1

ESPECTROFLUORIMETRIAESPECTROFLUORIMETRIA

PROF. FERNANDO B. EGREJA FILHOPROF. FERNANDO B. EGREJA FILHODQ DQ –– ICExICEx –– UFMG UFMG

QUI 221 QUI 221 –– ANANÁÁLISE LISE INSTRUMENTAL AINSTRUMENTAL A

FOTOLUMINESCÊNCIA

BIOLUMINESCÊNCIA

QUIMIOLUMINESCÊNCIA

♦♦♦♦ Fluorescência

♦♦♦♦ Fosforescência

LUMINESCÊNCIA

BIOLUMINESCÊNCIA

Luciferin + Luciferase + Oxygen = LIGHT

MINERAIS FLUORESCENTES

LUZ BRANCA LUZ UV

ORGANISMOS FLUORESCENTES

2

Aumento de fluorescência da 1,8-ANS (ácido 1-anilinonaphthaleno-8-sulfônico) ao ligar-se a uma proteína (albumina de soro bovino).

Candida albicans com branco de calcofluorMicroscópio de fluorescência, X 1000

REAGENTES FLUORESCENTES

LUZ BRANCA LUZ UV

ADITIVOS FLUORESCENTES

LÂMPADA FLUORESCENTE

Ca5(PO4)3F1-xClxDopado com Sb3+ e Mn2+

emissão em 254 e 185 nm

LÂMPADA FLUORESCENTELÂMPADA FLUORESCENTE(Ca(Ca55(PO(PO44))33FF11--xxClClxx))

AZUL AMARELO+ = BRANCO

3

Quimioluminescência do produto de reação da codeina com tris(2,2'-bipiridil)ruthenio(III)

QUIMILUMINESCÊNCIA

Identifica-se uma mancha particular como sangue ou não, ou talvez até mesmo revelar

manchas escondidas em materiais escuros ou onde foram feitas tentativas lavar o sangue.

Um teste particular que revela a presença de sangue é o Teste do Luminol. Neste teste as manchas de sangue aparecem sob uma luz azul devido ao produto luminescente da reação de do luminol na presença do ferro da hemoglobina

FOSFORESCÊNCIA

AbsorAbsorçção, geralmente, no UV e ão, geralmente, no UV e emissão, possemissão, possíível, em todo o vel, em todo o

espectro visespectro visíívelvel

4

N

OCH3

OHN

CH2

fenantreno

Processos de desativaProcessos de desativaççãoão

• Relaxação não radioativa (vibracional)

• Conversão Interna

• Conversão Externa

• Cruzamento Intersistemas

• Pré-dissociação

• Dissociação

Eficiência Quântica (Eficiência Quântica (ФФ))

absorvidosfótons

emitidosfótons

_

_=φ

dpdciceif

f

kkkkkk

k

+++++=φ

Fatores que afetam a Fatores que afetam a Fluorescência Fluorescência

a) Tipo de transiçãoPrincipal π* → π (100 a 1000x > π* → n) Não ocorre δ* → δ, pois 200 nm = 140 kCal/mol

b) Estrutura: duplas conjugadas (π* → π )

c) Rigidez estrutural d) Solvente e Temperaturae) pH f) O2 dissolvido

5

Rigidez estrutural

Fluoreno φ = 1 Bifenila φ = 0,2

Fluorescência x ConcentraFluorescência x Concentraççãoão

( )IIF −= 0φ

bCbC III

I εε −− ×=∴= 1010 0

0

( )bCIF εφ −−= 1010

Expandindo o termo exponencial em Expandindo o termo exponencial em sséérie de rie de MaclaurinMaclaurin::

( ) ( )

−+−= ...

!3

303,2

!2

303,2303,2

32

0

bCbCbCIF

εεεφ

kCIF

bCIF

bC

0

0 303,2

05,0

=

=

∴<

εφεSe

16

4

.105

10~

−−< LmolxC

ε

Fatores que afetam a Fatores que afetam a linearidadelinearidade

• Auto-supressão: perda de energia por choques em concentrações mais altas;

• Auto-absorção: absorção de radiação por moléculas não excitadas, entre as excitadas e o detector. Importante quando ocorre a fluorescência de ressonância.

FLUORÍMETRO

6

FONTES DE UVFONTES DE UV FLUORFLUORÍÍMETROSMETROS

MEDIDOR DE CLOROFILA EM CAMPO

Bacterial luciferin is a reduced riboflavinphosphate (FMNH2, pictured here)

GambiômetroGambiômetro ((quininômetroquininômetro))

• Excitação por lâmpada de vapor de mercúrio;

• Detecção por célula fotoelétrica (calculadora solar);

• Detecção por ldr (plotar 1/R x F);

• Sem sistema de seleção de λλλλ ;• Determinação de quinino em água tônica.

Água tônica:Água gaseificada com 20 – 70 mg L-1 de quinino,Benzoato de sódio (C6H4 COONa);

Sorbato de potássio (H3C- CH=CH-CH=CH-COOK)Ácido tartárico (HOOC – CH(OH)-CH(OH)-COOH)Ácido cítrico – (HOOCCH2 )2-C(OH)- COOH

7

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

0

5

10

15

20

25

30

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Espectro de Fluorescência (Emissão) λ

EXC = 350 nm

Espectro de Excitação (Absorção)

F (cpsx10

-6)

Ab

sorv

ânc

ia

λ (nm)

N

OCH3

OHN

CH2

200 300 400 5000.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500 Espectro de Absorção

Tonica Quinina

Abs

orbâ

nci

a

Comprimento de Onda (nm)

GambiômetroGambiômetro ((quininômetroquininômetro))

VANTAGENSVANTAGENS

• Maior Sensibilidade e menor limite de detecção (até 1000x mais sensível que a espectrofotometria);

• Grande Seletividade nas determinações diretas

DESVANTAGENSDESVANTAGENS

• Exatidão e Precisão 2 a 5 x pior que EAM;

• Fosforimetria menos precisa que a Fluorimetria;

• Alto custo;

• Menor Aplicabilidade.

APLICAAPLICAÇÇÕES FLUORIMETRIAÕES FLUORIMETRIA

• Espécies orgânicas: Enzimas, coenzimas, agentes medicinais, produtos de plantas, alcalóides, esteróides, vitaminas, ...

• Espécies inorgânicas: metais (quelatosfluorescentes), ânions (inibição de fluorescência)

Métodos fluorimétricos p/ espécies inorgânicas

Íon determinado

Reagente Comprimento de onda (nm)

Sensibilidade (µg mL-1)

Interferentes

Excit. Emis.

Al3+ Alizarina Granada R

470 500 0,007 Be, Co, Cr, Cu, F-, NO3

-, Ni, PO4

3-, Th, Zr F- Alizarina

Granada R com Al3+

470 500 0,001 Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO4

3-, Th, Zr

B4O72- Benzoína 370 450 0,04 Be, Sb

Cd2+ 2-(o-hidroxifenil)-benzoxanol

365 Azul 2 NH3

Li+ 8-hidroxiquinolina 370 580 0,2 Mg Sn4+ Flavonol 400 470 0,1 F-, Zr, PO4

3- Zn2+ Benzoína --- Verde 10 B, Be, Sb,

íons coloridos

Ca2+ Calceína 330 540 0,04 ?

8

NOH

8-hidroxiquinolina:

Al, Be e outros metais

N+

O

Zn

3

complexo fluorescente de

Zn-8-hidroxiquinolina

OH

OH

N N

OH

SO3NaAlizarina granada R

(p/ Al3+, F-)

Ligantes FluorescentesLigantes FluorescentesO

OHO

Flavonol

reag. p/ Zr e Se

O

OH

Benzoína

reag. p/ B, Zn, Ge e Si

OO OH

OH

O

N(CH2CO2-)2(-O2CH2C)2N

Calceína

OO OH

OH

O

Fluoresceína

FOSFORÍMETROAPLICAAPLICAÇÇÕES FOSFORIMETRIAÕES FOSFORIMETRIA

• Ácidos nucléicos,

• Aminoácidos,

• Purina e Pirimidina,

• Hidrocarbonetos do petróleo,

• Pesticidas

FLUORÍMETROEfeito da substituição da fluorescência do benzeno

Composto Fórmula λ de Fluorescência

(nm)

Intensidade relativa de

fluorescência

Benzeno C6H6 270-310 10 Tolueno C6H5CH3 270-320 17

Propilbenzeno C6H5C3H7 270-320 17 Fluorobenzeno C6H5F 270-320 10 Clorobenzeno C6H5Cl 275-345 7 Bromobenzeno C6H5Br 290-380 5 Iodobenzeno C6H5I --- 0

Fenol C6H5OH 285-365 18 Fenolato C6H5O

- 310-400 10 Anizol C6H5OCH3 285-345 20 Anilina C6H5NH2 310-404 20 Anilínio C6H5NH3

+ --- 0 Ácido benzóico C6H5COOH 310-390 3

Benzonitrila C6H5CN 280-360 20 Nitrobenzeno C6H5NO2 --- 0