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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO EM DOENÇAS INFECCIOSAS

CAMILA GIUBERTI DE SOUZA

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DIAGNÓSTICOS PARA A DENGUE

VITÓRIA

2012

1

CAMILA GIUBERTI DE SOUZA

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES

DIAGNÓSTICOS PARA A DENGUE

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Doenças Infecciosas.

Orientador: Dr. Reynaldo Dietze Co-orientadora: Dra. Elenice Moreira Lemos

VITÓRIA

2012

2

Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)

(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)

Souza, Camila Giuberti de, 1984-

S729a Avaliação da sensibilidade de diferentes testes diagnósticos

para a dengue / Camila Giuberti de Souza. – 2012.

70 f. : il.

Orientador: Reynaldo Dietze.

Coorientadora: Elenice Moreira Lemos.

Dissertação (Mestrado em Doenças Infecciosas) –

Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da

Saúde.

1. Dengue - Diagnóstico. 2. Teste imunoenzimático. I. Dietze,

Reynaldo. II.Lemos, Elenice Moreira. III. Universidade Federal

do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. IV. Título.

CDU: 61

4

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Reynaldo Dietze pelo incentivo e pela confiança depositada durante a

execução deste projeto. Obrigada por participar da minha formação como

pesquisadora.

À Dra. Elenice Moreira Lemos pelo acompanhamento diário, conhecimento

transmitido e pelas sugestões.

À Dra. Rita Maria Nogueira, do Laboratório de Flavivírus da Fiocruz, por me receber

em seu laboratório, e à Simone Sampaio pela disponibilidade.

Aos amigos, e colegas de mestrado, Lorenzzo Stringari, Ronaldo Bragança e Aline

Lyra pela agradável convivência; pelo apoio e, certamente, pela simples e tão rara

amizade verdadeira.

Aos colegas de laboratório Marco André Tonini, Mariela Piccin e Lygia Herkenhoff,

pela colaboração nas diversas fases de execução deste projeto.

Aos colegas do Laboratório de Leishmaniose e de Dengue, Juliana, Jauber, Renata,

Priscila, Nayana, Laura, Kamila, Giuliana e Aline pela ajuda, troca de idéias e por

cada momento compartilhado.

A todos os colegas da Pós Graduação em Doenças Infecciosas e à toda equipe do

NDI pelas experiências partilhadas, pela ajuda e pela agradável convivência diária.

Aos Professores desta Pós Graduação pela imensa contribuição intelectual.

A todos os funcionários do NDI pela atenção e disponibilidade sempre que

necessário.

Aos laboratórios Bioeasy, Bio-Rad e Inbios pelo fornecimento dos testes.

Ao Laboratório Central da Prefeitura de Vitória pela execução de parte dos testes.

5

Ao LACEN/ES pelo fornecimento dos controles positivos.

À CAPES e ao NDI pelo apoio financeiro.

Aos meus amigos, por participarem de mais esta etapa da minha vida, pelo carinho

e pela sincera torcida para o meu sucesso.

A Rafael, pelo apoio incondicional para meu crescimento profissional.

À minha família, pelo apoio e confiança no meu sucesso.

6

“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são.”

Aristóteles

7

RESUMO

Atualmente, a Organização Mundial da Saúde considera a dengue como a mais

importante doença viral transmitida por mosquitos e estima em 50 milhões o número

de novas infecções a cada ano no mundo. A expansão mundial dessa doença e a

demanda por testes diagnósticos rápidos, específicos e de execução simples,

aumentaram o número de novos testes disponíveis no mercado. Sabe-se que, para

uma melhor utilização dessas ferramentas, é fundamental sua avaliação nos

diversos cenários clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Este trabalho teve por

objetivo avaliar sete testes laboratoriais para o diagnóstico de dengue. As

sensibilidades encontradas para os testes imunocromatográficos baseados na

detecção de NS1 encontradas foram: 24,5% [16,2-34,4] para o Dengue Duo

(Bioeasy) e 29,8% [20,8-40,1] Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad). Para os testes

ELISA NS1 as sensibilidades encontradas foram 43,6% [33,4-54,2] para Dengue

NS1 ELISA Test (Bioeasy), e 54,3% [43,7-64,6] para PlateliaTM Dengue NS1 Ag-

ELISA (BioRad). O teste NS1 que apresentou maior sensibilidade na fase aguda da

doença foi o PlateliaTM (54,3%). Para todos os testes NS1 observou-se maior

sensibilidade para o sorotipo 1 quando comparado com os demais sorotipos e, para

o PlateliaTM, a presença de IgG influenciou negativamente na sensibilidade do teste.

As sensibilidades dos testes para anticorpos IgM, variaram entre 27,1% [15,3-41,9] a

52,1% [37,2-66,7] em amostra de fase aguda, e 72,9% [53,8-81,3] a 97,9% [88,9-

99,9] em fase convalescente. Todos os testes IgM apresentaram sensibilidades

superiores em amostras de fase convalescente. Dentre todos os testes avaliados, o

Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) em amostra de fase convalescente foi o que

apresentou o melhor desempenho. Em amostra de fase aguda, o melhor

desempenho foi obtido quando combinamos os testes PlateliaTM Dengue NS1 Ag-

ELISA (BioRad) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) (76,6% [66,7-84,7]). Os

resultados sugerem que testes de detecção de NS1 podem exibir sensibilidades

diferentes, de acordo com o sorotipo viral e com a presença de anticorpos IgG.

Além disso, nossos resultados reforçam o fato de que os estudos de avaliação de

testes diagnósticos para a dengue e sua utilização devem levar em consideração o

perfil epidemiológico da população.

Palavras-chave: Dengue. Diagnóstico. Sensibilidade. ELISA. Teste imunocromatográfico.

8

ABSTRACT Currently, the World Health Organization considers dengue the most important viral

disease transmitted by mosquitoes and it is estimated that 50 million new infections

occur each year worldwide. The global spread of dengue and the demand for rapid,

specific and easy to perform diagnostic tests has increased the marketing of new

tests. For a better use of these tools it is essential to evaluate them in different

clinical, epidemiological and laboratory settings. The aim of this study was to

evaluate the sensitivity of seven laboratory tests for dengue diagnosis. The

sensitivities for the NS1 immunochromatographic tests were: 24,5% [16,2 to 34,4] for

Dengue Duo (Bioeasy) and 29,8% [20,8 to 40,1] for Dengue NS1 Ag strip (Bio-Rad).

The sensitivities of the NS1 ELISA tests were: 43,6% for Dengue NS1 ELISA Test

(Bioeasy) [33,4 to 54,2] and 54,3% [43,7 to 64,6] for PlateliaTM Dengue NS1 Ag-

ELISA (BioRad). The NS1 test that demonstrated greatest sensitivity in acute phase

samples was PlateliaTM (54,3%). For all NS1 tests greater sensitivity was observed

for serotype 1, when compared to the others serotypes. The sensitivity of PlateliaTM

(BioRad) was negatively influenced by the presence of IgG. The sensitivity of the

ELISA IgM tests ranged from: 27,1% [15,3 to 41,9] to 52,1% [37,2 to 66,7] in acute

phase samples and from 72,9% [53,8 to 81,3] to 97,9% [88,9 to 99,9] in convalescent

phase samples. Among all the tests evaluated, Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy), in

convalescent phase samples, showed the best performance. The sensitivity in acute

phase samples was 76,6% [66,7 to 84,7] when Dengue NS1 Ag test PlateliaTM ELISA

(BioRad) and Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) were combined. Our results suggest

that NS1 tests may have different sensitivities, according to the viral serotypes, and

in the presence of IgG antibodies. Furthermore, our results emphasize that the

epidemiological profile of the population must be considered in the use and

evaluation of dengue diagnostic tests.

Key words: Dengue. Diagnosis. Sensitivity. ELISA. Immunochromatographic test.

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação do genoma do vírus Dengue. O genoma viral codifica 3 proteínas estruturais (capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E)) e sete não proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) …….……………………………….

20

Figura 2. Teste imunocromatográfico Dengue Duo (Bioeasy) apresentando resultado negativo para detecção de NS1 e de anticorpos IgM e IgG.....................................................................................................

40

Figura 3. Teste imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad)........... 41

Figura 4. Gel de agarose dos produtos da etapa semi-nested. Coluna 1 e 2: controle DENV-2. Colunas 3 e 4: controle DENV-3. Coluna 5: branco. Coluna 6: peso molecular (100pb). Coluna 7: controle 1. Colunas 8 a 14: amostras de pacientes...........................................................................................

47

10

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Notificações por dengue de acordo com as semanas epidemiológicas em 2009 nos Municípios de Vitoria, Serra e Vila Velha ..............................................................................................

34

Gráfico 2. Notificações por dengue durante as semanas epidemiológicas do ano de 2010 no Município de Vitória .............................................

35

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Iniciadores utilizados para a tipagem do vírus Dengue..................

38

Tabela 2. Dados demográficos e clínicos dos 158 sujeitos incluídos no estudo.............................................................................................

46

Tabela 3. Sensibilidade dos testes imunocromatográficos Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue......

48

Tabela 4. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de NS1: Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue....................................................................

49

Tabela 5. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com a presença de IgG, em 94 amostras de soro positivas para Dengue..........................

50

Tabela 6. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com o sorotipo viral.........

51

Tabela 7. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de anticorpos IgM em 48 amostras pareadas (fase aguda e convalescente)...........

52

Tabela 8.

Sensibilidade do teste Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e da combinação dos testes Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) em 94 amostras de fase aguda.................................

52

Tabela 9. Sensibilidade dos testes Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica), DENV Detect IgM (MAC ELISA) (Inbios International) e Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) em 48 amostras de fase convalescente de acordo com a presença de IgG em fase aguda.........................................................................

53

12

LISTA DE SIGLAS

ADE: facilitação dependente de anticorpos (antibody dependent enhancement)

cDNA: DNA complementar

CF: Fixação do complemento

Dengue RA: antígeno Dengue recombinante

DENV-1: vírus Dengue sorotipo 1




DENV: vírus Dengue

ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

FD: Febre do Dengue

FHD: Febre Hemorrágica do Dengue

HI: Inibição da hemaglutinação

HRP: Horseradish peroxidase

IgA: Imunoglobulina A

IgG: Imunoglobulina G

IgM: Imunoglobulina M

INF: interferon

IL-8: interleucina 8

LACEN/ES: Laboratório Central de Saúde Pública do Espírito Santo

MAC-ELISA: ELISA de captura de IgM

MTase: metiltransferase

NCA: antígeno celular normal

NS1: proteína não estrutural 1





OMS: Organização Mundial da Saúde

HLA: antígeno leucocitário humano (Human Leukocyte Antigen) PRNT: Teste de Neutralização em Placa (Plaque Reduction Neutralization Test)

RNA: ácido ribonucleico

13

RT-PCR: Reação em Cadeia da Polimerase (Reverse Transcriptase Polimerase

Chain Reaction)

SCD: Síndrome do Choque do Dengue

SESA: Secretaria de Estado da Saúde

TMB: tetrametilbenzidina

14

SUMÁRIO

1 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 16

1.1 Epidemiologia e Histórico .......................................................................... 16

1.2 O Vírus Dengue ............................................................................................ 20

1.2.1 Proteínas Estruturais ............................................................................... 21

1.2.2 Proteínas não estruturais ......................................................................... 21

1.3 Patogênese da Dengue e Resposta Imune ............................................... 22

1.4 Manifestações Clínicas ............................................................................... 24

1.5 Métodos Diagnósticos ................................................................................ 25

1.5.1 Isolamento Viral ....................................................................................... 26

1.5.2 RT-PCR (convencional e real time) ......................................................... 26

1.5.3 Detecção de antígeno NS1 ...................................................................... 27

1.5.4 Detecção de Anticorpos ........................................................................... 28

2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 31

3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 32

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 33

4.1 Desenho do Estudo ..................................................................................... 33

4.2 Aspectos Éticos ........................................................................................... 33

4.3 Obtenção de amostras ................................................................................ 33

4.3.1 Pacientes ................................................................................................. 33

4.3.1.1 Critérios de Inclusão ........................................................................... 36

4.4 Caracterização das amostras positivas e do sorotipo infectante .......... 36

4.4.1 RT-PCR ................................................................................................... 37

4.4.1.1 Extração do RNA ................................................................................ 37

4.4.1.2 Síntese do cDNA ................................................................................ 37

4.4.1.3 Amplificação do DNA .......................................................................... 37

4.4.1.4 Tipagem do vírus Dengue (Semi Nested) .......................................... 38

4.5 Testes Diagnósticos .................................................................................... 39

4.5.1 Testes de detecção de NS1 .................................................................... 39

4.5.1.1 Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) ................................................... 39

4.5.1.2 Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) .................................... 40

4.5.1.3 Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ....................................

15

4.5.1.4 PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories) ................ 41

4.5.2 Testes de detecção de anticorpos IgM .................................................... 42

4.5.2.1 Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ................................. 42

4.5.2.2 DENV Detect TM IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA) (Inbios

International) ................................................................................................... 43

4.5.2.3 Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) ................................................ 43

4.6 Pesquisa de anticorpos IgG ....................................................................... 44

4.6.1 Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ...................................... 45

4.7 Análise Estatística ....................................................................................... 45

5 RESULTADOS .................................................................................................... 46

5.1 Obtenção de amostras de soro .................................................................. 46

5.2 Amostras positivas para Dengue ............................................................... 47

5.3 Avaliação da sensibilidade dos testes diagnósticos ............................... 48

5.3.1 Testes para detecção de NS1 ................................................................. 48

5.3.1.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes NS1 ............. 49

5.3.1.2 Sorotipo infectante x sensibilidade dos testes NS1 ........................... 50

5.3.2 Testes para detecção de anticorpos IgM ................................................. 51

5.3.2.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes IgM .............. 52

5.3.3 Combinação de testes NS1 e IgM ........................................................... 53

6 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 54

7 CONCLUSÕES ................................................................................................... 59

8 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 60

APÊNDICE ................................................................................................................ 69

APÊNDICE A – Termo de Consentimento ......................................................... 69

APÊNDICE B – Ficha Clínica .............................................................................. 70

16

1 REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 Epidemiologia e Histórico

A febre do Dengue/Febre Hemorrágica do Dengue é uma doença febril aguda,

transmitida por mosquitos do gênero Aedes e causada por um dos quatro sorotipos

do vírus Dengue (DENV-1, 2, 3, e 4). O Dengue possui ampla distribuição mundial,

com predominância em regiões tropicais e subtropicais, determinada pela

distribuição do seu principal vetor, o Aedes aegypti. A doença é mais prevalente em

áreas urbanas e suburbanas, e nas últimas décadas, tornou-se um grave problema

de saúde pública mundial. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde considera

a dengue como a mais importante doença viral transmitida por mosquitos e estima-

se que 50 milhões de novas infecções ocorram a cada ano no mundo. Nos últimos

50 anos, sua incidência aumentou 30 vezes e hoje aproximadamente dois terços da

população mundial encontram-se sob o risco de adquirir a doença (WHO, 2009).

Nas Américas, o Cone Sul, representado por Argentina, Brasil, Chile, Paraguai e

Uruguai, é responsável por mais da metade das notificações da doença desde a

década de 90, sendo o Brasil responsável por 63% desses casos desde 2000 (San

Martin et al., 2010).

Existem registros, datados do ano 992, de descrições clínicas de uma síndrome

febril similar à febre do dengue, na China (Kyle; Harris, 2008). No final do século

XVIII epidemias de uma doença com manifestações semelhantes também foram

descritas quase simultaneamente em Jakarta (Indonésia), Cairo (Egito) e na

Filadélfia (EUA) (Gubler et al., 2007).

Até próximo da virada do século XX pouco era sabido sobre a etiologia e a

transmissão da doença. Sua etiologia viral foi sugerida experimentalmente no início

do século XX, em estudos conduzidos por militares norte americanos em regiões de

conflito, onde a doença era um grande problema não só de saúde pública mas

também militar. Esses experimentos foram motivados pelo sucesso de estudos

anteriores sobre a etiologia e epidemiologia da febre amarela, realizados por Walter

Reed em Cuba, e foram conduzidos por dois jovens militares do corpo de saúde do

17

exército americano: o capitão P.M. Ashburn e o tenente Charles F. Craig. Enviados

às Filipinas para estudar a doença, os militares iniciaram as investigações através

de uma série de experimentos envolvendo voluntários do exército dos EUA. Durante

os estudos, no verão de 1906, correu uma epidemia de FD no Forte William

McKinley, onde foram registrados 800 casos da doença, dos quais eles conseguiram

estudar 128. Baseados no estudo destes casos, os pesquisadores concluíram que:

a doença era causada por um agente não filtrável, que mais tarde confirmou-se ser

um vírus; que os parâmetros hematológicos dos doentes eram normais à exceção

de leucopenia; que alguns indivíduos não se infectavam, sugerindo a presença de

imunidade; que o período de incubação era de 3,5 dias, em média, e que a doença

não era contagiosa. Ashburn e Craig tentaram também comprovar a hipótese de

transmissão vetorial por mosquitos, cogitada à época por outros pesquisadores,

expondo quatro voluntários a mosquitos alimentados previamente em pacientes com

a doença. Os pesquisadores concluíram que os seus resultados reforçavam a

hipótese de transmissão vetorial, apesar da ausência de evidencia científica do

experimento, uma vez que utilizaram a espécie vetora errada (Culex fatigans

atualmente Culex quinquefasciatus) além de um curto período de incubação

extrínseca – apenas um dia (Ashburn; Craig 2004).

Os avanços tecnológicos ocorridos durante a II Guerra Mundial permitiram que

pesquisadores japoneses, Kimura e Hotta, e americanos, Sabin e Shlesinger,

isolassem pela primeira vez os sorotipos DENV-1 e DENV-2 (Kimura; Hotta, 1944;

Sabin; Schlesinger, 1945). Mais tarde, a existência destes dois sorotipos foi

confirmada através de testes de inibição da hemaglutinação e de estudos sobre

proteção cruzada em voluntários (Sabin, 1952). Os sorotipos 3 e 4 foram isolados

posteriormente, em 1956 nas Filipinas (Hammon et al., 1960). A partir desta época,

surgiram iniciativas para o desenvolvimento não só de uma vacina para a doença

como testes laboratoriais para o seu diagnóstico (Sabin,1952).

Também foi a partir da Segunda Guerra Mundial que a expansão geográfica da

doença tomou impulso, causado principalmente pela modernização dos meios de

transportes e, mais recentemente, pelo crescimento urbano desordenado,

disseminando assim o vírus e o vetor para novas regiões. O resultado foi um

dramático aumento da frequência e da magnitude das epidemias, tornando a doença

18

hiperendêmica na maioria dos centros urbanos do mundo. No sudeste asiático

surgiram as primeiras epidemias de casos graves da doença, febre hemorrágica do

Dengue (FHD), registrados em Manila, em 1956 (Hammon et al., 1960). A

implementação de programas de erradicação do Ae. aegypti a partir da década de

20, permitiu a eliminação do vetor na maioria dos países da América Central e do

Sul. Apesar de ter sido incialmente uma campanha de sucesso, a partir da década

de 50 não foi possível manter a vigilância entomológica e a estrutura de combate ao

vetor em vários países. O resultado foi a reintrodução do vetor em diversos países

do continente e a ocorrência de novas epidemias que evoluíram para epidemias de

FHD nas décadas de 80 e 90 (Pinheiro; Corber,1997; Rigau-Perez et al., 1998).

No Brasil os primeiros relatos de epidemias de dengue datam do século XIX (Rego,

1872; Reis, 1896; Pedro, 1923), porém os primeiros casos confirmados através de

isolamento viral, ocorreram em 1981 em Boa Vista, Roraima, onde foram

identificados os sorotipos 1 e 4 (Osanai et al., 1983). Esta epidemia ficou restrita ao

norte do país e somente após cinco anos, em 1986, o sorotipo 1 disseminou-se pelo

território nacional a partir de sua introdução no Rio de Janeiro (Teixeira et al., 2005).

Registros da doença causados pelo sorotipo 4 só ocorreriam duas décadas após,

em Manaus (Figueiredo et al., 2008).

Provavelmente, a razão para a ausência de surtos de dengue no Brasil entre a

década de 20 e 80 deve-se a campanha de erradicação do Aedes aegipty no país,

que se iniciou a partir de 1902 com Osvaldo Cruz lutando contra a febre amarela. A

partir de 1930, com apoio da Fundação Rockefeller, a campanha de erradição do

vetor foi intensificada. Em 1947, a Organização Pan Americana da Saúde e a

Organização Mundial da Saúde decidiram coordenar a erradicação do Ae. aegypti

no continente. O Brasil participou dessa campanha e teve êxito. Em 1976,

entretanto, o Ae. aegypti retornou ao Brasil em função de falhas na vigilância

epidemiológica e de mudanças sociais e ambientais decorrentes da urbanização

acelerada dessa época. Foram confirmadas reinfestações, e desde então, o

Ministério da Saúde tem implementado programas de controle (Braga e Valle, 2007).

Em 1990 o sorotipo 2 surgiu no Rio de Janeiro, produzindo uma grande epidemia no

estado que se espalhou rapidamente para a região sudeste. No ano de 1998 a

19

epidemia adquiriu grandes proporções com aumento exponencial do número de

casos chegando a 500.000 notificações. Uma grande expansão territorial da

circulação viral foi caracterizada neste período. Em 1999 houve um importante

declínio da incidência, possivelmente devido a redução do número de indivíduos

susceptíveis aos sorotipos circulantes nas áreas afetadas e, de certo modo, também

a medidas de controle vetorial adotadas. Entretanto, a dengue se espalhou para

outras áreas do país, especialmente a região Norte, que nos anos seguintes

demonstrou as mais altas incidências (Teixeira et al., 2005).

No final de 2000 foi confirmado pela primeira vez no Brasil o isolamento do sorotipo

3 na cidade do Rio de Janeiro, que vivenciou uma grande epidemia em janeiro de

2001. Isso se repetiu nos dois anos subsequentes, expandindo-se em seguida para

inúmeras cidades de pequeno porte e estados da região Sul, considerados até então

livres da doença (Teixeira, et al. 2005).

Em 2008 o sorotipo 4 ressurgiu em Manaus, após um hiato de 22 anos (Figueiredo

et al., 2008). Em Julho de 2010, ele reemergiu em Boa Vista, Roraima (Temporão et

al., 2011), tendo sido detectado até o momento em todas a regiões do Brasil à

exceção da região centro oeste (SVS-MSb).

No Espírito Santo, a primeira epidemia de dengue ocorreu em 1995 e foi causada

pelo sorotipo 2. Desde então as epidemias se sucederam, sendo a de maior vulto a

de 1998, causada pelo sorotipo 1, com 39.216 casos notificados. O sorotipo 3 foi

introduzido em 2000 causando importantes epidemias até 2003. A partir 2009 o

sorotipo 1 voltou a recircular, sendo o responsável por grande parte dos casos

notificados nos anos subsequentes (SVS-MSa). Em abril de 2012 os primeiros

casos autóctones do sorotipo 4 foram descritos na região metropolitana de Vitória

(comunicação pessoal LACEN/ES)

20

1.2 O Vírus Dengue

Os vírus Dengue (DENV) compreendem quatro sorotipos distintos: DENV-1, 2, 3 e 4,

e em cada sorotipo são descritos genotipos distintos: cinco no DENV-1, cinco no

DENV-2, quatro no DENV-3 e quatro no DENV-4 (Weaver; Vasilakis, 2009). Esses

vírus pertencem à família Flaviviridae, do latim "flavus” que significa “amarelo”, em

referência ao vírus da Febre Amarela. Nessa família ainda estão incluídos outros

vírus como: o vírus do Oeste do Nilo (WNV) e o vírus da Encefalite Japonesa (JEV).

Os Flavivirus são envelopados com aproximadamente 50nm de diâmetro,

compostos por uma bicamada lipídica com glicoproteínas de envelope (E)

circundando o nucleocapsídeo, que é formado por uma fita simples de RNA de

polaridade positiva, complexada com múltiplas cópias de uma proteína de capsídeo

(C). O genoma viral possui aproximadamente 11.000 pares de base e sua tradução

produz uma única e longa poliproteína de mais de 3.000 aminoácidos. Uma

combinação de proteases celulares e virais cliva essa poliproteína produzindo dez

proteínas: três estruturais e sete não estruturais (Gubler et al., 2007).

Figura 1 – Representação do genoma do vírus Dengue. O genoma viral codifica 3 proteínas

estruturais (capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E)) e sete não proteínas não estruturais

(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e N55). UTR = Região não traduzida Fonte:

Fonte: Guzman et al., 2010a

21

1.2.1 Proteínas Estruturais

O genoma dos vírus Dengue codifica três proteínas estruturais: capsídeo (C),

membrana (M) e envelope (E). A glicoproteína de envelope (E) possui

aproximadamente 53kDa e é a principal proteína da superfície do vírion, medeia a

ligação aos receptores, promove a fusão da membrana e é o maior determinante

antigênico nas partículas virais. A proteína C é o primeiro polipeptídeo viral a ser

sintetizado durante a tradução. É uma proteína de aproximadamente 11kDa,

altamente básica, o que lhe permite interagir com o RNA viral (Henchal;

Putnak,1990). A proteína de membrana (M) possui uma proteína precursora (PrM)

que é clivada por proteases do complexo de Golgi. Sua principal função é impedir

que a proteína E sofra rearranjo durante a conversão de partículas virais imaturas

em vírions maduros. A proteína PrM pode também elicitar a resposta de anticorpos

neutralizantes (Kaufman et al., 1989; Falconar,1999; Vazquez et al., 2002)

1.2.2 Proteínas não estruturais

Além das três proteínas estruturais previamente descritas, o genoma do vírus

dengue produz sete proteínas não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,

NS4B e N55. A glicoproteína NS1 possui aproximadamente 50kDa e é expressa

pelas células infectadas de mamíferos sob duas formas: a forma associada à

membrana (mNS1) e a secretada (sNS1) (Flamand et al., 1999). A NS1 secretada

pode ativar diretamente fatores do sistema complemento e parece ter importância na

progressão da doença (Kurosu et al., 2007). Demonstrou-se que a NS1 está

presente em altas concentrações no soro de pacientes infectados pelo vírus Dengue

no início da infecção (Young et al., 2000), o que possibilitou sua utilização em testes

diagnósticos na fase aguda da doença.

A proteína NS2A é hidrofóbica e relativamente pequena (22kDa) atuando

provavelmente na replicação do RNA e montagem viral. A NS2B é uma proteína

pequena, de aproximadamente 14kDa, associada à membrana. NS2B forma um

complexo estável com NS3 e atua como cofator da serino proteinase NS2B-NS3.

22

A NS3 é uma proteína grande (aproximadamente 70kDa) multifuncional contendo

funções helicase e protease, necessárias para o processamento da poliproteína e

replicação do RNA (Harris et al., 2006).

A proteína NS4A tem sido relacionada à alteração das membranas intracelulares do

hospedeiro mas este mecanismo ainda é desconhecido (Miller et al., 2007).

A NS4B tem papel na replicação viral inibindo a sinalização de interferon (INF),

sugerindo importância na patogênese da doença. NS4A e, em menor grau, NS2A

parecem também bloquear a sinalização de INF (Munoz-Jordan et al., 2003).

A NS5 é uma proteína grande (104kDa), altamente conservada entre os sorotipos do

DENV, com atividades metiltransferase (MTase) e RNA polimerase RNA-

dependente. Outros papéis da NS5, além da participação na replicação viral tem

sido levantados como p.ex. a indução da produção de IL-8, que contribui para a

disseminação viral através do recrutamento de células inflamatórias para o local da

infecção (Medin et al., 2005).

1.3 Patogênese da Dengue e Resposta Imune

O vírus Dengue é transmitido pela picada de mosquitos fêmeas do gênero Aedes,

principalmente Aedes aegypti. Após a inoculação, o vírus infecta as células

dendríticas da pele e queratinócitos. As células dendríticas infectadas migram do

sítio de infecção para os linfonodos, onde monócitos e macrófagos são recrutados e

se tornam alvos de infecção. Consequentemente, a infecção é amplificada com a

disseminação do vírus, atingindo diversas células da linhagem mononuclear, que

passam a produzir mediadores envolvidos na resposta inflamatória e hemostática do

hospedeiro (Martina et al., 2009).

Quanto à resposta imune adaptativa do hospedeiro, dois padrões podem ser

observados nas infeções pelo Dengue: a) a de indivíduos primo infectados, e

portanto sem anticorpos prévios – o que denomina-se infecção primária – e b) a de

23

indivíduos que possuem anticorpos prévios, provenientes de uma infecção anterior

por um sorotipo distinto – denominada infecção secundária.

A primeira situação (a) é caracterizada por um aumento gradativo e lento dos níveis

de anticorpos específicos. Os anticorpos IgM são o primeiro isotipo a aparecer e

tornam-se detectáveis, na grande maioria dos pacientes, entre o sétimo e décimo dia

após o início dos sintomas. Os níveis desses anticorpos atingem o pico

aproximadamente duas semanas após do início dos sintomas, permanecendo

detectáveis pelos próximos dois a três meses. Os anticorpos IgG geralmente surgem

no final da primeira semana de doença e permanecem detectáveis por anos e

possivelmente pelo resto da vida (Chanama et al., 2004; Schilling et al., 2004).

Na segunda situação (b), quando o indivíduo já teve infecção prévia por um sorotipo

diferente, os títulos de anticorpos IgG aumentam rapidamente. A resposta de

anticorpos IgM é geralmente mais lenta, menor, podendo até ser não detectável, e

persiste por um período mais curto do que nas infecções primárias. Nas infecções

secundárias os anticorpos IgG predominam, podendo ser detectados já nos

primeiros dias da doença (Schilling et al., 2004; Gubler et al., 2007).

Os anticorpos do tipo IgA também estão presentes na dengue e sua meia vida de

detecção é similar à da IgM (Groen et al., 1999).

A resposta imune adaptativa ao DENV contribui para a resolução da infecção e

desempenha papel de proteção duradoura contra uma nova infecção pelo mesmo

sorotipo, e proteção cruzada temporária, de aproximadamente dois meses, para os

outros sorotipos (Sabin,1952). Por outro lado, estes anticorpos podem contribuir

para o desenvolvimento de formas graves da doença. Halstead et al. mostraram

que uma nova infecção, em indivíduos com anticorpos prévios contra um sorotipo

distinto, aumenta o risco de desenvolvimento de FHD, fenômeno que denominaram

de ADE (antibody dependent enhancement) (Halstead et al., 1970; Halstead et al,.

1973; Halstead; O'Rourke, 1977a; Halstead; O'Rourke,1977b). Estes anticorpos

preexistentes em níveis subneutralizantes, se ligariam ao vírus, formando um

complexo antígeno-anticorpo, que por sua vez se ligaria a membranas dos

leucócitos, especialmente macrófagos, através de receptores Fc, facilitando a

internalização dos vírus na célula com consequente aumento da replicação viral.

24

Esta teoria explicaria também o risco aumentado de FHD em crianças até o primeiro

ano de vida, nascidos de mães com infecções prévias por um sorotipo distinto

(Sangkawibha et al., 1984; Kliks et al., 1988).

A patogênese da infecção pelos vírus do Dengue e principalmente os fatores

determinantes para o desenvolvimento da FHD e Síndrome do Choque do Dengue

(SCD) ainda não estão completamente elucidados. Algumas linhas de pesquisa

incluem, como já mencionado, os estudos relacionados à ADE, à ativação do

complemento (Avirutnan et al., 2011), aos anticorpos anti-plaquetários (Lin et al.,

2001) e à produção de citocinas (Bethell et al., 1998). Também tem sido estudados

os fatores inerentes ao vírus, na tentativa de relacionar determinados sorotipos ou

genotipos à maior gravidade da doença (Leitmeyer et al., 1999). Além dos fatores já

citados, a genética do hospedeiro pode também estar relacionada ao

desenvolvimento de gravidade na doença. Um exemplo é o polimorfismo do gene do

HLA, que parece estar relacionado à susceptibilidade do hospedeiro em desenvolver

as formas mais graves da infecção (Nguyen et al., 2008).

1.4 Manifestações Clínicas

A infecção pelo vírus Dengue apresenta um espectro clínico que pode variar desde

formas assintomáticas, oligossintomáticas, formas clássicas da doença (Febre do

Dengue), até suas formas mais graves: Febre Hemorrágica do Dengue e Síndrome

do Choque do Dengue (WHO, 2009) .

A doença se inicia após um período de incubação de aproximadamente quatro a

sete dias, com febre, mialgia, artralgias, cefaléia e dor retroorbital. Outros sintomas

podem surgir no decorrer da doença como náuseas, vômitos, diarreia e rash cutâneo

(Gubler, 1998). A infecção é autolimitada com duração aproximada de sete dias,

quando ocorre defervescência e regressão dos sintomas. Neste momento, é

importante que haja monitoramento dos sinais de alerta pois, apesar de a maioria

dos pacientes se recuperar, uma pequena porcentagem evolui para formas graves

da doença. Nesta situação, se o paciente não for tratado de forma adequada, pode

25

evoluir para o choque hipovolêmico, com ou sem hemorragia, em consequência da

alteração da permeabilidade vascular que se instala (WHO, 2009).

Distinguir clinicamente a dengue de outras doenças febris durante a fase precoce da

doença não é tarefa simples. Até o momento não há um algoritmo para o seu

diagnóstico diferencial que possa ser aplicado em todas as áreas endêmicas do

mundo. Isto se deve à inespecificidade dos sinais e sintomas, das alterações

laboratoriais e à diversidade de doenças endêmicas presentes, daí a importância de

métodos diagnósticos rápidos, confiáveis e acessíveis para utilização na rotina

diagnóstica do Dengue (Potts; Rothman, 2008).

1.5 Métodos Diagnósticos

Até a década de 70 os testes sorológicos empregados para o diagnóstico da dengue

eram os testes de inibição da hemaglutinação (HI), fixação do complemento (CF) e

teste de neutralização (Halstead, 1965). A partir daí, o desenvolvimento da técnica

de ELISA nos anos 70 (Engvall e Perlmann 1971; Van Weemen e Schuurs, 1971), e

o advento da biologia molecular na década de 80 (Mullis et al., 1986), foram

fundamentais para o avanço não só no diagnóstico laboratorial da dengue, mas para

o diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas em geral.

Atualmente, técnicas mais aprimoradas para detecção de anticorpos, detecção de

vírus ou de suas subunidades estão sendo combinados com técnicas ainda mais

modernas e automatizadas a fim de tornar o diagnóstico cada vez mais preciso e

rápido.

Hoje as técnicas disponíveis para o diagnóstico do dengue incluem: isolamento e

detecção do vírus, detecção do RNA viral, detecção de antígenos ou anticorpos, ou

uma combinação destas. Estes devem ser utilizadas levando-se em consideração a

cronologia da infecção. A seguir faremos um breve resumo das metodologias

utilizadas para o diagnóstico do dengue.

26

1.5.1 Isolamento Viral

A inoculação de espécimes clínicos (soro, plasma ou lisado de células

mononucleares) em linhagens celulares de mosquitos Aedes albopictus (C6/36),

seguido de uma reação de imunofluorescência indireta sorotipo específica, é o

método mais utilizado para o isolamento viral (Gubler et al., 1984). O isolamento

também pode ser realizado através de inoculação direta destes espécimes em

mosquitos ou larvas de Toxorhynchites spp (Tesh, 1979).

A detecção do vírus através do isolamento viral é considerado diagnóstico definitivo,

porém aspectos práticos limitam seu uso: primeiro, o alto custo de manutenção do

laboratório e de pessoal capacitado e segundo, o breve período de viremia no qual o

vírus pode ser recuperado com sucesso e, terceiro a termolabilidade do vírus, que

deve ser levada em consideração nos procedimentos de coleta, transporte e

armazenamento das amostras a serem testadas.

1.5.2 RT-PCR (convencional e real time)

Desde os anos 90, diferentes protocolos de RT-PCR tem sido desenvolvidos e

aplicados pra a pesquisa e diagnóstico de dengue. Os ensaios que envolvem a

amplificação e detecção do RNA viral envolvem três etapas básicas: extração e

purificação do ácido nucleico, conversão do RNA em cDNA e amplificação, e

detecção e caracterização do produto amplificado. Ainda, pode ser realizada uma

segunda etapa de amplificação, utilizando-se simultaneamente os iniciadores

sorotipo-específicos para identificação dos quatro sorotipos virais, chamada Nested

PCR. O produto das reações é separado por eletroforese em um gel de agarose e

visualizado como bandas. Os diferentes sorotipos são identificados pelos pesos

moleculares das bandas características (Lanciotti et al., 1992).

A alta sensibilidade e especificidade fazem dessa metodologia uma ferramenta

importante na confirmação do diagnóstico do dengue. Em comparação ao

isolamento viral, a PCR demonstra sensibilidade variando entre 93% a 100% entre

27

os quatro sorotipos (Lanciotti et al., 1992). Resultados falso positivos podem ocorrer

devido a contaminação secundária à manipulação de produtos de amplificação de

outras reações ou amostras, quando as boas práticas de laboratório não são

respeitadas (WHO, 2009).

Mais recentemente, a metodologia de RT-PCR em tempo real vem gradualmente

substituindo a PCR convencional para o diagnóstico de dengue em amostras de fase

aguda. Essa metodologia possui como vantagens em relação à metodologia

convencional, sua maior rapidez, possibilidade de quantificação do RNA viral, menor

possibilidade de contaminação e maior sensibilidade (Shu; Huang, 2004). A RT-PCR

em tempo real é um ensaio realizado em etapa única utilizando iniciadores e sondas

fluorescentes específicas para cada sorotipo do vírus. A utilização de uma sonda

fluorescente permite a detecção dos produtos de reação em tempo real através de

um equipamento específico, sem a necessidade de utilização de eletroforese em gel

de agarose (WHO, 2009).

1.5.3 Detecção de antígeno NS1

Muitos estudos tem sido direcionados para a utilização do antígeno NS1 do vírus

Dengue no diagnóstico precoce da doença. Em 2000, Young e colaboradores

descreveram o desenvolvimento de um ELISA de captura cujo alvo era a proteína

NS1 do vírus Dengue. A proteína se mostrava presente em altos níveis no soro de

pacientes na fase aguda da doença e sua utilização para diagnóstico precoce da

doença parecia promissora (Young et al., 2000). Atualmente, diversos kits que

utilizam esse princípio estão comercialmente disponíveis e estudos vem

demonstrando que sua sensibilidade e especificidade podem variar entre 52% e

84% e entre 90% e 100%, respectivamente (Dussart et al., 2008; Lapphra et al.,

2008; McBride, 2009; Guzman et al., 2010b; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al.,

2010).

Na tentativa de facilitar e agilizar o diagnóstico laboratorial os testes

imunocromatográficos, que também utilizam como alvo a proteína NS1, tem se

tornado uma alternativa rápida, barata e prática.

28

O desenvolvimento de testes rápidos utilizando técnicas de imunocromatografia tem

proporcionado a possibilidade para um diagnóstico a beira do leito. Entretanto, a

acurácia desses testes é questionada, pois geralmente está abaixo do que afirmam

seus fabricantes.

Inúmeros testes rápidos se encontram disponíveis e diversos estudos sido

conduzidos a fim de avaliar seu real desempenho para a adequada aplicação na

prática clinica. Sabe-se que sensibilidade dos testes rápidos para detecção de

antígeno NS1 pode variar bastante, desde 41% a 89%. A especificidade é alta,

ficando geralmente próximo a 100% e não sendo menor que 90% (Dussart et al.,

2008; Hang et al., 2009; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al., 2010; Najioullah et al.,

2011). Atualmente o Ministério da Saúde disponibiliza kits de teste NS1 ELISA para

triagem das amostras para isolamento viral em unidades sentinelas. Para a

realização desse teste as amostras devem ser coletadas até o quinto dia do início

dos sintomas, do contrário realiza-se a pesquisa de anticorpos (Brasil, 2010).

A detecção de antígenos virais também pode ser realizada através da técnica de

imunohistoquímica, em material obtido post mortem. Esse método permite a

detecção de antígenos em cortes de tecidos fixados em formalina e processados em

parafina, marcados com anticorpos específicos conjugados com fosfatase alcalina

ou peroxidase. A imunohistoquímica é bastante sensível e específica e deve ser

utilizada após o diagnóstico histopatológico presuntivo (Brasil, 2010).

1.5.4 Detecção de Anticorpos

Os estudos conduzidos durante a Segunda Guerra Mundial demonstraram que a

imunidade ao DENV estava associada a anticorpos neutralizantes e que esses

também poderiam ser utilizados para fins diagnósticos e epidemiológicos

(Sabin,1952). Entre as metodologias utilizando a detecção de anticorpos específicos,

estão: testes de inibição da hemaglutinação (HI), fixação do complemento (CF),

ensaios imunoenzimáticos (ELISA), testes imunocromatográficos, e testes de

29

neutralização.

Por muitos anos HI foi o método padrão para o diagnóstico de dengue. O princípio

do método consiste na capacidade dos anticorpos específicos para dengue,

presentes em amostra de soro, inibirem a aglutinação de eritrócitos. Realiza-se uma

comparação entre os títulos obtidos em amostra de soros coletados na fase aguda e

convalescente da doença. As principais desvantagens do método são a falta de

especificidade, necessidade de amostras pareadas (amostra de fase aguda e de

convalescença) e a incapacidade de distinção do sorotipo viral infectante (De Paula;

Fonseca, 2004).

Durante algum tempo, o teste de fixação do complemento foi considerado um dos

mais importantes no sorodiagnóstico. Atualmente tem pouca aplicação clínica e não

é utilizado na rotina laboratorial para o diagnóstico de dengue. É de difícil execução,

requerendo pessoal treinado para a obtenção de bons resultados. É baseado no

princípio que se houver anticorpos específicos para o DENV, esses irão se

complexar com antígenos, ativando a cascata e consumindo o complemento. Numa

segunda etapa mede-se a atividade hemolítica do complemento remanescente,

permitindo determinar e quantificar a presença de anticorpos na amostra inicial

(Gubler, 1998; Sanchez, 2001).

Ao final da década de 70 a metodologia de ELISA foi aplicada para o diagnóstico do

dengue. Essa metodologia oferecia diversas vantagens sobre as técnicas

sorológicas até então utilizadas: uma maior sensibilidade, a utilização direta do soro,

e a possibilidade de diagnóstico utilizando apenas uma amostra de soro, enquanto

para a HI, por exemplo, havia necessidade de comparação entre amostras pareadas

(Dittmar et al., 1979).

Atualmente, para o diagnóstico de dengue através da detecção de anticorpos, estão

comercialmente disponíveis inúmeros ELISA e testes imunocromatográficos. No

Brasil, o método ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA) é o método de escolha para

a confirmação laboratorial na rotina (Brasil, 2010). Nesse ensaio, o IgM total

presente no soro do paciente é capturado por anticorpos específicos imobilizados na

microplaca. É então adicionado uma solução de antígenos específicos proveniente

30

dos quatro sorotipos, ligados a anticorpos marcados com enzima, que forma um

“sanduíche”, caso haja a presença de anticorpos específicos anti-vírus Dengue.

Nesse caso, em presença de substrato, há formação de produto colorido cuja

densidade óptica é medida em espectrofotômetro e posteriormente avaliada em

relação a um valor de cut off determinado. Uma das desvantagens do método é que

um resultado negativo obtido em amostra de soro coletada em fase recente da

doença não exclui o diagnóstico de dengue, uma vez que, em alguns casos, os

níveis de IgM tornam-se detectáveis pelo teste somente após 10 dias. Então para a

confirmação do diagnóstico pode ser necessário uma nova coleta de soro do

paciente (Brasil, 2010).

O ensaio de neutralização em placa (PRNT) é o teste sorológico mais específico

para os flavivirus, e é sorotipo específico para os quatro vírus Dengue. O PRNT foi

primeiramente descrito nos anos 50 e depois adaptado para o DENV (Russell et al.,

1967). O principio básico desse ensaio é permitir que ocorra a interação vírus-

anticorpo em um tubo ou placa de microtitulação, e então avaliar a infecção viral

após o plaqueamento dessa mistura em células susceptíveis. Quanto maior a

presença de anticorpos sorotipo específicos, maior a capacidade neutralizante, e

menor é a infecção do vírus nas células. O PRNT é atualmente o teste laboratorial

padrão para avaliação de anticorpos neutralizantes, sendo utilizado para avaliação

de níveis de proteção (WHO, 2007).

31

2 JUSTIFICATIVA

Como ainda não há vacina nem drogas específicas para prevenção e tratamento da

dengue, a abordagem médica visa basicamente o tratamento dos sintomas e a

prevenção das possíveis complicações (Brasil, 2008). O manejo clínico é

relativamente simples, de baixo custo e efetivo na prevenção das complicações,

incluindo morte, desde que sejam instituídos corretamente e a tempo.

A infecção pelo DENV pode apresentar um amplo espectro de sintomas, muitos

deles inespecíficos, o que dificulta o seu diagnóstico clínico. Assim, a confirmação

laboratorial da doença, através de testes específicos e de rápida execução, pode

auxiliar na rotina da prática clínica e agilizar ações de controle. O diagnóstico

laboratorial pode envolver técnicas baseadas na detecção do vírus, do genoma viral,

de antígenos, anticorpos ou uma combinação destas. A decisão sobre a utilização

das técnicas deve basear-se na cronologia da infecção e nas condições laboratoriais

dos serviços de saúde .

Nós últimos anos, a expansão mundial da doença e a demanda por testes

diagnósticos rápidos, específicos e de execução simples, aumentaram o ritmo de

comercialização de novas plataformas diagnósticas. A validação e comparação do

desempenho destes testes é fundamental para sua implementação nos diversos

cenários clínicos, epidemiológicos e laboratoriais e é uma questão que só poderá ser

respondida através de pesquisas desenhadas para tal (TDR Diagnostics Evaluation

Expert Panel et al., 2010). Atualmente existem muitos testes disponíveis no mercado

e poucos estudos conduzidos no Brasil que avaliem seu desempenho. Além disso, a

maioria dos testes avaliados neste estudo ainda não possuem publicações que

relatem sua sensibilidade e especificidade.

32

3 OBJETIVOS

1. Avaliar a sensibilidade de quatro testes diagnósticos baseados na detecção

de NS1, sendo dois no formato imunocromatográfico e dois no formato

ELISA.

2. Avaliar a interferência da presença de anticorpos IgG na sensibilidade dos

testes para a detecção de NS1.

3. Avaliar a sensibilidade dos testes de detecção de NS1 para os diferentes

sorotipos do Dengue.

4. Avaliar a sensibilidade de três testes diagnósticos ELISA para detecção de

anticorpos IgM, em amostras de fase aguda e convalescente da doença.

33

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Desenho do Estudo

Do ponto de vista didático este estudo foi divido em duas etapas. Em um primeiro

momento foi realizada a obtenção de amostras de soro de pacientes com dengue.

Nessa etapa foram selecionados 158 pacientes com suspeita clínica de dengue dos

quais foram obtidas amostras de soro na fase aguda e 83 obtidas convalescente da

doença. Em um segundo momento, utilizando as amostras positivas para infecção,

avaliou-se a sensibilidade de sete testes diagnósticos.

4.2 Aspectos Éticos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da

Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, sob o número de registro: 100/09.

Todos os indivíduos incluídos no estudo foram previamente esclarecidos sobre o

mesmo e concordaram em participar, assinando o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (Apêndice A).

4.3 Obtenção de amostras

4.3.1 Pacientes

Foram incluídos na primeira etapa desse estudo 158 indivíduos com sinais e

sintomas de dengue, com até sete dias do início dos sintomas, que procuravam

atendimento em unidades de Pronto Atendimento do Sistema Único de Saúde dos

municípios de Vitória (São Pedro III), Serra (Serra Sede) e Vila Velha (Cobilândia). A

escolha de diferentes municípios teve por objetivo aumentar a chance de obtenção

dos diferentes sorotipos virais. A inclusão dos pacientes foi realizada em dois

34

momentos: entre os meses de maio e julho de 2009 (Vitória, Serra e Vila Velha) e

entre maio a agosto de 2010 (somente Vitória). Esses períodos corresponderam às

semanas epidemiológicas de 21 a 27 de 2009, e às semanas epidemiológicas 18 e

32 de 2010. A inclusão dos pacientes nesses dois períodos teve por objetivo otimizar

a captação dos pacientes em momentos de maior notificação da doença. Os

números de notificações por dengue nos dois períodos de inclusão pode ser

visualizado nos Gráficos 1 e 2.

Gráfico 1. Notificações por dengue de acordo com as semanas epidemiológicas em 2009 nos

Municípios de Vitoria, Serra e Vila Velha (Dados SESA).

35

Os pacientes com suspeita de dengue, atendidos nos Pronto Atendimentos dos

bairros acima mencionados, foram encaminhados para atendimento por um médico

infectologista, ou membro treinado, da equipe do estudo. Após assinatura do termo

de consentimento, um formulário foi preenchido com dados demográficos e clínicos

(Apêndice B), e se o paciente preenchesse os critérios de inclusão do estudo, uma

amostra de sangue periférico era coletada (amostra de fase aguda). O paciente era

então orientado a retornar após duas semanas para coleta de uma segunda amostra

(amostra fase convalescente). Todas as coletas de sangue foram realizadas em

tubos secos para soro de 10mL (Vacutainer™, BD). Após a coleta, as amostras

foram mantidas em caixas térmicas até o processamento. As amostras foram

centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos, sob refrigeração, em até 4 horas após a

coleta. O soro foi aliquotado em microtubos de polipropileno de 1,5 mL, livre de

RNAse, DNAse e pirógenos (Axygen, Inc.). As alíquotas foram armazenadas em

freezers -70°C e -20°C, para a posterior utilização nos testes.

Gráfico 2. Notificações por dengue durante as semanas epidemiológicas do ano de 2010 no

Município de Vitoria (Dados SESA).

36

4.3.1.1 Critérios de Inclusão

Para a inclusão dos pacientes foi utilizado o seguinte critério, baseado no critério de

“provável dengue” da OMS (WHO, 2009): presença de febre há até sete dias,

acompanhada de dois ou mais dos seguintes sintomas:

- dor de cabeça,

- mialgia e artralgias

- náusea, vômito ou diarreia

- rash cutâneo

- prova do laço positiva

Foram excluídos do estudo todos os sujeitos que, no momento da avaliação clínica,

apresentavam tosse, coriza ou outra infecção de etiologia claramente identificável

(otite, faringite, pneumonia, infecção urinária, etc.).

4.4 Caracterização das amostras positivas e do sorotipo infectante

Foram definidas como positivas as amostras de soro de fase aguda que

apresentaram resultado positivo para a detecção do genoma de qualquer um dos

sorotipos do vírus dengue através da metodologia de RT-PCR baseada no protocolo

descrito por Lanciotti et al. (Lanciotti et al., 1992).

O RT-PCR é uma metodologia bastante sensível quando aplicado na fase virêmica

da doença. Tal teste foi escolhido para utilização como teste de referência neste

trabalho devido às vantagens em relação ao isolamento viral, método considerado

“padrão ouro”. O isolamento viral quando comparado com métodos de biologia

molecular, na prática, possui desvantagens que influenciam diretamente em sua

sensibilidade. Como já mencionado, é breve o período no qual o vírus pode ser

recuperado com sucesso. Mais ainda, as condições de coleta, transporte e

armazenamento das amostras poderiam interferir diretamente na sensibilidade de

detecção do vírus através desse método. Tal fato foi também observado por nós

quando amostras de soro negativas no isolamento viral, provenientes do LACEN/ES,

37

foram positivas em nosso laboratório através da metodologia de RT-PCR (dados não

mostrados).

4.4.1 RT-PCR

4.4.1.1 Extração do RNA

O RNA viral foi extraído a partir de 140µL de soro utilizando o kit QIAamp® Viral

RNA Mini Kit (Qiagen, Germany) segundo as instruções do fabricante. O RNA

extraído foi imediatamente utilizado para a produção do DNA complementar (cDNA).

4.4.1.2 Síntese do cDNA

O cDNA foi sintetizado a partir de 5µL do RNA extraído e 15µL de um mix contendo

20mM de nucleotídeos (Promega), 20 picomol de primer D2 (Promega), 0,1M DTT

(Invitrogen), 40U de inibidor de RNAses RNAseout ™ (Invitrogen), 1,5U da enzima

RT-AMV (Invitrogen), 4 µL de tampão de hibridização (Invitrogen) e 4,9 µL de água

ultrapura (Gibco). A reaçao foi realizada em termociclador (Maxygene, Axygen)

programado para um ciclo de 42°C por 60 minutos.

4.4.1.3 Amplificação do DNA

Para amplificação do fragmento específico do genoma viral foi utilizado 1 µL do

cDNA obtido na reação anterior e 19 µL de um mix contendo: 2 µL de tampão

(Invitrogen), 3,0mM de MgCl2 (Invitrogen), 4mM de nucleotídeos (Promega), 10

picomol de iniciador D1 e D2, 1 U da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). A etapa

de amplificação foi realizada no mesmo termociclador, programado para 30 ciclos de

desnaturação (94°C, 35s), anelamento (56°C, 1min) e extensão (72°C, 2 min).

38

4.4.1.4 Tipagem do vírus Dengue (Semi Nested)

Uma segunda etapa de amplificação foi realizada a partir de 5µL do produto da

reação anterior, diluídos na proporção de 1:100, em água ultrapura. A 10µL do

produto dessa diluição foi adicionado 10µL de um mix contendo 2 µL de tampão

(Invitrogen), 3,0mM de MgCl2 (Invitrogen), 4mM de nucleotídeos (Promega), 10

picomol de iniciador D1, 10 picomol de cada iniciador sorotipo específico TS1, TS2,

TS3 e TS4, e 1U da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). Para essa etapa foram

programados 18 ciclos de desnaturação (94°C, 30 s), anelamento (55°C, 1 min) e

extensão (72°C, 2 min).

10 µL do produto da reação final foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2%

(BioAmerica). Após o final da eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo

de etídeo e visualizado em transiluminador (BioAmerica). As amostras foram

classificadas como positivas para algum dos sorotipos virais caso fosse visualizada

a banda de tamanho característico de cada sorotipo viral (Tabela 1).

Iniciador Sequência Tamanho do segmento

amplificado (pb)

D1 5'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3' 511

D2 5'-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3'

TS1 5'-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3' 482

TS2 5'-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3' 119

TS3 5'-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3' 290

TS4 5'-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3' 392

Tabela 1. Iniciadores utilizados para a tipagem do vírus Dengue.

39

4.5 Testes Diagnósticos

Foram avaliados os seguintes testes para o diagnóstico de dengue: Dengue NS1 Ag

Strip™ (Bio-Rad Laboratories), Dengue Duo™ (Bioeasy Diagnóstica), Platelia™

Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test™ (Bioeasy

Diagnóstica), DENV Detect™ IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA) (Inbios

International), Dengue IgM ELISA Test™ (Bioeasy Diagnóstica), Dengue IgM Capture

ELISA™ (PanBio). Dos sete testes avaliados, quatro baseavam-se na detecção do

antígeno viral NS1, e três baseavam-se na detecção de anticorpos IgM.

O teste Dengue IgM Capture ELISA (PanBio), foi executado pelo Laboratório Central

da Prefeitura Municipal de Vitória conforme as instruções do fabricante. Todos os

demais testes avaliados foram executados no laboratório do Núcleo de Doenças

Infecciosas, conforme as instruções fornecidas pelo fabricante e segundo as normas

de biossegurança. Todos esses testes foram gentilmente doados pelos fabricantes,

à exceção do teste Dengue NS1 Ag Strip™ (Bio-Rad Laboratories), adquirido do

distribuidor. Os testes baseados na detecção da NS1 foram realizados somente nas

amostras de soro de fase aguda. Os testes para pesquisa de anticorpos IgM foram

realizados nas amostras de soro pareadas, ou seja, nas amostra de fase aguda e

em suas respectivas amostras de convalescência.

4.5.1 Testes de detecção de NS1

4.5.1.1 Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)

É um teste imunocromatográfico qualitativo para detecção simultânea de antígeno

viral NS1 e anticorpos IgM e IgG para o DENV em amostra de soro, plasma ou

sangue total. Ao lado esquerdo do dispositivo encontra-se o teste para detecção de

antígeno NS1 e ao lado direto se encontra o teste para IgM e IgG para DENV. No

teste para detecção de NS1, foram adicionadas três gotas de soro e, no teste para

detecção de anticorpos, foram adicionados 10µL de soro e quatro gotas de tampão.

A interpretação dos resultados foi realizada entre 15 a 20 minutos após a aplicação

40

da amostra. A formação de uma linha visível na região C (controle) e T (teste)

indicou teste positivo para NS1. A visualização da linha na região C (controle) e das

linhas M e/ou G indicaram a presença de anticorpos IgM e/ou IgG para DENV.

4.5.1.2 Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories)

É um teste imunocromatográfico qualitativo, para detecção do antígeno viral NS1 em

plasma ou soro humano. É composto de um tampão de migração e uma tira de

nitrocelulose constituída de três zonas: uma zona de contato com a amostra; uma

zona de conjugado contendo partículas de ouro coloidal ligadas a anticorpos

monoclonais anti-NS1 e partículas de ouro coloidal ligadas a estreptavidina; e uma

zona da membrana, onde ocorre a reação. Essa última com duas linhas,

correspondentes à linha Teste, contendo anticorpos monoclonais anti-NS1, e a linha

Controle contendo biotina. Em um tubo de ensaio plástico adicionava-se 50µL de

soro e uma gota do tampão de migração. A tira Dengue NS1 Ag Strip com a

extremidade indicada, era colocada na posição vertical dentro do Tubo. A leitura da

reação era feita após 15 minutos. A presença de uma banda rosa na Linha Teste e

na Linha Controle indicou resultado positivo. O aparecimento somente da banda

Controle indicou resultado negativo.

Figura 2. Teste imunocromatográfico Dengue Duo (Bioeasy) apresentando resultado negativo para detecção de NS1 e de anticorpos IgM e IgG.

41

4.5.1.3 Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)

É um ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de antígeno NS1 em soro

humano. Em cada poço, foi adicionado 50µL de diluente de amostra. Foram

adicionados 50µL dos controles (três negativos e dois positivos) e 50µL de soro nos

respectivos poços. A microplaca placa foi incubada a 37°C por 60 minutos. Após a

incubação foi realizada as lavagens e adicionados 100µL de solução do conjugado,

incubando a 37°C por 60 minutos. Após as lavagens, foram adicionados 100µL de

substrato tetrametilbenzidina a cada poço, incubando a temperatura ambiente por 10

minutos. Foram adicionados 100µL de solução ácida de interrupção e a densidade

óptica foi obtida imediatamente em espectrofotômetro no comprimento de onda de

450nm com filtro de referência de 620nm. O ponto de corte foi calculado adicionando

o valor de 0,3 à média dos controles negativos. Se a amostra apresentasse o valor

de absorbância maior ou igual ao ponto de corte estabelecido, então foi considerada

positiva para presença de antígeno NS1.

4.5.1.4 PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories)

O teste PlateliaTM Dengue NS1 Ag é um método imunoenzimático, do tipo

“sanduiche,” em formato de microplaca, para detecção qualitativa ou semi

quantitativa do antígeno viral NS1 em soro ou plasma. Foi adicionado aos poços da

Figura 3. Teste imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad).

42

microplaca 50µL de solução diluente, e nos respectivos poços, 50µL de soro, 50µL

de cada controle e 50µL do calibrador. A cada poço foi adicionado 100µL de

conjugado diluído e incubado por 90 minutos a 37°C. Após a incubação foram

realizadas as lavagens e adicionado 160µL de uma solução cromógena, incubando

a temperatura ambiente por 30 minutos. A reação enzimática foi parada com a

adição de 100µL da solução ácida e em seguida procedida a leitura da densidade

óptica em espectrofotômetro (Molecular Devices) em comprimento de onda de

450nm com filtro de referência de 650nm. O resultado de cada amostra foi avaliado

através da comparação entre a densidade óptica obtida para a amostra e a

densidade óptica obtida para o calibrador. A razão das absorbâncias dos controles

foi utilizada para a validação dos testes. Para avaliar as amostras, se obtivessem

razão menor que 0.5 foram consideradas negativas. Amostras que obtiveram

resultado da razão entre 0.5 e 1 foram consideradas duvidosas. Amostras que

obtiveram razão maior que 1 foram consideradas positivas.

4.5.2 Testes de detecção de anticorpos IgM

4.5.2.1 Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)

Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgM para DENV em

soro humano. As amostras de soro dos pacientes e os controles fornecidos pelo

fabricante foram inicialmente diluídos em solução diluente fornecida no kit, na

proporção 1:100. Em seguida adicionou-se 100µL destas soluções nos respectivos

poços da microplaca, que era incubada a 37°C por 60 minutos. Após a incubação

procedeu-se a lavagem manual dos poços, aos quais adicionava-se 100µL de

solução conjugada (anti Dengue HRP + antígeno diluído). A placa era novamente

incubada a 37°C por 60 minutos. Após uma última lavagem, adicionou-se 100µL do

substrato TMB em cada poço. A placa foi então incubada a temperatura ambiente

por 10 minutos e em seguida adicionava-se 100µL de solução de ácido sulfúrico

1,6N para encerrar a reação enzimática. Procedeu-se então a leitura em

espectrofotômetro (Molecular Devices) a 450nm com filtro de referencia de 620nm.

O ponto de corte, sugerido pelo fabricante, foi calculado adicionando-se o valor de

43

0,3 à média do valor da leitura dos controles negativos. Valores maiores ou iguais ao

ponto de corte estabelecido, foram considerados positivos para a presença de IgM.

4.5.2.2 DENV Detect TM IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA)

(Inbios International)

DENV Detect MAC ELISA consiste num ensaio imunoenzimático do tipo sanduiche.

As amostras de soro e os controles, negativo e positivo, foram diluídos na proporção

1:100 em solução diluente. Posteriormente, 50µL dos soros e controles diluídos

foram adicionados na placa, em duplicata, e incubados a 37°C por 60 minutos. Após

a incubação, procedeu-se a lavagem e foram adicionados 50µL antígeno dengue

recombinante (Dengue RA) e Antígeno Normal Celular (NCA) separadamente, para

cada duplicada da amostra. A placa foi incubada a 37°C por 60 minutos, lavada, e

adicionado 50µL de anticorpo específico anti-Dengue RA marcado com peroxidase.

A placa foi novamente incubada a 37°C por 60 minutos e lavada. Após essa etapa,

foram adicionados 150µL de solução EnWash a cada poço e a placa foi incubada a

temperatura ambiente por 5 minutos. A placa foi novamente lavada, adicionado TMB

(tetrametilbenzidina) e incubada por 10 minutos em local escuro. Uma solução ácida

foi adicionada para parar a reação enzimática e a leitura da densidade óptica foi

realizada em espectofotômetro (Molecular Devices) a 450nm. O resultado para cada

amostra foi determinado através do cálculo da razão da absorbância entre o poço

que continha o Dengue RA e o poço NCA correspondente.

4.5.2.3 Dengue IgM Capture ELISA (PanBio)

É um ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgM para o

DENV em soro humano. Para realização desse teste, as amostras de soro do estudo

foram enviadas, congeladas, para o Laboratório Central da Prefeitura Municipal de

Vitória, onde o teste foi executado conforme as instruções do fabricante. Foram

diluídos, na proporção 1:100, em solução diluente, os controles positivo e negativo, o

calibrador e as amostras de soro. Paralelamente foi preparada a solução conjugada

antígeno-anticorpo marcado com enzima, adicionando 30µL do antígeno a 7,5mL do

diluente do antígeno e posteriormente foi adicionado igual volume do anticorpo

44

monoclonal marcado com peroxidase. A solução foi incubada por 60 minutos a

temperatura ambiente e reservada. À placa do teste foi adicionado 100µL das

amostras, controles e calibrador diluídos. A placa foi coberta e incubada a 37°C por

60 minutos. Procedeu-se a lavagem da placa e foram adicionados 100µL da solução

antígeno-anticorpo previamente preparada por poço. A placa foi coberta e incubada

a 37°C por 60 minutos. Após a incubação a placa foi lavada e a cada poço foi

adicionado 100µL de substrato TMB. A placa foi incubada por a temperatura

ambiente por 10 minutos. A reação enzimática foi interrompida adicionando-se

100µL da solução ácida de interrupção. A leitura foi efetuada em espectrofotômetro

em comprimento de onda de 450nm com filtro de referência de 650nm. O valor de

corte foi calculado utilizando a média das triplicatas do calibrador multiplicada pelo

fator de calibração (específico de cada lote e detalhado na folha de especificações

do teste). O valor indexador foi calculado dividindo a absorbância da amostra pelo

valor de corte calculado anteriormente. Se o valor do indexador obtido foi menor que

0,9, então o resultado da amostra foi considerado negativo. Se o valor do indexador

obtido foi entre 0,9 e 1,1, o resultado da amostra foi considerado duvidoso. Se o

valor do indexador obtido foi maior que 1,1 então o resultado foi considerado

positivo.

Nesse estudo a especificidade dos testes não foi avaliada. Não foi possível a

obtenção de um painel de soros de fase aguda de doenças caudadas por outros

flavivírus que poderiam apresentar reações cruzadas como: febre amarela,

chikungunya, vírus da febre do oeste do Nilo, Ilhéus, Rocio, vírus da encefalite de

Saint Louis, entre outros.

4.6 Pesquisa de anticorpos IgG

Com o objetivo de avaliar a interferência da presença de anticorpos IgG na

sensibilidade dos testes para detecção do antígeno NS1, e nos testes de IgM em

fase convalescente, foi realizado o teste Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy

Diagnóstica) nas amostras de fase aguda.

45

4.6.1 Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)

Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgG para o DENV

em soro humano. As amostras de soro dos pacientes e os controles fornecidos pelo

fabricante foram inicialmente diluídos em solução diluente fornecida no kit, na

proporção 1:100. Em seguida adicionava-se 100µL destas soluções nos respectivos

poços da microplaca, que era incubada a 37°C por 60 minutos. Após este período

de incubação procedeu-se a lavagem manual dos poços, aos quais adicionava-se

100µL de solução de conjugado. A placa foi novamente incubada a 37°C por 60

minutos. Após uma última lavagem, adicionou-se 100µL do substrato

tetrametilbenzidina (TMB) em cada poço. A placa foi então incubada a temperatura

ambiente por 10 minutos e em seguida adicionou-se 100µL de solução de

interrupção para encerrar a reação enzimática. Procedeu-se então a leitura em

espectrofotômetro (Molecular Devices) a 450nm com filtro de referencia de 620nm.

O ponto de corte, sugerido pelo fabricante, foi calculado adicionando-se o valor de

0,3 à média do valor da leitura dos controles negativos. Valores maiores ou iguais

ao ponto de corte estabelecido, foram considerados positivos para a presença de

IgG.

4.7 Análise Estatística

Os dados clínicos e resultados os testes diagnósticos foram incluídos em tabelas

utilizando o programa Microsoft Excel. Os cálculos estatísticos foram realizados

através do Teste Qui-quadrado e exato de Fisher utilizando o programa GraphPad

Prism, versão 5.0, assumindo significância estatística α<0,05. A sensibilidade foi

definida como: número de testes positivos/número de amostras positivas.

46

5 RESULTADOS

5.1 Obtenção de amostras de soro

De um total de 225 pacientes triados, 158 indivíduos preencheram os critérios de

inclusão e foram incluídos no estudo. A média da idade dos indivíduos foi de 34

anos, sendo 39,2% (62/158) do sexo masculino e 60,8% (96/158) do sexo feminino.

Em relação à procedência, 39 (24,7%) eram provenientes do município de Vitória, 62

(39,2%) do município de Vila Velha, 57 (36,1%) do município da Serra. Os dados

demográficos e clínicos da população incluída podem ser vistos na Tabela 2. De

todos os pacientes obteve-se amostra no momento da entrada no estudo (amostra

de fase aguda). Entretanto, só foi possível obter a amostra de fase convalescente

em 83 (52,5%) dos indivíduos. As amostras de fase aguda foram coletadas em

média 3,6 dias após o início dos sintomas e na fase convalescente 13,3 dias após o

início dos sintomas.

Tabela 2. Dados demográficos e clínicos dos 158 sujeitos incluídos no estudo. Características Demográficas Feminino (%) 60,8%

Masculino (%) 39,2%

Idade em anos (media, mediana e [intervalo]) 34,32 [18-79]

Sinais e Sintomas Clínicos no Momento da Inclusão Início dos sintomas em dias (média, mediana e [intervalo]) 4,3 [1-7]

N e (%)

Febre 158 (100,0%)

Dor de cabeça 151 (95,6%)

Mialgia 149 (94,3%)

Dor retroorbital 130 (82,3%)

Artralgia 124 (78,5%)

Náusea 107 (67,7%)

Rash 56 (35,4%)

Diarréia 46 (29,1%)

Vômito 40 (25,3%)

Sangramento anormal 14 (8,9%)

47

5.2 Amostras positivas para Dengue Das 158 amostras de fase aguda, 94 (59,5%) foram positivas para dengue pela

metodologia de RT-PCR, utilizada neste estudo como teste de referência para

confirmação da infecção. Os sorotipos identificados nessas amostras foram: DENV-1

em 16 (17%), DENV-2 em 67 (71,3%), DENV-3 em 10 (10,6%) e nenhum DENV-4.

Em uma única amostra (0,1%) constatou-se infecção simultânea por dois sorotipos:

DENV-1 e 2. A Figura 2 mostra a imagem do gel de agarose que inclui o resultado

da amostra do indivíduo com a dupla infecção (coluna 14). Este resultado foi

reconfirmado utilizando-se uma segunda alíquota de soro do mesmo paciente,

armazenada em freezer -70°C.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 4. Gel de agarose dos produtos da etapa semi-nested. Coluna 1 e 2: controle DENV-2. Colunas 3 e 4: controle DENV-3. Coluna 5: branco. Coluna 6: peso molecular (100pb). Coluna 7: controle 1. Colunas 8 a 14: amostras de pacientes.

48

5.3 Avaliação da sensibilidade dos testes diagnósticos

5.3.1 Testes para detecção de NS1

Para avaliação da sensibilidade dos testes de detecção de NS1 foram utilizadas as

94 amostras de soro de fase aguda, positivas para dengue por RT-PCR. A

sensibilidade dos testes diagnósticos para detecção de NS1, nos formatos

imunocromatográfico e ELISA, variaram de 24,5% a 54,3%. Não houve diferença

estatística entre a sensibilidade dos testes imunocromatográficos (Tabela 3) nem

entre os de formato ELISA (Tabela 4). O Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad

Laboratories) foi estatisticamente superior quando comparado com os testes

imunocromatográficos (p < 0,05).

Tabela 3. Sensibilidade dos testes imunocromatográficos Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue.

Testes N0 Positivos/Total Sensibilidade % [95% IC]

Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)* 23/94 24,5% [16,2-34,4]

Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories)

28/94 29,8% [20,8-40,1]

*somente considerada a leitura de NS1

49

Tabela 4. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de NS1: Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue.

Testes N0 Positivos/Total Sensibilidade % [95% IC]

Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) 41/94 43,6% [33,4-54,2]

Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Bio-Rad Laboratories)

51/94 54,3% [43,7-64,6]

Para a análise da sensibilidade dos testes de detecção do antígeno NS1, como

mencionado na seção Materiais e Métodos, foi avaliada também a interferência da

presença de anticorpos IgG, e do sorotipo infectante no desempenho dos testes

NS1.

5.3.1.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes NS1

A sensibilidade dos testes de acordo com a presença ou não de IgG pode ser

observada na Tabela 5. A sensibilidade de todos NS1 os testes foi menor para o

grupo em que foi detectado anticorpos IgG, entretanto somente foi estatisticamente

significante apenas para o teste Platelia.

50

Tabela 5. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com a presença de IgG, em 94 amostras de soro positivas para Dengue.

Detecção de IgG

N° de amostras

Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)

somente NS1 Dengue NS1 Ag Strip

(Bio-Rad Laboratories) Dengue NS1 ELISA

Test (Bioeasy Diagnóstica)

Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA

(Bio-Rad Laboratories)

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

negativo 49 14 28,6% [16,6-43,3] 16 32,7 %

[20,0-47,5] 24 49% [34,4-63,7] 33 67,4%

[52,5-80,0]

positivo 45 9 20% [10,0-34,6] 12 26,7%

[14,6-41,9] 17 37,8% [23,8-53,5] 18 40% a

[25,7-55,7]

a = diferença estatística em relação ao grupo negativo para IgG (p<0,05)

5.3.1.2 Sorotipo infectante x sensibilidade dos testes NS1

A sensibilidade dos testes também foi avaliada de acordo com o sorotipo infectante.

Todos os testes para detecção de NS1 apresentaram a maior sensibilidade para do

DENV-1 em relação ao sorotipos 2 e 3 (p<0,05), exceto o Platelia que apresentou

diferença estatística somente entre os sorotipos 1 e 3 (Tabela 6).

51

5.3.2 Testes para detecção de anticorpos IgM

Para avaliação da sensibilidade dos testes para detecção de IgM, foram utilizadas

48 amostras pareadas, coletadas na fase aguda e na convalescente. As

sensibilidades dos testes variaram de 27,1% a 52,1% em fase aguda, e entre 72,9%

a 97,9% em fase convalescente. Para todos os testes houve diferença estatística

entre as sensibilidades obtidas nas amostras coletadas em fase aguda e

convalescente, da doença como pode ser visualizado na Tabela 7.

Tabela 6. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com o sorotipo viral.

Sorotipo viral

n° de

amostras

Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)

** Dengue NS1 Ag Strip

(Bio-Rad Laboratories) Dengue NS1 ELISA

Test (Bioeasy Diagnóstica)

Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA

(Bio-Rad Laboratories)

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

N° de positivos

sens. (%) [95% IC]

DENV-1 16 12

a, c,

75,0% 12

a, c

75,0% 12

a, c

75,0% 12

75,0% c

[47,6-92,7] [47,6-92,7] [47,6-92,7] [47,6-92,7]

DENV-2 67 10 14,9% d

15 22,4% d

27 40,3%

35 52,2%

[7,4-25,7] [13,1-34,2] [28,5-53,0] [39,7-64,6]

DENV-3 10 0

0

[0,0-30,9]

0

0

[0,0-30,9]

1 10,0%

3 30,0%

[0,25-44,5] [6,7-65,3]

1não DENV-2 26 12

46,2%

12

46,2%

13

50,0%

15

57,7%

[26,6-66,6] [26,6-66,6] [30,0-70,1] [36,9-76,7]

1 Neste grupo estão incluídos as 16 amostras DENV-1 e as 10 amostras DENV-3. * A amostra com infecção dupla não foi considerada para essa análise. ** apenas NS1 positivos As letras a , b e c e d representam diferenças estatisticamente significantes (p< 0,05) em relação aos grupos DENV-2, DENV-1, DENV-3 e não DENV-2 respectivamente.

52

Tabela 7. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de anticorpos IgM em 48 amostras pareadas (fase aguda e convalescente).

Teste

Fase Aguda Fase Convalescente

N0 Positivos/Total Sensibilidade %

[95% IC] N0 Positivos/Total

Sensibilidade %

[95% IC]

Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)

25/48 52,1%

[37,2-66,7] 47/48

97,9% a

[88,9-99,9]

DENV Detect TM IgM (MAC ELISA) (Inbios International)

13/48 27,1%

[15,3-41,9] 41/48

85,4% a

[72,2-93,9]

Dengue IgM Capture ELISA

(PanBio) 20/48

41,7%

[27,6-56,8] 33/48

72,9% a

[53,8-81,3]

a = diferença estatística em relação a fase aguda (p<0,05)

5.3.2.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes IgM

Para os testes de detecção de IgM, também foi avaliada a relação da presença de

anticorpos IgG em fase aguda, que sugere infecção secundária, com a sensibilidade

observada em fase convalescente. Não houve diferença estatística entre as

sensibilidades nas amostras positivas e negativas para anticorpos IgG (Tabela 8).

Tabela 8. Sensibilidade dos testes Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica), DENV Detect IgM (MAC ELISA) (Inbios International) e Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) em 48 amostras de fase convalescente de acordo com a presença de IgG em fase aguda.

Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)

DENV Detect TM IgM (MAC ELISA)

(Inbios International) Dengue IgM Capture

ELISA (PanBio)

Detecção de IgG *

n° de amostras

fase convalescente

n° de posi.

sens. (%) [95% IC]

n° de posi.

sens. (%) [95% IC]

n° de posi.

sens. (%) [95% IC]

negativo 18 18 100% [81,5-100,0] 16 88,9%

[65,3-98,3] 12 66,7% [41-86,7]

positivo 30 29 96,7% [82,8-100,0] 25 83,3%

[65,3-94,4] 21 70,0% [50,6-85,3]

* em amostra de fase aguda

53

5.3.3 Combinação de testes NS1 e IgM

Para o Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), que possui detecção de NS1 e

anticorpos IgM no mesmo teste, quando considerou-se a leitura de NS1 e/ou IgM, a

sensibilidade do teste foi 48,6%, superior estatisticamente ao seu desempenho

quando considerada somente a leitura para NS1 (24,5%). Nesse mesmo raciocínio,

quando combinou-se o ELISA NS1 Platelia e o ELISA IgM do fabricante Bioeasy,

testes que apresentaram os melhores resultados, a sensibilidade para o diagnóstico

em fase aguda da doença foi de 76,6%. A sensibilidade observada com a

combinação desses dois testes foi estatisticamente superior à utilização do teste

imunocromatográfico Duo que possui detecção simultânea de NS1 e IgM (Tabela 9).

Tabela 9. Sensibilidade do teste Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e da combinação dos testes Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) em 94 amostras de fase aguda.

Teste N° de Positivos/Total Sensibilidade (%) [95% IC]

Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) 44*/94 46,8% [36,4-57,4]

Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) + Dengue IgM ELISA

Test (Bioeasy Diagnóstica) 72/94 76,6% [66,7-84,7] a

*Considerou-se os positivos para NS1 e/ou IgM a (p<0,05)

54

6 DISCUSSÃO

Nas últimas duas décadas, os avanços tecnológicos ocorridos na área diagnóstica

das doenças infecciosas e o aumento global das epidemias de dengue aumentaram

o número de testes diagnósticos disponíveis comercialmente no mercado. O

aumento de oferta tornou crucial a avaliação do desempenho destes testes em

diferentes cenários epidemiológicos de forma a possibilitar uma utilização adequada

e racional dos mesmos. Este aspecto foi reforçado pela OMS em 2006 através de

uma reunião do Scientific Working Group on Dengue, que incluía entre as

prioridades o desenvolvimento e a avaliação de testes diagnósticos para a melhora

do manejo clínico da doença (Kroeger; Nathan, 2006). A importância para avaliação

de testes diagnósticos motivou a realização deste estudo, que avaliou a

sensibilidade de sete testes laboratoriais, disponíveis comercialmente para o

diagnóstico da dengue.

Na primeira etapa deste trabalho foram incluídos 158 pacientes que preencheram os

critérios clínicos baseados na classificação de “provável dengue” segundo a OMS.

Apesar da utilização destes critérios, só foi possível confirmar a infecção por dengue

em pouco mais da metade (59,5%) dos indivíduos, o que reforça a inespecificidade

dos sintomas dessa doença e a necessidade da utilização de testes laboratoriais

complementares específicos para finalização do diagnóstico.

Nas amostras deste estudo, o DENV-2 prevaleceu sobre os demais: 71,3% seguido

do DENV-1 (17%) e DENV-3 (10,6%). Os sorotipos identificados coincidem com os

sorotipos que circulavam na região metropolitana de Vitória na ocasião (LACEN/ES

comunicação pessoal). Um indivíduo apresentou dupla infecção (DENV-1 e 2) e este

paciente teve evolução clínica de dengue sem complicações. Relatos de infecções

simultâneas por mais de um sorotipo tem se tornado relativamente frequentes no

mundo. O primeiro caso foi publicado em 1985 (Gubler et al., 1985) e de lá para cá

diversos casos de infecções simultâneas em diferentes países já foram publicados

(Gubler et al., 1985; Laille et al., 1991; Lorono-Pino et al., 1999; Wang et al., 2003;

Bharaj et al., 2008; Chinnawirotpisan et al., 2008; Gupta et al., 2008; Mamani et al.,

2010), sendo seis casos no Brasil (dos Santos et al., 2003; Araujo et al., 2006;

55

Figueiredo et al., 2011). Nenhum estudo até o momento conseguiu associar a

infecção simultânea por dois ou mais sorotipos com gravidade da doença.

Quanto aos testes diagnósticos avaliados, não existem dados publicados na

literatura sobre o desempenho dos testes da Bioeasy Diagnóstica, o que

impossibilita a comparação dos nossos resultados com os de outros estudos. Os

testes da Bio-Rad já foram descritos em várias publicações, que relataram

sensibilidades que variam de 57,7% a 98,7% para o teste de formato

imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip™ (Dussart et al., 2008; Ramirez et al.,

2009; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al., 2010; Tricou et al., 2010; Bisordi et al.,

2011; Blacksell et al., 2011) e de 56,5% a 99,3% para o formato ELISA, Platelia™

Dengue NS1 Ag-ELISA (Dussart et al., 2008; Lapphra et al., 2008; Castro-Jorge et

al., 2010; Lima Mda et al. 2010; Osorio et al. 2010; Bisordi et al., 2011; Blacksell et

al., 2012).

No Brasil apenas três estudos, todos publicados em 2010, avaliaram o desempenho

dos testes BioRad. O primeiro deles, publicado por Castro-Jorge e Colaboradores

(2010), avaliou a sensibilidade do teste Platelia™ (Bio-Rad) em 105 indivíduos com a

infecção confirmada através da combinação de cultura e/ou RT-PCR e/ou presença

de anticorpos IgM. Neste estudo todas as amostras eram de um único sorotipo, o

DENV-3. A sensibilidade do teste Platelia™ foi cerca de 20% maior na dengue

primária (89,6%) do que na dengue secundária (70,3%), que correspondiam a 33%

das amostras do estudo.

O segundo estudo, realizado por Bisordi et al. (2010), mostrou uma sensibilidade

muito elevada para ambos os testes NS1 da BioRad: 99,3% para o formato ELISA

(Platelia™) e 99,5% para o imunocromatográfico (Dengue NS1 Ag Strip™). Chama a

atenção nesse estudo a baixa frequência do DENV-2 (3,8%) entre os sorotipos

identificados na amostra: 72,8% DENV-1 e 23,4% DENV-3. Diferente do nosso

estudo, esse utilizou somente isolamento viral como teste de referência e os autores

não fazem distinção entre amostras de infeções secundárias e primárias.

O terceiro estudo, realizado por Lima et al. (2010), relatou sensibilidade de 83,6%

para o Platelia™ e 89,5% para o Dengue NS1 Ag Strip™. Nesse estudo os autores

56

dispunham de uma distribuição semelhante dos três sorotipos, mas só fizeram

distinção entre infecção primária e secundária em um pequeno percentual de soros

da amostra, 24,5% (54/220), cuja sensibilidade foi aproximadamente 20% inferior

nas infecções secundária (71,4%) em relação às infecções primárias (95%).

No nosso estudo encontramos sensibilidades de 54,3% para o Platelia™ e 29,8%

para o teste Dengue NS1 Ag Strip™, inferiores às descritas nos três estudos

brasileiros. Estas baixas sensibilidades podem ser parcialmente explicadas pelo fato

que a maioria das amostras do nosso estudo eram DENV-2 (71,3%). Estudos

recentes tem chamado atenção para a variação sorotipo dependente, da

sensibilidade dos testes de detecção de NS1. Esse fato foi também detectado em

nosso estudo, no qual observamos maior sensibilidade para o sorotipo 1 sobre os

demais, em quase todos os testes.

No estudo de Castro-Jorge et al. (2010) todas as amostras eram de um único

sorotipo (DENV-3) e no estudo de Bisordi et al. (2010) o DENV-2 compreendia

menos de 4% das amostras, o que limita sua comparação com os nossos

resultados. Guzman et al. (2010), em estudo multicêntrico no qual avaliou o teste

Platelia™, encontraram 34% de sensibilidade em amostras de pacientes da

Nicarágua, as quais eram em 94% do sorotipo DENV-2 (Guzman et al., 2010b).

Blacksell et al. (2012) encontraram 38% de sensibilidade no mesmo teste para o

DENV-2, 70% para o DENV-1 e 73% para o DENV-3 (Blacksell et al., 2012). Duong

et al. (2011) também relataram sensibilidade variável entre os sorotipos. Nesse

estudo foi observado sensibilidades de 40% para o DENV-2, 80% para o DENV-1 e

63,6% para o DENV-3 (Duong et al., 2011).

Outra variável que poderia ter interferido na sensibilidade dos testes de detecção da

proteína NS1 é a presença de IgG, encontrada precocemente nas infeções

secundárias, e que atuaria sequestrando a proteína NS1 através da formação de

imunocomplexos (Koraka et al. 2003; Bessoff et al. 2008; Hang et al. 2009). Bessoff

e colaboradores (2008) observaram que, para o kit Platelia™ Bio-Rad havia uma

relação inversa entre os títulos de IgG e a frequência de um resultado positivo

(Bessoff et al. 2008). Hang e colaboradores (2009) mostraram também relação

inversa entre a presença de IgG e a positividade dos testes da BioRad. Os autores

57

relataram uma diferença de aproximadamente 33% (93,1% para 60,5%) na

sensibilidade do teste Platelia™ e de 36% (de 83,9% para 47,4%) no teste

imunocromatográfico quando o soro testado era positivo para anticorpos IgG (Hang

et al. 2009).

Essa diferença entre a sensibilidade dos testes NS1 na presença de IgG também foi

observada no nosso estudo. Na presença de IgG, a sensibilidade de todos os testes

foi menor em relação às sensibilidades observadas nos soros negativos para este

anticorpo. Entretanto, esta diferença só foi estatisticamente significativa para o teste

Platelia™. Dentre os estudos brasileiros citados, o de Bisordi et al. (2010) não avaliou

este aspecto. O estudo de Castro-Jorge et al. (2010) possuía 33% de casos

secundários e o estudo de Lima et al. (2010) só investigou a existência de infecção

secundária (presença de IgG) em 54 dos 220 (24,5%) soros da amostra.

Não existem estudos publicados sobre dois (Dengue IgM ELISA Test da Bioeasy

Diagnóstica e DENV Detect TM IgM (MAC ELISA) da InBios International) dos três

testes ELISA IgM avaliados neste estudo. Nossos resultados mostraram que a

sensibilidade média dos testes para detecção de IgM foram aproximadamente

40,3% em amostras de fase aguda e 84% em amostras de fase convalescente. O

teste que apresentou a maior sensibilidade foi o teste Dengue IgM ELISA Test

(Bioeasy Diagnóstica) com 52,1% de sensibilidade para amostras de fase aguda e

97,9% para amostras de fase convalescente.

Sensibilidades próximas às mostradas no nosso estudo nos testes da Panbio foram

descritas por Blacksell et al (2012) que encontraram 83,2% de positividade nas

amostras de fase aguda e 93,7% nas amostras convalescentes. É importante

destacar que no estudo de Blacksell não há informação sobre o tempo de início dos

sintomas em relação à coleta das amostras, o que pode influenciar na sensibilidade

dos testes para detecção de anticorpo IgM, como demostra nosso estudo. Branch e

Levett (1999) encontraram 85% de sensibilidade em amostra de soro obtidas na fase

convalescente (Branch; Levett 1999). Hu e colaboradores (2011), estudando

somente casos de infecção primária encontraram 42,9% de sensibilidade em

amostras coletadas até o terceiro dia de doença e 100% em amostras obtidas após

o oitavo dia (Hu et al. 2011).

58

A sorologia para IgM é um ensaio simples e confiável, porém com sensibilidade

reduzida na fase aguda da doença, já que depende da produção e ascensão dos

níveis de anticorpos. Como previsto, a sensibilidade para todos os testes IgM foi

maior para amostras coletadas na fase convalescente em comparação com

amostras de fase aguda. Nesse estudo, as mais altas sensibilidades foram obtidas

com testes para detecção de IgM em amostras de fase convalescente, entretanto,

do ponto de vista clínico, a conclusão de um diagnóstico de dengue nessa fase tem

pouca importância clínica.

Na fase aguda da doença, a combinação de testes que detectam simultaneamente

ou separadamente NS1 e IgM, aumentam a sensibilidade do diagnóstico da doença

como já foi demonstrado por outros pesquisadores (Guzman et al., 2010b; Duong et

al., 2011; Blacksell et al., 2012). O nosso estudo mostrou que o teste

imunocromatográfico que possuía essas duas plataformas de detecção apresentou

maior sensibilidade para o diagnóstico quando comparado com a leitura isolada do

teste NS1. Da mesma forma, a combinação de resultados de testes ELISA para

detecção de NS1 e anticorpos IgM, permitiu um aumento na sensibilidade do

diagnóstico em relação à utilização de seus resultados isoladamente.

À luz dos recentes resultados sobre o desempenho dos testes para o diagnóstico do

dengue, devemos destacar que, em estudos futuros, é fundamental a análise dos

resultados estratificados conforme o sorotipo infectante e quanto ao status

sorológico do indivíduo, e tempo de doença.

59

7 CONCLUSÕES

1. Todos os testes NS1 apresentaram maior sensibilidade para o DENV-1 em

relação ao DENV-2 e 3.

2. O teste Platelia™ (Bio-Rad) apresentou sensibilidade mais baixa na presença

de anticorpos IgG.

3. Para o diagnóstico de dengue utilizando amostras de fase aguda, a

combinação de um teste para detecção da proteína NS1 com um teste de

detecção de anticorpos IgM aumentou a sensibilidade dos testes para

diagnóstico.

4. A maior sensibilidade para os testes de detecção de IgM foi observada para

amostras coletadas em fase convalescente da doença.

60

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APÊNDICE

APÊNDICE A – Termo de Consentimento

TERMO DE CONSENTIMENTO ESCLARECIDO

TÍTULO DO PROJETO: Avaliação do desempenho de diferentes metodologias no diagnóstico da Dengue. Eu,___________________________________________________________ fui convidado (a) para participar como voluntário de um estudo para avaliar o desempenho de diferentes metodologias para o diagnóstico da Dengue. Para isso, serão realizadas duas coletas de sangue, sendo que a primeira será feita no momento em que você comparecer no posto de saúde para a coleta de sangue para os exames solicitados pelo médico da unidade. A segunda será realizada quando você retornar para confirmar o diagnóstico da Dengue. Todos os procedimentos éticos em pesquisa serão rigorosamente cumpridos. Se você aceitar participar deste estudo, suas informações serão mantidas confidenciais. CONSENTIMENTO Eu recebi uma cópia desse termo de consentimento e sei que uma cópia ficará guardada no arquivo do estudo. Entendo que posso deixar o estudo a qualquer momento que quiser ou que o médico do estudo pode me pedir para deixar o estudo se ele entender que esta decisão é melhor para mim. Eu entendo que se eu assinar, ou colocar minha impressão digital no espaço abaixo, estou concordando em participar do estudo e realizar todos os procedimentos do mesmo estabelecidos neste documento. ________________ __________________________ ______________ Assinatura do voluntário Nome do voluntário Data/Hora Eu expliquei os objetivos deste estudo para o voluntário. Tenho plena convicção que ele (a) entendeu os objetivos, riscos e benefícios da sua participação no estudo. ________________ __________________________ ______________ Assinatura do investigador Nome do investigador Data/Hora

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APÊNDICE B – Ficha Clínica

PROJETO DENGUE – FICHA CLÍNICA Dados pessoais Nome:______________________________________________________________ Sexo: M ( ) F ( ) Data de nascimento: ___/___/______ Idade:_________ Endereço: ___________________________________________________________ Bairro:___________________________ Cidade: _________________________ Ponto de referência: ___________________________________________________ Telefone: (res) _______________ (cel) ________________ (outro) ____________ Ocupação (profissão):_______________________________ Dados Clínicos Data da primeira coleta: ___/___/___ _____ dias de sintoma Local da coleta: _______________ Data da segunda coleta: ___/___/___ _____ dias de sintoma

Sinais e Sintomas Primeira Coleta Segunda Coleta Febre ( ) ( ) Cefaléia ( ) ( ) Mialgia ( ) ( ) Artralgia ( ) ( ) Dor retro-orbital ( ) ( ) Náusea ( ) ( ) Vômito ( ) ( ) Diarréia ( ) ( ) Rash ( ) ( ) Sangramento anormal ( ) ( ) Outras Informações Dengue anterior: ( )Não Quantas vezes: _________________________ ( ) Sim Prova do laço: ( ) Negativa ( ) Positiva Hemograma (se houver) Hematócrito: Leucócitos: Plaquetas:

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