aula4_40h

1Curso: Tecnologia em Produo de Frmacos e FarmciaPerodo: 5 perodoDisciplina: Microbiologia IndustrialProfessora: Sabrina Dias

Centro Universitrio da Zona Oeste

AULA 4: Mtodos de deteco:meios de cultura e provas bioqumicas

Os meios de cultura so classificados quanto ao estado fsico:

Slidos, quando contm agentes solidificantes, principalmente gar

(cerca de 1 a 2,0 %);

Semi-slidos, quando a quantidade de gar e ou gelatina de 0,075 a

0,5 %, dando uma consistncia intermediria, de modo a permitir o

crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a

verificao da motilidade e tambm para conservao de culturas;

Lquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo,

utilizados para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas

bioqumicas, dentre outros.

MEIOS DE CULTURA

MEIOS DE CULTURAOs meios de cultura podem ainda ser classificados quanto a procedncia dos constituintes:

Naturais ou complexos, quando usa ingredientes com composio qumica no definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubrculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne, crebro, fgado, casena, etc.) e de microrganismos (levedura);

Artificiais, sintticos;

Quimicamente definidos quando a composio qumica conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigncias nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrognio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando ento so conhecidas as necessidades nutricionais especficas

MEIOS DE CULTURA

Quanto a composio qumica podem ser simples (meios bsicos) ou complexos.

Bsicos so aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial (Ex. caldo e garsimples).

Especiais quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar suco de tomate, gar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), garchocolate (agar simples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80C), Meio de Tarozzi (com fragmento de fgado - para anaerbios), Meio de Lowenstein, meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), TriptoseSulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substncias citadas), etc.

Meios de pr-enriquecimento - so aqueles que permitem a dessensibilizao de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (trmico ou qumico). Ex. gua peptonada, caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em p).

Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios tm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistinapara cultivo de Salmonelas (lquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.

MEIOS DE CULTURADiferenciais - quando contm substncias que permitem estabelecer diferenas entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), gar MacConkeypara a diferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar Baird-Parkerpara isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos (slidos).

Seletivos - os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: gar Salmonella-Shigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. Meio Baird-Parker, com 7,5% de cloreto de sdio, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibiticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, , meio de Blaser, meio de Skirrow, etc.). A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microrganismos.

MEIOS DE CULTURA

2MEIOS DE CULTURA

Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindo caracterizao e identificao perfunctria ou presuntiva de muitos microrganismos (gar trplice acar e ferro, uria, etc.);

Identificao - prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos a

identificao (meios Oxidao/Fermentao, gar Citrato, Caldo nitrato,

meio semi-slido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.;

Dosagem - empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos;

Contagem - empregados para a determinao quantitativa da populao microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, gar Baird-Parker, etc.);

MEIOS DE CULTURA

Estocagem ou manuteno - utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio, i.e. garantem a viabilidade de microrganismos (gar Sabouraud, Meios com leite, gar suco de tomate, gar sangue, gar Simples, meio semi-slido, etc.).

A - Substncias nutritivas em concentraes adequadas, que devem servir como:- fonte de energia - fonte de nitrognio- fonte de carbono - fonte de sais e ons- fonte de enxofre e fsforo - fatores de crescimento- doador de el trons - receptor de el trons

MEIOS DE CULTURA

B - Condies ambientais favorveis:- temperatura (termfilos, mesfilos e psicrfilos) - umidade - pH (de 2 a 9)

- atmosfera de incubao (aerobiose, microaerofilia, anaerobiose)

Componentes bsicos dos meios de cultura:

-Extratos: de carne e de levedura. Concentrados aquosos desidratados que servem como fonte de: carboidratos, vitaminas, compostos orgnicos nitrogenados e sais.

-Peptonas: derivados da hidrlise cida ou enzimtica de protenas de origem animal ou vegetal (peptona de casena, peptona de soja) que servem como fonte de N orgnico, vitaminas, carboidratos, enxofre, fsforo, clcio e magnsio.

-Agar-agar: polissacardeo obtido a partir de algas rodofceas. Funo: agente solidificante, cujo P.F.= 95 C e o P.S.= 45 C. No tem funo nutritiva.

-NaCl: mantm o equilbrio osmtico do meio e serve como fonte dos ons Na e Cl.

- gua: umidade e fontes de ons.

MEIOS DE CULTURA

Frmulas de alguns meios bsicos, de uso rotineiro em bacteriologia:

MEIOS DE CULTURAAGAR MAC-CONKEY:

Finalidade: meio de cultura seletivo-indicador, utilizado para isolamento de enterobactrias ( bacilos Gram negativos ) a partir de fezes, urina, lquor, alimentos, gua residual, etc.

FRMULA:Peptona de casena cristal violetaPeptona de carne agar-agarLactose gua destiladaMistura de sais biliares Cloreto de sdioVermelho neutro pH: + ou - 7.1

FUNDAMENTOS:1) Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota

Gram-positiva por ventura existente no material (seletividade para Gram-negativo).

2) A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradao (fermentao ) deste carboidrato (o que feito por apenas parte dos membros desta famlia). Quando ocorre a fermentao, a bactria classificada como Lac +.

MEIOS DE CULTURA

3PREPARAO DE AMOSTRAS

Amostra com peso conhecido (10, 25g, ...) diluda em soluo estril ou gua

peptonada a 0,1%. O tubo deve ser homogeneizado mecanicamente para misturar

os componentes. O diluente fica na proporo de 9:1, nas diluies de 10-1, 10-2,

10-3,...

Ex: Para 25g de amostra, segundo RDC no12 para teste de Salmonella sp.,

seriam necessrios 225mL de diluente.

25g de amostra x 9 = 225mL de diluente

Resoluo - RDC n 12, de 2 de janeiro de 2001

REGULAMENTO TCNICO SOBRE PADRES MICROBIOLGICOS PARA ALIMENTOS

DEFINIES

3.2.Amostra indicativa: a amostra composta por um nmero de unidades amostrais inferior ao estabelecido em plano amostral constante na legislao especfica.

3.3.Amostra representativa: a amostra constituda por um determinado nmero de unidades amostrais estabelecido de acordo com o plano deamostragem.

3.7.Unidade amostral: poro ou embalagem individual que se analisar, tomado de forma totalmente aleatria de uma partida como parte da amostra geral.

PREPARAO DE AMOSTRAS

Definies:

1) LoteQuantidade de alimento ou unidades de alimento produzidos e manuseados sob condies uniformes homogeneidade dentro do lote.

2) Unidade amostralPoro ou embalagem individual a ser analisada, tomada de forma totalmente aleatria de uma partida como parte da amostra geral.



Amostra indicativaComposta por um nmero de unidades amostrais inferior ao estabelecido no plano amostral.

Amostra representativaConstituda por um determinado nmero de unidades amostrais estabelecido de acordo com o plano amostral.

Amostra representativaNa avaliao de lotes e ou partidas

Amostra indicativaQuando nos pontos de venda ou de qualquer forma de exposio ao consumo o lote ou partida do produto estiver fracionado;

Ou quando o nmero total de unidades do lote for igual ou inferior a 100 (cem) unidades;

Ou quando o produto estiver a granel.

Situaes de aplicao dos planos de amostragem:

TIPOS DE PLANOS DE AMOSTRAGEM

A) Plano de duas classes

Quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como aceitvel ou inaceitvel, em funo do limite designado por M.

aplicvel para limites qualitativos.B) Plano de trs classes

Quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como:

aceitvel Qualidade intermediria aceitvel

inaceitvel,Em funo dos limites m e M, com um limite para c (resultados entre m eM). Nenhuma unidade pode ter resultado > M.

Valores em um plano de amostragem

n

Nmero de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente.

c

o nmero mximo aceitvel de unidades de amostras com contagens entre m e M ( plano de trs classes).

Nos casos em que o padro microbiolgico seja expresso por Ausncia, c = 0 (aplica-se plano duas classes).

4m

o limite que , em um plano de trs classes, separa o lote aceitvel do produto ou o lote com qualidade intermediria.

M o limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitvel

do inaceitvel.Em um plano de trs classes, separa o lote com qualidade

intermediria do lote inaceitvel.Valores acima de M so inaceitveis.

Valores em um plano de amostragem

1051043 5 105Coliformes a 45oC/g c) midos de aves

-Aus0 5 AusSalmonella sp/25ga) carnes resfriadas, ou congeladas, "in natura", de bovinos, sunos e outros mamferos (carcaas inteiras ou fracionadas, quartos ou cortes); carnes modas; midos de bovinos, sunos e outros mamferos

5 CARNES E PRODUTOS CRNEOS

-Aus0 5 AusSalmonella sp/25g

5x1021022 5 5x102Coliformes a 45oC/g b) frescas, "in natura", preparadas ( descascadas ou selecionadas ou fracionadas) sanificadas, refrigeradas ou congeladas, para consumo direto.


2x1032 x 102

2 5 2x103Coliformes a 45oC/g a) morangos frescos e similares, "in natura",

inteiras, selecionadas ou no.

1 FRUTAS, PRODUTOS DE FRUTAS e SIMILARES M m c n

Tolerncia para Amostra Representativa

Tolerncia para Amostra

INDICATIVA

MICRORGANISMO GRUPO DE ALIMENTOS



1031022 5 103Estaf.coag.positiva./g

5x1021022 5 5x102Coliformes a 45oC/g

a) de baixa umidade:

8. B- Queijos -Aus0 5 AusSalmonella sp/25ga) ovo ntegro cru

6 OVOS e DERIVADOS


5.PROCEDIMENTOS E INSTRUES GERAIS

5.1. As metodologias para amostragem, colheita, acondicionamento, transporte e para

anlise microbiolgica de amostras de produtos alimentcios devem obedecer ao

disposto pelo Codex Alimentarius; "International Commission on Microbiological

Specifications for Foods" (I.C.M.S.F.); "Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods" e "Standard Methods for the Examination of

Dairy Products" da American Public Health Association (APHA)"; "Bacteriological

Analytical Manual" da Food and Drug Administration , editado por Association of

Official Analytical Chemists (FDA/AOAC), em suas ltimas edies e ou revises,

assim como outras metodologias internacionalmente reconhecidas.

TCNICAS DE SEMEADURA



CONTAMINAO EM PRODUTOS COSMTICOS

Os cosmticos so divididos em quais categorias?Referente a contaminao microbiolgica, os cosmticos so divididos em quatro categorias, conforme sua susceptibilidade contaminao, sendo:

Categoria 1 - Alta SusceptibilidadeProdutos para rea dos olhos (aquosos e semi-aquosos)EmulsesPreparaes geritricas e peditricasPreparaes de cremes labiais (emulses de bases aquosas)Matrias-primas de origem natural

Categoria 2 - Mdia SusceptibilidadePs compactados (incluindo produtos para face e rea dos olhos)Preparaes em bastesTalcosAlguns aerossis


Categoria 3 - Baixa SusceptibilidadePreparaes alcolicas (teor alcolico maior que 25%)DesodorantesAntitraspirantesSais de banhoMaioria dos aerossisMatrias-primas com atividade antimicrobiana

Categoria 4 - No SusceptveisEsta categoria abrange os produtos que contm em sua formulao componentes de tal natureza que no permitaa sobrevivncia de organismos vegetativos (excluindo os conservantes).

5Quais os parmetros de controle microbiolgico de cosmticos?Estes parmetros seguem a Resoluo N 48, de 23 de setembro de 1999, onde estes so divididos em dois tipos:Tipo I Produtos para uso infantil, rea dos olhos e produtos que entram em contato com mucosasTipo II Demais produtos cosmticos susceptveis a contaminao microbiolgica.

Quais as metodologias utilizadas para a anlise microbiolgica?As principais fontes de metodologias utilizadas so: CTFA MicrobiologyGuidelines e Handbook of Cosmetic Microbiology, onde esto descritos os ensaios de contagem bacteriana, pesquisa de patgenos e desafio de conservantes (Challenge test).


Quais os equipamentos utilizados em pesquisa para controle microbiolgico

de produtos cosmticos?

Os equipamentos bsicos necessrios para realizao de ensaios de controle

microbiolgico so: Fluxo laminar, estufa de cultura, autoclave e contador de

colnias.


Fluxo laminar

Estufa de cultura

Autoclave

Contador de colnias

Quais as fontes que podem causar a

contaminao de produtos?

matria-prima;

material de embalagem;

gua;

manipulao e sanitizao;

higiene do pessoal utilizao de

adornos, lavagem das mos e braos,

barbas e bigodes raspados e cabelos

presos e com touca.

CONTAMINAO EM PRODUTOS COSMTICOSLegislaes - Guia de Estabilidade

de Produtos Cosmticos


Portaria 481, de 23 de setembro de 1999 - PARMETROS PARA CONTROLE MICROBIOLGICO DE PRODUTOS COSMTICOS

RDC 343, DE 13 DE DEZEMBRO DE 2005 - REGULAMENTOS ESPECFICOS SOBRE OS PRODUTOS DE HIGIENE PESSOAL, COSMTICOS E PERFUMES

Portaria 348, de 18 de agosto de 1997 - BOAS PRTICAS DE FABRICAO DE COSMTICOS, PRODUTOS DE HIGIENE E PERFUME

RDC 211, DE 14 DE JULHO DE 2005 DEFINIO E A CLASSIFICAO DE PRODUTOS DE HIGIENE PESSOAL, COSMTICOS E PERFUMES

RDC 48, de 16 de maro de 2006 - LISTA DE SUBSTNCIAS QUE NO PODEM SER UTILIZADAS EM PRODUTOSDE HIGIENE PESSOAL, COSMTICOS E PERFUMES

RDC 108, de 27 de abril de 2005 - REGULAMENTO TCNICO PARA EMPRESAS QUE EXERAM ATIVIDADE DE FRACIONAMENTO DE PRODUTOS DE HIGIENE PESSOAL, COSMTICOS E PERFUMES COM VENDA DIRETA AO CONSUMIDOR

Legislaes



6Semeadura em placa de petri contendo MEIO SLIDOA semeadura dos microrganismos pode ser realizada por:

-Estrias: flamba-se a ala de platina no bico de Bunsen, depois de esfriada, introduz-se a ala no tubo ou placa contendo o microrganismo e retira-se um pequeno inculo. Introduz-se a ala de platina na placa e desliza-se a mesma em vrios sentidos sobre a meio de cultura slido.

-Por ponto: com um fio de platina flambado no bico de Bunsen, coleta-se um pequeno inculo do microrganismo e introduz o fio no centro da placa de petricontendo o meio de cultura slido.

- Por espalhamento: com o auxlio de uma pipeta estril retira-se 0,1 mL de uma cultura de microrganismo e coloca-se em uma placa de petri contendo meio de cultura slido. Flamba-se a ala de Drigalsky em lcool e fogo e espalha-se por toda a superfcie da placa.

TCNICAS DE SEMEADURAMEIO SLIDO

Semeadura em estriasSemeadura em meio lquido

Espalhamento em meio slido

TCNICAS DE SEMEADURA TCNICAS DE SEMEADURA

TCNICAS DE SEMEADURA TCNICAS DE SEMEADURA

gar invertido em placa / Pour plate

Colocar 0,1 a 1mL de diluio, adicionar 10 mL de meio fundido e refriar a 45 50oC. Homogeneizar com movimento rotatrios.

Utilizado para contagem bacteriana de anaerbicos.

Semeadura em meio de cultura lquido

Com uma ala de platina previamente flambada retira-se um inculo de microrganismo contido em placa ou tubo de cultura e transfere-se para o tubo de cultura contendo meio lquido.

Gota em placa

gar solidificado coloca-se gotas de 0.02mL na superfcie da placa, totalizando 0,1mL da diluio

7Mtodo Pour Plate

Diluio bacteriana

Inocula as bactrias

Adiciona o meio de cultura

Mistura com movimentos

circulares

Colnias crescem embaixo

Colnias crescem na superfcie do meio

Inocula na superfcie com ala

de Drigalsky

Mtodo espalhamento em placa TCNICAS DE SEMEADURA

Catalisar a reao entre H2 e O2

Indicador redox

Para evitar a condensao da

gua

Ala de DrigalskiAla de platina

MATERIAIS PARA SEMEADURA

Placa de petri

Pipeta PasteurAlas para semeaduraSwab

Bico de Bunsen

TCNICAS DE SEMEADURA

Contagem aerbica facultativas e obrigatrias em placa

H enriquecimento do meio de cultura para aumento do no de clulas viveis, com meios como:

gar nutritivo extrato de carne, extrato de levedura, peptona (hidrolisado de sais orgnicos, peptideos) pH 7 a 7,4 para bactrias, e levemente cido para bolores e leveduras.

Depois de incubado, contar o no de clulas viveis, aerbicas obrigatrias e facultativas.

A temperatura de incubao pedende do m.o.

Isolamento de um microrganismo:O isolamento consiste na obteno de uma cultura pura (colnias isoladas de um nico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material ).

Finalidades do isolamento:

. Identificao de um microrganismo.A simples observao de caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos microrganismos. Para isto lanamos mo da anlise de uma srie de caractersticas destes como: caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas caractersticas est na dependncia do microrganismo que se pretende identificar.

. Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.

. Repique: Consiste na transferncia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.

FINALIDADE DA SEMEADURA PROVAS BIOQUMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAO DE BACTRIAS

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS

1- FERMENTAO DE CARBOIDRATOS:

Algumas bactrias so capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacardeos at glicose), e metabolizar a glicose at cidos (com ou sem liberao de gs) e/ou lcoois. Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) glicose c. pirvico cidos, lcoois e gases.

Meio utilizado: meio de cultura indicador que contm: caldo simples + carboidrato + indicador de pH + tubo de Durhan.

8PROVAS BIOQUMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAO DE BACTRIAS

2- PROVA DO CITRATO:Muitas bactrias so capazes de utilizar o citrato (c. orgnico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono.A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe vrias denominaes, dentre elas, citratoliase e citrilase.Os produtos de clivagem so acetato e oxaloacetato, este ltimo sendo subseqentemente convertido em Piruvato e CO2 , por uma oxalacetatodescarboxilase.

O piruvato utilizado pela clula ( para seu metabolismo ) e o CO2 liberado no meio de cultura. O CO2 liberado reage ento com o sdio ( proveniente do sal citrato de sdio incorporado na composio do meio de cultura ), formando carbonato de sdio ( composto alcalino ), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinizao.

PROVAS BIOQUMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAO DE BACTRIAS

METABOLISMO DE PROTENAS

A decomposio de protenas ( liberao de aminocidos ) conduz produo de substncias ptridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos a utilizao ou no de certos aminocidos pelas bactrias ( necessrios ao seu metabolismo ), atravs da deteco da presena de substncias ptridas.

Meio de cultura utilizado: Meio SIM. ( S=sulfeto; I=indol; M=motilidade)

Composio: peptona (protena que serve como fonte de tryptofano e cistina), sal de metal pesado (sal de ferro ou chumbo), gua e gar.


1- Produo de Indol: degradao do triptofano

c. pirvico: utilizado pelo metabolismo da bactria.Indol: liberado no meio de cultura. Adicionar aps incubao, de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs ( soluo de paradimetilaminobenzaldeido ). Se houver liberao de indol, formar-se- um anel vermelho ( composto denominado rosindol)

Resultado:- Indol positivo: anel vermelho- Indol negativo: no utilizao do triptofano. Presena de anel amarelo (cor do reativo de Kovacs)


2- Produo de H2S:Cistina: aminocido que contm enxofre (S). Degradao da cistina com liberao de H2S.

c. pirvico; utilizado no metabolismo da bactria.H2S: liberado no meio de cultura. O H2S liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado de cor negra.Resultado:

- H2S positivo: precipitado preto- H2S negativo: sem precipitado

TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) ( ANTIBIOGRAMA )

Teste para verificar o comportamento dos microrganismos

(sensibilidade ou resistncia) "in vitro" , frente a diversos antibiticos e

quimioterpicos, para a escolha do antimicrobiano ideal.


INDICAES:

Para microrganimos isolados e identificados como os agentes causadores da infeco; quando o microrganismo causador da infeco apresenta, estatisticamente, grande variabilidade no espectro de resistncia ou tendncia mesma.

Ex.: Enterobactrias, Staphylococcus aureus, Pseudomonas.

TIPOS DE TESTE: QUANTITATIVO: determinao da Concentrao inibitria mnima (CIM).

-Diluio : em tubo e em placa

-Teste E (Teste epsilomtrico): consiste em uma fita plstica, impregnada

com um gradiente de concentrao do antimicrobiano.

9TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) ( ANTIBIOGRAMA )

QUALITATIVO: Mtodo de difuso de discos em gar.

PRINCPIO DO MTODO QUALITATIVO: medida do halo de inibio em mm.

LEITURA:- ausncia de halo: resistncia- presena de halo: sensibilidade ou resistncia

FATORES QUE INFLUENCIAM O RESULTADO DO TSA:

COMPOSIO QUMICA DO MEIO DE CULTURA;DENSIDADE DO INCULO;TEMPERATURA DE INCUBAO;CONCENTRAO DOS ANTIMICROBIANOS NOS DISCOS;VALIDADE E CONSERVAO DOS DISCOS;AO E ESTABILIDADE DA DROGA;TEMPO DE INCUBAO

Leituras:Resultados quantitativos - expressos em concentrao inibitria mnima.Resultados qualitativos - como sensvel, intermedirio, resistente.

Interpretao de antibiogramas:

Sensvel (S): Uma infeco por determinada cepa pode ser tratada apropriadamente com dosagem de agente antimicrobiano recomendadapara aquela infeco, salvo qualquer outra contra indicao.

Intermediria (I): A CIM dos agentes antimicrobianos aproximam-se dos nveis plasmticos e tissulares habituais. Pode apresentar uma resposta menor que a das cepas sensveis.

Resistentes (R): Cepas no so usualmente inibidas por concentraes sistmicas avaliadas do agente.


Pesquisa de S. aureus: isolamento e identificao Gema de ovo possibilita ver formao de halo transparente devido a ao proteoltica e lipoltica do S.aureus e enriquece o meio

Telurito oxidado produzindo as colnias negras, agente inibidor do

crescimento de outros m.o.

Agente Seletivo

MEIOS DE CULTURA E PROVAS BIOQUMICAS ESPECFICAS PARA DETERMINAO DE M.O.

Indicador de pH

Agente Seletivo

Degrada o manitol, modificando pH do meio, deixando mais bsico

S. aureus apresenta enzima catalase, decompondo H2O2,Liberando oxignio, com formao de borbulhas.

b) Hemlise gar sangue

c) coagulase

d) DNAse/Termonuclease

Prova da termonuclease Baseia-se na degrada do DNA pela ao da enzima DNAse.

Aparecimento de halo rsea no gar azul de toluidina,

Clarificao no garteste com verde de metila.

Caldo BHI, lquido, contendo plasma de coelho, por ao da enzima coagulase, forma cogulos do fibrinognio do plasma de coelho

10

Isolamento e Identificao de Salmonella

I) Pr-enriquecimento

Inoculao da amostra em frascos contendo 225 mL de caldo lactosado ou gua peptonada a 1%.

II) Enriquecimento seletivo

Inoculao do pr-enriquecimento em:

Tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis (RV)

Tubos contendo 10 mL de caldo Tetrationato (TT)

Tubos contendo 10 mL de caldo selenito-cistina (SC)

Meio nutritivo, no seletivo = recuperao de clulas lesadas

Nutrientes: PeptonasInibidores: Sais biliares e tiossulfato/tetrationato com adio de iodo

Nutrientes: Lactose, triptona e cistinaInibidor: Selenito de sdio

Nutriente: Peptona

Inibidores: alta presso osmtica devido a concentrao de MgCl2, pH 5,2, presena de verde malaquita, temperatura 42,5oC

III) Plaqueamento diferencial

Placas de gar Bismuto Sulfito (BS)

Placas de gar Rambach

gar entrico de Hektoen

Placas de gar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD)


Inibidores: bismuto-sulfito, sulfito de sdio e verde brilhante

Sistema indicador: fosfato cido dissdico e sulfato ferroso

Inibidores: desoxicolato de sdio

Sistema indicador: lactose, sacarose e xilose

Indicador de pH: vermelho de fenol

Indicadores da produo de H2S: tiossulfatode sdio, citrato de ferro amoniacal

Sistema inibidor: sais biliares

Sistema indicador: lactose e sacarose

Indicador de pH: azul de bromotimol

Indicadores da produo de H2S: tiossulfato de sdio, citrato de ferro amoniacal.

Inibidor: desoxicolato de sdio

Indicador: mistura cromognica e propilenoglicol

IV) Confirmao (testes preliminares)

gar Trplice Acar Ferro (TSI)

gar Lisina Ferro (LIA) Descarboxilaoda lisina

Teste de hidrlise da uria (diferenciao entre Proteus e Salmonella)


Indicadores: lactose (1%), sacarose (1%), glicose (0,1 %)

Indicador de pH: vermelho de fenol

Indicador de H2S: tiossulfato de sdio e sulfato ferroso

Sistema indicador: glicose e lisina

Indicador de pH: prpura de bromocresol

Indicador de H2S: tiossulfato de sdio, citrato de amnia e ferro.

Hidrlise da uria

Uria amniaIndicador de pH: vermelho de fenol

Salmonella Proteus +

Urease

Tcnica dos tubos mltiplos para determinao do Nmero Mais Provvel (NMP)de coliformes - Teste Presuntivo

Testes para Coliformes totais e Coliformes termotolerantes

103

102

101

Formao de gs no tubo de Durhan


Meio: Caldo Lauril Sulfato de Sdio LST

Indicao: Formao de gs por fermentao da lactose gs aprisionado nos tubos de Durhan.

Seletividade: Presena do lauril sulfato de sdio agente surfactante aninico inibe crescimento de Gram positivas

+-


Teste Confirmativo

Coliformes termotolerantes Coliformes fecais

Caldo EC 45oC

Caldo Escherichia Coli

Inibidor: bile inibe gram positivos

Positivo: turvao do meio (crescimento) + produo de gs

Coliformes Totais

Caldo Verde Brilhante Bile lactose (VBBL) 35oC

Inibidor: bile inibe gram positivos

Positivo: turvao do meio (crescimento) + produo de gs

A combinao dos resultados vista na tabela de NMP apresentando resultadoNMP/g ou mL

11

Identificao Clostrdios sulfito redutores e Clostridium perfringens

1) Isolamento em meio TSC (triptose-sulfito-cicloserina) ou SFP (Sahid

Fergunson perfringens) ou SPS (sulfato polimixina sulfadiazina):

Importante: Mtodo do pour plate com sobrecamada Incubao em jarra de anaerobiose Incubao a 46C!


+ reage com + reage com citratocitrato de ferro originando colorade ferro originando colorao negrao negra

Agente seletivo

Agente indicador

2) Repique das colnias suspeitas

Inoculao das colnias suspeitas em caldo de carne cozida (com leo anaerobiose)

ou

caldo tioglicolato


Composio Peptona de casena 19,5 g/LExtrato de levedura 5,0 g/LGlicose 6,0 g/LCloreto de sdio 2,7 g/LL-cistina 0,5 g/LTioglicolato sdico 0,5 g/Lgar 0,75 g/Lgua Destilada q.s.p. pH final 7,3 0,2

Agente seletivo

A turvao do meio indica crescimento de microrganismos. No havendo crescimento de microrganismos, constata-se meio lmpido.

+-

3.a) Fermentao tempestuosa (storm test)

Inoculao de 1 mL do caldo de carne para meio leite com ferro

Adicionar leo estril

Incubar a 46oC/5h

Resultado: cogulo do leite e grande formao de gs (fermentao tempestuosa)

3) Testes bioqumicos


3.b) Reduo do nitrato

Todos os clostrdios so nitrato redutase positivos.

Revelao do teste: cido sulfanlico + a-naftol

3.c) Fermentao da lactose e liquefao da gelatina

O meio contm lactose e gelatina (Indicador de pH: vermelho de fenol)Aps inoculao, incubar a 36oC por 44 hSe o indicador virar para amarelado fermentao da lactose

Colocar na geladeira por 1 h:Se o meio que era semi-slido ficar lquido gelatinase presente


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Meios de cultura

CampyBAP Brucella agar base com 10% de sangue de carneiro, vancomicina, trimetoprim, polymixina B, amfotericina B, e cefalotina.

Skirrows sangue de cavalo lisado e desfibrinado e vancomicina, polimixina B, e trimetoprim.

Identificao de Campylobacter

Identificao

Oxidase +Catalase + (exceto C. sputorum)Gram -

Testes sorolgicos

Nveis de IgG, IgM, IgA

Antibitico Agente seletivo

Identificao de Helicobacter pylori

Importncia:

CO2 (5-10%)O2 (5-10%)Nitrognio (90-80%)Elevada umidade5-7 dias/37 C

Meios ricos com sangue ou soro

(BHI, Brucella, Colmbia, Skirrow)

CHROMagar Listeria

Identificao de Listeria monocytogenes

Prova imunolgica Teste Elisa

Identificao de Bacillus cereus

Meio seletivo OXIOD ou MYP

Meio seletivo e indicador Mossel Agar Gema de ovo

Sulfato de polimixina B -

antibitico

Vermelho de fenol como indicador de pH, observando fermentao do manitol. B. cereus no fermenta manitol.

Colnias plidas, em volta colorao prpura

D-manitol agente indicador, Cloreto de sdio, agente seletivo, vermelho de fenol - indicador

OXIOD Manitol- agente indicador, cloreto de sdio, sulfato de magnsio, fosfato dissdico e fosfato dicido de potssio agente seletivo, azul de bromotimol agente indicador seletivo. Colnias com colorao azul devido a

ausncia de fermentao do manitol, com zona de precipitao pela produo de lecitinase.

Colnias rugosas, secas, colorao rosada rodeadas por halo branco.

Identificao de Bacillus cereus

Testes confirmativos:

Colorao de Gram Gram +

Fermentao anaerbica da glicose a partir de Agar nutriente inclinado, com

auxilio de ala de platina, inocular caldo dextrose vermelho de fenol desaerado,

em jarra de anaerobiose. = Teste + se houver turbidez e mudana de vermelho

para amarelo produo de cido pela fermentao da glicose em

anaerobiose.

Prova de Voges Proskauer Com caldo MR-VP. Testar a presena de

acetilmetilcarbinol, em tubo contendo KOH 40% e a- naftol. = Teste + se

aparecer colorao vermelha, pois B.cereus produz acetilmetilcarbinol a partir

da glicose.

ISOLAMENTO DOS FUNGOS

-SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA

Agar SabouraudComposio qumica: gua, agar-agar, peptona, dextrose ou maltose, pH: cido (em torno de 5.6)

- Agar Mycosel - este meio apresenta composio qumica semelhante ao Agar Sabouraud, porm acrescido de antimicrobianos (Cloranfenicol -antibacteriano e Cicloheximida ou Actidione - inibidor do crescimento de fungos saprfitas), sendo muito utilizado no isolamento de fungos patognicos. O Agar Mycosel um meio seletivo para isolamento de fungos patognicos.

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-DTM - meio seletivo e indicador utilizado no isolamento de dermatfitos.

-Czapeck-Dox - utilizado no isolamento de fungos presentes em escarro e outras secrees ( tem substncias que fluidificam o muco).

-Chlamydospore agar - utilizado para induzir a formao de clamidosporos.

- Agar fub, agar arroz, agar batata - meios pobres, mas ricos em carboidratos que estimulam a esporulao, sendo usados no microcultivo


SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA CONDIES DE INCUBAO:- Temperatura: - ambiente

- para os fungos dimrficos: 1 tubo a 37C e outro temperatura ambiente.

- Atmosfera: aerobiose

- Tempo: fungos saprfitas - em torno de 3 dias ( 3 a 7 dias), fungos patognicos

- de 5 a 30 dias


IDENTIFICAO DE FUNGOS

A identificao dos fungos se baseia principalmente em caractersticas morfolgicas (macro e microscpicas), reprodutivas e metablicas.

-CARACTERSTICAS MACROSCPICAS

Na anlise da morfologia colonial vrias caractersticas devem ser observadas como: aspecto da colnia, cor, bordos, superfcie, consistncia, presena de protuberncia e sulcos.


-CARACTERSTICAS MICROSCPICASMicromorfologia e reproduo dos fungos.

P. ex.: microrganismo uni ou multicelular, a forma e tamanho das clulas, a presena de hifas, de clulas leveduriformes e de pseudo-hifa, se a hifa septada ou cenoctica, a presena de estruturas facultativas (cpsula, rizides e haustrios), o tipo de reproduo e o aspecto dos esporos e do corpo de frutificao.

- CARACTERSTICAS METABLICAS (OU BIOQUMICAS)Zimograma (prova de fermentao de carboidratos);auxanograma (prova de assimilao de carboidratos e de compostos nitrogenados);pesquisa de enzimas (urease, por exemplo).

Estas provas bioqumicas (principalmente zimograma e auxanograma) so indispensveis na identificao de leveduras.

OUTRAS PROVAS DE IDENTIFICAO. Tubo germinativo. Termotolerncia. Dimorfismo. Perfurao do plo. Sensibilidade cicloheximida


EXEMPLO DE EXAME MICROSCPICO:

TRATAMENTO PELA POTASSA ( KOH )

Este o procedimento mais utilizado para exame direto de espcimes clnicos (escamas de pele, plos, fragmentos de unha, secrees, etc.). O hidrxido de potssio (usado em concentraes de 20 a 40%) uma substncia clareadora que digere os elementos tissulares, permitindo uma melhor visualizao das estruturas fngicas (hifas, clulas leveduriformes, esporos).

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