Docentes: Prof. Dr. Felipe S. Chambergo – fscha@usp.br Prof. Dr. Luiz P. M. Andrioli – lpma@usp.br Monitores: MSc. Patrícia Pereira Adriani - paty_adriani@hotmail.com Bchr. Gustavo Roncoli - gustavoroncoli@hotmail.com Bchr. Daniela De Lucena Pedroso - pedrosoddl@usp.br Servidores não-docentes: Sr. Tec. Clarino do Divino Vieira Local: Laboratório de Biotecnologia, 1° andar bloco didático A2 - EACH/USP.

USP – 2019

Biotecnologia ACH5545 Engenharia Genética e Biologia Molecular

Atividades de Laboratório 2º Semestre 2019

SEM DATAS ATIVIDADE DOCENTE 5 29.08 Análise de Bioinformática, Extração de DNA genômico,

plasmidial e proteínas. Quantificação e Separação de Biomoléculas por Eletroforeses

Andrioli /Chambergo

05.09 SEMANA PÁTRIA / NÃO HAVERÁ AULA 6 12.09 Sistemas Procarióticos: Vetores de Clonagem e

Expressão - PCR, Enzimas de modificação de DNA, Clonagem e

Transformação

Andrioli/ Chambergo

8 26.09 Visita Turma 1 -Customer Experience Center – ThermoFisher*

14:00-18:00 h

9 03.10 Análise de Biomoléculas: DNA e Proteínas I - Transferência

Andrioli /Chambergo

11 17.10 Análise de Biomoléculas: DNA e Proteínas II - Revelação

Andrioli /Chambergo

13 31.10 Expressão de Proteínas heterólogas em bactéria e Análise SDS-PAGE

Purificação de Proteínas e Determinação de atividade enzimática

Andrioli /Chambergo

15 14.11 Visita Turma 2 - Customer Experience Center – ThermoFisher*

14:00-18:00 h

17 28.11 Hibridação in situ Andrioli /Chambergo

Definição: PCR (Polimerase Chain Reaction) • reação de polimerização em cadeia de DNA

Objetivo:

• amplificar exponencialmente seqüências específicas de DNA, de amostras de genôma, plasmídios, etc., a partir de picogramas (10-9 g) de material genético

Requisitos:

• conhecimento da seqüência a ser amplificada • “primers”, desoxinucleotídeos trifosfato (dNTP’s), DNA polimerase termoestável, termociclador

Vantagens: • funciona mesmo com amostras de DNA, mesmo que esteja parcialmente degradado • amplifica a partir de quantidades muito pequenas, na ordem de picogramas • etc.

A reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

DNA genômico

CGTAGACTAGCTGCAGCA

5’

3’ TCACGCATCAATTACGCGGCATCATGACGATCGATCGC TGACTTCC AATGTCC TAATCGC ATCTGATCG ACGTCGT AGTGCGTAGTTAATGCGCCGTAG TACTGC TAGCTAGCGACTGAAGGTTACAGGATTAGCGTAGACTAGCTGCAGCA

TCACGCATCAATTACGCGG 3’

5’

3’

5’

5’

3’

DNA e desenho de Oligonucleótidos

DNA e alinhamento de Olignucleótidos

Forward

Reverse

3’

5’

TCACGCATCAATTACGCGGCATCATGACGATCGATCGCTGACTTCCAATGTCCTAATCGC A TCTGATCGACGTCGT AGTGCGTAGTTAATGCGCCGTAGTACTGCTAGCTAGCGACTGAAGGTTACAGGATTAGCGTAGACTAGCTGCAGCA

CGTAGACTAGCT GCAGCA

TCACGCATCAATTACGCGG 5’

3’

+

Reação de PCR

3´ TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT 5´ 5´ AATTGCCCCGGGAAATTT 3´.......................>

+ <..................................................... 3´ TTTAAACCCGGGTTT 5´ 5´ AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA 3´

3´ TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT 5´ 5´ AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA 3´

Adaptado de Andy Vierstraete, 2001

Amplificación Exponencial 2n

3’ 5’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

94°C 1 min

Desnaturação

55°C 1 min

Anelamento

5’ 3’

5’ 3’

3’ 3’

72°C 1 min

Extensão

72°C 1 min

Extensão

5’ 3’

5’ 3’

35 ciclos: - Desnaturação - Anelamento - Extensão

Milhões de cópias amplificadas !!

Tecnologia do PCR

94°C, 1 min = desnaturação = rompimento das pontes de H entre as duas fitas de DNA 55°C, 1 min = anelamento = os primers de hibridam em suas posições específicas 72°C, 1 min = extensão = a DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA

Passos:

Ciclos:

94°C

72°C

55°C

CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 4.......

1 min

1 min

1 min

Tecnologia do PCR

P32

Fluoroforo

Seqüênciamento de DNA

>TREST0554 (Contig)-Glycogen Synthase 5'3' Frame 1 gacgaggtcaaccagctgtgtcaattcatgtttgattactgtggcaagagccggcgtcaa D E V N Q L C Q F M F D Y C G K S R R Q cgtatcaaccagagaaaccgtactgagcgactcagcgacctgcttgactggaagcgcatg R I N Q R N R T E R L S D L L D W K R M ggtatggagtatatcaaggcccgccagctcgccctccgacgagcataccccaactcgttc G M E Y I K A R Q L A L R R A Y P N S F cacggagacgaggaagaagaggagctggaggactttatccgtgggccggagcagaagatc H G D E E E E E L E D F I R G P E Q K I tccaggccattctccgtccctggttcgcctcgcgatcggactggcatgatgacccctgga S R P F S V P G S P R D R T G M M T P G gactttgccagcttgcaggaagggcgagaaggcttgagcacggaggattacgttgcctgg D F A S L Q E G R E G L S T E D Y V A W aagctgcctgaggaggaggaccccgaggagtatcccttctcgttgacccttcggacaaag K L P E E E D P E E Y P F S L T L R T K cagcccggccctgtgagcccagagactcaggccactctcaacggtaactaaaagaactta Q P G P V S P E T Q A T L N G N - K N L gcaaatcaaggcgtttttttctcaaggtagcatccatttgcgtccacagccagcattgcg A N Q G V F F S R - H P F A S T A S I A tcggatcggggacgttgtacgtgtgatttctcgttcgtgtcgaatctatgatatatggtt S D R G R C T C D F S F V S N L - Y M V tttgtctcttccaggactgcgtccgaggtgccatgggagtagcaggttgggtaaaggtgg F V S S R T A S E V P W E - Q V G - R W gacaggagaaggaaaccaggcggaaaagaaaaggcgcgggttatt D R R R K P G G K E K A R V I

Polymerase 3'->5' Exonuclease Source and Properties

Taq No From Thermus aquaticus. Halflife at 95C is 1.6 hours.

Pfu Yes From Pyrococcus furiosus. Appears to have

the lowest error rate of known thermophilic DNA polymerases.

Vent Yes From Thermococcus litoralis; also known as

Tli polymerase. Halflife at 95 C is approximately 7 hours.

Thermo tolerant polymerases used for PCR (polymerase chain reactions) reactions The total error rate of Taq polymerase has been variously reported between 1 x 10-4 to 2 x 10-5 errors per base pair. Pfu polymerase appears to have the lowest error rate at roughly 1.5 x 10-6 error per base pair Vent is intermediate between Taq and Pfu.

Enzimas Polimerases

Enzimas de Modificação de DNA e Mapas de restrição

Restriction-recognition sites are short DNA sequences recognized and cleaved by various restriction endonucleases.

1. Restriction Enzymes

Extremos coesivos Extremos cegos

EcoRI HindII

RADAR

2. DNA Ligase: Junção de moléculas

Clivagem e ligação de duas moléculas de DNA com EcoRI ---> DNA Recombinante

• Klenow fragment --the C-terminal 70% of E. coli DNA polymerase I; originally prepared as a proteolytic fragment (discovered by Klenow); now cloned – Perda da atividade 5'->3' exonuclease – Usos:

• Marcação da extremidade do DNA por preenchimento dos extremos coesivos deixados por enzimas de restrição.

• Geração de extremos cegos • Sequenciamento de DNA

3. DNA Polimerases

A way of making blunt ended DNA (repair after mechanical fragmentation)

5. RNA polymerase: Transcriptase Reverse

6. T4 polynucleotide kinase

• Transfers gamma phosphate of ATP to the 5’ end of polynucleotides • Useful for preparing DNA fragments for ligation (if they lack 5’

phosphates) • Useful for radiolabelling DNA fragments using gamma 32P ATP as a

phosphate donor

7. Fosfatasa alcalina

• Remoção do 5’ (e 3’) fosfato dos polinucleotídeos • Useful for treating restricted vector DNA sequences prior to ligation

reactions, prevents religation of vector in the absence of insert DNA

Vetores de Expressão e Proteínas de Fusão

1-Clonagem do cDNA da proteína de interesse num vetor de expressão -Seleção do vetor e proteína a expressar 2-Transformação e seleção de Bactérias ou células competentes -Seleção de organismo hospedeiro e técnica de transformação 3-Testes de Expressão -Identificar o clone que expressa a proteína recombinante 4-Produção em grande escala da proteína recombinante -Empregando um grande volumem de cultura 5-Recuperação e análises da proteína recombinante -Técnicas para recuperar a proteína a partir da cultura 6-Purificação -Técnicas de purificação de proteínas 7-Aplicação

Isto é possível por: -Universalidade do código genético. -Similaridade da maquinaria de transdução (ribossomos) -Rápido avanço das técnicas de biologia molecular e/ou engenharia genética:

– Clonagem de DNA – Seqüênciamento de DNA – Enzimas para cleavages, ligação, sínteses de moléculas de DNA, RNA, síntesis de

nucleotídeos, etc Deve-se obter plasmídios para clonagem que garantissem um alto nível de

expressão da proteína de interesse (Vetor de Expressão)

1-Regulador do promotor: Proteína que modula o promotor 2-Promotor: Deve ser forte (lac, trp, tac, λpL, gene 10 do fago T7) 3-Seqüência Shine-dalgarno: Sitio de ligação do ribossomo, (RBS). 4-Região codificadora: sítios de múltipla clonagem 5-Terminador de transcrição: Estabiliza o mRNA 6-Marcador genético (antibiótico de seleção) 7-Ori: Origem de replicação.

Elementos de um vetor de expressão procariótico

1 2 3 5 4 6 7

Start Codon

Stop Codon

-10 TATAAT

Vetor de Expressão

Diagram of a simple cloning vector derived from a plasmid, a circular, double-stranded DNA molecule that can replicate within an E. coli cell.

Vectors usados em clonagem molecular Vector (e Hospedeiro) Características Tamanho do inserto Plasmid Pequeno circular <5 - 10 kb (bacteria, yeast) Bacteriophage lambda DNA viral linear mais de ~20 kb ou phage lambda (bacteria) Cosmideo Híbrido de plasmídeo e fago mais de ~50 kb (bacteria) Yeast artificial DNA contendo centromero DNA containing yeast chromosome or YAC telomero e origem de replicação ~200 to ~1000 kb de levedura

General procedure for cloning a DNA fragment in a plasmid vector

pUC19

Polylinker: restriction sites

Origin sequence Ampicillin resistance gene

lacZ+

gene

Cloning a DNA fragment in a plasmid vector

*Cut with same restriction enzyme

DNA ligase

Recircularization LacZ Gene is Intact

Blue Colonies

Ligation LacZ Gene is Disrupted

White Colonies

Alkaline phosphatase prevents recircularization

increasing yield.

X

Eletroporação:

Seleção Branco/Azul

ATG TAG

Enzima2 Enzima1

ATG-TCC-GCT-ATG TAG-TCC-GCT-CTG

AUG UAG

Oligo-Enzima1

Oligo-Enzima2

RT-PCR (Transcriptasa reversa)

Cliva e liga no vetor de expressão

Vetor de Expressão Vetor de Expressão

Seqüência Codificadora

mRNA

cDNA

Clonagem da Sequencia de Interesse

Manter o passo de leitura !!!!!!!

Proteína de Interesse

Fusão Proteína de Interesse

Sitio de clivagem de Protease

(lacZ, GST, His, CBD,etc)

Sinal Proteína de Interesse

(ompA, ompT)

A)Expressão da proteína de interesse

B)Expressão da proteína de interesse fusionada com outra Proteína

C)Expressão da proteína de interesse com sinal para secreção

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Citoplasma Meio

Membrana Externa Membrana Interna

Periplasma

+ Secreção

Secreção

A)Proteínas Citoplasmáticas

B)Secreção de Proteínas

Met

Precipita Proteína Nativa Degrada

Precipita Degrada

Seqüência Sinal

Precipita ou

degrada

Expressão da Proteína de interesse O vetor de expressão é empregado para transformar Bactérias competentes (E. coli deficientes em Proteasas). Após cultura é Testada a expressão

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Gel SDS-PAGE – 29/08/19

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Visita no CEC – ThermoFisher 26/09/2019 – 13:45 h

1ra Turma em Amarelo