável se dá a 28°C. Após rearranjo

da estrutura cristalina para a forma estável , a fusão desta forma cristalina ocorre a

56°C (BUNJES et al., 1996).

O comprimento das cadeias de triglicerídeos influencia a temperatura de fusão

da forma : para cadeias longas (tristearina em C18 a 73ºC, tripalmitina em C16 a

64°C), a temperatura de fusão da cadeia se produz a uma temperatura mais elevada

que para as cadeias curtas (trimiristina em C14 a 56°C, trilaurina em C12 a 47°C)

(BUNJES et al., 1996).

Além disso, a cristalização de triglicerídeos sob forma dispersa (micro e

nanoparticulas) se efetua a uma temperatura menor que para os triglicerídeos em forma

não dispersa (massa sólida contínua). No caso da trimiristina, a recristalização em massa

sólida não dispersa se dá a 28°C enquanto que, sob forma de partículas, ela ocorre a 9°C

(WESTESEN et al., 1993; 1995; FREITAS e MULLER, 1999). Esta defasagem em

temperatura pode ser atribuída à presença de tensoativos na forma dispersa, mas

também ao fato que, sob forma dispersa a cristalização ocorre em pequenos volumes,

limitados e independentes. Enquanto que, em volume (massa contínua de material), a

partir da formação de pequenos núcleos, a cristalização se desenvolve rapidamente em

toda a massa contínua de material. Nos sistemas dispersos, a cristalização deve então

começar em cada gota dispersa, independentemente do estado cristalino das outras

gotas. Como conseqüência, partículas preparadas a partir de triglicerídeos, sólidos à

39

temperatura ambiente, podem não necessariamente se recristalizar após resfriamento a

temperaturas de estocagem desejadas, inferiores à temperatura esperada de cristalização.

Westesen e Bunjes (1995, 1997) observaram que suas partículas coloidais dispersas à

base de trimiristina e de trilaurina permaneciam em estado líquido após vários meses de

estocagem à temperatura ambiente, em um estado chamado de sub-fundido. Este estado

não é termodinamicamente estável. Ao longo do tempo de estocagem, uma cristalização

parcial vai ocorrer e as propriedades das partículas vão evoluir.

O polimorfismo observado nas partículas lipídicas sólidas também influencia a

capacidade de encapsulação destes sistemas. Ao longo de um processo de produção, as

moléculas ativas são dissolvidas ou dispersas na fase lipídica fundida. Após o

resfriamento e, portanto, devido à recristalização sob forma pouco estável e ordenada

dos lipídios (forma alfa), as moléculas ativas vão preferencialmente se localizar nas

zonas amorfas, ou seja, nas regiões menos organizadas da matriz cristalina (JENNING

et al., 2000).

Em ocorrendo o rearranjo cristalino conduzindo à forma mais estável , o

aumento da organização da estrutura lipídica resulta em uma redução das regiões

desorganizadas e em uma conseqüente expulsão das moléculas ativas até então

encapsuladas na partícula (PIETKIEWICZ et al., 2006).

Do mesmo modo, se a matriz lipídica é composta de um só tipo de lipídio (por

exemplo, glicerídeo de alta pureza como a tristearina), a cristalização conduz à

formação de um cristal perfeitamente ordenado apresentando poucos defeitos

(WESTESEN et al., 1995). Isto significa que esta matriz dificilmente poderá incorporar

de maneira eficaz uma quantidade significativa de moléculas ativas.

Em suma, o polimorfismo, é em particular, o rearranjo na forma estável de

cristais lipídicos e representa, em um primeiro momento, uma limitação no

desenvolvimento dos sistemas lipídicos sólidos, já que podem levar à expulsão das

moléculas ativas encapsuladas. No entanto, o importante é poder controlar esta

transformação polimórfica, utilizando-se, por exemplo, os Carreadores lipídicos

nanoestruturados (CLN) já discutidos (Figura 3) que começaram a ser desenvolvidos

explorando-se o conceito da ―imperfeição‖ para o desenvolvimento destas estruturas

(MÜLLER et al., 2002), o que também será abordado no decorrer deste trabalho

40

pela associação de diferentes matrizes lipídicas (cera de carnaúba e oleato de

isodecila).

2.3.2.2.1.2. Gelificação

O fenômeno da gelificação de partículas lipídicas corresponde à transformação

de uma suspensão aquosa de baixa viscosidade em um gel viscoso. Na maior parte dos

casos, a formação destes géis é um processo irreversível que conduz à perda da estrutura

coloidal do sistema (MEHNERT et al., 2001).

Siekmann e Westesen (1997) sugerem que a formação do gel está diretamente

ligada ao processo de cristalização dos lipídios. Lipídios cristalizados evoluem para

uma estrutura mais estável, , caracterizada por cristais sob forma de plaquetas que se

desenvolvem na superfície das partículas. Esta superfície criada ao longo da

cristalização precisa ser rapidamente estabilizada por tensoativos. As partículas lipídicas

sólidas descritas no estudo destes autores são estabilizadas por uma monocamada de

fosfolipídios. Os fosfolipídios em excesso se encontram sob forma de vesículas no meio

contínuo e apresentam mobilidade reduzida. Assim, eles não são capazes de cobrir

imediatamente este aumento de área superficial criado com o rearranjo cristalino. Estas

interfaces cristalizadas recobertas por pouco tensoativo representam sítios privilegiados

de agregação de partículas, ponto de partida para a formação do gel.

Até o presente momento, os mecanismos envolvidos na formação destes géis

não são precisamente descritos na literatura. No entanto, a influência de determinados

parâmetros já foi claramente demonstrado (FREITAS e MÜLLER, 1998; 1999). A

equipe de Freitas demonstrou que temperaturas elevadas, exposição à luz ou ainda

aplicação de uma força mecânica favorecem a gelificação de uma suspensão de

partículas lipídicas sólidas. De fato, a variação de um destes fatores externos aumenta a

energia cinética das partículas e a probabilidade de suas colisões, favorecendo a

formação do gel. Os autores demonstraram, por exemplo, que uma estocagem no escuro

a 8°C retardava a aparição deste fenômeno.

2.3.2.2.2. Modificações das nanodispersões

Nanoemulsões, lipossomas ou nanopartículas lipídicas sólidas podem sofrer

alterações de suas características físicas como floculação, cremeação, sedimentação e

41

coalescência, Ostwald ripening, dentre outros (HEURTAULT et al., 2003). Estes

fenômenos de desestabilização podem ser reversíveis, envolvendo agregação de gotas e

migração ou irreversíveis, relacionados com a modificação do tamanho de gotas

(ABISMAÏL et al., 1999). Os fenômenos reversíveis são cremeação, sedimentação,

floculação e os irreversíveis são coalescência e Ostwald ripening (difusão molecular).

2.3.2.2.2.1. Cremeação

Este processo pode ocorrer devido à diferença de densidades das fases do

sistema (fase lipídica e fase aquosa); as gotículas ou nanopartículas tendem a migrar

para a porção superior da suspensão. É um mecanismo reversível, onde o produto pode

ser reconstituído por agitação ou mistura (LACHMAN et al., 2001).

Figura 4. Processo de cremeação (Adaptado de Pinheiro, 2008).

2.3.2.2.2.2. Sedimentação

É o processo inverso ao mecanismo de cremeação, porém, neste caso, a

densidade da fase lipídica é superior à da fase aquosa. Os fatores que influenciam a

ocorrência deste tipo de desestabilização são os mesmos descritos no item 2.3.2.2.2.1.

Figura 5. Processo de sedimentação (Adaptado de Pinheiro, 2008).

42

2.3.2.2.2.3. Floculação

Neste processo duas nanopartículas ou gotículas vão se ligar umas às outras, mas

estando ainda separadas por uma camada líquida. Quando mais entidades estão

envolvidas, um agregado é formado (LIEBERMAN et al., 1988). Ocorre quando as

forças atrativas de Van der Waals excedem as repulsivas (TADROS, 2004).

Figura 6. Processo de floculação (adaptado de PINHEIRO, 2008).

2.3.2.2.2.4. Coalescência

A coalescência é caracterizada por uma ampla distribuição do tamanho de

gotículas de sistemas emulsionados, porém sem a presença de agregados das mesmas.

Este processo ocorre através de uma diminuição da espessura e ruptura do filme

existente ao redor das gotículas oleosas dispersas que se unem, promovendo uma

separação de fases (TADROS, 2004). Estas gotículas vão se tornando cada vez maiores,

até atingirem um ponto visível a olho nu, gerando a separação de fases, onde duas

camadas distintas do sistema são reconhecíveis (LIEBERMAN et al., 1988).

Figura 7. Processo de coalescência (adaptado de Pinheiro, 2008).

43

2.3.2.2.2.5. Ostwald ripening

Também conhecida como difusão molecular, trata-se de um mecanismo onde

gotículas pequenas da fase dispersa têm uma solubilidade finita na fase externa do

sistema. Neste caso, muitas gotículas pequenas formadas inicialmente agem como

pequenos núcleos que vão se incorporando às gotículas maiores formadas,

desaparecendo lentamente. Conforme estas gotículas crescem, a área ao redor delas é

diminuída (WELIN e BERGENSTAHL, 2000).

Figura8. Processo de Ostwald ripening (adaptado de Pinheiro, 2008).

2.3.2.2.3. Técnicas de caracterização

Os métodos de caracterização podem ser parâmetros sensíveis para prever o

desempenho das NLS e prever a formação de algum produto de degradação

(MEHNERT e MADER, 2001). No entanto, a caracterização é considerada um grande

desafio devido ao tamanho das partículas e a complexidade destes sistemas (LIM e

KIM, 2002; VENKATESWARLU e MANJUNATH, 2004). A estabilidade física das

nanopartículas lipídicas sólidas tem sido investigada intensivamente por: determinação

do tamanho de partícula (Espectroscopia de Correlação de fótons, Difração a laser,

microscopia eletrônica), de carga superficial (Potencial zeta) e análise térmica

(Calorimetria exploratória diferencial) (BUNJES et al., 1996; MEHNERT e MADER,

2001; SAUPE e RADES, 2006).

2.3.2.2.3.1. Tamanho de partículas

O tamanho de partículas é geralmente escolhido como primeiro parâmetro de

qualidade de produto. A espectroscopia de Correlação de Fótons (PCS) e a Difração a

Laser (LD) são os métodos comumente usados para determinar o tamanho e a

44

distribuição das nanopartículas lipídicas sólidas, parâmetro importante para o controle

de processo e particularmente em relação à qualidade do produto (MÜLLER-

GOYMANN, 2004).

O PCS consiste na medida da flutuação da intensidade da luz de espalhamento,

que é provocada pelo movimento da partícula. Esse método mede área de poucos

nanômetros até cerca de 3 microns. Já as partículas maiores são medidas por LD, esse

método é baseado na medida do ângulo de difração da partícula (Espectro de

Fraunhofer), onde partículas de menor tamanho provocam uma difração mais intensa

quando comparadas com partículas maiores. Esses dois métodos não medem

diretamente o diâmetro das partículas, mas medem os efeitos da difração da luz, os

quais são utilizados para calcular o diâmetro (MÜLLER et al., 2000; MEHNERT e

MADER, 2001).

As suspensões de NLS apresentam aspectos adicionais de estabilidade quando

comparados a outros sistemas lipídicos devido a eventos de cristalização e

polimorfismo do lipídio disperso. A análise do tamanho de partícula é necessária, mas

não é suficiente para caracterizar a qualidade das NLS; deve-se ter especial atenção à

caracterização em relação ao grau de cristalização e modificação do lipídio, que podem

afetar a incorporação e liberação do ativo. Alguns métodos como Calorimetria

Exploratória Diferencial (DSC) e Difração de Raios-X (DRX) são comumente

usados para investigar o status cristalino do lipídio (MEHNERT e MADER, 2001;

HEURTAULT et al., 2003).

2.3.2.2.3.2. Calorimetria exploratória diferencial

A Calorimetria exploratória diferencial (DSC) mede a diferença de energia

necessária entre a substância analisada e um material de referência (inerte de modo

térmico), enquanto ambos são submetidos a uma variação controlada de temperatura, de

maneira que a amostra e a referência sejam mantidas em condições isotérmicas.

Informações sobre a cristalinidade, transição polimórfica, temperatura de fusão,

entalpia e o grau de cristalização do lipídio fundido neste tipo de nanopartículas (NLS,

CLN) podem ser obtidas por DSC (HEURTAULT et al., 2003). O caráter

discriminativo da análise se baseia no fato de diferentes formas polimórficas lipídicas

45

apresentarem diferentes pontos de fusão e entalpias. A transição de fases é

acompanhada pela mudança da energia livre, que acontece devido à alteração da

entalpia e entropia do sistema (MÜLLER et al., 2000; MÜLLER-GOYMANN, 2004).

2.3.2.2.3.3. Difratometria de Raios-X

A difração de raios-x (DRX) é uma técnica que consiste na emissão um feixe de

raios-X através de um cristal da substância sujeita ao estudo. O feixe se difunde em

várias direções devido à simetria do agrupamento de átomos e, por difração, dá lugar a

um padrão de intensidades que pode interpretar-se segundo a distribuição dos átomos

no cristal, aplicando a lei de Bragg. De acordo com esse método é possível avaliar o

comprimento de espaços internos na rede cristalina lipídica (MÄDER et al., 2001;

VILLAFUERTE et al., 2008). Os lipídios se recristalizam parcialmente e uma

transformação polimórfica em função do tempo de armazenamento pode provocar a

expulsão do ativo encapsulado ou até mesmo interferir na sua liberação; tal problema

poderia ser resolvido com a formação de estruturas cristalinas menos ordenadas,

desordem essa, que pode ser determinada pela técnica de difração de Raios-X

(VILLAFUERTE et al., 2008).

2.3.2.2.3.4. Potencial zeta

A medida do potencial zeta é um indicador prático e importante da carga

superficial das partículas que pode ser usado para prever e controlar a estabilidade de

sistemas coloidais e emulsões. A medida do potencial zeta é obtida a partir de

fenômenos decorrentes da movimentação das partículas utilizando o princípio de

espalhamento da luz, em relação ao meio em que estão dispersas, provocando o

rompimento da dupla camada elétrica (DCE), no plano de cisalhamento (HUNTER,

1993). Esse método indica a estabilidade durante o tempo de armazenamento e

influencia nas propriedades das dispersões coloidais, tais como: estabilidade, interação

com os eletrólitos, e a reologia da suspensão. Em módulo, um valor de potencial zeta

relativamente alto é importante para uma boa estabilidade físico-química da suspensão

coloidal, pois grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação em função das

colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes (SCHAFFAZICK e GUTERRES,

2003). No entanto, essa regra não pode ser estritamente aplicada em sistemas que

http://dicionario.babylon.com/Feixe%20%28f%C3%ADsica%29#!!9G2CGKRAUE

http://dicionario.babylon.com/cristal#!!9G2CGKRAUE

http://dicionario.babylon.com/subst%C3%A2ncia#!!9G2CGKRAUE

http://dicionario.babylon.com/%C3%A1tomo#!!9G2CGKRAUE

46

contém estabilizantes estéricos, porque sua adsorção vai diminuir o potencial zeta

devido à transferência de cargas na superfície da partícula (MÜLLER et al., 2000).

2.3.2.2.3.5. Turbidimetria dinâmica

A turbidimetria quantifica, em uma emulsão ou suspensão de partículas, o

quanto um feixe de luz incidindo em uma amostra é desviado pelas partículas dispersas.

A turbidez depende essencialmente destas entidades de tamanho coloidal presentes na

fase líquida, da diferença do índice de refração entre as partículas e o meio líquido e da

distribuição de tamanho das partículas. Dispersões e colóides são inerentemente

sistemas instáveis que podem ser considerados como cineticamente estáveis se a taxa de

desestabilização for suficientemente pequena quando comparada com o ciclo de vida

esperado (MENGUAL, 1999). Técnicas comumente usadas para detectar a

desestabilização física são a olho nu ou através do uso de instrumentos analíticos mais

acurados e confiáveis, porém para a realização desses métodos são necessárias

diluições, reduzindo a acuidade e precisão dessas medidas (MENGUAL et al., 1999).

O equipamento Turbiscan® foi desenvolvido para preencher essa lacuna e

permitir a análise da estabilidade física de emulsões e dispersões, com base na técnica

de turbidimetria dinâmica.

O equipamento possui um detector que se move para cima e para baixo ao longo

de uma célula cilíndrica de vidro. O detector é composto por uma fonte de luz

infravermelha e dois detectores sincronizados. O detector de transmissão recebe a luz

que passa através da amostra enquanto que o detector de backscattering recebe a luz

desviada pela amostra. O princípio da análise é baseado na variação da fração

volumétrica da partícula ou gota, resultando na variação da transmissão e do

backscattering (Figura 9). Através desta análise é possível identificar fenômenos de

migração da partícula ou gota como: cremeação e sedimentação, e fenômenos de

alteração de diâmetro como: floculação e coalescência. A maior vantagem de utilização

do Turbiscan Lab® é a detecção dos fenômenos de instabilidade em suspensões,

emulsões e espumas não diluídas, muito antes que estes fenômenos sejam detectados

por observação visual do analista, especialmente no caso de sistemas opacos e

concentrados (MENGUAL et al., 1999; LEMARCHAND et al., 2003).

47

Figura 9. Representação esquemática do funcionamento do Turbiscan® (Adaptado de

Pinheiro, 2008)

2.3.2.2.3.6. Viscosidade

A medida da viscosidade é uma ferramenta valiosa para o controle de qualidade

dos ingredientes e do produto final. Ela também permite monitorar mudanças no

produto durante o armazenamento e propicia dicas valiosas em relação às mudanças na

microestrutura do sistema (MÄDER et al., 2004). Dentre elas, o fenômeno de

gelificação, que corresponde à transformação de um sistema de baixa viscosidade em

um gel viscoso (HEURTAULT et al, 2003).

2.3.2.3. Processos de preparação de nanopartículas lipídicas sólidas

Nanopartículas lipídicas sólidas podem ser obtidas por processos diversos que

serão descritos a seguir.

2.3.2.3.1. Emulsificação – evaporação de solvente

Sjöström e Bergenstahl descreveram um método de produção para preparar uma

dispersão de nanopartículas lipídicas sólidas a partir de emulsões do tipo o/a. Nesse

método o ativo é solubilizado na pré-solução de lipídio e solvente orgânico, o qual é

emulsificado na fase aquosa contendo um tensoativo. A seguir, procede-se a evaporação

do solvente em baixas pressões e a dispersão de nanopartículas é formada pela

precipitação do lipídio em meio aquoso. O tamanho de partícula depende do tamanho de

48

gotículas formadas na emulsão. Pode-se empregar agitação forte (Ultra-turrax®) ou

mesmo posterior homogeneização em alta pressão. Uma importante vantagem dessa

técnica em relação a outras técnicas onde a matriz lipídica é fundida é que se evita,

através deste método, riscos de estresse térmico do ativo sendo encapsulado (TROTTA

et al., 2003).

O processo para produção de NLS pela técnica de emulsificação - evaporação de

solvente é mostrado no esquema da Figura 10.

Figura 10. Esquema da produção de NLS pelo método emulsificação-evaporação de

solvente (adaptado de Sjöström e Bergenståhl,1992).

2.3.2.3.2. Homogeneização em alta pressão (HPH)

A homogeneização em alta pressão tem surgido como uma técnica segura e

importante para a preparação de NLS. Homogeneizadores de tamanhos diferentes são

comercialmente disponíveis no mercado e esta técnica tem sido usada há anos na

produção de nano-emulsões para nutrição parenteral. Ao contrário de outras técnicas, o

scaling up não representa problema na maioria dos casos.

49

O homogeneizador bombeia o líquido com pressão alta (100-2000 bar), através

de uma abertura estreita (na faixa de alguns microns). O fluido é acelerado numa

distância muito curta com velocidade muito alta (acima de 1000 km/h). Um alto grau de

cisalhamento e forças de cavitação rompem as gotículas na faixa de sub-microns

(MEHNERT e MADER., 2001).

Existem duas maneiras de realizar a etapa de homogeneização: homogeneização

a quente e a frio. Em ambos os casos, a etapa preliminar envolve a incorporação do

ativo no lipídio pela dissolução ou dispersão do ativo num lipídio fundido (MEHNERT

e MÄDER, 2001; TROTTA et al.., 2003). A Figura 11 mostra uma comparação

esquematizada dos processos de homogeneização a quente e homogeneização a frio.

2.3.2.3.2.1. Homogeneização a quente

A homogeneização a quente é feita a temperaturas acima do ponto de fusão do

lipídio e pode ser considerada como a homogeneização de uma emulsão. É obtida uma

pré-emulsão do lipídio fundido com o ativo e a fase aquosa com o emulsificante (na

mesma temperatura) com alto cisalhamento (Ultra-Turrax®). As gotículas obtidas estão

na faixa de micrômetros. Essa pré-emulsão é recirculada no homogeneizador de alta

pressão, a temperaturas acima do ponto de fusão do lipídio. Em geral, temperaturas

maiores produzem menor tamanho de partículas, devido à diminuição da viscosidade da

fase interna. No entanto, temperaturas altas podem também favorecer a degradação do

ativo e do carreador. A etapa de homogeneização pode ser repetida várias vezes.

Durante a etapa de homogeneização com alta pressão (500 bar) incrementa-se a

temperatura da amostra em aproximadamente 10C. Na maioria dos casos, são

suficientes 3-5 ciclos de homogeneização (pressão de 500-1500 bar). No entanto, o

aumento da pressão de homogeneização ou do número de ciclos pode também favorecer

a coalescência das partículas devido ao aumento de energia cinética fornecida

(MAGDASSI, 1997; WISSING e MÜLLER, 2001; MÜLLER et al., 2002)

O produto primário da homogeneização a quente é uma nano-emulsão devido ao

estado líquido do lipídio. O resfriamento da nano-emulsão até uma temperatura igual ou

inferior à ambiente resulta na solidificação e formação das nano-partículas lipídicas

(forma sólida).

50

Em alguns casos, devido ao tamanho muito pequeno das partículas e à presença

do emulsificante, a cristalização da nano-emulsão pode ser fortemente retardada e o

produto pode permanecer como um fundido super-resfriado por vários meses

(MEHNERT e MÄDER, 2001).

2.3.2.3.2.2. Homogeneização a frio

Diferente da homogeneização a quente, a homogeneização a frio é feita com o

lipídio sólido e envolve a moagem de uma suspensão, a alta pressão. O controle da

temperatura é necessário para assegurar um estado não-fundido do lipídio devido ao

incremento da temperatura durante a homogeneização.

A homogeneização a frio tem sido desenvolvida para superar os seguintes

problemas da técnica de homogeneização a quente:

1- A temperatura pode induzir a degradação de ativo;

2- Distribuição de ativo numa fase aquosa durante homogeneização;

3- A complexidade da etapa de cristalização da nano-emulsão levando a várias

modificações e o fundido sobre-resfriado.

A primeira etapa preparatória é a mesma que para o processo de

homogeneização a quente e inclui a solubilização ou dispersão do ativo num lipídio

fundido (Figura 11). Porém, as etapas seguintes são diferentes. O lipídio fundido que

contém o ativo é resfriado bruscamente (por meio de gelo seco ou nitrogênio líquido), o

que favorece a distribuição homogênea do ativo dentro da matriz lipídica. É feita a

moagem a micro-partículas (50 a 100microns) do sólido, lipídio, contendo ativo.

Essas micropartículas lipídicas são dispersas em uma solução fria de um

tensoativo, formando uma pré-suspensão, que é homogeneizada em seguida, para que e

as forças de cavitação quebrem as micropartículas diretamente em nanopartículas

(GOHLA et al., 2000).

As partículas obtidas na técnica de homogeneização a frio são em geral de

tamanho maior e possuem uma ampla distribuição quando comparadas com as

partículas obtidas na técnica de homogeneização a quente. A homogeniezação a frio

minimiza a exposição térmica da amostra, mas não a evita totalmente devido à etapa

51

inicial do processo, quando ocorre a fusão do lipídio para a dispersão do ativo

(MEHNERT e MÄDER, 2001).

Figura 11. Processo de produção de nanopartículas lipídicas usando Homogeneização

a alta pressão a frio (Cinza claro) e Homogeneização a alta pressão a quente (Cinza

escuro) ( Adaptado de MEHNERT e MÄDER, 2001).

2.3.3. Materiais de trabalho

O material escolhido para o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas sólidas

(convencionais NLS e modificadas CLN) neste trabalho foi a cera de carnaúba como

lipídio de base. O ativo de interesse foi a benzofenona-3 (BZ-3). As principais

características destes materiais serão resumidas a seguir.

2.3.3.1. Cera de carnaúba

A cera de carnaúba é obtida da árvore da carnaúba (Copernicia prunifera). É um

material que possui um ponto de fusão de 81 a 86°C e consiste num complexo de

52

misturas de alto peso molecular: ésteres de ácido e hidroxiácidos (BODMEIER, 2002).

Serve à indústria farmacêutica (como polidor para drágeas), cosmética (em batons) e

alimentícia, como agente desmoldante para panificação, dentre outros.

A cera de carnaúba tem várias classificações, embora a mais conhecida e

validada internacionalmente na década de 1980 relacione os tipos 1, 3 e 4 (OLIVEIRA,

2006):

A cera de carnaúba Tipo 1 ou Prime Yellow – também conhecida vulgarmente

como ―flor‖ – tem coloração amarelo-claro e é produzida a partir do pó extraído

do ―olho‖ da palmeira.Seu principal emprego é na fabricação de cosméticos e no

recobrimento de produtos alimentícios, devido ao baixo índice de acidez, o

reduzido percentual de impurezas e por tornar-se incolor durante o processo de

fusão.

A cera de carnaúba Tipo 3 ou Light Fatty Grey- é de cor castanha ou

amarelada –produzida a partir da clarificação da cera obtida do pó denominado

―palha‖ – e vulgarmente denominada ―cauípe‖ e ―gorda clara‖. Representa o tipo

mais produzido e demandado pelas indústrias nacionais e estrangeiras, com

utilização voltada para as indústrias químicas e de informática, face ao baixo

preço, se comparada à cera tipo 1 .Quando comparada à cera de carnaúba tipo 1

(Prime Yellow), percebe-se que possui um ponto de fusão discretamente mais

baixo, índice de acidez mais elevado, menor solubilidade à maioria dos

solventes utilizados e cor mais escura.

A cera de carnaúba Tipo 4 ou Fatty Grey, à semelhança da cera tipo 3 (Light

Fatty Grey), também é proveniente do pó extraído da ―palha‖, mas não sofre

processo de clarificação, mantendo sua cor natural, marrom-escuro ou marrom-

esverdeado, tendendo a negro. Aplica-se em usos menos sofisticados, como

polidores para piso. Quando comparada com a cera de carnaúba Tipo 3 (Light

Fatty Grey), percebe-se que os parâmetros físico-químicos são idênticos, de

forma que a única diferença entre ambas é a cor. Por não passar pela etapa de

clarificação durante sua produção, esta cera é bastante escura, o que inibe sua

utilização em processos produtivos nos quais a interferência da coloração dos

insumos utilizados deve ser mínima, o que restringe sua demanda.

53

Estudos relatados na literatura descrevem o desenvolvimento de CLN de cera de

carnaúba e oleato de decila para veicular protetores solares inorgânicos (sulfato de

bário, carbonato de estrônico e dióxido de titânio) e demonstram efeito bloqueador UV

dos carreadores lipídicos. Para efeito comparativo foram manipulados CLN sem o

pigmento, na presença do protetor solar e também o pigmento disperso (não

encapsulado). Os resultados revelaram que a presença dos nanocarreadores aumentou

consideravelmente o fator de proteção solar (FPS) dos ativos estudados

(VILLALOBOS-HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005, 2006b, 2007. Na feira

In-Cosmetic em Barcelona em Abril de 2006, uma dispersão de CLN composta de cera

de carnaúba e óleo de semente de groselha negra foi apresentada, de nome comercial

Nanolipid CLRTM

(MÜLLER et al., 2007).

2.3.3.2. Benzofenona-3

As benzofenonas começaram a ser utilizadas como filtros solares no final da

década de 50. A benzofenona-3 (BZ-3) (2-hidroxi-4-metoxibenzofenona) ou

oxibenzona, um composto lipofílico, é o mais utilizado dessa categoria nos Estados

Unidos (NEDOROST, 2003). A BZ-3 (Figura 12) é um congênere monometoxilado da

2-hidroxibenzofenona que é encontrada em pigmentos de plantas. Ela pode ser

sintetizada pela reação entre o 2-hidroxianisol e cloreto de benzoíla (STECHER, 1958).

É um derivado benzafenônico utilizado em aplicações tópicas como filtro solar químico

e agem absorvendo e dissipando a radiação UVA, porém absorvendo em menor

intensidade, na região UVB (SUZUKI et al., 2004).

Embora seja um filtro amplamente utilizado, a BZ-3 pode causar reações

adversas. Causando eritemas faciais em pessoas alérgicas a este composto

(NEDOROST, 2003), podendo provocar também urticária logo após aplicação e uma

dermatite tardia (COLLINS; FERGUSON, 1994).

54

Figura 12. Estrutura da benzofenona-3 (SHAATH, 1997).

Estudos têm demonstrado que a BZ-3 pode penetrar através da barreira

epidérmica após sua aplicação por fricção na superfície do corpo. Hayden e

colaboradores (1997) quantificaram a absorção sistêmica da BZ-3 em voluntários

humanos. Após 12 horas de ensaio, 1% a 2%, da quantidade de BZ-3 aplicada na pele,

foi detectada na urina. Nesta pesquisa foram utilizadas quantidades de filtro seis vezes

maiores que as utilizadas para determinação do fator de proteção solar (HAYDEN et al.,

1997).

Algumas referências na literatura indicam a veiculação de BZ-3 em diferentes

nanocarreadores. Santos (2007) caracterizou a inclusão de BZ-3 em lipossomas e

desenvolveu uma formulação fotoprotetora. Paese (2008) avaliou comparativamente a

permeação cutânea in vitro da BZ-3 a partir de nanocápsulas poliméricas incorporadas

em diferentes formulações semi-sólidas. Siqueira (2008) determinou a influência da

carga de superfície das nanocápsulas revestidas com quitosana sobre as características

físico-químicas e também avaliou a penetração cutânea da BZ-3 a partir dessas

nanocápsulas incorporadas em hidrogéis. Marcato e colaboradores (2008)

desenvolveram e caracterizaram NLS com cetil ésteres contendo BZ-3 e avaliaram sua

toxicidade in vivo. Os ensaios de toxicidade (cultura de células zebrafish embryos)

sugeriram que as NLS contendo BZ-3 diminuem o risco de danos na pele e são

considerados carreadores interessantes para protetores solares, por apresentarem uma

boa estabilidade e baixa toxicidade.

55

3. OBJETIVOS

56

3. OBJETIVOS

O presente trabalho tem por objetivo geral desenvolver um nanocarreador

lipídico à base de cera de carnaúba, veiculando benzofenona-3 como um ativo modelo

lipofílico.

Seus objetivos específicos:

Desenvolver sistemas nanoestruturados à base de cera de carnaúba;

Investigar o efeito de variáveis de formulação e de processo nas características

das nanopartículas formadas (estudo de formulação e processo na ausência de

ativos);

Incorporar benzofenona-3 como ativo modelo (proteção solar) em

nanopartículas lipídicas sólidas nanoestruturadas e caracterizá-las físico-

químicamente.

Verificar o desempenho desses sistemas de liberação nanoestruturados através

de testes in vitro: cinética de liberação e perfil de penetração.

Este tema insere-se em atividades de pesquisa realizadas no bojo da Rede Nacional

de Nanocosméticos coordenada pela Profª. Sílvia Guterres da UFRGS. O trabalho foi

realizado no Laboratório de Processos Químicos e Tecnologia de Partículas do Instituto

de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), para o qual, o

desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de substâncias ativas é uma das

principais linhas de pesquisa.

57

4. MATERIAIS E MÉTODOS

58

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS

Benzofenona-3. (2-hidroxi-4- metoxibenzofenona), fornecida pela Coordenação da

Rede Nacional de Nanocosméticos (fornecedor identificado – DELAWARE).

Cera de Carnaúba. Três tipos de ceras de carnaúba foram gentilmente cedidas pela

empresa Cerapeles Ltda, identificadas como CERA TIPO 1, CERA TIPO 3 e CERA

TIPO 4.

Oleato de Isodecila. Oleato de Isodecila, fornecido pela Dhaymers- Química Fina

(Ficha técnica-ANEXO I).

Poloxamer 188. Poloxamer (Lutrol F 68), co-polímero de bloco usado como agente

tensoativo não-iônico, doado pela BASF Ltda.

Dimeticone. Silicone de cadeia básica, de grande uso em formulações, fornecido pela

Dow Corning.

Fenoxietanol F. Conservante empregado na área cosmética devido ao seu amplo

espectro de ação.

Polisorbato 80. Agente tensoativo não-iônico, também conhecido como Polioxietileno

(20) Monooleato de sorbitana, Tween 80. Adquirido da Anidrol produtos para

laboratório Ltda.

Nile Red. Corante fluorescente (Sigma-Aldrich).

59

4.2. MÉTODOS

4.2.1. CARACTERIZAÇÃO DAS PRINCIPAIS MATÉRIAS-PRIMAS

4.2.1.1. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IR)

Os espectros de absorção na região do infravermelho na faixa de 4000-400 cm-1

foram obtidos em um espectrofotômetro marca Nicolet modelo Avatar 360 FTIR – S,

usando brometo de potássio (KBr) como agente dispersante.

4.2.1.2. Análise Termogravimétrica (TGA)

Análise realizada na faixa de temperatura de 0ºC a 400ºC utilizando-se um

equipamento TGA/sDTA Metler-Toledo, Modelo 851e, taxa de aquecimento de

5ºC/min e fluxo de nitrogênio de 80 ml/min.

4.2.1.3. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

Análise realizada em um equipamento DSC Mettler Toledo modelo 822e para a

determinação do ponto de fusão, variação de entalpia e compatibilidade física das

amostras, que foram pesadas e hermeticamente fechadas em cadinho de alumínio com

tampa perfurada. As mesmas foram submetidas a um programa de aquecimento de -20 à

130°C com uma taxa de aquecimento de 5°C/min, fluxo de nitrogênio de 50 mL/min.

4.2.1.4. Difratometria de Raios-X (DRX)

Os difratogramas foram obtidos em um difratômetro de raios-X modelo XRD

6000 marca Shimadzu, operando com radiação CuK (ângulo de varredura variando de

5° a 80°), velocidade de 1°C por minuto, tensão de 40 kV e corrente de varredura 30

mA. As amostras foram preparadas em porta-amostras consistindo de placas circulares

de alumínio para depositar a amostra de forma homogênea sem regiões preferenciais e

com uma superfície plana, que é uma condição essencial para medidas de difração da

amostra, submetidos a uma rotação de 60 rpm.

60

4.2.2. NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS: PROCESSO E PRÉ-

FORMULAÇÃO

4.2.2.1. Preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas

A matriz lipídica, constituída de cera de carnaúba (misturada ou não a oleato de

isodecila), foi aquecida e fundida até aproximadamente 85 ± 5° C. Paralelamente, uma

fase aquosa contendo tensoativo foi aquecida aproximadamente à mesma temperatura.

As duas fases foram emulsificadas numa seqüência de duas etapas:

Etapa 1. Pré-dispersão em um sistema de agitação mecânica (agitador

Ultraturrax® Heidolph DIAX 900) a uma velocidade de agitação de 26,000 rpm durante

4 min;

Etapa 2. Homogeneização da pré-mistura formada na Etapa 1 em um

homogeneizador de alta pressão da marca APV modelo APV-2000 (Figura 13), em

condições controladas de pressão de homogeneização (bar) e ciclos de homogeneização

(passagens).Após a homogeneização o produto foi resfriado à temperatura ambiente sob

agitação.

Figura 13. Processo de homogeneização a alta pressão.

Os experimentos foram planejados usando fatorial completo com quatro fatores

a dois níveis, e executados em ordem aleatória. Duas séries de experimentos foram

realizadas, uma fixando-se, como fatores, variáveis de formulação e outra, com

61

variáveis de processo. A resposta observada foi o diâmetro de partículas e o índice de

polidispersão, adotados como parâmetro de medida da estabilidade física das

nanoemulsões. As variáveis independentes foram normalizadas no intervalo de -1 a +1.

O nível -1 representa o limite inferior e o nível +1 representa o limite superior de cada

variável. As Tabelas 2 e 4 mostram as condições dos ensaios e as Tabelas 1 e 3 mostram

os valores possíveis para cada uma das variáveis.

Tabela 1. Dois níveis reais e codificados das variáveis de entrada (estudo de

formulação).

Variáveis Codificação Nível -1 Nível +1

Concentração de emulsificante na fase aquosa (m/m) A 1% 3%

Teor total de lipídios (m) B 5% 20%

Tipo emulsificante fase aquosa C Pluronic Tween 80

Proporção mássica cera de carnaúba e oleato de

isodecila (m:m) D 2:1 m/m 1:1 m/m

Tabela 2. Matriz do planejamento fatorial 24 (estudo de formulação).

Ensaio**

Variável de entrada

(codificada)

A B C D

1 +1 +1 +1 +1

2 -1 +1 +1 +1

3 +1 -1 +1 +1

4 -1 -1 +1 +1

5 +1 +1 -1 +1

6 -1 +1 -1 +1

7 +1 -1 -1 +1

8 -1 -1 -1 +1

9 +1 +1 +1 -1

10 -1 +1 +1 -1

11 +1 -1 +1 -1

12 -1 -1 +1 -1

13 +1 +1 -1 -1

14 -1 +1 -1 -1

15 +1 -1 -1 -1

16 -1 -1 -1 -1

** As demais condições fixadas foram: tempo de preparo da pré-emulsão em

ultraturrax® de 4 min; pressão de homogeneização de 600 bar; número de ciclos igual a

5; resfriamento natural da nanoemulsão formada à temperatura ambiente; formulação

sem conservante.

62

Tabela 3. Dois níveis reais e codificados das variáveis entrada (estudo de processo).

Variáveis Codificação Nível -1 Nível +1

Número de Ciclos (passagens no homogeneizador) E 2 8

Pressão de homogeneização ( bar ) F 400 900

Taxa de Resfriamento G Banho

de gelo

Temperatura

ambiente

Tempo de preparo da pré-emulsão (ultraturrax®) H 4 min 8 min

Tabela 4. Matriz do planejamento fatorial 24 (estudo de processo).

Ensaio**


(codificada)

E F G H

17 +1 +1 +1 +1

18 -1 +1 +1 +1

19 +1 -1 +1 +1

20 -1 -1 +1 +1

21 +1 +1 -1 +1

22 -1 +1 -1 +1

23 +1 -1 -1 +1

24 -1 -1 -1 +1

25 +1 +1 +1 -1

26 -1 +1 +1 -1

27 +1 -1 +1 -1

28 -1 -1 +1 -1

29 +1 +1 -1 -1

30 -1 +1 -1 -1

31 +1 -1 -1 -1

32 -1 -1 -1 -1

** As demais condições fixadas foram: teor total de lipídios de 10% ; proporção

mássica cera de carnaúba e oleato de isodecila de 1:1; emulsificante Tween 80 na fase

aquosa a uma concentração de 1% em massa; ; formulação sem conservante.

A análise dos resultados foi feita pelo software STATISTICA for windows

versão 5.0 produzido pela StatSoft e foram fornecidos os gráficos de Pareto e de

Superfície de Resposta para a avaliação dos resultados.

63

4.2.2.2. Caracterização das Nanopartículas Lipídicas Sólidas (nano-suspensões)

4.2.2.2.1. Granulometria

A distribuição granulométrica das nano-suspensões foi avaliada por dois

diferentes métodos/equipamentos:

Em um Beckman Coulter modelo LS 13 320, após a dispersão das partículas em

água. O equipamento utiliza o princípio da difração da luz para determinar a

distribuição do tamanho de partículas em volume. Um feixe de laser é enviado

em direção à amostra líquida a ser analisada. Quando o feixe colimado encontra

as partículas, parte do laser é difratado e, subseqüentemente, focado, por meio de

lentes, no detector. Quanto menor o tamanho da partícula, maior será o ângulo

de difração. A distribuição de tamanho é avaliada em termos de d10%, d50%, d90% e

span. A notação dx% significa que x% das partículas (distribuição em volume)

estão abaixo deste valor dx%. O valor de span é uma medida indireta da

dispersão ou largura da distribuição granulométrica (igual a (d90% - d10%/ d50%).

Em um equipamento Malvern Zetasizer (Malvern Instruments, UK) que permite

deteminar o tamanho de nanoestruturas e o índice de polidispersão por

espectroscopia de correlação de fótons (PCS). A análise é realizada em meio

líquido e mede o volume hidrodinâmico das partículas atribuindo-se a elas o

formato esférico. O diâmetro médio das nanopartículas foi determinado, pela

média de três medidas, observando-se o espalhamento a 90º, após diluição das

amostras com água destilada. O índice de polidispersão, também medido por

esta análise, refere-se à distribuição de tamanho.

4.2.2.2.2. Estabilidade Física

A estabilidade física das nano-suspensões foi avaliada por diferentes

métodos/equipamentos:

Monitoramento da granulometria da fase dispersa (nanopartículas) no primeiro

dia e decorridos 10, 15 ou 20 dias da produção. Um equipamento Malvern

Zetasizer (Malvern Instruments) foi utilizado para as análises.

64

Ciclo congela-descongela das nano-suspensões (freeze-thaw cycling), segundo

metodologia descrita por Joshi e Patravale (2008). O ciclo de congelamento-

descongelamento consiste em submeter a amostra a um período de

congelamento a - 4 °C por 24 h seguido de um período de descongelamento a

40°C também por 24h. Este ciclo foi realizado para avaliação de instabilidades

físicas das nano-suspensões como precipitação e separação de fases em um

período de uma semana.

Monitoramento da instabilidade física em um analisador óptico Turbiscan Lab®,

cujo princípio de funcionamento baseia-se na incidência de uma luz com

comprimento de onda fixo, de 850 nm, sobre um tubo de vidro cilíndrico

contendo a amostra (solução, emulsão ou dispersão), fazendo-se uma varredura a

cada 40 µm, verticalmente, no sentido ascendente e descendente, desde a parte

inferior até a parte superior do tubo cilíndrico (Figura 14). O feixe de luz

emitido pode ser transmitido ou retroespalhado, dependendo da interação da luz

com o meio. Em se tratando de um sistema dinâmico, tem-se que o perfil das

curvas obtidas varia tanto em função do tempo quanto em função da altura, e os

perfis obtidos são registrados ao longo da trajetória da luz. A avaliação da

estabilidade das nano-suspensões foi feita durante um período de 24 horas à

temperatura de 25°C. A estabilidade ou instabilidade da amostra foi determinada

pelos perfis de varredura obtidos em função do tempo (cada 30 min). Se os

perfis de retroespalhamento da luz na amostra nos diferentes tempos se

sobrepõem, o produto é estável, senão, o produto é instável.

Figura 14. Esquema de funcionamento do equipamento Turbiscan® cujo principio de

operação é a turbidimetria dinâmica (transmissão e retro-espalhamento da luz).

65

4.2.2.2.3. Efeito Oclusivo

O teste de oclusão foi realizado segundo a metodologia descrita por Vringer e

Ronde (1996): 300 μ l de amostra foram espalhados homogeneamente em papel de filtro

colocados em frascos de 35 mL com 3,36 cm² de área contendo 30g de água, estocados

a 32°C por 48 h. As amostras foram pesadas decorridos diferentes períodos de tempo

para avaliação do efeito oclusivo (8, 24, e 48 h). Foram preparadas amostras em

quadruplicata e o fator de oclusão foi calculado através da equação (1):

F = A - B x 100 (1)

A

Onde,

A= Massa perdida de Água do Controle

B= Massa perdida de Água da Amostra

Usou-se água como controle nestes testes de oclusão (nenhum efeito oclusivo).

4.2.3. CLN: VEÍCULO PARA APLICAÇÃO COSMÉTICA DE BENZOFENONA-3

4.2.3.1. Preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas contendo BZ-3

Nesta etapa do trabalho, benzofenona 3 (BZ-3) foi introduzida nas

nanopartículas como ativo cosmético de nosso interesse. O procedimento de preparação

das nanopartículas lipídicas sólidas contendo BZ-3 foi basicamente o mesmo já descrito

no item 4.2.2.1, com algumas particularidades na etapa de homogeneização (etapa 2),

realizada nas seguintes condições de processo: 900 ± 10 bar e 8 ciclos de

homogeneização (passagens).

As condições de formulação destes carreadores lipídicos nanoestruturados à base

de cera de carnaúba e oleato de isodecila estão resumidas na Tabela 5.

66

Tabela 5. Condições de formulação de carreadores lipídicos nanoestruturados à base de

cera de carnaúba e oleato de isodecila.

Excipientes Teor em massa na

formulação (%)

FASE OLEOSA

Cera de Carnaúba Tipo 1 5

Oleato de Isodecila 5

Benzofenona-3 X**

Dimeticone 1

FASE AQUOSA

Tween 80 1

Fenoxietanol-F 0,2

Água Ultra Pura q.s.p 100 mL

** X = 0,5%, 1,0%, 3% e 5% em massa na

formulação, o que corresponde respectivamente a

4,8 %; 9,1%; 23% e 33,3% da fase oleosa.

4.2.3.2. Caracterização das nano-suspensões contendo BZ-3

4.2.3.2.1 Granulometria

A distribuição granulométrica das nano-suspensões foi avaliada em um

equipamento Malvern Zetasizer (Malvern Instruments). O valor estimado do diâmetro

das nanopartículas lipídicas sólidas e o índice de polidispersão foram determinados por

espectroscopia de correlação de fótons (PCS). Todas as amostras foram diluídas com

água destilada para uma concentração de dispersão adequada para a medida.

4.2.3.2.2. Potencial Zeta

O potencial zeta das nano-suspensões foi obtido através da medida da

mobilidade elétrica das nanopartículas e essa determinação foi realizada após a diluição

das amostras em aproximadamente 2000 vezes em água destilada em um equipamento

marca Malvern Instruments modelo Zetasizer Os resultados foram obtidos através da

média de 15 determinações.

67

4.2.3.2.3. Viscosidade

A viscosidade das nano-suspensões foi determinada em um Viscosímetro

Brookfield modelo DV-III ULTRA, usando um spindle 00, acoplado a um banho

termostático mantido em temperatura de 25° C.

4.2.3.2.4. Determinação de pH

A determinação do pH foi realizada em phâmetro da Micronal modelo B474

calibrado com solução tampão 4,0 e 7,0. A determinação foi feita diretamente nas

nano-suspensões.

4.2.3.2.5. Eficiência de Encapsulação

As amostras foram preparadas segundo metodologia descrita por

(VILLALOBOS-HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2006a), modificada:

Inicialmente uma alíquota de suspensão foi coletada sem agitação prévia, em seguida

dispersa em solução de sacarose 20% m/m e submetida a uma centrifugação à 10.400 g,

por 1 hora. Foi descartado todo sobrenadante e as partículas foram redispersas em uma

sol de lauril sulfato de sódio 0,2% m/m e novamente centrifugadas nas mesmas

condições anteriores. Foi descartado todo sobrenadante e as partículas separadas do

meio foram secas em temperatura ambiente sob vácuo por 8 horas e pesadas em

quantidade pré-estabelecida. Uma massa conhecida de partículas foi então tratada com

acetonitrila ocasionando a dissolução da matriz lipídica e a liberação e dissolução da

benzofenona-3 contida no interior das nanopartículas, que foi em seguida quantificada

por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), seguindo metodologia descrita por

Sarveya e colaboradores (2004) e Paese (2008), modificada. As análises foram

realizadas em cromatógrafo, fixando-se:

Comprimento de onda: 289 nm;

Fase estacionária: Coluna LiChrospher 100 RP-18 (5µm, 250 x 4,6 mm);

Pré-coluna do mesmo material (5 µm);

Fase móvel: Isocrática de metanol e água em uma proporção 95:5 (v/v), com pH

aparente igual à 4,0;

Agente de pareamento iônico brometo de tetrabutilamônio (4 mg/100ml);

Fluxo: 1,0 ml/min;

68

Volume de Injeção: 20µl;

Temperatura do forno: 30°C.

A eficiência de encapsulação foi calculada a partir da equação (2):

EE%= Concentração da Amostra (experimental) x 100 (2)

Concentração da curva padrão (Teórica)

O método foi co-validado segundo a Resolução n° 899 da Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (BRASIL, 2003), apresentado no ANEXO II.

4.2.3.2.6. Estabilidade física

O acompanhamento da estabilidade física das nano-suspensões foi realizado

através da medida dos seguintes parâmetros ao longo do tempo (primeiro dia e

decorridos 15 e 30 dias da produção):

Granulometria da fase dispersa (nanopartículas);

Potencial zeta;

pH;

Viscosidade;

Eficiência de encapsulação.

Como também por turbidimetria dinâmica (analisador óptico Turbiscan LAB® ),

empregando-se a metodologia já descrita no item 4.2.2.2.2.

4.2.3.2.7. Liberação de BZ-3 in vitro

Utilizou-se células de Franz (Figura 15) possuindo um compartimento receptor

com capacidade em torno de 5,0 mL e uma área de difusão de 2,3 cm² ( Franz, 1975 ) e

uma membrana sintética de acetato de celulose. Como meio receptor utilizou-se uma

solução tampão fostato pH 7,4.

69

Figura 15. Esquema representativo da Célula de Franz.

A membrana de acetato de celulose foi mantida em contato com a solução

tampão fosfato pH 7,4 com 5% de polisorbarto 80 à 37°C, sendo o compartimento

inferior constantemente agitado a 300 rpm (PAESE et al , 2008). As amostras da

formulação foram testadas em quadruplicata e as coletas da solução receptora foram

feitas no tempo de 1, 2 ,3 , 4, e 8 horas. Após cada amostragem, foi realizada a

reposição do meio receptor. As análises do coletado foram realizadas por CLAE como

já descrito no item 4.2.3.2.5.

4.2.3.2.8. Estudo de Penetração cutânea in vitro

4.2.3.2.8.1. Preparação das nano-suspensões contendo corante Nile Red

O estudo de penetração in vitro foi realizado a partir de nanopartículas contendo

o corante Nile Red, cujo procedimento de preparação foi o mesmo descrito no item

4.2.3.2.1, com modificações: o corante fluorescente (Nile Red), também lipofílico, foi

adicionado na fase oleosa.

4.2.3.2.8.2. Preparação dos Cortes para estudo in vitro

Para o estudo de penetração in vitro das nano-suspensões utilizou-se células de

Franz, possuindo um compartimento receptor com capacidade em torno de 5,0 mL e

uma área de difusão de 2,3 cm² ( FRANZ, 1975 ). A membrana utilizada foi pele de

orelha de porco mantida em contato com a solução tampão fosfato pH 7,4 com 5% de

polissorbato 80 à 37 °C durante 8 h, sendo o compartimento inferior constantemente

agitado a 300 rpm ( PAESE , 2008 ).

70

As membranas de pele de porco foram preparadas da seguinte maneira,

esquematizada na Figura 16: pedaços de pele foram lavados para remoção do excesso

de formulação, cortados em formato circular (~ 2,3 cm² – área de permeação),

acondicionados em blisters, sendo envolvidos por uma camada de OCT (crioprotetor e

matriz de suporte para a amostra) e congelados à – 4°C. Após a remoção do OCT em

excesso (cortes sucessivos com o criostato) foram feitos no sentido transversal das

amostras, com espessura de 10 microns a uma temperatura de – 20°C, para fixação na

lâmina com água.

Figura 16. Esquema de preparação dos cortes.

Os cortes foram observados por microscopia confocal através de um

Microscópio de varredura laser confocal (LSM 510 Meta). As imagens obtidas pela

microscopia confocal estão dispostas para melhor visualização dos resultados da

seguinte forma:

Onde,

A- Imagem de fluorescência;

B- Imagem de transmissão;

C- Imagem de sobreposição;

D- Imagem com escala de luz aumentada

O estudo de penetração in vitro foi realizado a partir das nanopartículas

contendo o corante Nile Red e deste mesmo corante disperso em oleato de isodecila.

71

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

72

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. CARACTERIZAÇÃO DAS PRINCIPAIS MATÉRIAS-PRIMAS

No presente trabalho, as principais matérias-primas utilizadas foram a BZ-3

(ativo modelo a ser encapsulado) e a cera de carnaúba (matriz encapsulante), obtidas

como amostras comerciais. Para confirmação da identidade química destas amostras

determinou-se seus pontos de fusão (calorimetria exploratória diferencial) e outras

características térmicas (termogravimetria), espectros de absorção na região do infra-

vermelho (espectrometria infra-vermelho) e espectros de raios-x (difratometria de raios-

x).

5.1.1. Caracterização da Benzofenona-3 (BZ-3)

5.1.1.1. Espectro da BZ-3 na região do infra-vermelho

Os espectros de infravermelho são resultantes dos diferentes modos de interação

da radiação eletromagnética com a molécula (vibração e rotação). Pode ser considerado

como uma ―impressão digital‖ do composto. A Figura 17 apresenta os espectros na

região do infravermelho obtidos com a amostra de BZ-3. Do espectro representado

nesta figura, foram selecionadas as principais bandas de absorção e estas foram

comparadas com valores encontrados na literatura na Tabela 6. Pode-se verificar que a

amostra de BZ-3 utilizada neste trabalho apresenta bandas de absorção com valores bem

próximos aos seus padrões da literatura (CTFA, 1991) e também comparáveis a outras

amostras de BZ-3 comerciais já utilizadas em outros trabalhos (SANTOS, 2007). A

estrutura química é caracterizada pela presença de compostos aromáticos característicos

de filtros solares químicos (SCOTTI e VELASCO, 2003).

73

5

10

15

20

25

30

35

40

45

%T

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Wavenumbers (cm-1)

Figura 17. Espectro no Infravermelho da BZ-3, região de 4000 a 400 cm-¹.

Tabela 6. Comparação das principais bandas de absorção do espectro infravermelho da

BZ-3.

5.1.1.2. Análise termogravimétrica (TGA)

A termogravimetria é a técnica de análise térmica em que a variação de massa da

amostra (perda ou ganho) é determinada como uma função da temperatura e/ou tempo,

enquanto a amostra é submetida a uma programação controlada de temperatura

(GIOLITO e IONASCHIRO, 1980). Variações na massa da amostra analisada (m),

Regiões no espectro ( cm-¹ )

Grupos Funcionais Amostra analisada

Literatura

(CTFA,1991)

Literatura

(SANTOS, 2007)

2950 2900 2950 Estiramento O– H de

fenóis

1650 1650 1636

Estiramento de

carbonila

1600 1600 1595 Estiramento de anel

aromático

1270 1270 1260 Estiramento C– O de

éter

74

podem fornecer informações quanto à sua estabilidade térmica. A Figura 18 representa a

variação de massa sofrida pela amostra de BZ-3 em função da temperatura, onde se

observa um primeiro evento de perda de massa na faixa de temperatura de 125 a 250°C.

Este resultado demonstra que, a partir de 125 °C a BZ-3 torna-se termicamente instável,

iniciando o evento de degradação que ocorre em uma única etapa.

Figura 18. Curvas TG da BZ-3 obtidas sob atmosfera dinâmica de nitrogênio na

razão de aquecimento 5°C/min.

5.1.1.3. Determinação do ponto de fusão

O ponto de fusão é característico para uma substância e variações no seu valor

podem indicar a presença de impurezas e/ou a degradação da amostra (SANTOS, 2007).

A determinação do ponto de fusão da amostra de BZ-3 foi realizada por calorimetria

exploratória diferencial (DSC). O resultado é apresentado na Figura 19, com a presença

de um pico endotérmico e entalpia de cerca de 92 Jg-1

, correspondente à fusão da BZ-3

em 64,6°C, valor bem próximo a valores apresentados na literatura para amostras de

BZ-3 (Tabela 7).

Tabela 7. Valores de ponto de fusão de BZ-3.

Amostra ∆H ( Jg-1

) Onset (°C) Tf (°C) Endset (°C)

Benzofenona-3 (amostra analisada) 92,1 63,0 64,6 67,8

Literatura

(SHAATH, 1997; SANTOS, 2007) * * 62-65 *

75

Figura 19. Curva DSC da BZ-3 obtida sob atmosfera dinâmica de nitrogênio na razão

de aquecimento 5°C/min.

5.1.2. Caracterização das amostras de cera de carnaúba (1, 3 e 4)

Inicialmente selecionou-se os 3 tipos de cera de carnaúba disponíveis no

mercado nacional, denominadas 1, 3 e 4. As três amostras foram analisadas por

espectrometria no infra-vermelho, calorimetria exploratória diferencial e difratometria

de raois-x para avaliação da composição química e possíveis diferenças de propriedades

entre elas, a temperatura de fusão, parâmetro de fundamental importância na seleção de

lipídios para o desenvolvimento de nanoparticulas lipídicas sólidas. Os resultados

obtidos são apresentados de forma comparativa para os três tipos de cera de carnaúba .

5.1.2.1. Espectro na região do infra-vermelho (IR)

Utilizou-se a espectroscopia vibracional para indicar a presença de grupos

funcionais característicos da cera de carnaúba que absorvem entre 400 e 4000 cm-¹

(Figura 20).

76

Figura 20. Espectro no Infravermelho de cera de carnaúba (região de 4000-400 cm-¹).

As principais absorções características identificadas nos espectros da Figura 20

são apresentadas na Tabela 8. Verificou-se a presença de esqueleto carbônico

(freqüência de estiramento C-H e de deformação C-H) e a presença de grupos

carboxílicos (freqüências de estiramento C=O associada com freqüência de estiramento

C-O, característicos para ésteres).

Tabela 8. Principais absorções características (ceras de carnaúba 1, 3 e 4).

Regiões no espectro (cm-¹)

Grupos Funcionais CERA TIPO 1 CERA TIPO 3 CERA TIPO 4

2943 e 2854 2980 e 2860 2980 e 2860 Estiramento C–H

1743 1730 1750 Estiramento C=O

1180 1120 1160 Estiramento C–O de éster

725 710 730

Deformação angular

assimétrica de CH,

característico de cadeias

longas de hidrocarbonetos

(CH2)n.

77

Os espectros de absorção no infravermelho médio (entre 4000 e 400 cm-1

)

obtidos para as três amostras de cera de carnaúba analisadas (tipo 1, 3 e 4) foram muito

semelhantes, corroborando com a composição freqüentemente indicada na literatura de

que a cera de carnaúba é composta majoritariamente por ésteres de ácidos graxos

(OLIVEIRA, 2006).


Um estudo termoanalítico foi realizado para determinar a temperatura de fusão

das três ceras analisadas ( 1, 3 e 4). A Figura 21 apresenta as curvas DSC do segundo

aquecimento para as três ceras analisadas, onde verifica-se a presença de picos

endotérmicos que caracterizam a fusão das ceras 1, 3 e 4 em 82,6°C, 81,4 °C e 82,5°C,

respectivamente. A Tabela 9 reúne os demais dados obtidos das curvas da Figura 21.

Figura 21. Curvas DSC dos três tipos de cera de carnaúba.

78

Tabela 9: Valores da transição térmica dos três tipos de cera de carnaúba.

Amostras ∆H ( Jg-1


C.Carnaúba-1 186,1 74,4 82,6 84,8

C.Carnaúba-3 185,7 70,4 81,4 84,5

C.Carnaúba-4 189,0 70,9 82,5 85,5

A cera de carnaúba é uma das mais duras e de maior ponto de fusão entre as

ceras naturais e, segundo a Farmacopéia Brasileira, possui o ponto de fusão entre 80 e

86°C. De acordo com a Tabela 9, as ceras apresentam propriedades térmicas muito

similares, situando-se o ponto de fusão entre 81,4 e 82,6°C, com uma entalpia de fusão

correspondente cerca de 186-189 Jg-1

. A matéria-prima estudada apresenta, portanto,

características térmicas similares às referências relatadas na literatura (VILLALOBOS-

HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005, OLIVEIRA , 2006 , FARMACOPÉIA

BRASILEIRA, 2002 ).

5.1.2.3. Difratometria de raios-X (DRX)

A Figura 22 apresenta os difratogramas de raios-x obtidos para as três amostras

de cera de carnaúba analisadas (1, 3 e 4). E observou-se que não há variação da

estrutura química entre os três tipos de cera, sugerindo uma mesma estrutura cristalina

(VILLALOBOS-HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005).

79

Figura 22. -. Difratogramas dos três tipos de cera de carnaúba.

5.1.3. Misturas de cera de carnaúba (1, 3 e 4) com oleato de isodecila

O uso de oleato de isodecila foi investigado neste trabalho como proposta de

diminuição da temperatura de fusão da matriz lipídica quando comparada com o lipídio

sólido original, parâmetro-chave para o desenvolvimento de carreadores lipídicos

nanoestruturados.

Os três tipos de cera (1, 3 e 4) e suas respectivas misturas, na proporção 2:1 e

1:1 de cera de carnaúba e oleato de isodecila foram analisados por DSC e DRX para

avaliação das propriedades da matriz lipídica resultante.

De acordo com as análises apresentadas da cera de carnaúba pura, não foram

observadas diferenças significativas entre os três tipos de cera. Por esta razão, serão

apresentados neste capítulo apenas os resultados referentes à mistura de cera de

carnaúba tipo 1 e oleato de isodecila. Os resultados das misturas das ceras 3 e 4 com o

mesmo lipídio líquido encontram-se no ANEXO III.

80


Foi realizado um estudo termoanalítico para determinar alterações na

temperatura de fusão da mistura binária de cera de carnaúba e oleato de isodecila em

diferentes proporções. Comprova-se na Figura 23 o efeito do lipídio líquido na

organização cristalina da cera de carnaúba, que apresenta as curvas DSC do segundo

aquecimento das misturas analisadas. Percebe-se que o aumento de oleato de isodecila

na mistura binária resultou em diminuição da endoterma de fusão. Isto significa que este

óleo afetou a recristalização da cera de carnaúba durante o processo de resfriamento. A

diminuição do ponto de fusão, da entalpia de fusão, bem como a ocorrência de uma

alteração nos picos indica defeitos na estrutura cristalina (TEERANACHAIDEEKUL et

al., 2008).

Em comparação com a cera de carnaúba pura, pode-se observar através da

Tabela 10, uma diminuição no ponto de fusão e da entalpia de fusão da mesma com o

aumento da proporção mássica de oleato de isodecila na mistura binária e esta redução

foi maior, quanto maior a proporção de óleo. Um efeito similar foi relatado na literatura

por Villalobos-Hernández e Müller-Goymann (2005) que também trabalharam com esta

mesma mistura de lipídios.

Figura 23. Curvas DSC da cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e oleato

de isodecila (2:1 e 1:1).

81

Tabela 10: Valores da transição térmica da mistura de cera de carnaúba e oleato de

isodecila.



C.Carnaúba 186,1 74,4 82,6 84,8

C.Carnaúba+ Oleato de Isodecila (2:1) 97,9 64,8 78,1 81,4

C.Carnaúba + Oleato de Isodecila (1:1) 85,1 61,2 76,5 81,0

5.1.3.2. Difratometria de raios-X (DRX)

As análises de DRX foram realizadas a fim de elucidar o efeito da quantidade de

oleato de isodecila sobre a estrutura química e cristalina da cera de carnaúba. Observou-

se na Figura 24 que a presença do oleato de isodecila não muda a posição dos picos,

mas altera as intensidades e esta alteração pode ser devido à geração de estruturas

menos ordenadas ou defeitos na estrutura cristalina da cera como preconizado na

literatura (TEERANACHAIDEEKUL et al, 2007, 2008). Esses dados corroboram com

os resultados apresentados nas curvas DSC da cera pura e das misturas binárias com

oleato de isodecila (item 5.1.3.1).

Figura 24. Difratogramas cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e

oleato de isodecila (2:1 e 1:1).

82

5.1.4. Estudos de compatibilidade ou pré-formulação utilizando análise térmica

Através da utilização das técnicas termoanalíticas é possível caracterizar

possíveis incompatibilidades e interações entre os componentes de uma determinada

formulação. A aplicação destas técnicas torna possível caracterizar o comportamento

térmico das substâncias individualmente (ativo e excipiente), e posteriormente analisar

o comportamento da mistura do fármaco com excipientes (BALESTRIERI, F. 1996). A

Figura 25 mostra as curvas DSC da cera, da BZ-3 e da mistura física 1:1 cera de

carnaúba e BZ-3, verificam-se eventos endotérmicos na faixa de temperatura de 62°C e

84°C, representando a fusão desses componentes separados e os mesmos picos de fusão

na mistura física cera e BZ-3, que mostram o somatório dos eventos existentes tanto

para o composto ativo puro quanto para o excipiente, indício de que não ocorre

interação química entre os compostos.

Figura 25. Curvas DSC da cera e da BZ-3 e da mistura física entre elas.

83

5.2. NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS: PROCESSO E PRÉ-

FORMULAÇÃO

5.2.1. NLS: estudo preliminar de formulação com cera de carnaúba

Nesta primeira fase do trabalho, ensaios foram realizados para a obtenção de

Nanopartículas Lipídicas Sólidas usando apenas a cera de carnaúba como material

lipídico. O parâmetro de estudo foi o tipo de cera de carnaúba (1, 3 e 4), a fim de se

prever algumas possíveis mudanças no sistema usando diferentes tipos de cera. Uma

formulação inicial com 10% em massa de material lipídico e uma fase aquosa contendo

1 % em massa de tween 80 foram usadas para teste de processo, com base em dados de

literatura (VILLALOBOS-HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005, 2006).

Condições de formulação na Tabela 11.

Tabela 11. Formulação de nanoparticulas lipídicas sólidas à base de cera de carnaúba.

COMPOSIÇÃO FORMULAÇÕES I, II e III * (% em massa)

FASE OLEOSA

Cera de Carnaúba 10

FASE AQUOSA

Tween 80 1

Água Ultra Pura q.s.p. 100 mL

* As Formulações I, II e III correspondem respectivamente às ceras de

carnaúba Tipo 1, 3 e 4 respectivamente. A solução aquosa corresponde a

uma solução contendo 10 mg/ml de Tween 80. Condições de

homogeneização utilizadas na etapa 2 do processo, metodologia descrita

no item 4.2.2.1.: pressão de homogeneização de 600 ± 10 bar e 5 ciclos.

As seguintes características dos sistemas gerados foram analisadas:

Distribuição granulométrica e índice de polidispersão das nanopartículas;

Estabilidade física das nano-suspensões, analisada em função do monitoramento

da granulometria da fase dispersa (nanopartículas) no primeiro dia e decorridos

15 e 20 dias da produção.

84

Os resultados estão apresentados na Tabela 12 e na Figura 26.

Tabela 12. Granulometria das partículas lipídicas a base de ceras de carnaúba (LD).

Dia 1

Formulação Span D10 ( µm) D50 ( µm) D90 ( µm)

Formulação I 1,61 0,62 1,31 2,74

Formulação II 1,89 0,76 2,21 4,96

Formulação III 1,95 0,83 2,85 6,40

Dia 15

Formulação Span D10 ( µm) D50 ( µm)) D90 ( µm)

Formulação I 2,31 0,98 1,47 4,37

Formulação II 1,67 0,74 2,06 4,18

Formulação III 1,73 0,85 2,50 5,19

Dia 20

Formulação Span D10 ( µm) D50 ( µm) D90 ( µm)

Formulação I 1,91 0,60 1,45 3,38

Formulação II 1,49 0,75 2,48 4,46

Formulação III 1,73 0,88 2,53 5,27

Estes resultados mostram que, em todas as formulações, partículas de tamanho

micrométrico foram geradas com os três tipos de cera de carnaúba utilizados (tipos 1, 3

e 4). Uma possível causa da obtenção de partículas na faixa micrométrica pode ser a

elevada viscosidade do sistema devido a dificuldades encontradas na montagem

experimental de manter a temperatura de trabalho bem acima da temperatura de fusão

das ceras (o isolamento das tubulações para reduzir perda de calor não foi suficiente

para evitar perdas e, portanto, oscilações da temperatura da cera em estado fundido

ocorreram, levando a um difícil controle do estado fundido antes da homogeneização

em alta pressão).

85

Figura 26. Monitoramento do tamanho médio (d50) de partículas de cera de carnaúba

(tipos 1, 3 e 4) decorridos 1, 15 e 20 dias da preparação.

Como não foram apresentadas diferenças significativas entre os 3 tipos de cera

na formulação e na caracterização da mesma (item 5.1.2) ,a matéria-prima de escolha

para o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas à base de cera de carnaúba foi a cera

de carnaúba Tipo 1 já que, segundo Oliveira (2006), seu principal emprego é na

fabricação de cosméticos e no recobrimento de produtos alimentícios, devido ao baixo

índice de acidez, o reduzido percentual de impurezas e por tornar-se incolor durante o

processo de fusão (OLIVEIRA, 2006).

5.2.2. CLN: incorporação de oleato de isodecila à cera de carnaúba

Em razão dos primeiros resultados obtidos com a cera de carnaúba como matriz

lipídica, optou-se pela modificação da composição desta matriz e associação da cera de

carnaúba com lipídios líquidos para obtenção de sistemas lipídicos nanoestruturados,

que apresentam as vantagens frente aos sistemas constituídos de uma única matriz

lipídica sólida, já descritas na revisão bibliográfica (item 2.3.2.1.).

Oleato de isodecila foi selecionado como lipídio líquido em função de resultados

anteriores publicados na literatura referentes a este sistema (VILLALOBOS-

HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005, 2006a, 2006b, 2007). A caracterização

inicial das misturas de cera de carnaúba e oleato de isodecila mostrou o efeito desta

associação nas propriedades térmicas (temperatura de fusão, da entalpia de fusão) e

86

estrutura cristalina do novo sistema quando comparado à cera de carnaúba pura (item

5.1.3.)

Uma segunda série de experimentos foi então realizada com uma mistura de cera

de carnaúba e oleato de isodecila nas proporções indicadas na Tabela 13, onde avaliou-

se o efeito da formulação (proporção em massa entre cera de carnaúba e oleato de

isodecila de 2:1 e 1:1) na granulometria das partículas obtidas.

Tabela 13. Condições de formulação de carreadores lipídicos nanoestruturados à base

de cera de carnaúba e oleato de isodecila.

COMPOSIÇÃO FORMULAÇÕES* (% em massa)

IV V VI

FASE OLEOSA

Cera de Carnaúba 10 10 5

Oleato de isodecila - 5 5

FASE AQUOSA

Tween 80 1 1 1

Água Ultra Pura q.s.p. 100 mL q.s.p. 100 mL q.s.p. 100 mL

* Condições de homogeneização utilizadas na etapa 2 do processo, metodologia

descrita no item 4.2.2.1. : pressão de homogeneização de 600 ± 10 bar e 5

ciclos.

5.2.2.1. Análise Granulométrica

Partindo-se dos dados apresentados na Tabela 14 e da distribuição

granulométrica representada na Figura 27 verificou-se apenas na Formulação IV (Cera-

Oleato de Isodecila 1:1) a obtenção de partícula na faixa nanométrica e uma distribuição

de tamanho estreita.

A Figura 28 mostra uma relação inversa e proporcional entre a quantidade de

oleato de isodecila e o diâmetro de partícula obtido, ou seja, quanto maior o teor deste

lipídio na formulação, menor o tamanho de partícula. Este comportamento está

relacionado à qualidade da pré-emulsão preparada na primeira etapa do processo: a

incorporação de oleato de isodecila na formulação reduz a viscosidade da matriz

fundida, o que melhora as características da pré-emulsão nas mesmas condições de

agitação mecânica (gotas menores).

87

Tabela 14. Granulometria dos carreadores lipídicos nanoestruturados a base de cera de

carnaúba e oleato de isodecila.

Formulação Span D10 (µm ) D50 (µm) D90 (µm) Formulação IV 2,26 1,15 4,68 11,73

Formulação V 1,77 1,10 3,33 7,00

FormulaçãoVI 0,21 0,38 0,42 0,47

Figura 27. Distribuição granulométrica das formulações de partículas de cera de

carnaúba e oleato de isodecila (PCS).

Figura 28. Diâmetro hidrodinâmico das formulações de partículas de cera de carnaúba

e oleato de isodecila (PCS).

88

5.2.3. Planejamento experimental estatístico

O desenvolvimento de um processo ou de uma formulação pode ser facilitado

pelo emprego de uma metodologia de trabalho baseada em um planejamento estatístico

de experimentos. O objetivo do uso desta ferramenta é desenvolver o processo ou a

formulação pretendida de forma organizada e mediante um número mínimo de

experimentos (GOUVEIA et al., 2002). Planejamentos fatoriais nos quais cada fator é

estudado em dois níveis são importantes na varredura de fatores de experimentos e em

muitas investigações científicas (BOX et al., 1978).

O objetivo aqui foi investigar o processo de obtenção de nanopartículas de cera

de carnaúba e oleato de isodecila através de duas séries de experimentos com um

planejamento fatorial completo a dois níveis.

As duas séries de experimentos foram planejadas usando fatorial completo com

quatro fatores a dois níveis, e executados em ordem aleatória. Os fatores e níveis

estudados foram:

SÉRIE 1:

(A) Concentração do emulsificante na fase aquosa – 1% e 3% (m/m).

(B) Teor total de lipídios – 5% e 20% (m/m).

(C) Tipo de emulsificante – Tween 80 e Pluronic.

(D) Proporção mássica entre cera de carnaúba e oleato de isodecila : 2:1 e 1:1.

As demais condições fixadas foram: tempo de preparo da pré-emulsão em

ultraturrax® de 4 min; pressão de homogeneização de 600 bar; número de ciclos igual a

5; resfriamento natural da nanoemulsão formada à temperatura ambiente; formulação

sem conservante.

SÉRIE 2:

(E) Número de Ciclos (passagens no homogeneizador): 2 e 8.

(F) Pressão de homogeneização (bar): 400 bar e 900 bar.

89

(G) Modo de resfriamento das nano-emulsões formadas: banho de gelo

resfriamento natural em temperatura ambiente.

(H) Tempo de preparo da pré-emulsão (ultraturrax): 4 min e 8 min.

As demais condições fixadas foram: teor total de lipídios de 10% (m/m);

proporção mássica cera de carnaúba e oleato de isodecila de 1:1; emulsificante Tween

80 na fase aquosa a uma concentração de 1% em massa; formulação sem conservante.

5.2.3.1. Análise de formulação

Os resultados obtidos do planejamento de experimentos referente ao estudo de

formulação (SÉRIE 1) são dados na Tabela 15.

Tabela 15. Resultados do planejamento experimental estatístico.

(SÉRIE 1 – variáveis de formulação)

Ensaio**


(codificada)

Variável resposta

A B C D Diâmetro de

Partícula ( nm)

Índice de

polidispersão

1 +1 +1 +1 +1 277,4 0,410

2 -1 +1 +1 +1 405,0 0,314

3 +1 -1 +1 +1 570,5 0,334

4 -1 -1 +1 +1 482,5 0,410

5 +1 +1 -1 +1 1612,5 1,000

6 -1 +1 -1 +1 3663,9 0,636

7 +1 -1 -1 +1 567,0 0,357

8 -1 -1 -1 +1 223,3 0,243

9 +1 +1 +1 -1 322,7 0,317

10 -1 +1 +1 -1 1471,9 1,000

11 +1 -1 +1 -1 1008,9 0,776

12 -1 -1 +1 -1 741,5 1,000

13 +1 +1 -1 -1 11912,9 1,000

14 -1 +1 -1 -1 7736,0 0,989

15 +1 -1 -1 -1 2657,8 1,000

16 -1 -1 -1 -1 5613,5 1,000

90

Em função do planejamento fatorial expresso na Tabela 15 e utilizando o

software Statistica for windows versão 5.0, obteve-se os valores dos efeitos de cada

parâmetro. Os gráficos de Pareto e de Superfície de Resposta foram usados como

parâmetros para decisão dos fatores que mais influenciam nestas características das

nanopartículas que nos interessam: o tamanho médio de partícula e o índice de

polidispersão associado.

Os valores dos efeitos estimados apresentados em um Gráfico de Pareto

possibilitam verificar se os mesmos são estatisticamente significativos. A linha vertical

vermelha indica o valor mínimo para que isso ocorra, e o efeito é tão mais significativo

quanto mais à direita dessa linha ele estiver (para um dado nível de confiança).

(A)

(B)

Figura 29. Gráfico de Pareto para a SÉRIE 1 para as variáveis resposta: diâmetro (A) e

indice de polidispersão (B).

91

Observando os Gráficos de Pareto na Figura 29 (A), percebe-se que, nas faixas

testadas para as quatro diferentes variáveis independentes, as variáveis que mais

influenciam nos valores de diâmetro de partícula são as características do emulsificante

utilizado e a composição da matriz lipídica (proporção entre cera e oleato de isodecila).

Somente para esta variável-resposta a interação entre estas duas variáveis de entrada

torna-se significativa (p<0,5). Quanto ao índice de polidispersão, o efeito da proporção

cera:óleo tem o efeito mais estatisticamente significativo para um nível de 95% de

confiança (Figura 29(B) ).

Os gráficos de Superfície de Resposta são tridimensionais e permitem uma

melhor visualização do efeito de duas variáveis sobre o diâmetro ou sobre o índice de

polidispersão. Através da inclinação, percebe-se o grau de significância do efeito. Os

mesmos resultados obtidos com o Gráfico de Pareto foram confirmados pelo gráfico de

Superfície de Resposta (Figura 30). Pode-se assim dizer que a Figura 30 (A) mostra que

o aumento da proporção cera:oleato de 1:1 para 2:1 leva ao aumento acentuado do

tamanho das nanopartículas com o uso do pluronic como emulsificante; na Figura 30

(B) observa-se que as duas variáveis de entrada (tipo de emulsificante e proporção

cera:óleo) influenciam na resposta (tamanho de partícula e índice de polidispersão ).

(A) (B)

Figura 30. Gráfico de superfície de resposta: variação do diâmetro de partícula (A) e

do índice de polidispersão (B) em função do tipo de emulsificante e da proporção

cera:óleo usados na formulação das partículas lipídicas.

92

5.2.3.1.1. Monitoramento da granulometria no tempo

O acompanhamento da estabilidade física durante repouso foi feito monitorando-

se a granulometria da fase dispersa (nanopartículas) no primeiro dia e 10 dias da

produção das nano-suspensões obtidas nos Ensaios 1 a 16.

A Tabela 16 permite a comparação das variáveis resposta (diâmetro e índice de

polidispersão) no primeiro dia (to dia) e 10 dias após a preparação das formulações

(condição de repouso, t10 dias).

Tabela 16. Tamanho das partículas lipídicas (imediatamente e após 10 dias).

Ensaio**

Variável resposta

Diâmetro

(nm)

Índice de

polidispersão

Diâmetro

(nm)

Índice de

polidispersão

t0 dia t10 dias

1 277,4 0,410 286,7 0,728

2 405,0 0,314 370,9 0,136

3 570,5 0,334 595,3 0,470

4 482,5 0,410 542,7 1,000

5 1612,5 1,000 512,3 0,501

6 3663,9 0,636 5626,1 0,776

7 567,0 0,357 559,5 0,832

8 223,3 0,243 223,6 0,200

9 322,7 0,317 307,5 0,249

10 1471,9 1,000 6304,8 1,000

11 1008,9 0,776 763,8 1,000

12 741,5 1,000 2627,3 1,000

13 11912,9 1,000 3823,3 0,967

14 7736,0 0,989 4077,0 0,897

15 2657,8 1,000 2109,3 1,000

16 5613,5 1,000 4102,9 1,000

Pode-se observar que determinadas formulações apresentam boa estabilidade

física, confirmada pela pouca variabilidade do diâmetro das partículas como nos

Ensaios 1, 2, 3, 4, 7, 8 e 9 após 10 dias em repouso. Estas formulações foram em sua

maioria preparadas com a proporção de cera e oleato de isodecila de 1:1 e Tween 80,

93

como emulsificante, mantém a estabilidade mesmo nas maiores concentrações de

lipídios (20%) como é o caso das formulações 1, 2,3 e 4.

O planejamento de experimentos realizado para este estudo de pré-formulação

foi realizado sem repetições e os efeitos analisados são de caráter descritivo. No

entanto, eles possibilitam a análise dos fenômenos físicos envolvidos no processo de

formação das nanopartículas lipídicas nanoestruturadas de nosso interesse com base nas

tendências apresentadas pelos gráficos de Pareto (Figuras 29 (A )e 29 (B) ) e pelas

superfícies de resposta (Figuras 30 (A )e 30 (B) ):

A literatura mostra que a escolha do emulsificante e sua concentração são fatores

que possuem um grande impacto na estabilidade das emulsões que são formadas

na primeira etapa do processo de obtenção de nanopartículas lipídicas sólidas

(MEHNERT e MADER., 2001). O tamanho de gotas (lipídios fundidos) e a

estabilidade física destas gotas dependem das características do emulsificante

(sua composição química, seu HLB) além de outras condições de processo como

a energia fornecida para a formação das gotas (pressão de homogeneização e

ciclos de passagem no caso estudado) que foram analisadas na Série 2 de

experimentos (estudo de processo). Tween 80 e o Pluronic são tensoativos

hidrofílicos (alto HLB) não iônicos, geralmente solúveis ou dispersíveis em água

e empregados para obter emulsões do tipo óleo em água (o/a). Diferem entre si

na composição química: o tween 80 é composto por ésteres de sorbitan

etoxilados. Já o pluronic é um co-polímero de polioxietileno-polioxipropileno,

ambos usados em formulações farmacêuticas e cosméticas. A literatura cita

também que o emulsificante utilizado pode também afetar a cristalização das

gotas lipídicas fundidas, afetando o mecanismo de nucleação (SAKAMOTO et

al., 2004), mas esta investigação do efeito do emulsificante na cristalização da

matriz lipídica não foi aprofundada neste trabalho.

Por outro lado, o aumento do teor de oleato de isodecila na matriz lipídica levou

a uma redução do diâmetro das partículas formadas e do índice de polidispersão,

o que provavelmente se deve ao impacto da presença deste lipídio líquido na

viscosidade da matriz lipídica fundida. A redução provável da viscosidade desta

fase (não medida) facilita a dispersão da fase oleosa na fase aquosa e,

conseqüentemente, a formação da emulsão (gotas menores e menos dispersas), o

94

que se comprovou experimentalmente pela medida do tamanho e índice de

polidispersão das partículas obtidas.

Em resumo, os resultados obtidos orientaram a seleção das condições de pré-

formulação: operando-se com uma proporção cera:oleato de isodecila de 1:1 e

utilizando-se Tween 80 como estabilizante na fase aquosa obtém-se os menores

diâmetros e com menor índice de polidispersão e estas foram as condições

escolhidas para preparação das nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de

isodecila na continuidade do trabalho (análise de processo).

5.2.3.2. Análise de processo

Os resultados referentes ao planejamento de experimentos aplicado às variáveis

de processo (SÉRIE 2) são dados na Tabela 17.

Tabela 17. Resultados do planejamento experimental estatístico.

(SÉRIE 2 – variáveis de processo)

Ensaio**


(codificada)

Variável resposta

E F G H Diâmetro de

Partícula ( nm)

Índice de

polidispersão

17 +1 +1 +1 +1 235,2 0,181

18 -1 +1 +1 +1 262,4 0,131

19 +1 -1 +1 +1 4509,1 1,000

20 -1 -1 +1 +1 1736,6 1,000

21 +1 +1 -1 +1 292,2 0,572

22 -1 +1 -1 +1 437,5 1,000

23 +1 -1 -1 +1 441,2 1,000

24 -1 -1 -1 +1 1589,7 1,000

25 +1 +1 +1 -1 263,1 0,332

26 -1 +1 +1 -1 259,8 0,317

27 +1 -1 +1 -1 696,0 1,000

28 -1 -1 +1 -1 287,5 0,608

29 +1 +1 -1 -1 251,3 0,120

30 -1 +1 -1 -1 265,2 0,160

31 +1 -1 -1 -1 2735,6 1,000

32 -1 -1 -1 -1 5231,9 1,000

95

Os gráficos de Pareto e de Superfície de Resposta foram também neste caso

usados como parâmetros para decisão dos fatores que mais influenciam o tamanho

médio e o índice de polidispersão das partículas obtidas. As variáveis selecionadas

foram: tempo de pré-emulsificação, condições de homogeneização (pressão e número

de ciclos) e modo de resfriamento das nano-suspensões. A Figura 31 mostra o efeito

estatisticamente significativo da pressão de homogeneização sobre o índice de

polidispersão, porém sem significância estatística (nível de confiança de 95%) sobre o

diâmetro médio das partículas.

(A)

(B)

Figura 31. Gráfico de Pareto para a Série 2 para as variáveis resposta: diâmetro (A) e

indice de polidispersão (B).

96

Os gráficos de Superfície de Resposta (Figura 32) mostram, a título descritivo,

que uma pressão de homogeneização de 900 bar e 8 ciclos no homogeneizador são as

condições que favorecem a obtenção das menores partículas e com menor índice de

polidispersão.

(A)

(B)

Figura 32. Gráfico de Superfície de resposta: variação do diâmetro de partícula (A) e

do índice de polidispersão (B) em função da pressão e do n° de ciclos.

5.2.3.2.1. Monitoramento da granulometria no tempo

O acompanhamento da estabilidade física das nano-suspensões durante repouso

à temperatura ambiente foi feito monitorando-se a granulometria da fase dispersa no

primeiro dia e 10 dias da produção para os Ensaios 17 a 32.

A Tabela 18 permite a comparação das variáveis resposta (diâmetro e índice de

polidispersão) no primeiro dia (to dia) e após 10 dias da preparação das formulações (t10

dias), mostrando que a maior pressão de homogeneização estudada (900 bar) realmente

favorece a estabilidade física da nano-supensão formada (Ensaios 17, 18, 21, 25, 29 e

30).

97

Tabela 18. Variação das características físicas das nano-supensões em 10 dias.

Ensaio**

Variável resposta

Diâmetro

(nm)

Índice de

polidispersão

Diâmetro

(nm)

Índice de

polidispersão

t0 diu t10 dias

17 235,2 0,181 257,0 0,176

18 262,4 0,131 249,2 0,196

19 4509,1 1,000 386,4 1,000

20 1736,6 1,000 1358,4 1,000

21 292,2 0,572 295,0 0,510

22 437,5 1,000 862,5 0,689

23 441,2 1,000 419,1 1,000

24 1589,7 1,000. 958,5 1,000

25 263,1 0,332 261,5 0,186

26 259,8 0,317 347,5 1,000

27 696,0 1,000 335,3 1,000

28 287,5 0,608 3243,8 0,555

29 251,3 0,120 257,6 0,150

30 265,2 0,160 261,9 0,114

31 2735,6 1,000 6589,0 1,000

32 5231,9 1,000 1567,0 1,000

5.2.3.2.2. Acompanhamento da estabilidade por turbidimetria dinâmica

Durante o armazenamento das nano-suspensões verificou-se que aquelas

preparadas com uma pressão de homogeneização de 400 bar formavam um creaming

visível quando comparadas com formulações processadas a 900 bar. Um

acompanhamento da cinética deste processo foi feito através da análise em equipamento

Turbiscan Lab® (metodologia descrita no item 4.2.2.2.2.) dos produtos dos Ensaios 25

e 27. Breve, estes ensaios foram realizados nas seguintes condições de processo: tempo

de pré-emulsificação de 4 min; número de ciclos igual a 8, homogeneização a pressões

de 400 bar (Ensaio 25) e 900 bar (Ensaio 27) e resfriamento natural das nano-

emulsões em temperatura ambiente.

98

Para entendimento dos resultados obtidos, uma breve descrição de como deve

ser interpretado os perfis no gráfico obtido através de turbidimetria dinâmica pelo

aparelho Turbiscan Lab® é dada na Figura 33, onde:

a) Eixo das ordenadas: representa a porcentagem residual de luz retroespalhada /

transmitida.

b) Eixo das abscissas: corresponde a altura do tubo contendo a amostra, sendo

que a base do tubo esta à esquerda e o topo do tubo está à direita.

Figura 33. Representação ilustrativa de um gráfico do aparelho Turbiscan Lab®.

Este gráfico permite a verificação comparativa entre os perfis de variação de

retroespalhamento da luz em diferentes tempos para a amostra. A estabilidade ou

instabilidade da amostra é determinada pelos perfis de varredura obtidos de tempos em

tempos. Se os perfis de retroespalhamento da luz na amostra nos diferentes tempos se

sobrepõem, o produto é estável, caso contrário, o produto é instável e pode-se calcular a

cinética de migração da fase dispersa da amostra.

A Figura 34 apresenta os resultados desta varredura efetuada nas nano-suspensões

obtidas com diferentes pressões de homogeneização (400 e 900 bar) e a variação do

retroespalhamento no período de 24 horas de análise (deltaTbackstering) é mostrada na

Figura 35, onde se constata a maior estabilidade da amostra preparada em pressão de

Tempo de análise trancorrida Preto: tempo inicial Vermelho: última leitura

99

900 bar, frente à variação de aproximadamente 12% do retroespalhamento observado

com a amostra obtida a 400 bar.

(A)900 bar

(B)400 bar

Figura 34. Variação de retroespalhamento no estudo da estabilidade das

suspensões de nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas a

900 bar (A) e 400 bar (B).

100


(deltaTbackscatering) medido nas amostras de nanopartículas de cera de carnaúba

e oleato de isodecila obtidas em diferentes pressões de homogeneização. Ensaio

realizado à temperatura ambiente, amostra em repouso.

A ocorrência de fenômenos de desestabilização (ex.: agregação, floculação) e

separação de fases (ex.: segregação, sedimentação e flotação) modifica o modo de

interação do feixe de luz com o meio, ocasionando aumento ou redução da intensidade

de transmissão e do retroespalhamento devido à variação e diferença do tamanho de

partícula / migração das partículas. Neste caso, nota-se a ocorrência de fenômenos desta

natureza com a amostra obtida a 400 bar (Figura 34(B)) : redução do retroespalhamento

no fundo da amostra (clarificação) e aumento no topo, denotando uma provável

separação de fases. É importante lembrar que a velocidade de separação é maior quanto

maior for o diâmetro de partículas, quanto maior for a diferença de densidade entre as

duas fases e quanto menor for a viscosidade da fase externa. O fenômeno de

instabilidade observado poder ser considerado um processo de cremeação e essa

formação de ―nata‖ ascendente ocorre em emulsões instáveis quando a fase interna tem

densidade menor do que a fase externa (ANSEL et al., 2000). No entanto, nesse caso,

além da diferença de densidade entre as fases a instabilidade também pode ser

provocada pelo diâmetro de partículas e sua distribuição, pois a cinética do movimento

browniano depende diâmetro de partícula, o que pode facilitar agregação da fase interna

e conseqüente separação de fases (MUCCIACITO, 2007). Algumas características

101

físico-químicas são fundamentais para a estabilidade dos sistemas, como o tamanho de

partículas. Este é um parâmetro importante utilizado no controle de qualidade

(MÜLLER-GOYMANN, 2004). ).

Dando continuidade a esta análise de estabilidade, foram realizados mais 2

ensaios adicionais à pressão de homogeneização de 900 bar e sob as demais condições

dos Ensaios 25 e 27, variando-se o número de ciclos (2 e 8). As nano-suspensões, cujas

características de tamanho estão dadas na Tabela 19, foram submetidas a esta mesma

análise de estabilidade física por turbidimetria dinâmica.



Experimento Diâmetro ( nm ) Indíce de Polidispersão

900 bar, 8 ciclos 250,3 0,098

900 bar, 2 ciclos 268,1 0,358

Os resultados (Figura 36) mostram a estabilidade da nano-suspensão preparada

com o maior número de ciclos (uma variação do retroespalhamento (backscattering) )

de 0,5% e 1,6% para as amostras obtidas respectivamente com 8 e 2 ciclos, como

confirma a cinética do processo ilustrada na Figura 37. Este comportamento está

provavelmente ligado à polidispersidade de tamanho da amostra gerada com 2 ciclos

como mostrado na Tabela 19.

102

(A) 8 ciclos

(B) 2 ciclos


suspensões de nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas em

pressão de 900 bar e com diferentes números de ciclos no homogeneizador: 8

ciclos (A) e 2 ciclos (B).

103


(deltaTbackscatering) medido nas amostras de nanopartículas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila obtidas em pressão de 900 bar e com diferentes números de ciclos no

homogeneizador. Ensaio realizado à temperatura ambiente , amostra em repouso.

5.2.4. Teste de oclusão e de estabilidade de nano-suspensões preparadas nas

melhores condições de processo selecionadas do planejamento estatístico de

experimentos.

Novas amostras foram preparadas em condições de formulação e processo

fixadas após análise dos efeitos descritivos obtidos pelo planejamento estatístico de

experimentos (dadas na Tabela 20). Adicionou-se silicone (dimeticone) na fase lipídica

e um conservante sob agitação (fenoxietanol-F) após o resfriamento da formulação

(AZZELINI, 1995; VILLALOBOS-HERNÁNDEZ e MÜLLER-GOYMANN, 2005,

2006b). Verificou-se o efeito de oclusão (metodologia item 4.2.2.2.3) que estes

sistemas podem proporcionar e também avaliou-se a estabilidade física sob estresse

térmico através do método de freeze-thaw cycling (ciclo congela-descongela).

104

Tabela 20. Condições de formulação de nanopartículas lipídicas sólidas à base de cera

de carnaúba e oleato de isodecila na proporção 1:1 e 2:1.

Condições de processo: Tempo de pré-emulsificação = 4 min; pressão de

homogeneização = 900 bar; número de ciclos = 8; resfriamento natural

em temperatura ambiente.

5.2.4.1. Fator de Oclusão

Os sistemas nanolipídicos possuem propriedades oclusivas de formação de filme

sobre a pele e agem como protetores solares físicos atuando em sinergismo com

moléculas de protetores solares (SOUTO et al., 2005). Esse teste investigou o efeito da

quantidade de oleato de isodecila nas propriedades oclusivas das CLN obtidas, cujas

características de tamanho são dadas na Tabela 21.

A Figura 38 apresenta os resultados obtidos dos testes de oclusão com estes

sistemas, que apresentam fatores de oclusão superiores a 45%. A amostra com uma

maior quantidade de oleato de isodecila (1:1) apresentou um maior fator de oclusão, que

pode ser explicado em função do tamanho das partículas (menores). Partículas menores

tendem a formar um filme oclusivo na superfície onde se depositam como ilustra a

Figura 39.

Composição % (massa)

1:1 2:1

FASE OLEOSA

Cera de Carnaúba Tipo I 5 10

Oleato de Isodecila 5 5

Dimeticone* 1 1

FASE AQUOSA

Tween 80 1 1

Fenoxietanol-F* 0,2 0,2

Água Ultra Pura q.s.p 100 mL q.s.p 100 mL

105

Tabela 21. Granulometria dos carreadores lipídicos nanoestruturados a base de cera de


Amostras Diâmetro ( nm) Índice de Polidispersão

2:1 1291, 3±213,6 1,000

1:1 266,4± 0,7 0,139±0,019

Figura 38. Gráfico representativo do Fator oclusivo para formulações com

diferentes proporções de oleato de isodecila.

Figura 39. .Efeito da redução do tamanho das partículas se depositando na

superfície do papel (fenômeno similar ao esperado sobre a pele).

diâmetro

de partícula

diâmetro

de partícula

106

O frasco de referência não impede a evaporação da água e possui um fator de

oclusão de 0%; já a não evaporação indica um fator oclusivo que pode ser de até 100%

(MÜLLER et al., 2007). Em estudos realizados com nanopartículas lipídicas

incorporadas em bases cosméticas observou-se um fator de oclusão de

aproximadamente 40-50% (DINGLER, 1998, WISSING, 2002), o que indica que os

CLN desenvolvidos neste trabalho podem representar um efeito oclusivo da mesma

ordem de grandeza de sistemas de mesma natureza (lipídicos) encontrados na literatura.

5.2.4.2. Ciclo Congela-descongela (freeze-thaw cycling)

Como descrito no item 4.2.2.2.2., o ciclo congela-descongela consiste em

submeter a amostra a um período de congelamento a - 4 °C por 24 h seguido de um

período de descongelamento a 40°C também 24h. Este ciclo foi realizado para avaliação

de instabilidades físicas das nano-suspensões como precipitação e separação de fases

em um curto período de tempo (1 semana). O resultado do teste se traduz em análise do

diâmetro e do índice de polidispersão e potencial zeta das nanopartículas, e viscosidade

das nano-suspensões, como mostrado na Tabela 22.

Tabela 22. Caracterização físico-química das partículas antes e depois do ciclo

congela-descongela.

Características da

amostra

Antes

Freeze-thaw cycling

Após

Freeze-thaw cycling

Diâmetro ( nm) 260,16 ± 1,64 345,13 ± 0,25

Índice de Polidispersão 0,115 ± 0,03 0,125 ± 0,02

Potencial Zeta ( mV ) -34,87 ± 0,62 -35,2 ± 0,74

Viscosidade (cPs) 2,27 2,74

A Tabela 22 mostra que o ciclo congela-descongela que estas nano-suspensões

foram submetidas durante uma semana não afetaram características como viscosidade e

potencial zeta. Constata-se um aumento do tamanho das partículas de 260 nm para 345

nm. Estas mesmas nano-emulsões foram analisadas por turbidimetria dinâmica

(Turbiscan Lab®) antes e depois do estresse térmico e o comportamento pode ser

observado na Figura 40. A variação do backscattering antes e após o teste foi de 0,16 %

e 0,24% respectivamente (mostrado na Figura 41), indicando que as condições definidas

107

para a formulação e processo são satisfatórias quanto à estabilidade física do produto

obtido.

(A)

(B)


suspensões de nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila obtidas a

900 bar e 8 ciclos de passagem, antes (A) e após (B) estresse térmico.

108


(deltaTbackscatering) medido nas amostras de nanopartículas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila obtidas antes e após o estresse térmico.

Em suma, a variação de tamanho das partículas não afetou a estabilidade física

das nano-suspensões após o ciclo congela-descongela, como mostrado pelos perfis de

restroespalhamento na Figura 41. A boa estabilidade destas nano-suspensões é em parte

assegurada pelo elevado valor absoluto do potencial zeta (> [30] mv).

O emulsificante usado pode ter representado um parâmetro importante

contribuindo para esta estabilidade das nanopartículas ao estresse térmico: Segundo a

literatura (JOSHI e PATRAVALE, 2008), na fase de congelamento, a fase aquosa da

nano-suspensão é cristalizada, o que acaba causando um alongamento e achatamento

das partículas lipídicas. A porção lipofílica do emulsificante perde mobilidade enquanto

que a porção hidrofílica fica ―desidratada‖ devido ao congelamento da água. Quando a

amostra é descongelada a água é liberada e percorre rapidamente toda a nano-

suspensão. Se o sistema se estabiliza antes de ocorrer coalescência, ele é estável.

Entretanto, se a taxa de redispersão dos ingredientes é baixa, a instabilidade pode

ocorrer, o que não acontece em temperatura ambiente.

109

5.3. CLN: VEÍCULO PARA APLICAÇÃO COSMÉTICA DE BENZOFENONA-3

Após um estudo de formulação e obtenção de nanopartículas lipídicas

constituídas de cera de carnaúba e oleato de isodecila, foi realizada uma nova etapa do

trabalho incorporando-se o ativo de interesse, BZ-3. O parâmetro de estudo foi o teor de

BZ-3 nas nanopartículas constituídas da mistura cera de carnaúba-oleato de isodecila

(1:1), investigando-se o efeito deste parâmetro na eficiência de encapsulação e

estabilidade física das nano-suspensões.

5.3.1. Características das nanopartículas lipídicas nanoestruturadas com BZ-3

A Tabela 23 reúne as informações referentes a diâmetro médio, índice de

polidispersão, potencial zeta e eficiência de encapsulação das nanopartículas lipídicas.

Estas caracterizações foram feitas na data de preparação das amostras (t0) e decorridos

15 e 30 dias desta data (t15 e t30).

5.3.1.1. Tamanho

Nanopartículas com um tamanho médio variando de 266 a 318 nm com baixos

índices de polidispersão (< 0,21) foram obtidas. Observa-se uma tendência de aumento

do tamanho das partículas com o aumento da concentração do ativo. A variação de

tamanho observada após 15 e 30 dias é pouco significativa.

5.3.1.2. Potencial zeta

As nanopartículas apresentam um elevado potencial zeta negativo (> - 30mV), o

que explica a tendência à estabilidade física comprovada pela pouca variação de

tamanho das nanopartículas ao longo do tempo de estocagem. De modo geral, a

agregação é menor com partículas que apresentam um grande potencial zeta em valores

absolutos, o que ocasiona uma maior repulsão eletrostática (MÜLLER et al., 2000).

110

Tabela 23. Caracterização físico-química das nanoparticulas lipídicas de cera de

carnaúba e oleato de isodecila 1:1 contendo BZ-3.

Teor de BZ-3

nas formulações

% (mBZ-3/

mfase lipidica)

Dia

Diâmetro

( nm)

Índice de

polidispersão

Potencial Zeta

(mv)

Viscosidade

( cPs)

pH EE %

Teor BZ-3

% (mBz3/

mnanopartículas)

BRANCO

t0 266,4 ± 0,7 0,139 ± 0,019 - 32,4 ± 1,6 1,95 5,31 - -

t15 274,8 ± 1,4 0,100 ± 0,046 - 28,8 ± 2,2 2,00 5,77 - -

t30 205,3 ± 2,38 0,186 ±0,023 -27,2± 2,8 2,04 5,42 - -

4,8

t0 266,3 ± 0,9 0,074 ± 0,029 - 35,1 ± 0,7 2,02 5,47 91,0 3,60

t15 278,4 ± 6,0 0,100 ± 0,006 - 38,5 ± 1,9 1,90 5,32 87,6 3,40

t30 210,0 ± 1,2 0,103± 0,030 -34,1± 2,0 2,12 5,73 58,8 2,20

9,1

t0 278,5 ± 0,1 0,104 ± 0,014 - 34,0 ± 3,3 3,69 5,04 63,7 4,70

t15 291,1 ± 4,8 0,091 ± 0,032 - 34,7± 12,1 3,05 5,01 57,9 4,40

t30 259,3 ± 8,9 0,015 ± 0,008 -39,2 ±10,0 2,02 4,67 55,2 4,30

23,1

t0 314,4 ± 6,0 0,052 ± 0,031 - 33,1 ± 0,7 2,15 5,23 25,5 5,20

t15 317,6 ± 9,3 0,041 ± 0,018 - 36,8 ± 1,2 1,98 5,12 24,7 4,80

t30 302,1 ± 5,8 0,153 ± 0,126 -32,8± 1,0 2,20 4,91 20,3 4,00

33,3

t0 * * * 2,00 5,38 17,1 5,10

t15 359,1 ± 8,2 0,184 ± 0,058 - 38,5 ± 0,5 1,22 5,51 14,9 4,40

t30 302,1 ± 24,4 0,215 ± 0,187 -33,9± 0,7 2,45 5,61 12,4 3,50

* Dados não determinados

5.3.1.3. Eficiência de Encapsulação

A Tabela 23 apresenta também a eficiência de encapsulação de BZ-3 pelos CLN

de cera de carnaúba e oleato de isodecila. Nota-se que a eficiência de encapsulação

depende da concentração inicial de BZ-3 nas formulações, ou seja, a eficiência de

encapsulação diminui com o aumento da concentração de BZ-3, o que pode ser melhor

visualizado na Figura 42.

111

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40

efic

ien

cia

de

enca

psu

laçã

o (

%)

concentração de Bz3 (mg/mg fase lipídica)

tempo zero

15 dias

30 dias

Figura 42. Eficiência de encapsulação de BZ-3 em nanoparticulas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila em função do teor inicial de BZ-3 e do tempo de estocagem.

O comportamento apresentado na Figura 42 pode ser melhor interpretado com o

apoio da Figura 43 : CLN de cera de carnaúba e oleato de isodecila 1:1 parecem ter uma

capacidade máxima de retenção do ativo em torno de 4-5% de BZ-3 (massa BZ-3/massa

nanopartículas).

Figura 43. Relação entre teor de BZ-3 na formulação inicial e BZ3 encapsulado

nos CLN.

112

No caso específico deste estudo, e com base na literatura (MÜLLER et al., 2002;

MÜLLER-GOYMANN, 2004), propõe-se o seguinte mecanismo para explicar os

resultados obtidos: a composição da matriz lipídica determina um arranjo específico dos

cristais o que vai permitir uma capacidade máxima de incorporação do ativo; uma

evolução da estrutura cristalina ao longo do tempo pode resultar em maior probabilidade

de expulsão do ativo contido na estrutura.

Figura 44. Representação esquemática do efeito da nanoestrutura sobre a encapsulação

do ativo (na produção e evolução ao longo do tempo).

5.3.2. Características das nano-suspensões

5.3.2.1. pH e viscosidade

As nano-suspensões produzidas neste estudo apresentam pH levemente ácido na

faixa 4,9-5,8 que são valores adequados para formulações de uso tópico (PAESE,

2008). O pH permaneceu praticamente inalterado ao longo da estocagem, o que é

113

bastante positivo já que a alteração do pH pode indicar a degradação de algum

excipiente (GUTERRES et al. , 2007).

De acordo com os valores apresentados na Tabela 23 observamos que as

formulações apresentam baixa viscosidade, na faixa de 1,9-3,7 cPs. O controle da

viscosidade em compostos lipídicos nanoestruturados também é considerado um fator

que indica estabilidade do sistema, pois este parâmetro mostra se a formulação perdeu

ou não sua estrutura inicial com o passar do tempo. Dispersões lipídicas líquidas podem

adquirir uma consistência semi-sólida, fenômeno conhecido como gelificação, que

corresponde à transformação de uma suspensão destas partículas de baixa viscosidade

em um gel viscoso (MÜLLER et al., 2007).

5.3.2.2. Estabilidade física (turbidimetria dinâmica)

A estabilidade física das nano-suspensões foi avaliada por turbidimetria

dinâmica usando o equipamento Turbiscan Lab®. A Figura 45 apresenta os resultados

da varredura de retroespalhamento efetuada nas nano-suspensões formuladas com os

diferentes teores iniciais de BZ-3 (0, 4,8; 9,1; 23,1 e 33,3 % em massa). Nota-se

sobreposição das varreduras de retroespalhamento em todos os casos, o que denota boa

estabilidade física das amostras, com exceção da maior concentração (333µgBZ-

3/mgLip). Na base desta amostra é possível verificar um aumento do retroespalhamento

com o tempo enquanto que nas regiões intermediária e superior da amostra nota-se uma

queda do retroespalhamento (clarificação), indicando uma possível separação de fases.

Isto demonstra um processo de migração do topo para a base da cubeta, sugerindo um

possível fenômeno de sedimentação, como descrito em trabalho de MENGUAL e

colaboradores (1999), neste caso, provocado pela sedimentação dos cristais presentes na

formulação e não encapsulados.

114

(A) (B)

(C) (D)

(E)

Figura 45. Variação de retroespalhamento no estudo da estabilidade das suspensões

de nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila com diferentes teores

iniciais de BZ-3:0 (A); 4,8 (B); 9,1 (C); 23,1 (D); 33,3 (E) % BZ-3.

115

A cinética desta evolução (deltaTbackscatering) é representada na Figura 46, o

que permite melhor visualizar a estabilidade das nano-suspensões com os diferentes

teores de BZ-3.


(deltaTbackscatering) medido nas amostras de nanoparticulas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila contendo BZ-3.

5.3.2.3. Estudo de Liberação in vitro

A cinética de liberação in vitro é uma etapa inicial da medida de extensão da

cedência de uma formulação (LIRA et al., 2003). A liberação in vitro de BZ-3 de

nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de isodecila desenvolvidas neste trabalho

foi investigada experimentalmente empregando-se membranas sintéticas de acetato de

celulose, que são empregadas em estudos de liberação in vitro e recomendadas pelo

FDA (FDA/CDER, 1998) por atenderem exigências como não reagir com a formulação

ou com o meio receptor.

Um ensaio de liberação in vitro foi realizado para a formulação com 48 µg de

BZ-3/mg de lipídios, que apresentou maior eficiência de encapsulação imediatamente

após preparação (> 90%). A Figura 47 apresenta a evolução da concentração de BZ-3

no meio receptor (em µg/cm2) ao longo de 8 horas de ensaio. Nota-se neste caso que a

concentração de BZ-3 na fase receptora evolui muito lentamente no tempo,

correspondendo a uma cinética de ordem zero e uma velocidade de liberação de 2,4

µgcm-2h-

1. A quantidade liberada no meio receptor é bastante baixa com relação à

116

quantidade de BZ-3 na formulação; no entanto, lembrando que este é um teste in vitro

de difusão de um ativo encapsulado através de uma membrana sintética, esta liberação

lenta pode ser devido a vários fatores inerentes às condições do teste:

BZ-3 é hidrofóbica e a matriz lipídica é hidrofóbica; o ativo tem mais afinidade

pela matriz (formulação) que pelo meio receptor que não simula exatamente as

características do estrato córneo;

A lenta liberação pode também ser um indicativo de que a BZ-3 está

encapsulada e não adsorvida na superfície das nanopartículas.

Tratando-se de um ativo de uso como filtro químico solar, seu efeito será na

superfície da pele, sendo que a penetração cutânea não é desejada. Este comportamento

é, portanto compatível para o uso das nanopartículas de cera de carnaúba e oleato de

isodecila como veículo de filtro solar químico. É importante lembrar, no entanto, que

esse comportamento deve ser confirmado por um estudo de retenção ou permeação

cutânea, que não foi realizado neste trabalho.

Figura 47. Perfil de liberação de BZ-3 a partir de nanopartículas de cera de carnaúba e

oleato de isodecila (48 µg de BZ-3/mg de lipídios). Meio receptor = tampão fosfato 7,4

(n=4).

117

5.3.2.4. Estudo de Penetração in vitro

O grau de penetração destas nanopartículas na pele foi avaliado através da

técnica de microscopia confocal de fluorescência por varredura laser (CLSM), utilizando

um fluoróforo (Nile Red), que possui características lipofilícas como as do ativo

estudado. O composto Nile Red foi encapsulado nos CLN de cera de carnaúba e oleato

de isodecila 1:1 nas mesmas condições usadas com BZ-3.

Esta técnica de microscopia de fluorescência tem sido empregada para avaliar o

grau de penetração in vitro (BORGIA et al. , 2005 e CHEN et al., 2006), avaliando-se de

forma qualitativa a distribuição e intensidade da fluorescência de amostra de

nanopartículas contendo um corante como o Nile Red em diferentes camadas da pele.

A representação da fluorescência nas seções transversais da pele explora uma

informação comparativa entre o sítio alvo dos CLNs e a penetração do fluoróforo

disperso em óleo na pele. Nas Figuras 48 e 49 observou-se uma intensidade maior da

fluorescência na epiderme nas amostras que possuíam o carreador e essa intensidade

diminui gradualmente com o aumento da profundidade. Quando comparadas com as

amostras sem o carreador lipídico, a fluorescência não é muito uniforme e apresenta-se

menos intensa nas camadas mais superficiais e melhor distribuída nas camadas mais

profundas da pele.

Essas imagens revelam que a presença dos carreadores lipídicos

nanoestruturados evita a permeação de grande parte do corante até a derme.

Diferentemente das amostras do corante disperso em óleo (ausência do carreador), onde

o corante apresentou-se distribuído em todas as camadas da pele, indicando a

penetração. Partículas desta ordem de tamanho (200-300 nm) podem se acumular na

superfície da pele, podendo permanecer na região folicular por um tempo e, então,

serem removidas lentamente pela secreção do sebo (ALVAREZ-ROMÁN, 2004,

NOHYNEK et al., 2007).

118

(A) CLN- CARREADORES LIPÍDICOS

NANOESTRUTURADOS

(B) DISPERSÃO OLEOSA

Figura 48. Cortes de pele do estudo de penetração in vitro.

(A) CLN- CARREADORES LIPÍDICOS

NANOESTRUTURADOS

(B) DISPERSÃO OLEOSA

Figura 49. Cortes de pele do estudo de penetração in vitro.

119

6. CONCLUSÕES FINAIS

120

6. CONCLUSÕES

O estudo aqui realizado concentrou-se no desenvolvimento de carreadores

lipídicos nanoestruturados à base de cera de carnaúba e oleato de isodecila.

Benzofenona-3 foi o ingrediente de interesse cosmético encapsulado no sistema

desenvolvido.

Através de um estudo de processo (homogeneização em alta pressão) e de

préformulação, obteve-se nano-suspensões na faixa de 200-300 nm de tamanho médio,

com boa estabilidade física para uso como veículos de ingredientes ativos. Estas

nanopartículas lipídicas são constituídas de uma mistura do lipídio sólido (cera de

carnaúba) com o lipídio líquido (oleato de isodecila) na proporção 1:1. Parâmetros de

processo como a pressão de homogeneização e o número de ciclos ou passagens no

homogeneizador afetaram significativamente a estabilidade física das nano-suspensões.

O estudo evidenciou o efeito da composição da mistura lipídica na eficiência de

encapsulação da benzofenona-3 e na estabilidade física das nano-suspensões,

comprovada por 30 dias. A identificação de uma capacidade máxima de retenção da

benzofenona-3 em torno de 4-5% em massa nas nanopartículas destaca-se como

resultado inédito obtido neste trabalho. Em suma, estudos similares de desenvolvimento

de carreadores lipídicos nanoestruturados em geral não relacionam a capacidade de

encapsulação de um ativo com a composição estrutural do sistema estudado, o que foi

demonstrado neste trabalho para um dado sistema ativo-matriza lipídica. Identificar uma

capacidade de reter uma dada molécula em função de uma dada composição química

(mistura de lipídios) dos nanocarreadores, mantendo como referència a estabilidade do

sistema, pode representar um aspecto original até então não abordado no

desenvolvimento tecnológico de um novo carreador lipídico nanoestruturado.

121

7. PERSPECTIVAS

122

7. PERSPECTIVAS

Para continuidade do trabalho referente ao desenvolvimento de carreadores

lipídicos nanoestruturados à base de cera de carnaúba, sugere-se como estudos

complementares:

Complementar a caracterização fisico-química das nanopartículas lipídicas

obtidas (análise da estrutura cristalina da matriz lipídica por DSC e DRX,

dentreoutras técnicas);

Incorporar as nano-suspensões lipídicas contendo BZ-3 em diferentes bases

cosméticas e analisar o impacto na estabilidade física das formulações

cosméticas resultantes;

Realizar estudos de fotoestabilidade, permeação ou retenção cutânea destas

formulações resultantes para verificar o impacto da nano-encapsulação da BZ-3

na ação do ativo encapsulado (ação foto-protetora, estabilidade quimica,

estabilidade física da formulação, etc);

Explorar a hipótese de que cada matriz lipídica pode acomodar um máximo de

um dado ativo (o que certamente depende do tipo de molécula a ser

encapsulada) com outras proporções mássicas para a mistura de cera de

carnaúba com oleato de isodecila;

Testar outros lipídeos líquidos em associação com a cera de carnaúba, por

exemplo, óleos amazônicos como da castanha do pará, copaíba, dentre outros.

123

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

124

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABISMAÏL, B., CANSELIER, J.P., WILHELM, A.M., DELMAS, H., GOURDON, C.

Emulsification by ultrasound: drop size distribution and stability. Ultrasonics

Sonochemistry, vol. 6, p. 75-83, 1999.

ALVAREZ-ROMÁN, R., NAIK, A., KALIA, Y.N., GUY, R.H., FESSI, H. Skin

penetration and distribution of polymeric nanoparticles. Journal of Controlled Release,

vol. 99, p. 53-62, 2004.

ALVAREZ-ROMÁN, R.; BARRÉ, G.; GUY, R. H.; FESSI, H. Biodegradable polymer

nanocapsules containing a sunscreen agent: preparation and photoprotection. European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceuitcs, vol. 52, p. 191-195, 2001.

ANIL KUMAR ANAL, HARJINDER SINGH . Recent advances in microencapsulation

of probiotics for industrial applications and targeted delivery. Trends in Food Science &

Technology, vol. 18, p. 240-25, 2007.

ANSEL, H.C.; POPOVICH, N.G.; ALLEN, L.V. Farmacotécnica: Formas

farmacêuticas e liberação de fármacos. 6a

ed., São Paulo: Premier, 2000.

AUGUSTIN, M.A., SANGUANSRI, L., MARGETTS, C. & YOUNG, B.

Microencapsulation of food ingredients. Food Australia, vol. 53, p. 220–22, 2001.

AZZELLINI, S.C., Agentes potencializantes de fotoprotetores. Cosmetic &Toiletries

(edição em português),vol. 7, p. 34-37, São Paulo, 2007.

BAKAN, J. A. Microencapsulation of foods and related products. Food Technology,

vol. 27, n. 11, p. 34-44, 1973.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TW3-3W071BJ-B&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F1999&_alid=916264347&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5551&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=2&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=946dbc1aeba2f8d17bd776e50ebc7a23

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VHY-4MXBF95-1&_user=10&_coverDate=05%2F31%2F2007&_alid=916019965&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_cdi=6079&_docanchor=&view=c&_ct=1&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=dbd5a7a0528a89630c7bbddc087b50f1



125

BALESTRIERI, F.,. MAGRÌ, A. D., MAGRÌ, A.L.,MARINI, D., SACCHINI, A.

Application of differential scanning calorimetry to the study of drug-excipient

compatibility. Thermochimica Acta, vol. 285, p. 337-345, 1996.

BERTOLINI, A. C., SIANI, A. C., & GROSSO, C. R. F. Stability of monoterpenes

encapsulated in gum Arabic by spray-drying. Journal of Agriculture and Food

Chemistry, vol. 49, p. 780–785, 2001.

BINGHAM, G., GUNNING, R.V., GORMAN, K., FIELD, L.M. AND MOORES, G.D.

Temporal Synergism by Microencapsulation of Piperonyl butoxide and α-cypermethrin

overcomes insecticide resistance in crop pests. Pest Management Science Pest Manag

Sci. vol. 63, p.276–281, 2007.

BODMEIER, R.A. Waxes, in: Encyclopedia Pharmaceutical Technology. Marcel

Dekker , New York, NY, p. 2988-2999, 2002.

BOH B.AND KORNHAUSER A. Reducing the Toxicity of Pesticides. Critical Reviews

in Analytical Chemistry, vol. 33(4), p.281–284, 2003.

BOH, BOJANA, SAJOVIC, IRENA, VODA, KARMEN. Microcapsule applications :

patent and literature analysis. In: ARSHADY, Reza ed., BOH, Bojana (eds.).

Microcapsule patents and products, The MML series, Vol. 6, Citus reference series.

London: Citus, pp. 158-185,2003.

BORGIA, S.L.,REGEHLY, M., SIVARAMAKRISHNAN, R., MEHNERT, W.,

KORTING, H.C., DANKER, K.,. RÖDER, B,. KRAMER, K.D, SCHÄFER-

KORTING, M. Lipid nanoparticles for skin penetration enhancement—correlation to

drug localization within the particle matrix as determined by fluorescence and

parelectric spectroscopy. Journal of Controlled Release, vol. 110, p. 151-163, 2005.

BOUTBOUL, A., GIAMPAOLI, P., FEIGENBAUM, A., & DUCRUET, V. Influence

of the nature and treatment of starch on aroma retention. Carbohydrate Polymers, vol.

47, p. 73–82, 2002.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THV-3VB3M54-H&_user=10&_coverDate=08%2F25%2F1996&_alid=916697958&_rdoc=129&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5292&_st=13&_docanchor=&view=c&_ct=192&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=1da1810b16273f89a8d8cc549da68592

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THV-3VB3M54-H&_user=10&_coverDate=08%2F25%2F1996&_alid=916697958&_rdoc=129&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5292&_st=13&_docanchor=&view=c&_ct=192&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=1da1810b16273f89a8d8cc549da68592

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3D-4HK5SG2-3&_user=10&_coverDate=12%2F10%2F2005&_alid=910438562&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4944&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=1&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=242a34991206812d9fdee1756390446e



126

BOX, G.E.P.; WILSON, K.B. On the experimental attainment of optimum conditions.

Journal Royal Statistics Society, B13, p.38, 1978.

BRANNON-PEPPAS, L. Controlled release in the food and cosmetics industries. In:

Polymeric delivery systems: properties and applications. Oxford: Oxford University

Press, chapter 3, p. 42-52, 1993.

BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária- ANVISA. Resolução- RE N° 899,

de 29 de maio de 2003.

BUNJES, H., WESTESEN, K., and KOCH, M.H.J. Crystallization tendency and

polymorphic transitions in triglyceride nanoparticles. International Journal of

Pharmaceutics, vol.129, p. 159-173, 1996.

CALVO, P., ALONSO, M.J., VILA-JATO, J.L. AND ROBINSON, J.R. Improved

ocular bioavailability of indomethacin by novel ocular drug carriers. J.

Pharm.Pharmacol., vol. 48, p.1147–1152, 1996.

CAPAN ,Y., WOO, B. H., GEBREKIDAN, S., AHMED, S., DELUCA, P. P. Influence

of formulation parameters on the characteristics of poly( -lactide-co-glycolide)

microspheres containing poly( -lysine) complexed plasmid DNA. Journal of

Controlled Release, vol. 60, p. 279-286, 1999

CEVC, G. lipid veiscles and other colloids as drug carriers on the skin. 2004. Adv.

Drug. Delivery Rev., vol. 56:671–675, 2004.

CHEN, H., CHANG, X., DU, D., LIU,W., LIU, J.,WENG, T., YANG, Y., XU, H.,

YANG, X.,Podophyllotoxin-loaded solid lipid nanoparticles for epidermal targeting. J.

Controlled Release, vol. 110, p. 296–306, 2006.

CHO, Y. H., & PARK, J. Characteristics of double encapsulated flavour powder

prepared by secondary fat coating process. Journal of Food Science, vol. 67(3), p. 968–

972, 2002.

COLLINS, P.; FERGUSON, J. Photoallergic contact dermatitis to oxybenzone. Br. J.

Dermatol. vol. 131, p. 124-129, 1994.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3D-3X1VTB5-F&_user=10&_coverDate=08%2F05%2F1999&_alid=916110750&_rdoc=56&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4944&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=68&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=d0462edc27dd859cceebdd4c151fbedc




127

CTFA, Cosmetic Ingredient Dictionary. 5a

ed., ed.: NIKITAKIS, J. M.; Mcwen Junior,

G. N., Washington DC, 1991.

DAILEY, O.D., JR.; DOWLER, C. C.; GLAZE, N. C. Evaluation of Cyclodextrin

Complexes of Pesticides for Use in Minimization of Groundwater Contamination. In

Pesticide Formulationsand Application Systems, vol. 10, 1990.

DASH ,A.K., CUDWORTH, G.C. Therapeutic applications of implantable drug

delivery systems. J Pharmacol Toxicol Methods, vol. 40(1), p.1-12, 1998.

DINGLER, A., Feste Lipid-Nanopartikel als kolloidale wirkstofftragersystenme zur

dermalen apllikation. PhD Thesis, FU Berlin, 1998.

E. B. SOUTO, S. A. WISSING, C. M. BARBOSA, R. H. MÜLLER. Evaluation of the

physical stability of SLN and NLC before and after incorporation into hydrogel

formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 58, p.

83-90, 2005.

FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 4ª Ed. São Paulo. Atheneu Editora, 2002.

FDA/CDR. Topical Dermatological Drug Product NDAs and ANDAs -- In Vivo

Bioavailability, Bioequivalence, In Vitro Release and Associated Studies (Issued

6/18/1998).

FIALHO, S. L.; JÚNIOR,

A.S.C. Sistemas de transporte de drogas para o segmento

posterior do olho: bases fundamentais e aplicações. Arq. Bras. Oftalmol, vol.70, n°.1,

2007.

FRANZ, T.J. Percutaneous absorption. On the relevance of in vitro data. The Journal of

Investigative Dermatology, vol. 64, p. 190-195, 1975.

FREITAS, C., MÜLLER R.H., Correlation between long term stability of solid

nanoparticles (SLN) and crystallinity of lipid phase. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 47, p. 125-132, 1999.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6C-4CB69G0-1&_user=10&_coverDate=07%2F31%2F2004&_alid=910516306&_rdoc=18&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5027&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=18&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ccf09aaaceb9bc4730a4bcf776de6b71




http://www.geocities.com/HotSprings/Spa/6896/2481dft.pdf



128

FREITAS, C., MÜLLER, R.H. Effect of light and temperature on zeta potential and

physical stability in solid lipid nanoparticle (SLN™) dispersions. International Journal

of Pharmaceutics, vol. 168, p. 221-229, 1998.

GALLATARE, M., CARLOTTI, M.E., TROTTA, M. e BOVO , S. On the stabiluty of

ascorbic acid in emulsified systems for topical and cosmetic use. Intern. J. Pharm., vol

188, p.233-241, 2002.

GAO Z, AMASAKI I, KANEKO T, NAKADA M. Polym Degrad Stabp. 83:67, 2005.

GARDINER, G. E., O’SULLIVAN, E., KELLY, J., AUTY, M. A. E., FITZGERALD,

G. F., COLLINS, J. K., et al. Comparative survival rates of human-derived probiotic

Lactobacillus paracasei and L. salivarius strains during heat treatment and spray drying.

Applied and Environmental Microbiology, vol 66, p. 2605e2612, 2000.

GIOLITO, I.; IONASHIRO, M. A nomenclatura em análise térmica – parte II.

Cerâmica, São Paulo, vol.34, n.225, p.163-164, 1980.

GOHLA, S., MÄDER ,K., MÜLLER, R.H. Solid lipid nanoparticles (SLN) for

controlled drug delivery-a review of the state of art. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics vol. 50, p. 161-177, 2000.

GOUVEIA, J.P.G., MOURA, R.S.F., ALMEIDA, F.A. C., OLIVEIRA, A.M.V. AND

SILVA, M.M. Avaliação aliação da cinética de secagem de caju mediante um

planejamento experimental. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental,

vol.6, n.3, p.471-474, 2002.

GREEN, B.K. & SCHEICHER, L. Pressure Sensitive Record Materials. US Patent no.

2, 217, 507, Ncr C, 1955.

GUERY J. Emulsions Doubles Cristallisables: Stabilite, Encapsulation et Relargage

These de doctorat de l’universite Paris VI, École doctorale de Physique et Chimie des

Matériaux, 2006.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-3TB55GT-C&_user=10&_coverDate=06%2F15%2F1998&_alid=916262964&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_docanchor=&view=c&_ct=6&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3af43f5d68dba506ba6e69818b2fb302

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-3TB55GT-C&_user=10&_coverDate=06%2F15%2F1998&_alid=916262964&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_docanchor=&view=c&_ct=6&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3af43f5d68dba506ba6e69818b2fb302

129

GUTERRES, S., ALVES, M.P., POHLMANN, R. Polymeric nanoparticles,

nanospheres and nanocapsules, for cutaneous applications. Drug Target Insights, vol. 2,

p. 147-157, 2007.

HAYDEN, C.G.J. et al. Systemic absorption of sunscreen after topical administration.

Lancet. vol. 350, p. 863-864, 1997.

HEINZEN, C. Microencapsulation solve time dependent problems for foodmakers.

European Food and Drink Review, vol. 3, p. 27–30, 2002.

HEURTAULT, B., SAULNIER , P., PECH, B., PROUST, J.E., BENOIT, J.P. Physico-

chemical stability of colloidal lipid particles, Biomaterials, vol.24( 23) , p. 4283-4300,

2003.

HU, F., ZHANG, Y., DU, Y., YUAN, H. Nimodipine loaded lipid nanospheres

prepared by solvent diffusion method in a drug saturated aqueous system. International

Journal of Pharmaceutics, vol. 348, p.146-152, 2008.

HUNTER, R. J. Introduction to modern colloid science. New York: Oxford University

Press, 1993.

JENNING, V., GOHLA, S.H. KORTING, S.A. Vitamin A loaded solid lipid

nanoparticles for topical use: occlusive properties and drug targeting to the upper skin.

European. J. Pharm. Biopharm, vol.49, p.211-218, 2000.

JOSHI, M. AND PATRAVALE, V. Cetyl palmitate-based NLC for topical delivery of

Coenzyme Q10- Development, physicochemical characterization and in vitro release

studies. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics vol. 67, p. 141-148,

2008.

KIM B., N. K., CHOI, H. Preparation and characterization of solid lipid nanoparticles

(SLN) made of cacao butter and curdlan. European Journal of Pharmaceutical

Sciences, vol., p.199-205, 2005.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TWB-48XD58M-2&_user=10&_coverDate=10%2F31%2F2003&_alid=915999567&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5558&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=6&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ee69c355227bdb75585b546fc859edac

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TWB-48XD58M-2&_user=10&_coverDate=10%2F31%2F2003&_alid=915999567&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5558&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=6&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ee69c355227bdb75585b546fc859edac

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4P8GWXH-1&_user=10&_coverDate=02%2F04%2F2008&_alid=916144403&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=1&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b0b35d569d9b0e62dbce350746cce940



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T25-4F085DY-2&_user=10&_coverDate=02%2F01%2F2005&_alid=916197386&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4909&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cd649a2515dd73f31ce7e21b5c27811a



130

KIM, C.K.; LEE, E.J. The controlled release of blue dextranfrom alginate beads. Int. J.

Pharm., Amsterdam, vol. 79, p. 11-19, 1992.

KIMURA, H., OGURA, Y. Biodegradable polymers for ocular drug delivery.

Ophthalmologica, vol.215(3), p.143-55, 2001.

KLOSE, F. SIEPMANN, K., ELKHARRAZ, S., KRENZLIN, J. SIEPMANN. How

porosity and size affect the drug release mechanisms from PLGA-based microparticles.

International Journal of Pharmaceutics, vol. 314, p. 198-206, 2006.

KREILGAARD, M. Influence of microemulsions on cutaneous drug delivery.Adv. Drug

Deliv. Rev., 54, S77-S98 (2002).

KUMAR, M.N.V.R., KUMAR, N., DOMB, A.J. AND ARORA, M. Filled

Elastomers/Drug Del. Systems( Adv. Polymer Sci. p. 45–117, 160.

LACHMAN, L., LIEBERMAN, H.A., KANG, J.L. Teoria e Prática na Indústria

Farmacêutica, Lisboa, Fundação Galauste Gulbenkian, 2001.

LAMPRECHT, A., YAMAMOTO, H., TAKEUCHI, H.; KAWASHIMA, Y. Design of

pH-sensitive microspheres for the colonic delivery of the immunosuppressive drug

tacrolimus. Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 58, p. 37-43, 2004.

LEMARCHAND, C., COUVREUR, P. VAUTHIER, C., CONSTANTINI, D, GREF,

R. Study of emulsion satabilization by graft copolymers using the optical analyser:

Turbiscan. International Journal of Pharmaceutics, vol. 254, p. 77-82, 2003.

LIEBERMAN, H. A., RIEGER, M.M., BANKER, G.S. Pharmaceutical Dosage Forms:

Disperse Systems, Marcel Dekker, New York, vol. 1, vol 2, 1988.

LIM, S.J. AND KIM, C.K. Formulation parameters determing the characteristics

physicochemical of solid lipid nanoparticles loaded with all-tans retinoic acid.


http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4JCBNCM-1&_user=10&_coverDate=05%2F18%2F2006&_alid=916111315&_rdoc=70&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=432&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=1867a87c7daadbcf3034b2ab8b7bb29e



131

LIRA, A.A.M. Estudo de permeação in vitro e avaliação térmica de emulgel tópico a

base de lapachol. Dissertação de Mestrado do Departamento de Ciências Farmacêuticas.

Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Ciências Farmacêuticas. Universidade

Federal de Pernambuco, 2003.

LIU, J., HU, W., CHEN, H., NI, Q., XU, H., YAMG, X. Isotretinoin-loaded solid lipid

nanoparticles with skin targeting for topical delivery. International Journal of

Pharmaceutics, vol. 328, p.191-195, 2006.

LI, G.L., DANHOF, M., BOUWSTRA, J.A. Effects of elastic liquid-state vesicle on

apomorphinr iontophoresis transport through human skin in vitro. Pharm., vol.18, p.

1627-1630, 2004.

LOPES, L.B. Estratégias para o aumento da penetração cutânea de fármacos peptídicos:

avaliação in vitro e in vivo de sistemas de liberação e moléculas carreadoras. Faculdade

de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo. Ribeirão

Preto, 2005.

MADENE, A.; MURIEL, J.; SCHER, J.; DESOBRY, S. Flavour encapsulation and

controlled release – a review. International Journal of Food Science and Technology,

Oxford, vol. 41, n. 1, p. 1-21, 2006.

MÄDER, K., MÜLLER R.H., LIPPACHER A. Liquid and semisolid SLN TM

dispersions for tropical application: rheological characterization. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 58, p. 561-567, 2004.

MAGDASSI, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A:

Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 123-124, p. 671-679, 1997.

MARCATO, P.D., ADAMI, L.F., CAVERZAN, , HUBER, S.C., MISSET, T, DEN

HERTOG, J., FERREIRA, C.V., AND. DURAN, N. Solid Lipid Nanoparticles as

Sunscreen Carrier System and its Toxicity in Zebrafish Embryos, 2008.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TFR-3WMC50H-23&_user=10&_coverDate=05%2F15%2F1997&_alid=916328765&_rdoc=29&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5233&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=48&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ae777985f0750d9ae8f37ec7385b8872

132

MEHNERT, W., MÄDER, K. Solid lipid nanoparticles: Production, characterization

and applications. Advanced Drug Delivery Reviews, vol.47, p. 165-196, 2001.

MENGUAL, O., MEUNIER, G., CAYRE, I., PUECH, K., SANABRE, P.

Characterisation of instability of concentrated dispersions by optical analyser:

TURBISCAN MA 1000, Colloids and Surfaces A, vol. 152, p. 111-123, 1999.

MILÃO, D., KNORST, M.T. AND GUTERRES, S.S. 2003. Hidrofilic gel containing

nanocapsules of diclefenac: Development, stability study and physic-chemical

characterization. Pharmazie, vol. 58, p.325, 2003.

MIYAZAKI, S., TAKAHASHI, A., KUBO, W., BACHYNSKY, J. AND

LÖBENBERG, R. Pol y n-butylcyanoacrylate (PNBCA) nanocapsules as a carrier for

NSAIDS: in vitro release and in vivo skin penetration. J. Pharm. Pharmaceutical Sci.,

vol.6, p. 238–245, 2003.

MONLLOR. P., SÁNCHEZ L., CASES F., BONET M.A. Thermal Behavior of

Microencapsulated Fragrances on Cotton Fabrics. Textile Research Journal, vol. 79,

No. 4, p.365-380, 2009.

MUCCIACITO, J.C. Sistemas de Filtragem para Incineração de Resíduos. Revista Meio

Filtrante, Ano VI, Edição 19, 2007.

MÜLLER- GOYMANN, C.C. Physicochemical characterization of colloidal drug

delivery systems such as reverse micelles. Vesicles, liquid crystals and nanoparticles for

topical administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol.

58, p. 343-356, 2004.

MÜLLER, R.H., K. MÄDER AND GOHLA, S.. Solid lipid nanoparticles for

controlled delivery – a review of the state of art, Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 50 , p.

161–177, 2000.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3R-42T4JMM-4&_user=10&_coverDate=04%2F25%2F2001&_alid=916152853&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4953&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=2&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=6ab46cf3b06bb6ca4cff398bde270fb6



133

MÜLLER, R.H., PERTERSEN, R.D., HOMMOSS, A., PARDEIKE, J.

Nanoestructured lipd carriers (NLC) in cosmetic dermal products. Adv. Drug Delivery

Reviews, vol. 59, p.522-530, 2007.

MULLER, R.H., MEHNERT, W.LUCKS, J.S. SCHWARZ, Solid lipid nanoparticles

(SLN) – na alternative colloidal carrier system for controlled drug delivery. Eur. J.

Pharm. Biopharm. vol. 41, p. 423-427, 2002.

NEDOROST, S.T. Facial erythema as a result of benzophenone allergy. J. Am. Acad.

Dermatol. vol. 49, p. 259-261, 2003.

NELSON GORDON. Application of microencapsulation in textiles. Int J Pharm., vol.

242, p.55–62, 2002.

NOHYNEK, G.J., LADEMANN, J., RIBAUD, C., ROBERTS, M.S.. Grey Goo on the

skin? Nanotechnology, Cosmetic and Sunscreen Safety. Critical Reviews in Toxicology,

vol. 37, p. 251-277, 2007.

OLIVEIRA, A. M. S. Comércio da Cera de Carnaúba e meio ambiente: barreiras e

vantagens mercadológicas. Dissertação de Mestrado em Desenvolvimento e Meio

Ambiente. Programa Regional de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Meio

Ambiente. Núcleo de Referência em Ciências Ambientais do Trópico Ecotonal do

Nordeste. Universidade Federal do Piauí. Teresina, 2006.

PAESE, K. Desenvolvimento Tecnológico, estudo de fotoestabilidade e avaliaçãoda

permeação cutânea in vitro da benzofenona-3 a partir de nanocápsulas poliméricas

incorporadas em diferentes veículos semi-sólidos. Dissertação de Mestrado do

Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Faculdade de Farmácia.

Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre-2008.

PARK, E.S., CUI, Y., YUN, B.J., KO I.J. e CHI, S.C. Transdermal delivery of

piroxicam using microemulsions. Arch. Pharm. Res., vol. 28, p. 243-248, 2005.

134

PERUGINI, P., SIMEONI, S., SCALIA, S., GENTA, I., MODENA, T., CONTI, B.,

PAVANETTO, F. Effect of nanoparticle encapsulation on the photostability of the

sunscreen agent, 2-ethylhexyl-p-methoxycinnamate. International Journal of

Pharmaceutics, vol. 246, p. 37-45, 2002.

PIETKIEWICZ, J., SZNITOWSKAM., PLACZEK M. The expulsion of lipophilic

drugs from the cores of solid lipid microspheres in diluted suspensions and in

concentrates . Int. Journal of Pharmaceutics, vol.310, p. 64-71, 2006.

POTARD, N., MOY, R.L., HIGTON, A. Properties of topical sunscreen formulation.

J.dermatol. Surg. Oncol, vol. 18, p. 316-320, 2000.

POTARD, N., MOY, R.L., HIGTON. A. Properties of topical sunscreen formulation. J.

dermatol. Surg. Oncol. , vol. 18, p. 316-320. 2000.

REINECCIUS, T. A., REINECCIUS, G. A., & PEPPARD, T. L. Encapsulation of

flavours using cyclodextrins: Comparison of Arabic retention on alpha, beta, and

gamma types. Journal of Food Science, vol. 67(9), p. 3271–3279, 2002.

SAKAMOTO, M.; OHBA, A.; KURIYAMA, J.; MARUO, K.; UENO, S.; SATO, K.

Colloids Surf., B, vol.37, 27-33, 2004.

SANSDRAP , P., MOËS, A.J.. Influence of manufacturing parameters on the size

characteristics and the release profiles of nifedipine from poly(DL-lactide-co-glycolide)

microspheres. International Journal of Pharmaceutics, vol. 98, p. 157-164, 1993.

SANTOS, V. M. Preparação de Filtros Solares em Nanosistema Visando à Maior Ação

Protetora. Dissertação de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Faculdade de Farmácia. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2007.

SARVEIYA, V. RISK, S., BENSON, H.A.E. Liquid chromatographic assay for

common sunscreen agents: applicationto in vivo assessment of skin penetration and

systemic absorption in human volunteers. Journal of Chromatography B, vol 83, p. 255-

231, 2004.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-46NX9VW-1&_user=10&_coverDate=10%2F10%2F2002&_alid=916216529&_rdoc=8&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=11&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c3309d24560f03cadbefeda9de894911



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-474YHR7-C5&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F1993&_alid=916110886&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=2&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5b91d0e8e337a236f1b37433aca2894d



135

SATO, K., GARTI, N., Crystallisation of fats and fatty acids. Garti N., Sato K. (Eds),

Crystallisation and Polimorphism of Fats and Fatty Acids, Marcel Dekker Inc.,

Newyork, Basel, p. 227-266, 1988a.

SATO, K., GARTI, N., Crystallisation of fats and fatty acids. Garti N., Sato K. (Eds),

Crystallisation and Polimorphism of Fats and Fatty Acids, Marcel Dekker Inc.,

Newyork, Basel, 3-87, 1988b.

SAUER M., STREICH D, W. MEIER . pH-Sensitive Nanocontainers. Advanced

Material, vol. 13 ,p.1649–1651, 2001.

SAUPE, A., Pharmaceutical and cosmetic applications of nanoestructured lipid carriers

(NLC): sun protection and care, Free University of Berlin, 2004.

SAUPE, A., and RADES, T., Nanocarrier Technology: Frontiers of Nanotherapy, p.

41-5, Netherlands, 2006.

SCHAFFAZICK, S.R., GUTERRES,

S.S., FREITAS, L.L., POHLMANN,

A R.

Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados

para administração de fármacos. Química Nova, vol. 26, 2003.

SCOTII, L., VELASCO, M.V.R. Envelhecimento cutâneo à luz da cosmetologia. Ed.

Tecnopress, 1ª edição, p. 65-66, São Paulo, 2003.

SHAATH, N.A. Evolution of moderns sunscreen Chemicals. In: LOWE, N. J.;

SHAATH, M. A.; PATHAK, M. A. Sunscreens Development, Evaluation, and

Regulatory Aspects. New York: Marcel Dekker, p. 589-600, 1997.

SHAHIWALA, A. AND MISRA, A. Studies in topical applications of niossomaly

entrapped nimesulide. J. Pharm. Pharma. Sci., vol. 5, p.220–225, 2002.

SHIM , J., KANGH, H., PARK , W.S., HAN, S.S. KIM, J., CHANG, I.S. Transdermal

delivery of minoxidil with block copolymer nanoparticels. Journal of Controlled

Release, vol. 97, p. 477-484, 2004.

136

SIEKMENN B., WESTENSEN K. Thermoanalysis of the recrytallisation of melt-

homogenised glyceride nanoparticles, Colloids and surfaces B: Biomaterias, vol. 3, p.

159-175, 1994.

SIEKMENN, B., WESTENSEN, K., Submicron-sized parenteral carrier system based

on solid lipids. Pharm. Pharmacol., vol.1, p. 123-126, 1992.

SIEPMANN , J., FAISANT, N., AKIKI, J., RICHARD, J., BENOIT, J. P. Effect of the

size of biodegradable microparticles on drug release: experiment and theory. Journal of

Controlled Release, vol. 96, p. 123-134, 2004.

SINGH, B., MEHTA, G., KUMAR, R., BHATIA, A., AHUJA, N. e KATARE, O.P.

Design, development and optimization of nimesulide-loaded lipossomal systems for

topical application. Curr.Drug Delivery, vol. 2, p. 143-153, 2005.

SIQUEIRA, N.M. Desenvolvimento tecnológico e avaliação da penetração cutânea de

benzofenona-3 a partir de nanocápsulas revestidas com quitosana. Dissertação de

Mestrado do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Faculdade de

Farmácia. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre-2008.

SJÖSTRÖM , B. , BERGENSTÅHL, B. Preparation of submicron drug particles in

lecithin-stabilized o/w emulsions I. Model studies of the precipitation of cholesteryl

acetate. International Journal of Pharmaceutics, vol. 88,p. 53-62, 1992.

SOUTO, E B; MÜLLER, R H, Cosmetic features and applications of lipid nanoparticles

(SLN, NLC). International Journal of Cosmetic Science, vol. 30(3), p.157-65, 2008.

STANTON, C., DESMOND, C., FITZGERALD, G., & ROSS, R. P. Probiotic health

benefitsdreality or myth? Australian Journal of Dairy Technology, vol.58, p.107e113,

2003.

STECHER, H. Ultraviolet-absorptive additives in adhesives lacquers and plastics.

Adhesion, vol. 2, p. 243-244, 1958.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3D-4BVNY40-1&_user=10&_coverDate=04%2F16%2F2004&_alid=916109646&_rdoc=52&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4944&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=100&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5610b0ade11e66b0fa7007a24abfe5f2



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-474WXJ9-9&_user=10&_coverDate=12%2F08%2F1992&_alid=916324294&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=18e256001790db5bcafb0296dd9c17a3



137

SUZUKI, T. et al. Estrogenic and antiandrogenic activities of 17 benzophenone

derivatives used as UV stabilizers and sunscreens. Toxicol. Appl. Pharmacol. vol. 203,

n. 1, p. 9-17, 2005.

TADROS, TH.F., VANDAMME, A., BOOTEN, K., LEVECKE, B., STEVENS, C.V.

Stabilisation of emulsions using hydrophobically modified inulin (polyfructose).

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 250, p.133-

140, 2004.

TEERANACHAIDEEKUL ,V., SOUTO, E.B., JUNYAPRASERT, V. B, MÜLLER, R.

H. Cetyl palmitate-based NLC for topical delivery of Coenzyme Q10 – Development,

physicochemical characterization and in vitro release studies European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 67, p. 141-148, 2007a.

TEERANACHAIDEEKUL, V., JUNYAPRASERT, V.B., SOUTO, E.B., MÜLLER,

R.H. Development of ascorbyl palmitate nanocrystals applying the nanosuspension

technology.International Journal of Pharmaceutics, vol. 354, p.227-234, 2008.

TEERANACHAIDEEKUL, V., MÜLLER, R. H., JUNYAPRASERT, V.B.

Encapsulation of ascorbyl palmitate in nanostructured lipid carriers (NLC)—Effects of

formulation parameters on physicochemical stability International Journal of

Pharmaceutics, vol. 340, p.198-206, 2007b.

TEICHMANN, A., JACOBI, U., WEIGMANN, H.J., STERRY, W. e LADEMANN, J.

Resevoir function of the stratum corneum: development of an in vivo method to

quantitavely determine the stratum corneum reservoir for topical and cosmetic use. Skin

Pharmcol. Physiol., vol 18, p. 75-80, 2005.

TROTTA M., DEBERNARDI F., CAPUTO O. Preparation of solid lipid nanoparticles

by a solvent emulsification-diffusion techinique. International Journal of

Pharmaceutics, vol. 257, p 153-160, 2003.

TSAI, Y., FANG, Y., WU, P., HUANG, Y. Comparison of 5-aminolevulinic acid-

encapsulated liposome versus ethosome for skin delivery for photodynamic therapy


http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TFR-4DSR1RW-4&_user=10&_coverDate=12%2F10%2F2004&_alid=916279131&_rdoc=47&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5233&_docanchor=&view=c&_ct=260&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ec60631dc91c02a0734f526ec7fd4d77

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6C-4MY0MFS-2&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2007&_alid=916076136&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5027&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a3da7254c2dbcb24ea15a8eb1717b122

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6C-4MY0MFS-2&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2007&_alid=916076136&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5027&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a3da7254c2dbcb24ea15a8eb1717b122

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4RC2S0J-1&_user=10&_coverDate=04%2F16%2F2008&_alid=916200248&_rdoc=2&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=4&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cebc9c3cd899ea7b501dd290b7c25c7c



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4NBBYS4-2&_user=10&_coverDate=08%2F01%2F2007&_alid=916076136&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=8754bf794dffe98f2cf79e22afdb1636

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4NBBYS4-2&_user=10&_coverDate=08%2F01%2F2007&_alid=916076136&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=8754bf794dffe98f2cf79e22afdb1636

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4RMFP01-2&_user=10&_coverDate=05%2F22%2F2008&_alid=916139522&_rdoc=24&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=207&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=8e73dab35834d8eb823770c9a18801ef

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-4RMFP01-2&_user=10&_coverDate=05%2F22%2F2008&_alid=916139522&_rdoc=24&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=207&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=8e73dab35834d8eb823770c9a18801ef

138

VENKATESWARLU, V., MANJUNATH, K. Preparation, characterization and in vitro

release kinetics of clozapine solid lipid nanoparticles. Journal of Controlled Release,

vol. 95, p. 627-638, 2004.

VERMA, D., VERMA, S., BLUME, G., FAHR, A,. Particle size of lipossomes

influences dermal delivery of substances into skin. International Journal of

Pharmaceutics, vol. 258, p. 141-151, 2003.

VILLAFUERTE, L., GARCÍA, B.F., GARZÓN, M.L.S., HERNÁNDEZ, A,L.,

VÁZQUEZ, M.L. Nanopartículas Lipídicas Sólidas, Revista Mexicana de Ciencias

Farmacéuticas, vol 39, p.38-52, 2008.

VILLALOBOS-HERNÁNDEZ, J.R. AND MÜLLER-GOYMANN, C.C. In vitro

erythemal UV-A protection factors of inorganic sunscreen distributed in aqueous media

using carnauba wax-decyl oleate nanoparticles. European Journal of Pharmaceutics

and Biopharmaceutics, vol 65, p. 122-125, 2007.

VILLALOBOS-HERNÁNDEZ, J.R. AND MÜLLER-GOYMANN, C.C. Novel

nanoparticulate carrier systems based on carnauba wax an decyl oleate for the

dispersion of inorganic sunscreens in aqueous media, Eur. J. Pharm. Biopharm. Vol.

60, p.113–122, 2005.

VILLALOBOS-HERNÁNDEZ, J.R. AND MÜLLER-GOYMANN, C.C. Physical

stability, centrifugation tests, and entrapment efficiency studies of carnauba wax-decyl

oleate nanoparticles used for the dispersion of inorganic sunscreens in aqueous media.

European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. vol. 63, p.115-127, 2006a.

VILLALOBOS-HERNÁNDEZ, J.R. AND MÜLLER-GOYMANN, C.C. Sun

protection enhancement of titanium dioxide crystals by the use os carnauba wax

nanoparticles: The synergistic interaction between organic and inorganic sunscreen at

nanoscale. International Journal of Pharmaceutics, vol.322. p.162-170, 2006b.

VRINGER, T., RONDE, H.A. Preparation and structure of a water-in-oil cream

containing lipid nanoparticles , J. Pharm. Sci., vol.84(4), p. 466-472, 1996.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09396411

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235027%232006%23999369997%23623928%23FLA%23&_cdi=5027&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=52226c6ca1b4b5f51c7068dffe6958d9

139

WELIN, B. K., BERGENSTÅHL, B. Inhibition of Ostwald ripening in local anesthetic

emulsions by using hydrophobic excipients in the disperse phase. International Journal

of Pharmaceutics, vol.200, p.249-260, 2000.

WESTESEN, K., BUNJES, H., Do nanoparticles prepared from lipids solid at room

temperature possess a solid matrix lipidic?, Int. Jour. of Pharma. vol. 115, p. 129-131,

1995.

WESTESEN, K., BUNJES, H., KOCH, M. H. J.Physicochemical characterization of

lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustained release

potential. Journal of Controlled Release, vol. 48, p. 223-236, 1997.

WESTESEN, K., SIEKMANN, B. Investigation of the gel formation of phospholipid-

stabilized solid lipid nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, vol. 151, p.

35-45, 1997.

WESTESEN, K., SIEKMANN, B., KOCH, M.H.J. Investigations on the physical state

of lipid nanoparticles by synchrotron radiation X-ray diffraction. International Journal

of Pharmaceutics, vol. 93, p. 189-199, 1993.

WISSING, S.A., MÜLLER, H.R. Cosmetic applications for solid lipid nanoparticles

(SLN). International Journal of Pharmaceutics, vol.. 254, p. 65-68, 2002.

WISSING, S.A., MÜLLER, R.H. The development of an improved carrier system for

sunscreen formulations based on crystalline lipid nanoparticles. International Journal of

Pharmaceutics, vol. 242, p.373-375, 2001.

WISSING, S.A., MÜLLER, R.H. The influence os solid lipid nanoparticles on skin

hydration and viscoelasticity – in vivo study. European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, vol. 56, p.67-72, 2003.

YUAN, H., WANG, L., DU, Y., YOU, J., HU, F., ZENG, S. Preparation and

characteristics of nanostructured lipid carriers for control-releasing progesterone by

melt-emulsification. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 60, p. 174-179, 2007.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-40J79CM-C&_user=10&_coverDate=05%2F10%2F2000&_alid=916290464&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=3&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a1725aed00cb45328984acf652493583



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3D-3V2MY5Y-S&_user=10&_coverDate=10%2F13%2F1997&_alid=916256719&_rdoc=3&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4944&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=6119fe288e5dd4980c59f7db26f96fcb




http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-3RJG2G5-N&_user=10&_coverDate=05%2F12%2F1997&_alid=916256719&_rdoc=4&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=0bf0f488606aed194b620d3302681597

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-3RJG2G5-N&_user=10&_coverDate=05%2F12%2F1997&_alid=916256719&_rdoc=4&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=0bf0f488606aed194b620d3302681597

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T7W-475TC7X-95&_user=10&_coverDate=05%2F31%2F1993&_alid=916256719&_rdoc=12&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5069&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c2b6abd7cbcceb1ac67df1b32c70ccc1




http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0939641103000407



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TFS-4P06CBJ-2&_user=10&_coverDate=11%2F15%2F2007&_alid=916141069&_rdoc=56&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5234&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=224&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=70c85b37f7827e4ce7ae834790adc054




140

9. ANEXOS

141

9.1. ANEXO I

Ficha Técnica do Oleato de Isodecila

142

Figura 9.1.1. Ficha Técnica do Oleato de Isodecila (Fonte: Dhaymers)

143

9.2. ANEXO II

Co- Validação da metodologia por CLAE para quantificação de

BZ-3 em Nanopartículas Lipídicas Sólidas de cera de carnaúba de

oleato de isodecila.

144

CO- VALIDAÇÃO DA METODOLOCIA ANALÍTICA POR

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA PARA A

QUANTIFICAÇÃO DE BENZOFENONA-3 EM NANOPARTÍCULAS

LIPÍDICAS SÓLIDAS DE CERA DE CARNAÚBA DE OLEATO DE

ISODECILA.

INTRODUÇÃO

Uma validação tem como objetivo demonstrar que o método analítico

desenvolvido é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação

qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em

produtos farmacêuticos (BRASIL, 2003).

A validação de um método assegura a especificidade, linearidade, exatidão,

sensibilidade e precisão de um ensaio analítico e estima a estabilidade do analito

durante a estocagem e manipulação (TIDWELL e PEREIRA , 2001), tendo como

objetivo garantir que o procedimento analítico forneça resultados reprodutíveis e

confiáveis, que sejam adequados aos fins para os quais tenha sido planejado (MATIOLI

et al, 2004).

O método utilizado foi desenvolvido e validado anteriormente para quantificação

de BZ3 em suspensões coloidais – nanocápsulas (PAESE, 2008), portanto necessita

apenas ser co-validado. Segundo a RE 899, em transferência de metodologias da matriz

para suas subsidiárias no Brasil e/ou das empresas nacionais para os centros de estudos

de equivalência farmacêutica, a metodologia será considerada validada, desde que sejam

avaliados os parâmetros de e linearidade, precisão e especificidade. Mesmo não se

tratando de uma empresa matriz para subsidiárias, podemos considerar que foi uma

metodologia transferida.

DOSEAMENTO DA BZ-3 NAS SUSPENSÕES

Inicialmente uma alíquota de suspensão foi coletada sem agitação prévia,

possibilitando o doseamento do ativo associado às nanopartículas e não do ativo

eventualmente sedimentado ou aderido à superfície interna do frasco de

145

armazenamento. Seguido da separação das partículas do meio dispersante usando a

metodologia descrita por Hernández e Goymann, (2006), modificada.

As partículas foram tratadas com acetonitrila ocasionando a dissolução parcial

da matriz lipídica e a liberação e dissolução do ativo contido no interior das

nanopartículas.

O doseamento da BZ3 foi realizado através de cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por Sarveiya e colaboradores (2004) e

Paese (2008), modificada.

As análises foram realizadas em cromatógrafo Schimadzu Prominence-

Schimadzu, detector UV-vis e ELSD, utilizando-se detector ultravioleta visível 289

nm, coluna LiChrospher 100 RP-18 (5µm, 250 x 4 mm), pré-coluna do mesmo material

(5 µm) e fase móvel isocrática de metanol e água em uma proporção 95:5 (v/v), com

pH aparente igual a 4,0, fluxo de 1,0 mL por minuto, e, como agente de pareamento

iônico, brometo de tetrabutilamônio (4 mg/100 mL).

O método foi co-validado segundo Resolução nº 899 da Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (BRASIL, 2003) e Internacional Conference on Harmonization of

Techinical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use (ICH,

1996) em termos de: especificidade, linearidade e precisão.

CO-VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA

Um método analítico linear indica que o mesmo tem a capacidade de demonstrar

que os resultados obtidos experimentalmente são diretamente proporcionais à

concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado (BRASIL,

2003). A quantificação da BZ-3, a partir de nanopartículas lipídicas de cera de carnaúba

e oleato de isodecila, foi realizada através de CLAE em cromatógrafo Prominence-

Schimadzu, detector UV-vis e ELSD, utilizando-se detector ultravioleta visível 289 nm,

coluna LiChrospher 100 RP-18 (5µm, 250 x 4 mm), pré-coluna do mesmo material (5

µm) e fase móvel isocrática de metanol e água em uma proporção 95:5 (v/v), com pH

aparente igual à 4,0 e fluxo de 1,0 mL por minuto.

146

Para a avaliação da linearidade foi realizada a análise de, no mínimo, 5

concentrações diferentes, considerando um intervalo entre 25 a 200% da concentração

teórica do teste.

Foram preparadas 3 curvas a partir de 3 soluções mães autenticas (500 µg/mL)

utilizando a matéria-prima nas seguintes concentrações: 5 µg/mL , 10 µg/mL, 20

µg/mL, 30 µg/mL , 40 µg/mL. Foram determinadas 3 curvas-padrão com estas

concentrações , com auxílio do programa Excel, foram determinados o coeficiente de

correlação, intersecção com o eixo y, o coeficiente angular.

As áreas obtidas no intervalo de concentração analisado demonstraram que o

resultado é linear, como mostra a figura 1, apresentando a equação da reta: y=

80478,19x- 13051,5 para BZ-3, correlacionando as concentrações do ativo(x) e as áreas

dos picos (y). O coeficiente de correlação obtido foi de r2= 0,9998, superior a 0,99, que

é o valor mínimo preconizado pelos códigos oficiais (ICH, 1996; BRASIL, 2003).

Indicando uma correlação linear entre as variáveis aleatórias x e y. Portando o método é

linear em concentrações compreendidas entre 5 e 40 µg/mL.

147

Figura 9.2.1. Curva de linearidade para quantificação de BZ-3 a partir de

nanopartículas lipídicas de cera de carnaúba e oleato de isodecila.

A precisão de um método analítico indica a proximidade dos resultados obtidos

em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A

precisão intra-dia é a concordância dos resultados obtidos em um curto espaço de tempo

com o mesmo analista e mesma instrumentação, já a precisão inter-dia considera a

concordância entre os resultados obtidos em dias diferentes de análise (ICH, 1996;

BRASIL, 2003).

A precisão foi determinada ao nível de repetibilidade (precisão intra-dia) e

precisão intermediária (precisão inter-dia). Para isto, soluções-amostra diferentes de 20

µg/mL foram obtidas a partir de nanocápsulas contendo BZ-3 e injetadas, em

sextuplicata. Foram determinados os desvios-padrão e os coeficientes de variação (CV

%) intra-dia e inter-dia.

A avaliação do RSD e CV % intra-dia (Tabela 9.2.1) demonstra pequena

variação na análise de amostras de mesma concentração num mesmo dia, assim como a

determinação do RSD e CV % inter-dia (Tabela 9.2.2 e 9.2.3). Tanto o CV % intra-dia

148

quanto o CV % inter-dia apresentaram valores que não ultrapassam 4 %, sendo inferior

ao limite máximo estabelecido pelos códigos oficiais, que é de 5 %. Bem como o

RSD% intra-dia quanto o RSD% inter-dia apresentaram valores que não ultrapassam

1%, sendo inferior ao limite máximo estabelecido pelos códigos oficiais, que é de 2 %

(ICH, 1996; BRASIL, 2003).

Tabela 9.2.1. Avaliação do desvio padrão relativo (RSD%) e dos coeficientes de

variação (CV %) intra-dia do método analítico para o doseamento da BZ-3 em

nanopartículas lipídicas de cera de carnaúba e oleato de isodecila.(n=6).

CONCENTRAÇÕES ( µg/mL) Média RSD % C.V. %

1 2 3 4 5 6

BZ-3

18,11466

18,38721

18,25872

17,82787

18,29581

17,95053

18,1391

0,1973

1,0874

Tabela 9.2.2. Avaliação do desvio padrão relativo (RSD%) e dos coeficientes de

variação (CV %) inter-dia 1° dia do método analítico para o doseamento da BZ-3 em


CONCENTRAÇÕES ( µg/mL) Média RSD % C.V.%

Analista 1 2 3 4 5 6

A BZ-3 18,88088 18,26915 19,21058 17,51894 17,89855 17,60002 18,2297 0,6323 3,4687

B BZ-3 18,68571 17,81678 18,10590 18,02252 18,21573 18,43493 18,2136 0,2821 1,5488

149

Tabela 9.2.3. Avaliação do desvios padrão relativo (RSD%) e dos coeficientes de

variação (CV %) inter-dia 2° dia do método analítico para o doseamento da BZ-3 em


CONCENTRAÇÕES ( µg/mL) Média RSD % C.V. %

Analista 1 2 3 4 5 6

A BZ-3 18,11466 18,38721 18,25872 17,82787 18,29581 17,95053 18,1391 0,1973 1,0874

B BZ-3 17,33794 18,08524 16,85085 18,39800 17,98580 18,16967 17,80458 0,5361 3,0110

Para a precisão intermediária, testada entre dias e analistas diferentes (Tabela 2 e

3), não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre analistas e

dias, empregando-se o teste t de Student, visto que o t calculado foi inferior ao t

tabelado ( Tabela 9.2.4), com 95% de confiança.

Tabela 9.2.4. Resultados do teste t de Student para verificação da precisão intermediária

do método.

t calculado t tabelado

1º Dia- Analistas A e B BZ-3 0,0519 2,2281

2º Dia- Analistas A e B BZ-3 1,3095 2,2281

Analista A- 1º e 2º Dia BZ-3 0,3056 2,4469

Analista B- 1ºe 2º Dia BZ-3 1,5097 2,3060

Os cromatogramas apresentados na Figura 9.2.2. demonstram a especificidade

do método para quantificação de BZ-3 a partir de nanopartículas lipídicas de cera de

carnaúba e oleato de isodecila, sem haver interferentes de outros componentes da

formulação na quantificação do ativo.

150

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 9.2.2. Cromatogramas de CLAE para o método analítico de dosemanto de BZ-3

em nanopartículas lipídicas de cera de carnaúba e oleato de isodecila: Fase Móvel (A);

Diluente (B); Nanopartícula sem o ativo (C); Nanopartícula contendo BZ-3(D).

151

CONCLUSÃO

O método descrito, desenvolvido disponibilizou um procedimento analítico para

a quantificação da Benzofenona-3 nas nanopartículas lipídicas sólidas de Cera de

Carnaúba e Oleato de Isodecila. Os parâmetros verificados garantiram que ele é

específico, linear e preciso apresentando-se, portanto, como co-validado conforme a RE

899/2003, ANVISA e sendo recomendado para análises de controle de qualidade.

152

9.3. ANEXO III

Análises de DSC e DRX da mistura binária de cera de carnaúba (3 e 4) e oleato de

isodecila

153

9.3. Misturas de cera de carnaúba (3 e 4) com oleato de isodecila

Os dois tipos de cera (3 e 4) e suas respectivas misturas, na proporção 2:1 e 1:1

de cera de carnaúba e oleato de isodecila foram analisados por DSC e DRX para

avaliação das propriedades da matriz lipídica resultante

9.3.1. Cera de carnaúba Tipo 3


Figura 9.3.1. Curvas DSC da cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e


Tabela 9.3.1: Valores da transição térmica da mistura de cera de carnaúba e oleato de

isodecila.



C.Carnaúba 185,54 70,40 81,37 84,53



154

9.3.1.2. Difratometria de raio-X (DRX)

Figura 9.3.2. Difratogramas cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e


9.3.2.Cera de carnaúba Tipo 4

9.3.2.1.Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

Figura 9.3.3. Curvas DSC da cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e


155

Tabela 10: Valores da transição térmica da mistura de cera de carnaúba e oleato de

isodecila.



C.Carnaúba 188,99 70,89 82,51 85,51



9.3.2.2. Difratometria de raio-X (DRX)

Figura 9.3.4. Difratogramas cera de carnaúba pura e da mistura de cera de carnaúba e


156

9.4. ANEXO IV

Artigo submetido à Colloids and Surfaces B

157

Preparation and characterization of carnauba wax nanostructured

lipid carriers containing benzophenone-3

P. LACERDAa , N. N. P. CERIZE

b and M.I.RÉ

b,c*

a Federal

University of Pernambuco – PE- Brazil

bInstitute for Technological Research of State of São Paulo - SP- Brazil

cRapsodee Research Center, École des Mines d’Albi, 81013 Albi, France

* *Corresponding author. Tel.: ; fax:;

E-mail address: [email protected] (M.I.Ré)

158

Abstract

Nanostructures Lipid Carriers (NLCs) are potential active delivery systems based on mixtures

of solid lipids and liquid oil. In the present paper, aqueous dispersions of NLC were prepared by

hot high pressure homogenization technique using carnauba wax as the solid lipid and isodecyl

oleate as the liquid oil. The preparation and stability parameters of benzophenone-3-loaded

NLC have been investigated concerning particle size, zeta potential and loading capacity to

encapsulate benzophenone-3, a molecular sunscreen. The current investigation illustrates the

effect of the composition of the lipid mixture on the entrapmemt efficiency, in vitro release and

stability of benzophenone-3-loaded in these NCL. A loading capacity of approximately 5% of

BZ-3 (mBZ-3/mlipids) was characteristic of these systems.

Keywords: Nanostructures Lipid Carriers, benzophenone-3, carnauba wax, isodecyl oleate

159

1. Introduction

Lipid nanoparticles with solid particle matrice (SLNs) are derived from o/w emulsions by

simply replacing the liquid lipid (oil) by a solid lipid at body temperature. They were developed

at the beginning of the nineties with the purpose of increasing physicochemical stability of both

incorporated actives and the system itself.

Nanostrucutured Lipid Carriers (NLCs) constitute a second generation of this technology. They

are produced by using a blend of a solid lipid with a liquid lipid, this blend also being solid at

body temperature [1]. The original purpose of these mixtures is to avoid lipid re-crystallization

causing an expulsion of the enclosed actives observed with SLNs. Since the last decade, NLCs

have been studied intensively as suitable vehicles for the dermal delivery of different drugs and

cosmetic actives [2].

Binary mixtures with different compositions have been proposed to develop NLCs. Among

them, stearic acid with oleic acid [3] cetyl palmitate and miglyol® 812 (caprylic/capric

triglycerides) [4], glyceryl tripalmitate and miglyol® 812 (caprylic/capric triglycerides) [5].

Carnauba wax is described as a plastic solid obtained from the carnauba palm tree. It is a very

hard material having a melting point range from 81 to 86oC and consisting of a complex mixture

of high molecular weight esters of acid and hydroxyacids [6]. Isodecyl oleate is a well known

emollient showing high fluidity and causing no irritation when it is spread onto human skin [7].

A binary mixture between carnauba wax as a thermoplastic lipid and decyl oleate as the liquid

lipid was proposed by Hernández e Goymann and co-workers [8, 9, 10] to encapsulate inorganic

sunscreens such as barium sulfate, strontium carbonate and titanium dioxide. The results

reported in the literature show that the combination of the properties of both excipients

constitutes a potential medium for the dermal application of these inorganic compounds.

NLCs, in similar way to other disperse systems, may face stability problems attributed to

physical, chemical and microbiological factors. Consequently, the destabilization of those

160

systems can be reflected by changes in particle size, homogeneity or chemical composition [11].

Stability studies can be used to identify the weakness of a formulation. The information

generated through stability studies can be used for reformulation purposes considering

properties such as the type of emulsifier and its concentration, the zeta potential of the particles,

the thermodynamically most stable particle size, the use of preservatives, etc [12]. On the other

hand, besides the stability of the system, the incorporation of the actives into the lipid matrices,

defined as loading capacity or entrapment efficiency, has also to be evaluated in order to judge

the suitability of a nanoscale carrier system [13]. This parameter can be related to different

variables, among them, the active/lipid ratio [14].

In the present work, isodecyl oleate was incorporated as the liquid oil into carnauba wax by a

hot high pressure homogenization technique. This study aims to obtain experimental evidence

about process and formulation parameters such as the active/lipid ratio on the physicochemical

characteristics of these systems.

2. Materials and Methods

2.1. Materials

Carnauba wax (T-1) was a gift from Cerapeles Ltda (Brazil) and Isodecyl oleate gift by

Dhaymers (Brazil) were used as lipid material. Polysorbate 80 (Tween 80) and

Poloxamer 188 (Pluronic F68), a gift by BASF (Brazil) were used as emulsifiers for the

formulations. Dimeticone was purchase from Dow Corning (Brazil) and Phenoxiethanol

F was used like preservative in the formulations. The molecular sunscreen

Benzophenone-3 (BZ-3) was purchased from Delaware (Brazil).

2.2. Preparation of lipidic nanoparticles (NLC) and their characterization

Preparation of blank NLC. The aqueous phase was prepared by dispersing the

surfactant in water. The lipid phase consisting of a binary mixture of carnauba wax and

161

isodecyl oleate was melted at 85 +/- 5° C. The aqueous nanodispersions were prepared

in two successive steps. First, the melted lipid phase was emulsified in the aqueous

phase by using high shear dispersion system, Ultraturrax® (Diax, 900, Heidolph.) at

26.000 rpm during 4 min at a temperature of 85 ±5° C. Then, the pre-emulsion formed

was homogenized using a high pressure homogeniser of Invensys APV, Model APV-

2000 (Gaulin, Germany) at pressures between 400 and 900 bar, and between 2 and a

maximum of 8 homogenization cycles (passes). The formed nano-emulsion was finally

cooled to form the solid nanodispersions.

Preparation of benzophenone-3-loaded NLC dispersions. The formulation was

produced by dispersing the lipid phase containing the BZ-3 as expressed in Table 1, into

the aqueous phase using high-pressure homogenization. The phases were initially pre-

dispersed and subsequently high-pressure homogenized at 900 bar within 8 cycles

(Homogenizer Invensys APV, Model APV-2000). After the homogenization, the

product was cooled down at room temperature.

Preparation of Nile red-loaded NLC dispersions. The same procedure for blank NLC

dispersion was also used to prepare Nile red NLC dispersion contaning 0,04% (wt) of

dye.

2.3. Nanoparticles characterization

2.3.1. Particle size and polydispersity index

All measurements were performed in triplicates using a Particle Size Analyzer (Malvern

Zetamaster®) at a temperature of 25±2 °C and at 90° to the incident beam applying the principle

of photon correlation spectroscopy (PCS). Dispersions were diluted with distilled water to

ensure that the light scattering intensity was within the instrument’s sensitivity range.

162

2.3.2. Zeta potential

The zeta potential was determined on a Zeta Potencial Analyzer (Malvern Zetamaster®)

and was measured by determining the electrophoretic mobility of the particles. It

reflects the particle surface and indicates the physical stability of the nanodispersions.

The measures were performed in distilled water. Each sample was diluted appropriately

and the results were determined by the mean of fifteen measures.

2.3.3. Encapsulation efficiency

The amount of BZ-3 encapsulated per unit weight of the nanoparticles was determined

after separation of the solid phase (free crystals and solid lipids) from the aqueous

medium. A known dilution of the NLC dispersion was prepared and centrifuged at

10.400×g (Selecta Medfriger-BL Centrifuge) for 60 min. The precipitated was washed,

first with saccharose 20 wt % and after with 0.2 wt% SLS solution and then dried in a

vaccum dessicator for 8 h. After appropriate dilution, the BZ-3 content was determined

by HPLC analysis. The method described by Sarveiya [15] and Paese [16] was used for

the analysis. The HPLC system consisted of a Shimadzu Prominence Chromatograph

equipped with a UV-vis detector, column LiChrospher 100 RP-18 (5µm, 250 x 4 mm

and a guard-column (5 µm). The mobile phase (methanol:water in the ratio of 95:5) was

run at a flow rate of 1.0 ml/min and the ultraviolet absorption was read at 289 nm.

2.3.4. Stability studies

The stability of the nanosuspensions was evaluated using a Turbiscan® Lab (Formulaction,

France). The nanosuspensions were sampled immediately after preparation and the sample was

transferred to a glass cylindrical cell and analyzed by a light beam emitted in near infrared (880

nm) wavelength which scanned the sample cell. Two synchronous optical sensors received

respectively light transmitted through the sample and light backscattered by the sample. The

backscattering (BS) was directly dependent on the particle mean diameter. The sample in the

163

cell was scanned every 30 min for 24 h at 25oC and the change in BS in unit time was taken as a

measure of the stability of the nanosuspensions.

The physical stability of NCL was also determined by measuring particle size of the

formulations at 0, 15 and 30 days.

2.3.5. Differential scanning calorimetry

DSC was performed using a heat flux instrument (DSC 851e, Mettler Toledo) to characterize the

thermal behavior of the lipid nanocarriers. A nitrogen purge at a flow rate of 80 mL/min was

used to provide an inert gas atmosphere in the DSC cell. The system was calibrated using an

indium standard and the sample was run against a hermetic empty reference pan. In all cases, a

heating rate of 10 ◦C/min were used.

2.4. In vitro experiments

2.4.1. Occlusive effect

In order to evaluate the occlusive properties of the wax:oil NLC, an in vitro occlusion test

described by Vringer was performed [17]. Glass bottles (35 mL) were filled with 30 g of water

and covered with a filter paper (cellulose filters, 125 mm, Whatman number 4, USA). 300 μl of

sample was spread homogeneously on the filter surface (3.36 cm2) and the sample was

subsequently stored at 32 °C for 48 h in order to mimic the temperature of the skin surface. The

weight of water remaining in the glass bottles was weighed at 8, 24, and 48 h. The glass bottles

covered with the filter paper which was spread with water was used as a reference. All

experiments were done in four replicates (n=4). The occlusion factor (F) was computed by the

following equation (1):

F = A - B x 100 (1)

A

164

Where A stands for the water loss without sample (reference) and B is the water loss with

sample. An F value of 0 means no occlusive effect compared to the reference, while an F value

of 100 means maximum occlusiveness.

2.4.2. Skin penetration test

The skin penetration test was performed using fresh ears of domestic pigs obtained from a local

abattoir on the day of the experiment. Full thickness porcine ear dorsal skins were excised and

immediately mounted in a Franz diffusion cell (Microette-Hanson) with the dermal side facing

downwards into the receptor compartment, which was filled with the acceptor medium of

compartment, with 4 mL of isotonic phosphate buffer (pH 7.4) containing 5% w/w of

Polysorbate 80 . The donor compartment was then filled with 5 mL of the formulations: Nile

red-loaded NLC dispersion and Nile red in solubilized in isodecyl oleate were applied. The total

available diffusion area of the cell was 2.3 cm2, the system was maintained at 37°C and the

receptor medium stirred at 300rpm for up to 8 h. Then, the treated skins were removed from the

Franz diffusion cells. The skin was frozen afterwards in liquid nitrogen by immersion in OCT

(crio-protector) and sectioned using a criostate in about 15 micrometer slices, from stratum

corneum towards the dermis. The skin slices were investigated under fluorescence microscopes

CLSM (LSM 510 Meta). The images from this technique were overlaid to obtain the

information of the Nile red distribution in the different skin layers.

2.4.3. In vitro release

The in vitro release was performed using a synthetic membrane of cellulose acetate. It was

mounted in a Franz diffusion cell (Microette-Hanson) and the acceptor compartment was filled

with 4 mL of isotonic phosphate buffer (pH 7.4) containing 5% w/w of Polysorbate 80. The

donor compartment was then filled with 5 mL of the formulations containing benzophenone-3

(0.5%w/w). The total available diffusion area of the cell was 2.3cm2. The system was

maintained at 37°C and the receptor medium stirred at 300rpm. at regular intervals: 1,2,3,4 and

165

8 h, 1 mL of the receptor phase was removed for the determination of total drug content by

HPLC assay (as described before) and replaced by an equal volume of fresh receptor solution.

3. Results

3.1. Preparation of blank NLC and their characterization

Experimental design. One aim of this study was to optimize the carnauba wax-based

nanocarriers regarding the particle size and polydispersity. These characteristics are

influenced by process parameters such as the concentrations of surfactant and total

lipids, the ratio wax: oil and the homogenization conditions (pressure and cycles

number).

To investigate these effects, the experiments started following two 4-factorial 2-level

type experimental designs and statistical analysis applied successively to limit the

number of parameters influencing the preparation process.

First, the 4 independent factors at 2 levels were taken into consideration without

repetitions, resulting in 16 scheduled experiments. The homogenization conditions were

kept constant (600 bar, 5 homogenization cycles) and nanodispersions of carnauba wax-

isodecyl oleate were obtained under different formulation conditions. Nanosuspensions

were prepared containing 5 or 20 wt% of a binary mixture of carnauba wax and isodecyl

oleate, the ratio wax-oil being fixed at 2:1 or 1:1, based on previous data reported in the

literature [18]. The aqueous phase consisted of an aqueous solution containing

polysorbate 80 or poloxamer 188, as an alternative surfactant. Two different surfactant

concentrations were fixed, namely 1 and 3 wt% .

166

Second, the formulation conditions were fixed (ratio wax-oil 1:1; aqueous phase

containing 1 wt% polysorbate 80) and the homogenization conditions were varied

(homogenization cycle: 2 and 8; homogenization pressure: 400 and 900 bar; pre-

emulsification time: 4 and 8 min; cooling rate after homogenization: ice bath and

cooling down at room temperature), resulting in 16 more scheduled experiments.

For the analysis of physical stability of NLC the product was investigated with PCS analysis.

PCS yields the mean particle size and the polydispersity index (PI) as a measure of the width of

the distribution.

Table 2 shows that the particle size average ranged from a nanometric size (277 nm) to

some micrometers (7.7µm) depending on the formulation composition. Narrow

dispersions comprise PI values between 0.1 and 0.25 and broad dispersions are reflected

by PI values > 0.25 [19]. Hence, according to Table 2, all dispersions can be labeled as

broad disperse.

Results were analyzed by using the software STATISTICA for WINDOWS 5.00

(StatSoft, Inc.). From a Pareto diagram (data not shown) and response surface

methodology it could be seen that the wax: oil ratio and the surfactant were the factors

more statistically significant affecting the particle average size and the polydispersity

index (p<0.05). The surface graphics are three-dimensional and show a better

visualization of the effect of these factors on the particle size average and polydispersity

index (Figure 1).

Table 3 shows that the particle size ranged from 235 to 4509 nm, depending on the

homogenization conditions. Smaller particles (< 265 nm) and narrow dispersions comprising PI

values between 0.12 and 0.18 were favored by the highest homogenization pressure (e.g., T17,

T18, T25, T29, T30). They also showed only minor changes when stored for 10 days. The

visualization of these homogenization conditions effects is shown in Figure 2.

167

To summarize, homogenization conditions were optimized to give carnauba-oil NLC

with good physical stability. Most efficient homogenization was achieved at pressure of

900 bar and 8 cycles for polysorbate 80 stabilized nanoparticles, and at a wax:oil ratio

of 1:1. Blank NLCs obtained with these conditions were submitted to additional in vitro

analyses (occlusive properties and skin penetration of a fluorescent dye from NLC).

3.2. Occlusive properties

The formation of a protective and occlusive film of SLN and NLC on the skin has been

described in the literature [20]. The occlusivity of the aqueous blank NLC dispersion was

evaluated quantitatively in vitro by a filter test. The occlusion factor was determined as a

function of time, i.e., after 8, 24 and 48 h of storage at 32oC.

Figure 3 shows that the blank NLC has occlusive properties (55-60%) probably due to its

nanometric size. Occlusion factors of the same magnitude were previously observed for lipid

nanoparticles of approximately 200 nm [21, 22]. Although studies of this kind do not fully

mimic the natural conditions of moisture loss, the lower the size of the particles, the greater the

barrier for evaporation.

3.3. Penetration of fluorescence dye on the skin from NLC

Also, the skin penetration of Nile-red-loaded NLC dispersion composed of carnauba wax and

isodecyl oleate was evaluated by CLSM. CLSM has been widely used to access the distribution

within the skin of fluorescence dyes entrapped into nanoparticles [21,22].

Figure 4 depicts the fluorescence images of the vertical sections of pigskin after being treated

with Nile-Red-loaded NLC for 8 h (Fig 4.A and.4 C) and Nile-red loaded isodecyl oleate

(Figure 4.B and 4 D). Pictures are obtained by superposing normal light and fluorescence

images of the same area. It was clearly shown that dye penetration depended on the Nile-red

carrier used (NCL or oil). NLC showed the highest intensity of fluorescence compared to the

dye-loaded oil. After 8 h, the fluorescence distribution of NLC was more pronounced in the SC.

168

These images reveal that the presence of nanostructured lipidic carriers avoids the permeation of

large amount of dye up to the dermis. This is different from what is observed when the dye is

dispersed in oil, without carrier, where the dye is distributed in all layers of the skin.

3.4. Preparation of benzophenone-3-loaded NLC dispersions

Here, we report the characterization of BZ-3-loaded NLC dispersion prepared by high

pressure homogenization at pressure of 900 bar and 8 cycles, with polysorbate 80

stabilized nanoparticles. For the manufacture of this, five BZ-3 concentrations (0, 48;

91; 231 and 333µg BZ-3/mg lipids) were incorporated in the formulations.

3.4.1. DSC analysis

Lipids of less ordered crystal lattices such as the mixture of carnauba wax and isodecyl oleate

can favor the active inclusion and be more stable. The study included an evaluation of the raw

materials and mixtures thereof using differential scanning calorimetry (DSC) to appreciate

possible changes in the crystalline structure of the mixture wax-oil after the incorporation of

BZ-3. Table 4 and Figure 5 show the DSC data of blank and BZ-3-loaded NCL. BZ-3, carnauba

wax and a physical mixture of carnauba wax and isodecyl oleate were also characterized for

comparison.

Bulk wax showed a sharp endothermic event, ascribing to the melting, around 83.9oC

(minimum) with and extrapolated onset of the melting peak at 79.9oC. As shown in Figure 5,

the addition of oil (isodecyl oleate) into the matrix provoked a sharp decline in enthalpy from

the bulk material from 163.1 to 69.2 Jg-1

(Table 4). Also an additional shift of the melting point

to lower temperatures, with the difference between the onset and the minimum of the peak of

about 13°C was observed. For less ordered crystals or amorphous solids, the melting of the

substances requires much less energy than crystalline substances which need to overcome lattice

forces (30). As a result, the lower melting enthalpy values observed for the binary mixture

169

wax:oil and also for blank NLC suggest lower ordered lattice arrangement compared to the bulk

materials. The loading of BZ-3 within these nanostructures did not provoke any considerable

effect in the lipid matrix thermal behavior under these experimental conditions.

3.4.2. Encapsulation Efficiency

Table 5 shows the characteristics of the BZ-3-loaded NLC such as the viscosity and pH,

particle size and polidispersity, zeta potential, entrapment efficiency and loading

capacity.

In order to judge the suitability of a nanoscale carrier system, besides the stability of the system,

the incorporation of the actives into the lipid matrices, defined as loading capacity has also to be

evaluated. This parameter can be related to different variables, among them, the active/ lipid

ratio. As shown in Table 5, the entrapment efficiency of BZ-3 by the NLC decreased from 91%

to 17%, depending on its initial content in the formulation. In fact, the results show the same

loading capacity within the lipidic nanoparticles of 4-5 µg BZ-3/ mg lipids, despite higher

amounts in the initial formulation.

3.4.3.Stability studies

The physical stability of NLC dispersions is a complex issue and can be influenced by a number

of factors including particle size, viscosity and environmental conditions such as temperature.

The stability of the NLC dispersions was first monitored by the backscattering profiles produced

by Turbiscan Lab immediately after production. The biggest advantage of this technique is that

it can detect changes in the particle size of nanodispersion long before they become visible.

The Turbiscan® Lab measured the light backscattered by the sample, which is directly

dependent on the particle mean diameter at preset intervals (30 min in this work) over a

predetermined period of time (24 h in this study). Figure 6 shows the backscattering profiles of

the BZ-3-loaded NLC. No variations in these profiles are observed over 24h within

formulations containing 48 to 231 µgBZ-3/mlipids BZ-3, suggesting that in this mass domain,

170

particles are not interacting through colloidal forces. However, at the highest concentration of

333 µgBZ-3/mlipids, particles seem sufficiently close to each other for colloidal interactions to take

place. Somme agglomeration of the non entrapped crystals of BZ-3 is probably taking place,

then, kinetics of sedimentation in the lower part of the tube is enhanced as measured by the

change of the backscattered light.

The physical stability of NLC was investigated with PCS analysis over a period of 30 days. PCS

yields the mean particle size and the polydispersity index as a measure of the width of the

distribution. Zeta potential and viscosity measurements of the samples stored at room

temperature (25oC) were also performed over the same period (Table 5). After production under

the same conditions, the blank NLC dispersions show a narrow particle size distribution, which

is completely in the nanometer range. Incorporation of BZ-3 (0, 4.8; 9.1; 23.1 and 33.3 %)

slightly influenced the particle size. PCS data reveal a mean diameter of about 200-300 nm,

which remains constant over the period of 30 days.

These observations coincided with the information derived from the zeta potential

measurements. Table 5 also reveals that the zeta potential data values of BZ-3-loaded NLC

remained practically unchanged during this storage time. All the formulations exhibited

negative values. The measurement of the zeta potential allows predictions about the stability of

colloidal aqueous dispersions [24]. Usually, particle aggregation is less likely to occur for

charged particles with high z-potential (> [30] mV) due to electrical repulsion[25].

NLC dispersions possess low viscosity (~ 2 mPa.s) also unchanged during the storage time.

From these results it can be stated that BZ-3-loaded NLC are physically stable under these

shelf-life test conditions. Application of the pure aqueous NLC dispersions to the skin is

possible although semisolid preparations are normally preferred because of their more

convenient application.

171

3.4.4. In vitro release

The in vitro permeation release ability of these nanocarriers was performed using Franz

diffusion cells through a cellulose acetate membrane and a phosphate-buffer saline (PBS) as

receptor fluid. The permeation study performed for 8 h indicates that the amount of BZ-3 in

receptor medium was increased with time, following a zero order kinetics with a steady

permeation rate of 2.4 µg cm-2

h-1

(Figure 7).

Several reasons could explain the small quantities of BZ-3 found in receptor medium after the

application time (<1%) such as the high lipophilicity of the active, associated to a high

hydrophobicity of the lipidic matrix, preventing diffusion from the NLC into the receptor

medium, or the use of a separation membrane in contact with the receptor medium which could

influence the diffusion rate of BZ-3. On the other hand, the slow diffusion rate of BZ-3 from the

nanocarriers can establish that the active was entirely encapsulated and not absorbed at the

external surface of the nanoparticles and the shell of NLC acted as a barrier to interfacial

diffusion.

4. CONCLUSIONS AND FURTHER DEVELOPMENTS

In the present study, NLCs were prepared by hot high pressure homogenization using a mixture

of carnauba wax and isodecyl oleate. The method resulted in consistent production of smaller

size nanoparticles in the range 200-300 nm with narrow size distribution (PI< 0.25). The

surfactant (Polysorbate 80) was optimized at 1% based on the particle size and polydispersity

indices.

The current investigation illustrates the effect of the composition of the lipid misture on the

entrapmemt efficiency, in vitro release and stability of benzophenone-3-loaded in these NCL. A

loading capacity of approximately 5% of BZ-3 (mBZ-3/mlipids) was characteristic of these

systems.

172

The physical stability of aqueous BZ-3 loaded nano-supensions was proven for at least 30 days.

Previous data have shown that incorporation of NLC or SLN in viscous gels or o/w creams

leads to enhancement of physical stability, i.e, NLC or SLN unstable in aqueous dispersion are

sufficiently stabilized. From this, it can be assumed that the NLC developed in the present study

will lead to long term stable sunscreen gels or creams. Next steps are formulation of gels/creams

and tests of their sun protection efficiency.

5. ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are grateful to CNPq (Brazilian Network of Nanocosmetics). The authors also

thank Ms.Toshie Kawano and Mr. Alexsander Seixas de Souza (Laboratory of Parasitology and

Malacology, Butantan Institute, Sao Paulo, SP, Brazil) for the CLSM analyses.

173

REFERENCES

[1] Müller et al. Advanced Drug Delivery Reviews 59 (2007) 522–530.

[2] Jana Pardeike, Aiman Hommoss, Rainer H. Müller, Lipid Nanoparticles (SLN,NLC) in

cosmetic and pharmaceutical dermal products. International Journal of Pharmaceutics,

Vol.366(2009), 170-184

[3] Hong Yuan , Lei-Lei Wang, Yong-Zhong Du, Jian You, Fu-Qiang Hu, Su Zeng, Preparation

and characteristics of nanostructured lipid carriers for control-releasing progesterone by melt-

emulsification. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 60 (2007) 174–179

[4] Veerawat Teeranachaideekul, Eliana B. Souto, Varaporn B. Junyaprasert, Rainer H. Müller.

Cetyl palmitate-based NLC for topical delivery of Coenzyme Q10 – Development,

physicochemical characterization and in vitro release studies. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Volume 67, Issue 1, August 2007, Pages 141-148.

[5] E. B. Souto, S. A. Wissing, C. M. Barbosa, R. H. Müller. Evaluation of the physical stability

of SLN and NLC before and after incorporation into hydrogel formulations. European Journal

of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Volume 58, Issue 1, July 2004, Pages 83-90.

[6] R.A. Bodmeier. Waxes, in: Encyclopedia Pharmaceutical Technology. Marcel Dekker , New

York, NY, 2002, pp. 2988-2999

[7] CERAPHYL® 140A. V. Description. Cognis Care Chemicalls Bull, 2002

[8]J.R. Villalobos-Hernández and C.C. Müller-Goymann; European Journal of Pharmaceutics

and Biopharmaceutics. Volume 63, Issue 2, June 2006, Pages 115-127

[9] J.R. Villalobos-Hernández and C.C. Müller-Goymann, Novel nanoparticulate carrier

systems based on carnauba wax an decyl oleate for the dispersion of inorganic sunscreens in

aqueous media, Eur. J. Pharm. Biopharm. 60 (2005), pp. 113–122.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6C-4MY0MFS-2&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2007&_alid=910510629&_rdoc=7&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5027&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=13&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a94ea646fd23bf3d35bcb59582b68f7a

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6C-4MY0MFS-2&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2007&_alid=910510629&_rdoc=7&_fmt=high&_orig=search&_cdi=5027&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=13&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a94ea646fd23bf3d35bcb59582b68f7a







http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235027%232006%23999369997%23623928%23FLA%23&_cdi=5027&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=52226c6ca1b4b5f51c7068dffe6958d9

174

[10] J.R. Villalobos-Hernández, C.C. Müller-Goymann European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, Volume 65, Issue 1, January 2007, Pages 122-125.

[11] N. Weiner, Introduction. In: H.A. Liebermann, M.M. Rieger and S. Banker, Editors,

Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems vol. 1, Marcel Dekker, New York, NY

(1996), pp. 1–14

[12] W. Grimm, General concept of stability testing, in: W. Grimm, K. Krummen (Eds),

Stability Testing in the EC, Japan and EUA, 1984, pp. 191-223.

[13] R.H. Müller, K. Mäder and S. Gohla, Solid lipid nanoparticles for controlled delivery – a

review of the state of art, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (2000), pp. 161–177

[14] R.H. Müller, K. Mäder and S. Gohla, Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug

delivery – a review of the state of art, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (2000), pp. 161–167

[15] Vikram Sarveiya, Stacey Risk and Heather A. E. Benson Liquid chromatographic assay for

common sunscreen agents: application to in vivo assessment of skin penetration and systemic

absorption in human volunteers. Journal of Chromatography B. Volume 803, Issue 2, 25 April

2004, Pages 225-231

[16]. PAESE, P.Desenvolvimento Tecnológico, estudo de fotoestabilidade e avaliaçãoda

permeação cutânea in vitro da benzofenona-3 a partir de nanocápsulas poliméricas incorporadas

em diferentes veículos semi-sólidos. 2008. 213f. Programa de Pós Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Faculdade de Farmácia. Universidade Federal do Rio Grande do Sul.. Porto

Alegre-2008

[17] T. de Vringer, H.A. de Ronde , Preparation and structure of a water-in-oil cream containing

lipid nanoparticles , J. Pharm. Sci. 84(4)(1995)466-472.

[18] G. Petzold, V. Dutschk, M. Mende, R. Miller, Interaction of cationic surfactant and anionic

polyelectrolytes in mixed aqueous solutions, Coll. Surf. A: Phys. Engin. Asp. 319 (2008) 43-

50.


http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%237220%232004%23991969997%23491423%23FLA%23&_cdi=7220&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=78fe4cef6db374151cc23b83e8d51d23

175

[19] J. Pardeike, R.H. Müller, Penetration enhancement and occlusion properties of coenzyme

Q10-loaded NLC, The Am. Assoc. Pharm. Sci.(AAPS), San Antonio, Texas, USA, 2006

[20] R H Müller, R D Petersen, A Hommoss, J Pardeike, Nanostructured lipid carriers (NLC) in

cosmetic dermal products, Advanced Drug Delivery. Volume 84, May 2007, pages 522-530.

[21] E.B. Souto and R.H. Müller, Cosmetic Features and applications of lipid

nanoparticles (SLN, NLC). International Journal of Cosmetic Science.Volume 30, 2008,

pages 157-165.

[22] Veerawat Teeranachaideekul, Prapaporn Boonme , Eliana Barbosa Souto , Rainer Helmut

Müller, Varaporn Buraphacheep Junyaprasert, Influence of oil content on physicochemical

properties and skin distribution of Nilered-loaded NLC. Journal of Controlled Release . Volume

128 , 2008)., pages134–141.

[23] S. Lombardi Borgia, M. Regehly, R. Sivaramakrishnan, W. Mehnert, H.C. Korting, K.

Danker, B. Röder, K.D. Kramer, M. Schäfer-Korting. Lipid nanoparticles for skin penetration

enhancement—correlation to drug localization within the particle matrix as determined by

fluorescence and parelectric spectroscopyJournal of Controlled Release, Volume 110, Issue 1,

10 December 2005, Pages 151-163.

[24] Kun-Hong Lee, Shih-Ju Chen, Jing-Yueh Jeng, Yu-Ching Cheng, Jen-Taie Shiea, Huan-

Tsung Chang. Fluorescence and interactions with thiol compounds of Nile Red-adsorbed gold

nanoparticlesJournal of Colloid and Interface Science, Volume 307, Issue 2, 15 March 2007,

Pages 340-348.

[25] Schaffazick, S. R.; Guterrez, S.S. Caracterizacao e estabilidade fisico-quimica desistemas

polimericos nanoparticulados para administracao de farmacos. Química Nova, v.26, n.5, p.726-

737, 2003.

[26] Muller, R.H., Mehnert, W.lucks, J.S. Schwarz, Solid lipid nanoparticles

(SLN) – na alternative colloidal carrier system for controlled drug delivery. Eur. J.

Pharm. Biopharm. V. 41, p. 423-427, 2002.

https://www.researchgate.net/author/R+H+M%C3%BCller

https://www.researchgate.net/author/R+D+Petersen

https://www.researchgate.net/author/A+Hommoss

https://www.researchgate.net/author/J+Pardeike




http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WHR-4MHX7GB-1&_user=10&_coverDate=03%2F15%2F2007&_alid=910440984&_rdoc=46&_fmt=high&_orig=search&_cdi=6857&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=82&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=070b0a1c9ff76fe0d9b41acf252b636c

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WHR-4MHX7GB-1&_user=10&_coverDate=03%2F15%2F2007&_alid=910440984&_rdoc=46&_fmt=high&_orig=search&_cdi=6857&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=82&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=070b0a1c9ff76fe0d9b41acf252b636c

176

Figure captions

Figure 1. Response surface methodology (effect of wax:oil ratio, type and concentration of the

emulsifier on the particle size average (A) and PI (B) of the lipid nanoparticles.

Figure 2. Response surface methodology (effect of homogenization pressure and number of

cycles on the particle size average (A) and PI (B) of the lipid nanoparticles)

Figure 3. Occlusion factor of NLC dispersions at various times after application. Data give

occlusion factor mean values ±standard deviations (SD) (n=4) and error bars mean SD

Figure 4. Penetration into pig skin after 8 h. Nile Red from NLC dispersion (A, C) , Nile

dispersed in isodecyl oleate ( B, D).

Figure 5. DSC data of the raw lipid material (carnauba wax, isodecyl oleate and its mixture),

crystalline benzophenone-3 as well as blank and Bz3-loaded NLC. Exothermic up.

Figure 6. Effects of initial BZ-3 load on the stability of BZ-3-loaded NLC dispersions

prepared with polysorbate 80 at 900 bar and 8 cycles.

Figure. 7. Kinetic release of BZ-3-loaded NCL of carnauba wax and isodecyl oleate.

177

Figure (s)

A) B)

Figure 1

178

Figure (s)

A) B)

Figure 2

179

Figure (s)

Figure 3

180

Figure (s)

(A) (B)

(C) (D)

Figure 4

181

Figure (s)

Figure 5

182

Figure (s)

Figure 6

183

Figure (s)

Figure 7

184

Table (s)

Ingredients Composition (wt %)

LIPID PHASE Blank NLC BZ-3-loaded NLC

Carnaúba wax 5 5

Isodecyl oleate 5 5

Benzophenone-3 - 0.5; 1.0 and 5.0

Dimeticone 1 1

AQUEOUS PHASE

Polysorbate 80 1 1

Phenoxiethanol-F 0.2 0.2

Distilled water q.s. 100 q.s. 100

wt = weight; q.s.= quantum sufficient; BZ-3 = benzophenone-3

Table 1. The composition of NLCs containing BZ-3.

185

Table (s)

Test

Surfactant

concentratio

n (wt%)

Lipids

Total

(%wt)

Type of

Surfactant

Proportion

Wax:Oil

PSA (nm) and PI

PSA PI PSA PI

t0 t10

1 3 20 Polysorbate 80 1:1 277.4 0.41 286.7 0.72

2 1 20 Polysorbate 80 1:1 405.0 0.31 370.9 0.13

3 3 5 Polysorbate 80 1:1 570.5 0.33 595.3 0.47

4 1 5 Polysorbate 80 1:1 482.5 0.41 542.7 1.00

5 3 20 Poloxamer 188 1:1 1612.5 1.00 512.3 0.50

6 1 20 Poloxamer 188 1:1 3663.9 0.63 5626.1 0.77

7 3 5 Poloxamer 188 1:1 567.0 0.35 559.5 0.83

8 1 5 Poloxamer 188 1:1 223.3 0.24 223.6 0.20

9 3 20 Polysorbate 80 2:1 322.7 0.31 307.5 0.24

10 1 20 Polysorbate 80 2:1 1471.9 1.00 6304.8 1.00

11 3 5 Polysorbate 80 2:1 1008.9 0.77 763.8 1,00

12 1 5 Polysorbate 80 2:1 741.5 1.00 2627.3 1.00

13 3 20 Poloxamer 188 2:1 1912.9 1.00 3823.3 0.96

14 1 20 Poloxamer 188 2:1 7736.0 0.98 4077.0 0.89

15 3 5 Poloxamer 188 2:1 2657.8 1.00 2109,3 1.00

16 1 5 Poloxamer 188 2:1 5613.5 1.00 4102.9 1.00

t0 = immediately after homogenization; t10 = 10 days after preparation.

Table 2. Particle size average (PSA) and polydispersity index (PI) of the nanosuspensions

for different formulation compositions.

186

Table (s)

Test** Homogenization

cycles

Homogenization

pressure (bar)

Cooling

method

Pre-

emulsion

time

(min)

PSA (nm) and PI

PSA PI PSA PI

t0 t10

17 8 900 RT 8 235.2 0.18 257.0 0.17

18 2 900 RT 8 262.4 0.13 249.2 0.19

19 8 400 RT 8 4509.1 1.00 386.4 1.00

20 2 400 RT 8 1736.6 1.00 1358.4 1.00

21 8 900 Ice batch 8 292.2 0.57 295.0 0.51

22 2 900 Ice batch 8 437.5 1.00 862.5 0.68

23 8 400 Ice batch 8 441.2 1.00 419.1 1.00

24 2 400 Ice batch 8 1589.7 1.00. 958.5 1.00

25 8 900 RT 4 263.1 0.33 261.5 0.18

26 2 900 RT 4 259.8 0.31 347.5 1.00

27 8 400 RT 4 696.0 1.00 335.3 1.00

28 2 400 RT 4 287.5 0.60 324.8 0.55

29 8 900 Ice batch 4 251.3 0.12 257.6 0.15

30 2 900 Ice batch 4 265.2 0.16 261.9 0.11

31 8 400 Ice batch 4 2735.6 1.00 6589.0 1.00

32 2 400 Ice batch 4 5231.9 1.00 1567.0 1.00

t0 = immediately after homogenization; t10 = 10 days after preparation. RT = room temperature

Table 3. Particle size average (PSA) and polydispersity index (PI) of the nanosuspensions for

different homogenization conditions.

187

Table (s)

Sample ∆H( Jg-1


Benzophenone-3 90.08 62.73 64.35 67.85

Carnauba wax 163.15 79.89 83.96 86.06

Carnauba wax: isodecyl oleate (1:1) 69.24 66.89 78.62 82.57

Blank NLC 64.19 76.73 80.25 83.29

Bz-3 loaded NLC (91µgBz3/ mg lipids) 65.82 77.64 79.59 82.41

Table 4.DSC data of the raw material and NLC dispersions.

188

Table (s)

Initial BZ-3

in formulation %

(µg BZ-3/ mg lipids)

Time

(days)

Diameter

( nm)

PI

Zeta potential

(mv)

Viscosity

( cps)

pH

Entrapment

Efficiency

(%)

Loading

capacity, %

(µgBz3/mglipids)

Blank

t0 266.4 ± 0.70 0.139 ± 0.019 - 32.4 ± 1.6 1.95 5.31 * *

t15 274.8 ± 1.40 0.100 ± 0.046 - 28.8 ± 2.2 2.00 5.77 * *

t30 205.3 ± 2,38 0.186 ±0.023 -27.2± 2.8 2.04 5.42 * *

4.8

t0 266.3 ± 0,90 0.074 ± 0.029 - 35.1 ± 0.7 2.02 5.47 91.0 3.60

t15 278.4 ± 6,00 0.100 ± 0.006 - 38.5 ± 1.9 1.90 5.32 87.6 3.40

t30 210.0 ± 1.20 0.103± 0.030 -34.1± 2.0 2.12 5.73 58.8 2.20

9.1

t0 278.5 ± 0.10 0.104 ± 0.014 - 34.0 ± 3.3 3.69 5.04 63.7 4.70

t15 291.1 ± 4.80 0.091 ± 0.032 - 34.7± 12.1 3.05 5.01 57.9 4.40

t30 259.3 ± 8.90 0.015 ± 0.008 -39.2 ±10.0 2.02 4.67 55.2 4.30

23.1

t0 314.4 ± 6.00 0.052 ± 0.031 - 33.1 ± 0.7 2.15 5.23 25.5 5.20

t15 317.6 ± 9.30 0.041 ± 0.018 - 36.8 ± 1.2 1.98 5.12 24.7 4.80

t30 302.1 ± 5.80 0.153 ± 0.126 -32.8± 1.0 2.20 4.91 20.3 4.00

33.3

t0 * * * 2.00 5.38 17.1 5.10

t15 302.1 ± 24.40 0.184 ± 0.058 - 38.5 ± 0.5 1.22 5.51 14.9 4.40

t30 359.1 ± 8.20 0.215 ± 0.187 -33.9± 0.7 2.45 5.61 12.4 3.50

* The measurements was not determined.

NLC were prepared using polysorbate 80 at a final concentration of 1% (w/w) as emulsifier and

at homogenization conditions of 900 bar and 8 cycles.

Table 5. Characteristics of the Bz-3-loaded NLC

CARREADOR LIPÍDICO NANOESTRUTURADO À BASE DE CERA DE ... · Aos meus primos e primas em especial...

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